Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng gây độc tế bào một số dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

NGUYỄN ĐÌNH QUÝ
MSV: 1101434

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THỬ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO
MỘT SỐ DẪN CHẤT
HALOGENOETHYL HÓA CỦA
CURCUMIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

NGUYỄN ĐÌNH QUÝ
MSV: 1101434

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THỬ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO
MỘT SỐ DẪN CHẤT
HALOGENOETHYL HÓA CỦA
CURCUMIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. TS. Nguyễn Văn Hải
2. Th.S. Ngô Quang Trung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội
1. Bộ môn Công nghiệp Dược
2. Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn
Hải và Th. S. Ngô Quang Trung, những người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt
cho tôi những kiến thức, lời khuyên quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đặc
biệt là PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, TS. Nguyễn Văn Hải, Th.S. Nguyễn Văn
Giang, và CN. Phan Tiến Thành của tổ môn Tổng hợp Hóa dược đã nhiệt tình
giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy cô
giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho chúng tôi
trong suốt quá trình học tập tại trường.
Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ
Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện
Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, cùng
toàn thể các thầy cô trong trường, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tôi xin
chân thành cảm ơn!
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình và bạn bè - những
người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập!

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, nên
khóa luận không tránh khỏi nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của
các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Đình Quý


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN ...................................................................3

1.1.1. Cấu trúc phân tử curcumin ......................................................................3
1.1.2. Tính chất hóa lý .......................................................................................4
1.1.3. Phương pháp điều chế .............................................................................6
1.1.4. Độ ổn định ...............................................................................................7
1.1.5. Tác dụng sinh học của curcumin .............................................................8
1.2.

TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CÁC DƯỢC CHẤT MỚI THÔNG QUA

VIỆC BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC PHÂN TỬ CURCUMIN .......................................10
1.2.1. Thay đổi nhóm chức diceton .................................................................10
1.2.2. Thay đổi tại nhóm methylen ..................................................................11
1.2.3
1.3.

Thay đổi chuỗi gắn với aryl ...................................................................11

CÁC PHẢN ỨNG ALKYL HÓA CURCUMIN .........................................12

1.3.1. Phương pháp alkyl hóa ..........................................................................12
1.3.2. Một số nghiên cứu bán tổng hợp dẫn chất alkyl hóa của curcumin đã
được thực hiện ....................................................................................................13
1.4.

LỰA CHỌN HƯỚNG NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC

DỤNG SINH HỌC ................................................................................................14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................15


2.1.

NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT ..................................................................15

2.2.

DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ................................................................................15

2.3.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................16

2.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................16

2.4.1. Tổng hợp hóa học ..................................................................................17
2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết ............................................................................17
2.4.3. Xác định cấu trúc hóa học .....................................................................17
2.4.4. Thử hoạt tính sinh học ...........................................................................18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................21
3.1

TỔNG HỢP HÓA HỌC...............................................................................21

3.1.1

Tổng hợp dẫn chất di-O-(2-cloroethyl)-curcumin (SP1) ......................22

3.1.2

Tổng hợp dẫn chất di-O-(2-bromoethyl)-curcumin (SP2) ....................24

3.2

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC .............................................................................25

3.2.1. Xác định cấu trúc sản phẩm SP1 ...........................................................25

3.2.2. Xác định cấu trúc sản phẩm SP2 ...........................................................27
3.3

THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO .....................................................28

3.4

BÀN LUẬN .................................................................................................29

3.4.1

Về tổng hợp hóa học ..............................................................................29

3.4.2

Về xác định cấu trúc ..............................................................................32

3.4.3

Về thử hoạt tính sinh học.......................................................................36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
1

H-NMR

1

H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)
13

C-NMR

13

C - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)
BDMC

Bisdemethoxycurcumin

COX

Cyclooxygenase

CTPT

Công thức phân tử

DMC

Demethoxycurcumin

EtOH

Ethanol

EtOAc

Ethyl acetat

FBS

Huyết thanh phôi bò

h

Giờ

IR

Infrared spectroscopy
(Phổ hồng ngoại)

LOX

Lipoxygenase

LU-1

Human lung carcinoma
(Dòng tế bào ung thư phổi)

