Bước đầu nghiên cứu tạo magnesi lactat bằng cố định tế bào lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ THỊ THÚY NGÂN
MÃ SINH VIÊN: 1101357

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO MAGNESI
LACTAT BẰNG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
Lactobacillus acidophilus
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ THỊ THÚY NGÂN
MÃ SINH VIÊN: 1101357

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO MAGNESI
LACTAT BẰNG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
Lactobacillus acidophilus
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
ThS. Kiều Thị Hồng, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Em cũng chân thành gửi lời cảm ơn tới TS. Đàm Thanh Xuân cùng toàn thể
thầy cô giáo và anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công Nghiệp Dược đã luôn tạo điều
kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm khóa luận.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn,
khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng
góp của thầy cô và các bạn để có thể hoàn thiện hơn nghiên cứu của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Võ Thị Thúy Ngân


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN..................................................................... 3
1.1. Vi khuẩn sinh acid lactic ...................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic .........................................................3
1.1.2. Chi Lactobacillus .............................................................................................3
1.1.3. Loài Lactobacillus acidophilus ........................................................................4
1.2. Magnesi lactat .....................................................................................................5
1.2.1. Đặc điểm ...........................................................................................................5

1.2.2. Công dụng .........................................................................................................6
1.2.3. Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường .......................................................6
1.3. Các phương pháp sản xuất Magnesi lactat ......................................................7
1.3.1. Phương pháp tổng hợp hóa học ........................................................................7
1.3.2. Phương pháp vi sinh vật....................................................................................8
1.4. Phương pháp bất động tế bào và ứng dụng ....................................................8
1.4.1. Nguyên tắc ........................................................................................................8
1.4.2. Các phương pháp bất động tế bào ....................................................................9
1.4.3. Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào..................................................10
1.5. Alginat ...............................................................................................................12
1.5.1. Cấu trúc của alginat........................................................................................12
1.5.2. Tính chất của alginat ......................................................................................13
1.6. Các nghiên cứu về Magnesi lactat ..................................................................14
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16
2.1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị máy móc ....................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................18


2.2.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L. acidophilus
khi cố định trên gel Calci alginat ..............................................................................18
2.2.2. Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L. acidophilus khi cố định trên gel
Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat..................................................................18
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................19
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào ....................................................19
2.3.2. Phương pháp tạo hệ gel cố định tế bào ..........................................................19
2.3.3. Phương pháp lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat ....................................20
2.3.4. Phương pháp tách Magnesi lactat từ dịch lên men ........................................20
2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục – tính số lượng vi khuẩn được cố định và
rửa trôi trong quá trình lên men ...............................................................................21
2.3.6. Phương pháp tính hiệu suất tiêu thụ đường của vi khuẩn ..............................22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................. 24
3.1. Khảo sát khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L. acidophilus khi
cố định trên gel Calci alginat..................................................................................24
3.1.1. Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất Magnesi lactat theo phương
pháp lên men mẻ........................................................................................................24
3.1.2. Đánh giá khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L. acidophilus khi cố
định trong gel Calci alginat so với tế bào tự do .......................................................25
3.2. Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L. acidophilus khi cố định trên
gel Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat .......................................................32
3.2.1. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn L. acidophilus được cố định và lưu giữ
trong hệ gel Calci alginat trong quá trình nuôi cấy .................................................32
3.2.2. Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L. acidophilus khi cố định trên gel
Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat ................................................................34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 38
Tài liệu tham khảo


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC

Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
(American Type Culture Collection)

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

IR

IUPAC

Phổ hồng ngoại (Infrared Radiation)

Liên minh Quốc tế về Hóa học thuần túy và Hóa học
ứng dụng
(International Union of Pure and Applied Chemistry)

L.acidophilus

Lactobacillus acidophilus ATCC 4653

MRS

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
(de Man, Rogosa, Sharpe)

MS

Phổ khối lượng
(Mass spectrometry)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1 Một số sản phẩm chứa Magnesi lactat trên thị trường

7

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

16

Bảng 2.2 Máy móc, thiết bị và dụng cụ sử dụng

16

Bảng 2.3 Môi trường MRS lỏng

17

Bảng 2.4 Môi trường lên men

17

Bảng 3.1 Lượng hạt chứa tế bào vi khuẩn L. acidophilus tương đương với

25

số lượng tế bào trong 15ml dịch nhân giống sau 24h
Bảng 3.2 Lượng Magnesi lactat tạo thành sau khi lên men L. acidophilus

26

ở trạng thái tế bào tự do và cố định trong gel Calci alginat (g)
Bảng 3.3 Hiệu suất tiêu thụ đường và hiệu suất quá trình lên men của tế

28

bào L. acidophilus tự do và cố định
Bảng 3.4 Lượng MgCO3 bổ sung trong quá trình lên men

30

Bảng 3.5 Lượng vi sinh vật cố định trong hạt gel Calci alginat tại các thời

32

điểm
Bảng 3.6 Khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau mỗi lần sử dụng

35

Bảng 3.7 Hiệu suất tiêu thụ đường và hiệu suất quá trình lên men của tế

36

bào cố định L. acidophilus
Bảng 3.8 Khối lượng hạt tế bào cố định L. acidophilus tại các thời điểm

37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Tên hình vẽ và đồ thị

Trang

Hình 1.1 Hình ảnh L. acidophilus dưới kính hiển vi quang học

4

Hình 1.2 Hình ảnh L. acidophilus dưới kính hiển vi điện tử

4

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của Magnesi (L-) lactat

5

Hình 1.4 Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic

12

acid
Hình 1.5 Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic

12

acid
Hình 1.6 Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG

13

Hình 1.7 Liên kết của ion Ca2+ với alginat

14

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau 96h

27

lên men giữa tế bào cố định trên gel Calci alginat và tế bào tự do
Hình 3.2 Tinh thể Magnesi lactat tạo thành từ tế bào tự do

27

Hình 3.3 Tinh thể Magnesi lactat tạo thành từ tế bào cố định

27

Hình 3.4 Lượng MgCO3 bổ sung vào môi trường lên men tại các thời

31

điểm
Hình 3.5 Số lượng tế bào L. acidophilus cố định trong 1g vi nang Calci
alginat sau các lần lên men

33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Magnesi là một trong những khoáng chất phổ biến cần thiết cho sự phát triển
của con người [27], [41], [42], [48]. Thiếu hụt Magnesi dẫn đến những thay đổi sinh
hoá nghiêm trọng, là nguyên nhân gây ra bệnh lý về tim mạch, loãng xương, hen
suyễn… [24], [30], [39], [47]. Ngoài việc bổ sung Magnesi thông qua khẩu phần ăn
hằng ngày, ngày nay, một số bệnh cần phải bổ sung Magnesi dưới dạng thuốc. Sinh
khả dụng của thuốc ở dạng muối Magnesi vô cơ được đánh giá là thấp hơn so với
muối Magnesi hữu cơ [25], [33], [40], muối Magnesi lactat có sinh khả dụng là
41% [38]. Ngoài tác dụng chữa bệnh, Magnesi lactat còn có vai trò qua trọng trong
sản xuất Calci lactat, Acid lactic, Polylactid (PLA, nhựa sinh học) là những sản
phẩm thông dụng không chỉ sử dụng trong ngành dược mà còn trong các ngành
công nghiệp khác như công nghiệp thực phẩm, công nghệ chất dẻo [23], [34]. Qua
đó có thể thấy được tính ứng dụng cũng như giá trị kinh tế cao của Magnesi lactat.
Trong các sản phẩm của công nghệ lên men vi sinh vật, acid lactic và muối
lactat là những sản phẩm ra đời từ rất sớm và ứng dụng rộng rãi, vì thế
Lactobacillus acidophilus, một đại diện điển hình của nhóm vi sinh vật sinh lactic
được quan tâm nghiên cứu nhiều [1], [7]. Mặc dù Magnesi lactat có tầm quan trọng
là vậy nhưng hiện nay các loại muối lactat nghiên cứu tổng hợp chủ yếu ở dạng
muối Calci. Cũng đã có những đề tài liên quan đến Magnesi lactat song sinh tổng
hợp bằng phương pháp bất động tế bào còn là một vấn đề khá mới mẻ mặc dù đã có
những vượt trội của phương pháp này được ghi nhận như sản phẩm thu được tinh
khiết hơn so với lên men các tế bào tự do, các tế bào vi sinh vật cố định sau khi lên
men có thể thu hồi, tái sử dụng và đặc biệt là có thể sản xuất liên tục trong các quy
trình tự động hoá [5].
Bởi tính ứng dụng cao của Magnesi lactat và ưu điểm của phương pháp bất động
tế bào, chúng tôi lựa chọn đề tài:
“Bước đầu nghiên cứu tạo Magnesi lactat bằng cố định tế bào Lactobacillus
acidophilus”

Với những mục tiêu sau:


2

- Khảo sát khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào Lactobacillus acidophilus
khi cố định trên gel Calci alginat.
- Xem xét khả năng tái sử dụng các tế bào Lactobacillus acidophilus khi cố
định trên gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat.