MCF-7

Michigan Cancer Foundation-7
(Dòng tế bào ung thư vú)

MeOH

Methanol

MS

Mass spectrometry
(Phổ khối lượng)

Rf

Retension factor
(Hệ số lưu giữ)

đvC

Đơn vị cacbon

H%

Hiệu suất phản ứng

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

T°nc

Nhiệt độ nóng chảy


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh mục các nguyên liệu - hóa chất .....................................................15
Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ thiết bị ............................................................... 15
Bảng 3.1. Khảo sát thời gian phản ứng của phản ứng (1) .......................................23
Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của SP1 ...............................................25
Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của SP1 ..................................26
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của SP1 ................26
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của SP1...............26
Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của SP2 ...............................................27
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của SP2 ..................................27
Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của SP2 ................28
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR 125 MHz, CDCl3) của SP2 ................28
Bảng 3.11. Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào MCF-7 và LU-1 ...............29
Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)
của curcumin ............................................................................................34


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của curcumin .................................................................3
Hình 1.2. Các đồng phân enol - ceton của curcumin ................................................3
Hình 1.3. Dạng hỗ biến ceton-enol của curcumin trong dung dịch ..........................3
Hình 1.4. Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch ...................................4
Hình 1.5. Phản ứng của curcumin với gốc tự do.......................................................5

Hình 1.6. Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin........................6
Hình 1.7. Phản ứng imin hóa β-diceton của curcumin..............................................6
Hình 1.8. Phức của curcumin và dẫn chất với kim loại ............................................6
Hình 1.9. Công thức cấu tạo của curcumin (A), demethoxycurcumin(B),
bisdemethoxycurcumin (C) .......................................................................7
Hình 1.10. Sơ đồ tổng hợp curcumin ..........................................................................7
Hình 1.11. Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm .........................................8
Hình 1.12. Sự phân hủy curcumin dưới tác dụng của ánh sáng khi không có mặt O28
Hình 1.14. Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin: sửa đổi chuỗi bên aryl (A), sửa
đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylene
(D), tạo phức hợp kim loại - curcumin (E) ..............................................10
Hình 1.15. Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin ..................................................11
Hình 1.16. Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin .....................................11
Hình 1.17. Dẫn chất thay đổi tại nhóm methylen hoạt động của curcumin ..............11
Hình 1.18. Một số dẫn chất thay đổi chuỗi gắn với aryl của curcumin ....................12
Hình 1.19. Sơ đồ tổng hợp diethyl-curcumin của Hemanta Chowdhury và cộng sự
.................................................................................................................13
Hình 1.20. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất methoxycarbonylmethyl-curcumin của Hironori
Ohtsu và cộng sự .....................................................................................13
Hình 1.21. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin ...................................13
Hình 1.22. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất ethoxycarbonylmethyl-curcumin .................... 14
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp dẫn halogenoethyl của curcumin ................................... 17


Hình 3.1. Sơ đồ quá trình bán tổng hợp dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin
.................................................................................................................21
Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất di-O-(2-cloroethyl)-curcumin .........................22
Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất di-O-(2-bromoethyl)-curcumin .......................24
Hình 3.4. Cơ chế phản ứng SN2 ..............................................................................30