3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn sinh acid lactic
1.1.1. Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic
Vi khuẩn sinh lactic gồm các trực khuẩn hay cầu khuẩn Gram (+), tỉ lệ GC
(guanin và cystein) thấp, chịu được acid, thường không sinh nha bào, kị khí hoặc vi
hiếu khí, được phân nhóm dựa vào đặc điểm chung trong quá trình trao đổi chất và
các đặc tính sinh lý. Ban đầu, các vi khuẩn này được tìm thấy trong thực vật đã
phân hủy và các sản phẩm của acid lactic. Điểm chung lớn nhất của vi khuẩn nhóm
này là sự lên men hydratcarbon sinh ra acid lactic là sản phẩm trao đổi chất cuối
cùng [2], [32].
Vi khuẩn sinh lactic chủ yếu thuộc 4 chi: Lactobacillus, Pediococcus,
Streptococcus, Leuconostoc; ngoài ra có một số loài nấm thuộc chi Rhizopus [1].
Hình dạng và kích thước của vi khuẩn sinh lactic rất đa dạng và phức tạp:
hình cầu, hình oval, hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc mọc thành chuỗi.
Sinh lý của vi khuẩn lactic khá giống nhau, chúng là các vi khuẩn Gram (+),
không tạo bào tử, hầu như không di động, ưa nhiệt, là vi khuẩn yếm khí hoặc vi

hiếu khí, sử dụng năng lượng từ phân giải glucid và tiết ra acid lactic. Chúng phát
triển và tồn tại tốt ở pH thấp (4,5 – 6,8), nhiệt độ khoảng 10 – 500C [1], [2].
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn dị dưỡng nên môi trường dinh dưỡng tương đối
phức tạp, giàu chất dinh dưỡng, gồm: các vitamin, các acid amin, các peptid ngắn…
Chúng có khả năng đồng hóa nhiều loại đường: glucose, saccarose, lactose,
mantose…, một vài loài cũng có khả năng sử dụng đường cao phân tử [1].
1.1.2. Chi Lactobacillus
Là chi lớn nhất trong các vi khuẩn sinh lactic với nhiều chủng đã được
nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất. Chi Lactobacillus được phát hiện với hơn
125 loài, dựa vào sự chuyển hóa glucid trong tế bào và sản phẩm tạo ra trong quá
trình lên men, chia thành 3 nhóm chính [2]:


4



Nhóm 1: Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình. Đại diện: L. acidophilus, L.

bulgaricus, L. delbrueckii…


Nhóm 2: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình không bắt buộc. Đại diện: L.

plantarum, L. casei, L. leichmenii…


Nhóm 3: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc. Đại diện: L. brevis, L.

fermentum, L. buchneri…

1.1.3.

Loài Lactobacillus acidophilus
Loài L. acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Fermicutes, lớp bacilli, bộ

lactobacilliales, họ lactobacillaceae, giống lactobacillus [2], [4]

Hình 1.1 Hình ảnh L. acidophilus

Hình 1.2 Hình ảnh L. acidophilus

dưới kính hiển vi quang học

dưới kính hiển vi điện tử

L. acidophilus là trực khuẩn Gram (+), dạng hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc
tạo chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, phản ứng catalase âm tính; là vi
khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu để phát triển là 37 – 450C, chịu được pH tương đối
thấp (5 – 6); hô hấp hiếu khí và kị khí nhưng chủ yếu là kị khí; có khả năng chuyển
hóa hydratcarbon cho sản phẩm là D (-), L (+) lactic [1], [2], [6].
L. acidophilus là “probiotic”, chúng là các vi khuẩn có lợi trong hệ thống
tiêu hóa giúp chống lại vi khuẩn có hại gây bệnh, góp phần duy trì hệ vi khuẩn có
lợi. L. acidophilus được phân lập từ dịch ruột trẻ em và dịch ruột bê. Hiện nay, L.
acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu hóa như: Antibio,
Lactomin,… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa ở trẻ mới ăn dặm hoặc do
dùng kháng sinh dài ngày [7].


5

L. acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng
là acid lactic được ứng dụng nhiều trong y – dược dưới các dạng muối như Calci
lactat (dùng trong trường hợp thiếu calci hoặc nhu cầu cơ thể tăng như phụ nữ mang
thai, phụ nữ cho con phú, trẻ em còi xương…), Magnesi lactat (tác nhân bảo vệ tim
mạch, làm giảm nguy cơ tiểu đường..) ,… và cả trong ngành mỹ phẩm như dung
dịch vệ sinh phụ nữ (Dạ hương, Lactacyd,…).
1.2.

Magnesi lactat

1.2.1. Đặc điểm
 Công thức tổng quát: C6H10MgO6.
 Tên khoa học (theo IUPAC): Magnesi 2 – hydroxyl propanoate.
 Thành phần: C 35,60%, H 4,98%, Mg 12,01%, O 47,42%.
 Khối lượng phân tử: 202,45g/mol.
 Công thức cấu tạo: gồm cation Mg2+ và 2 anion lactat.