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xa xưa, củ Nghệ đã được sử dụng phổ biến ở một số nước châu Á như một
thứ gia vị chính giúp điều hương, tạo mùi vị và màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm.
Không những thế, nghệ còn được biết đến như một loại thuốc quý dùng để trị mụn
nhọt, làm liền sẹo, làm lành vết thương… và đặc biệt dùng để chữa các bệnh có liên
quan đến dạ dày. Ngày nay, người ta đã phát hiện ra nhóm chất màu curcuminoid nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ.
Curcuminoid là tên gọi chung của các chất mang khung diarylheptadien được
phân lập từ thân rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), bao
gồm curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin và một số chất khác,
trong đó curcumin là thành phần chủ yếu [12].
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh curcumin có tác dụng chống oxy hóa
mạnh, kháng viêm, chống đái tháo đường, kháng virus, kháng khuẩn và ức chế phát
triển khối u... [3]. Hiện nay, curcumin được sử dụng như dược chất trong nghiên
cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư phổi, viêm khớp dạng thấp, bệnh
Alzheimer, ung thư trực tràng, bệnh vảy nến... [37].
Với nhiều ưu điểm; nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có; và xu hướng ngày càng
ưa chuộng những sản phẩm nguồn gốc từ thiên nhiên thì việc phát triển những hoạt
chất từ curcumin đang là hướng nghiên cứu rất có tiềm năng. Nhiều tác giả trên thế
giới đã nghiên cứu về việc biến đổi cấu trúc của curcumin và đã đạt được những
thành công nhất định trong việc nâng cao hoạt tính sinh học hay sinh khả dụng của
nó. Trong đó những nghiên cứu biến đổi chuỗi gắn với Aryl của curcumin đã thu
được những dẫn chất có hoạt tính chống ung thư khá tốt [1] [15].
Hiện nay, curcumin đang được nghiên cứu và sử dụng phổ biến trong các chế
phẩm ngăn chặn sự khởi phát, phát triển và di căn của khối u. Curcumin có khả
năng diệt các tế bào ác tính, ngăn chặn hình thành tế bào ung thư mới mà không
làm ảnh hưởng đến các tế bào lành [29].

2

Bên cạnh đó, nhiều dẫn chất dạng alkyl-halogen có hoạt tính chống ung rất tốt
điển hình là Melphalan, Clorambucil, Meclorethamin... với các biệt dược nổi tiếng
như Alkeran Sarcoclorin, Amboclorin, Mustargen... [8].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng
hợp và thử tác dụng gây độc tế bào một số dẫn chất halogenoethyl hóa của
curcumin” với 2 mục tiêu là:
1. Tổng hợp một số dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin
2. Thử tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được


3

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN

1.1.1. Cấu trúc phân tử curcumin
- Cấu trúc phân tử (Hình 1.1)

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của curcumin
- Tên khoa học: (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hepta-1,6-dien-3,5dion [36].
- Tên khác: Diferuloylmethan, curcumin I [36].
- Công thức phân tử: C21H20O6.
- Khối lượng phân tử: 368,39 đvC [36].

Hình 1.2. Các đồng phân enol - ceton của curcumin

Curcumin và dẫn chất tồn tại ở dạng đồng phân hỗ biến: cis-diceton hoặc transdiceton và dạng enol (cis-enol) [25] (Hình 1.2). Trong dung dịch, trạng thái cân
bằng giữa dạng diceton và dạng enol được thiết lập (Hình 1.3). Tùy theo từng dung
môi khác nhau mà tỷ lệ giữa dạng diceton và dạng enol có thể khác nhau. Trong
một số dung môi, dạng enol có thể chiếm hơn 95% [23].

Hình 1.3. Dạng hỗ biến ceton-enol của curcumin trong dung dịch


4

1.1.2. Tính chất hóa lý
1.1.2.1. Tính chất vật lý
 Cảm quan:
Dạng bột vô định hình hoặc tinh thể hình kim màu vàng cam, không mùi [25].
 Độ tan:
Curcumin tan được trong acid acetic, ethanol, methanol, aceton, dicloromethan,
cloroform, ít tan trong n-hexan, không tan trong ether [2], thực tế không tan trong
nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan < 10mg ở 25oC), tan trong kiềm tạo
dung dịch màu đỏ máu [27].
 Điểm chảy: 182-183oC [6].
 Sự hấp thụ ánh sáng:
Các phân tử curcuminoid có khả năng hấp thụ bức xạ khả kiến, tạo ra màu
vàng. Tính chất hấp thụ ánh sáng của chúng gần giống nhau với cực đại hấp thụ
khác nhau rất ít: 429nm đối với curcumin, 424nm với demethoxycurcumin và
419nm với bisdemethoxycurcumin [20]. Chúng có khả năng phát huỳnh quang
(520nm) khi hấp thụ bức xạ tử ngoại có bước sóng 350nm [25].
1.1.2.2. Tính chất hóa học
 Sự điện ly theo pH:

Hình 1.4. Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch

5

Sự điện ly của curcumin trong khoảng pH = 1-11 đã được nghiên cứu bằng
phương pháp HPLC và cho kết quả như sau:
- Ở pH < 1, dung dịch nước của curcumin có màu đỏ và tồn tại ở dạng ion H4A+.
- Ở khoảng pH = 1-7, curcumin rất ít tan trong nước. Ở khoảng pH này, dung dịch
nước của curcumin có màu vàng và tồn tại chủ yếu ở dạng trung tính H3A.
- Ở pH > 7,5, dung dịch có màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A-, HA2- và
A3- lần lượt tương ứng với các giá trị pka là 7,8; 8,5 và 9,0 [23] (Hình 1.4).
 Phản ứng của nhóm hydroxyl trên vòng benzen
Các cặp electron chưa liên kết của oxy nhóm hydroxyl liên hợp mạnh với vòng
benzen làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl trở nên linh động hơn. Vì vậy
mà curcumin có tính acid và có khả năng phản ứng với các gốc tự do. Phản ứng với
các gốc tự do của curcumin còn liên quan đến sự di chuyển hydro của nhóm
methylen hoạt động (C-4). Nhờ 2 cơ chế trên mà curcumin có thể làm giảm hay làm
mất hoạt tính của các gốc này nên có tác dụng chống oxy hóa mạnh [34] (Hình 1.5).

Hình 1.5. Phản ứng của curcumin với gốc tự do
 Phản ứng hydro hóa
Trong công thức cấu tạo của curcumin có chứa các hydrocarbon chưa no, do đó
có khả năng tham gia phản ứng cộng hợp 1 hoặc nhiều phân tử hydro khi có mặt
xúc tác kim loại hay oxyd kim loại (Ni, PtO2…) tạo các dẫn chất dihydrocurcumin,
tetrahydrocurcumin, thậm chí khử ceton. Các sản phẩm này cũng là các chất chống
oxy hóa (Hình 1.6).


6

Hình 1.6. Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin
 Phản ứng imin hóa
Nhóm β-diceton của curcumin có thể phản ứng với các amin bậc nhất (Y-NH2)
như hydroxylamin (Y = -OH), phenylhydrazin (Y = C6H5-NH-)… để tạo thành các
dẫn chất imin tương ứng. Các dẫn chất này đều có hoạt tính chống nấm và chống
oxy hóa tốt [4] (Hình 1.7).

Hình 1.7. Phản ứng imin hóa β-diceton của curcumin
 Phản ứng tạo phức

Hình 1.8. Phức của curcumin và dẫn chất với kim loại
Do cấu trúc β-diceton trong môi trường acid và trung tính nằm dưới dạng hỗ biến
ceton-enol đối xứng và ổn định nên curcuminoid có khả năng tạo phức với nhiều
ion kim loại khác nhau: Mn2+, Fe2+, Cu2+…[11].
1.1.3. Phương pháp điều chế
1.1.3.1. Nguồn gốc Curcumin
Curcuminoid là tên gọi chung một nhóm dẫn xuất diarylheptan được phân lập từ
thân rễ cây Nghệ vàng Curcuma longa L., bao gồm curcumin, demethoxycurcumin,
bisdemethoxycurcumin và một ít cyclocurcumin. Chúng là những hợp chất
phenolic, khác nhau ở nhóm thế trên gốc phenyl (Hình 1.9) [12].


7

Hình 1.9. Công thức cấu tạo của curcumin (A), demethoxycurcumin(B),
bisdemethoxycurcumin (C)
1.1.3.2. Chiết xuất Curcumin từ củ nghệ
Năm 1977, Nguyễn Khang (Đại học Dược Hà Nội) đã chiết bột củ nghệ sau khi
đã cất lấy hết tinh dầu với benzen, sau đó cất thu hồi dung môi và kết tinh lại trong
ethanol đến khi thu được một vết trên sắc ký lớp mỏng và có nhiệt độ nóng chảy

không đổi, thu được 0,76-1,1% curcumin I tinh khiết, độ chảy 182-183°C [6].
Một phương pháp khác để chiết tách curcumin là chiết bằng siêu âm. Bột nghệ
được chiết với dung môi thích hợp thu sản phẩm thô và tinh chế bằng sắc ký cột
silicagel, thu được curcumin tinh khiết [10].
1.1.3.3. Tổng hợp toàn phần curcumin
Phương pháp thông thường sử dụng để tổng hợp curcumin là phương pháp đi từ
valinin và aceton [16]. Sơ đồ phản ứng chung được trình bày trong Hình 1.10.

Hình 1.10. Sơ đồ tổng hợp curcumin
1.1.4. Độ ổn định
 Phân hủy trong môi trường kiềm:
Curcumin tương đối bền ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH > 7.
Tonnesen và Karlsen (1985) đã nghiên cứu sự phân hủy của curcumin ở pH = 7-10
và xác định sản phẩm phân hủy bằng phương pháp HPLC. Ban đầu sản phẩm phân
hủy là acid ferulic và feruloylmethan; sau đó feruloylmethan tiếp tục phân hủy
thành vanillin và aceton, acid ferulic phân hủy thành vinylguaiacol và CO2; ngoài ra
còn có các sản phẩm ngưng tụ [23] (Hình 1.11).


8

Sản phẩm ngưng tụ

Hình 1.11. Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm
 Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng:
Curcumin kém bền với ánh sáng ngay cả khi có và không có mặt của O2. Khi có
mặt O2, curcumin bị phân hủy thành vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic và acid
ferulic. Trong điều kiện không có O2, curcumin có thể bị vòng hóa [23] (Hình 1.12).

Hình 1.12. Sự phân hủy curcumin dưới tác dụng của ánh sáng khi không có mặt O2

1.1.5. Tác dụng sinh học của curcumin
Curcumin đã được chứng minh là có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và ký
sinh trùng, kháng viêm, chống viêm loét dạ dày-tá tràng, làm lành vết thương, liền
sẹo, chống tăng sinh và ngăn ngừa ung thư...[3] [14] [28]. Nghiên cứu trên động vật
cho thấy curcumin có hiệu quả với một số bệnh như tiểu đường, béo phì, rối loạn
tâm thần... [3]. Dưới đây là một số tác dụng sinh học nổi bật của curcumin.
 Tác dụng chống oxy hóa
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng của curcumin có khả năng chống oxy hóa mạnh,
tương đương với vitamin C, vitamin E và β-caroten [14] nhờ khả năng khử các gốc
tự do như anion superoxid, gốc hydroxyl, ngăn cản quá trình peroxy hóa lipid [15].


9

 Tác dụng phòng và điều trị ung thư
Curcumin có tác dụng diệt tế bào ung thư theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các
tế bào ác tính, kìm hãm tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai
đoạn cuối [32]. Hiện nay có trên một nghìn công trình được tiến hành và kết quả
bước đầu cho thấy [38]:
- Curcumin ngăn các các tế bào ung thư đi vào pha tổng hợp của chu kỳ tế bào
- Curcumin thúc đẩy các tế bào ung thư đi vào chết tế bào theo chương trình
- Curcumin là chất ức chế tạo mạch máu mới mạnh
 Tác dụng chống viêm
Curcumin có khả năng ức chế nhiều chất liên quan đến phản ứng viêm như
phospholipase, LOX, COX-2, leukotrien, thromboxan, prostaglandin… Curcumin
còn ức chế quá trình sản xuất các cytokin tiền viêm trong PMA hay bạch cầu đơn
nhân ở máu ngoại vi và ở các đại thực bào phế nang. Ngoài ra curcumin còn làm
tăng và kéo dài tác dụng của cortisol, một chất chống viêm tự nhiên trong cơ thể.
Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy hiệu quả của curcumin trong việc điều trị
bệnh viêm khớp do gout, viêm xương khớp và viêm khớp dạng thấp. [33]

 Tác dụng điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng
Nghệ đã được chứng minh là có tác dụng làm giảm tiết dịch vị, làm tăng chất
nhầy ở thành dạ dày, ức chế sự hình thành loét và chống lại tác động của các yếu tố
gây loét như stress, rượu, thuốc reserpin... Do đó Nghệ có tác dụng bảo vệ niêm
mạc dạ dày - tá tràng. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng curcumin có tác dụng
ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn H. pylori. [14]
 Tác dụng khác
Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng dịch chiết nghệ và curcumin gây ức chế sự
phát triển của một số loài vi khuẩn, điển hình là trực khuẩn lao (Plasmodium
falciparum), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), Salmonella paratyphi, Microcus
pyogenes... [10]. Curcumin có tác dụng hạ cholessterol và triglycerid máu, ức chế
kết tập tiểu cầu, làm giảm tình trạng tắc ống dẫn mật đồng thời làm chậm và cải
thiện tình trạng tổn thương và xơ hóa tế bào gan... [3] [14]


10

1.2.

TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CÁC DƯỢC CHẤT MỚI THÔNG QUA
VIỆC BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC PHÂN TỬ CURCUMIN

Mặc dù có nhiều ưu điểm nổi bật về tác dụng sinh học cũng như độ an toàn cao
nhưng việc sử dụng curcumin qua đường uống để điều trị gặp phải một số khó khăn
như sinh khả dụng rất thấp, bị chuyển hóa nhanh khi vào cơ thể và một số hoạt tính
chưa có ý nghĩa lâm sàng [15]. Có nhiều nghiên cứu biến đổi cấu trúc của curcumin
được tiến hành và đã đạt được những thành công nhất định với việc nâng cao hoạt
tính sinh học hay sinh khả dụng của curcumin. Việc biến đổi trong cấu trúc của
curcumin bao gồm sửa đổi chuỗi bên aryl, chức diceton, các liên kết đôi, thay đổi
chức methylen hoạt động, tạo phức kim loại của curcumin [13] (Hình 1.13). Sau

đây là một số ví dụ cụ thể về các dẫn chất bán tổng hợp từ curcuminoid.

Hình 1.13. Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin: sửa đổi chuỗi bên aryl (A),
sửa đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylene (D),
tạo phức hợp kim loại - curcumin (E)
1.2.1. Thay đổi nhóm chức diceton
J.S.Shim và cộng sự đã tổng hợp được một vài dẫn xuất hydrazinocurcumin (HC)
và hydrazinobenzoylcurcumin (HBC) [35]. Kết quả nghiên cứu cho thấy HC có
hoạt tính ức chế tế bào BAOEC (Bovine aortic endothelial cells), ngăn chặn tiến
trình angiogenesis (một trong các tiến trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần
so với curcumin. Ngoài ra HC còn có khả năng ức chế một số dòng tế bào: HT29,
NH3T3, Chang. HBC thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào BAOEC mạnh hơn
curcumin nhưng kém hơn HC. HBC có hoạt tính ức chế mạnh trên tế bào HCT15, ở
nồng độ 40μM HBC thì hầu như toàn bộ tế bào HCT15 bị ức chế sau hơn 48h.


11

Hình 1.14. Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin

Hình 1.15. Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin
1.2.2. Thay đổi tại nhóm methylen

Hình 1.16. Dẫn chất thay đổi tại nhóm methylen hoạt động của curcumin
Dẫn chất trên đã được Ohtsu bán tổng hợp từ curcumin và được Ohtsu đánh giá
như một chất có tiềm năng đối kháng với androgen receptor (AR), chống lại dòng tế
bào ung thư tuyến tiền liệt ở người, PC-3 và DU. Kết quả cho thấy hoạt động
kháng androgen của dẫn chất trên vượt trội hơn so với hydroxyflutamide - một hợp
chất kháng androgen tiêu chuẩn hiện có sẵn để điều trị ung thư tuyến tiền liệt. [30]
1.2.3 Thay đổi chuỗi gắn với aryl

Fuchs và cộng sự đã thực hiện việc biến đổi trên chức –OH của chuỗi aryl thu
được dẫn chất (1) và (2) (Hình 1.17) đồng thời đánh giá tác dụng của chúng trên
dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt và dòng tế bào ung thư vú. Kết quả cho thấy
chúng có tác dụng chống lại tế bào ung thư tuyến tiền liệt mạnh thể phụ thuộc
androgen cũng như thể không phụ thuộc androgen. Các hợp chất này cũng ức chế
dòng tế bào ung thư vú thể phụ thuộc estrogen và không phụ thuộc estrogen [18].
Aggrwal và cộng sự đã tổng hợp phức [DLys6 ]-LHRH-curcumin (dẫn chất (3)
Hình 1.17) và nghiên cứu tác dụng chống ung thư tuyến tụy trên cả in vivo và in
vitro. Kết quả cho thấy [DLys6 ]-LHRH-curcumin ức chế sự tăng sinh tế bào ung


12

thư trên in vitro. Trên in vivo, [DLys6]-LHRH-curcumin ngăn chặn sự tăng sinh
của tế bào ung thư tuyến tụy ở chuột, làm giảm trọng lượng và khối lượng khối u
một một cách đáng kể so với curcumin [13].
Handler và cộng sự đã tổng hợp các chất tương tự curcumin trong đó hợp chất
(4), (5) (Hình 1.17) đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh enzym COX-1
và COX-2 [19].