Magnesi lactat là muối kết tinh của acid lactic với ion Mg2+, tồn tại trong tự nhiên
dạng dihydrat (C6H10MgO6.2H2O) và trihydrat (C6H10MgO6.3H2O).
Cấu trúc không gian

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của Magnesi (L-) lactat
 Tính chất: Magnesi lactat tồn tại dạng kết tinh màu trắng, không mùi, vị cay
đắng, khó tan trong nước lạnh, tan tốt trong nước nóng (1g bột tan trong 25ml nước
lạnh; 3,5ml nước nóng) và hơi tan trong ethanol 960 [26].


6

1.2.2. Công dụng

Magnesi lactat được sử dụng trong nhiều lĩnh vực:
 Trong Y học:
-

Magnesi trong cơ thể người lên đến 25-30g, là cation nhiều thứ hai trong nội bào,
tham gia vào các chuyển hóa glucid, lipid, protid của nội bào, cân bằng kiềm toan,
oxy hóa khử, và đóng vai trò sinh lý quan trọng, được xác định bởi những rối loạn
do thiếu hụt. Nó tác động lên quá trình tăng trưởng, giống như vitamin D, giúp calci
và phospho cố định trên xương [12], [44].

-

Magnesi lactat được kê cho phụ nữ có thai dùng một cách có hệ thống để điều trị
đau tử cung trong thai kỳ [22] .

-

Magnesi lactat là tác nhân bảo vệ tim mạch, được sử dụng trong bệnh viện nhiều
nhất trong các khoa cấp cứu bệnh nhồi máu [13], [18], [35].

-

Magnesi lactat đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chống lại các hiện tựợng
được kết hợp với lão hóa [16], [43].

-

Magnesi lactat cũng cần thiết cho quá trình phát triển và hoạt động bình thường của
tổ chức, đặc biệt liên quan đến chuyển hóa [49] và các hoạt động của não [45], [46],
làm giảm nguy cơ mắc tiểu đường typ II, loãng xương, tăng huyết áp và tim mạch

[50].

 Trong các ngành công nghiệp khác:
Trong sản xuất dược phẩm, Magnesi lactat là một tá dược trơn dùng trong dập viên,
tá dược điều chỉnh pH, điều vị… Magnesi lactat là tiền sản phẩm trong công nghiệp
lên men sản xuất acid lactic, các muối lactat như Calci lactat. Magnesi lactat còn
được sử dụng rộng rãi để chế tạo các linh kiện điện tử, thiết bị kỹ thuật (máy tính
xách tay, máy tính bảng…) [34].

1.2.3. Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường


7

Bảng 1.1. Một số sản phẩm chứa Magnesi lactat trên thị trường
STT Tên biệt dược
1

Maglek B6

3

Magne B6 Stada

4

Magne - B6 Corbière

Thành phần

Hãng sản xuất
Lek-AM, Poland Lek-AM,
Ba Lan
Stada-VN JV, Việt Nam
Mekophar, Việt Nam

Magnesi lactat,

5

Magnelis B6

6

Magvit

7

Amfamag B6

Ampharco USA, Việt Nam

8

New - Mag

Whan, Hàn Quốc

9

Magne-B6 Boston

Boston Pharma, Việt Nam

10

Magnerot

11

Magnesium recip

12

Magnesium

13

Oromag

14

Magnegon

15

Wamag

16

1.3.

Pyridoxin

Magnesi lactat,
Acid orotic

Pharmstandard, Nga
GlaxoSmithKline, Anh

Wörwag Pharma, Nga
Recip, Thụy Điển

Magnesi lactat,
Magnesi citrat

Nycomed, Romania
Theramex, Tunisia
Takeda Pharma, Thụy Sĩ

Magnesi lactat, hỗn Hasco, Ba Lan
hợp muối calci

Magnesium

Magnesi lactat và Serp, Monaco

Glycocolle Lafarge

glycin

Các phương pháp sản xuất Magnesi lactat

1.3.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Bằng các phương pháp tổng hợp hóa học, các nhà khoa học đã nghiên cứu
tổng hợp được Magnesi lactat từ các nguồn nguyên liệu khác nhau như trong sản
xuất acid lactic [14], [21].
 Ưu điểm [5]: Dễ thu sản phẩm từ nhiều nguồn khác nhau (như Thủy phân α
– halogenid acid từ acid α – cloropropionic, khử hóa ceton acid bằng hydro mới


8

sinh đi từ acid pyruvic, cộng hợp ái nhân với tác nhân HCN từ nguồn acetaldehyd),
chi phí rẻ, sản phẩm có độ tinh