Hình 1.17. Một số dẫn chất thay đổi chuỗi gắn với aryl của curcumin
1.3.

CÁC PHẢN ỨNG ALKYL HÓA CURCUMIN

1.3.1. Phương pháp alkyl hóa
1.3.1.1. O-alkyl hóa
Bao gồm các phản ứng alkyl hóa nhóm –OH alcol hoặc phenol (sản phẩm là
ether), nhóm –OH của acid carboxylic (sản phẩm là ester) [7]. Curcumin là một hợp
chất diphenolic, để alkyl hóa curcumin cần sử dụng phản ứng tổng hợp ether (phản

ứng Williamson). Đây là một phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2), trong đó
một ion alkoxid thay thế một halogen, sulfonyl hoặc một nhóm sulfat tùy thuộc vào
tác nhân alkyl hóa được sử dụng. Alkyl halogenid được sử dụng nhiều nhất [31].
1.3.1.2. C-alkyl hóa
C-alkyl hóa thường là phản ứng alkyl hóa các hợp chất chứa nhóm methylen hoạt
động (là các hợp chất có nguyên tử hydro gần các nhóm hút điện tử mạnh) [7]. Do
cấu trúc β-diceton nên 2 nguyên tử hydro ở vị trí C-4 của curcumin trở nên rất linh
động, liên kết C-H ở đây dễ dàng bị cắt đứt. Chính vì vậy mà vị trí C-4 trong phân
tử curcumin có khả năng bị tấn công bởi các tác nhân alkyl hóa, tạo ra dẫn chất Calkyl hóa của curcumin.


13

1.3.2. Một số nghiên cứu bán tổng hợp dẫn chất alkyl hóa của curcumin đã
được thực hiện
1.3.2.1. Phản ứng tổng hợp diethyl-curcumin [21]

Hình 1.18. Sơ đồ tổng hợp diethyl-curcumin của Hemanta Chowdhury và cộng sự
Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt K2CO3, sử dụng
tác nhân ethylbromid, đun hồi lưu trong 24-48h. Sau phản ứng, lọc và cất loại dung
môi, chiết cắn bằng dung môi hữu cơ. Pha hữu cơ được rửa sạch bằng nước. Làm
khan và bốc hơi dung môi thu được sản phẩm. Hiệu suất phản ứng đạt 86,0%.
1.3.2.2. Phản ứng tổng hợp dẫn chất methoxycarbonylmethyl-curcumin [22]

Hình 1.19. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất methoxycarbonylmethyl-curcumin của Hironori
Ohtsu và cộng sự
Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt K2CO3 và KI, sử
dụng tác nhân methyl cloroacetat, đun hồi lưu trong 24h. Sản phẩm được tách ra
bằng sắc ký cột, thu được mono-O-methoxycarbonylmethyl-curcumin và di-Omethoxycarbonylmethyl-curcumin với hiệu suất đều là 20%.
1.3.2.3. Phản ứng tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin [17].

Hình 1.20. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin


14

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt K2CO3, sử dụng
tác nhân 2-bromoethanol, đun hồi lưu trong 5h. Sản phẩm được tách ra bằng sắc ký
cột, thu được mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin và di-O-(2-hydroxyethyl)curcumin với hiệu suất lần lượt 47% là 32%.
1.3.2.4. Phản ứng tổng hợp dẫn chất ethoxycarbonylmethyl-curcumin [5]

Hình 1.21. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất ethoxycarbonylmethyl-curcumin
Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt K2CO3 và KI, sử
dụng tác nhân ethyl cloroacetat, đun hồi lưu trong 14h. Sản phẩm được tách bằng
cách chiết với ethyl acetat và acid HCl 1M, và được tinh chế bằng cách kết tinh lại
trong EtOH 70o, thu được sản phẩm với hiệu suất là 60,57%.
1.4.

LỰA CHỌN HƯỚNG NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC
DỤNG SINH HỌC

Như đã nói trong phần đặt vấn đề, có rất nhiều hợp chất alkyl-halogen có tác
dụng gây ức chế sự nhân lên và làm ngừng sự phát triển của tế bào ung thư. Cơ chế
tác dụng của chúng là alkyl hóa đôi base nitơ của AND, làm rối loạn tổng hợp acid
nhân, dẫn đến làm ngừng sự phát triển và nhân lên của tế bào ung thư [8].
Nu−H +

Alkyl−Cl

→

Nu− Alkyl

+

HCl

Bản thân curcumin cũng là một chất có tác dụng chống ung thư khá tốt và cũng
ko gây độc với tế bào lành. Các kết quả nghiên cứu invitro cho thấy curcumin có tác
dụng khá tốt trên 2 dòng tế bào là MCF-7 và LU-1, với giá trị IC50 lần lượt là
9.815μM [26] và 18μM [24].
Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu biến đổi chuỗi gắn aryl của curcumin đã đạt được
thành công nhất định với hoạt tính chống ung thư dẫn chất cao hơn so với curcumin.
Với những lý do trên, chúng tôi dự kiến tổng hợp dẫn chất halogenoethyl hóa của
curcumin và thử tác dụng gây độc của chúng trên 2 dòng LU-1 và MCF-7.


15

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT

2.1.

Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là bột curcuminoid chiết xuất từ củ nghệ vàng
tại Bộ môn Công nghiệp dược - Đại học Dược Hà Nội. Các nguyên vật liệu và hóa
chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh mục các nguyên liệu - hóa chất
Tên hóa chất

STT

2.2.

Xuất xứ

1

1,2-dibromoethan

Mỹ

2

1,2-dicloroethan

Trung Quốc

3

Aceton

Trung Quốc

4

Cloroform

Trung Quốc

6

Diethyl ether

Trung Quốc

7

Ethanol

Trung Quốc

8

Ethyl acetat

Trung Quốc

9

Kali carbonat

Trung Quốc

10

Methanol

Trung Quốc

11

n-hexan

Trung Quốc

12

Natri hydroxyd

13

Natri sulfat

14

Nước cất

Merck
Trung Quốc
Việt Nam

DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

Các dụng cụ, thiết bị đã sử dụng trong khóa luận được trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ thiết bị
STT

Thiết bị, dụng cụ

Xuất xứ

1

Bản mỏng silica gel 60 F254

Merck

2

Bình cầu 1 cổ dung tích 50mL, 100mL

Đức

3

Bình cầu 2 cổ dung tích 100mL, 250mL

Đức

4

Bình gạn dung tích 250mL, 500mL

Trung Quốc


16

2.3.

5

Bộ lọc hút chân không

6

Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S

7

Cốc có mỏ 100mL, 250mL, 500mL

Đức

8

Đèn soi UV sắc ký

Đức

9

Đĩa petri

Trung Quốc

10

Đũa thủy tinh

Trung Quốc

11

Giấy lọc

12

Giấy chỉ thị màu đo pH

13

Máy cấy quay chân không Buchi R210

Thụy Sĩ

14

Máy đo nhiệt động nóng chảy EZ-Melt

Mỹ

15

Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA

Đức

16

Máy sấy đèn hồng ngoại

Đức

17

Nhiệt kế thủy ngân (0-200oC)

Trung Quốc

18

Ống đong 25mL, 50mL

Trung Quốc

19

Pipet chia vạch 1mL, 2mL, 5mL, 10mL

Đức

20

Sinh hàn hồi lưu

Đức

21

Tủ sấy Memmert

Đức

Trung Quốc
Thụy Sĩ

Việt Nam
Trung Quốc

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Tổng hợp một số dẫn chất halogenoethyl của curcumin thiên nhiên chiết từ củ
nghệ vàng bằng cách sử dụng tác nhân alkyl hóa.
 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi
thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy.
 Xác định cấu trúc các sản phẩm tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại
(IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và
phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR).
 Thử tác dụng gây độc tế bào các sản phẩm tổng hợp thu được.
2.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU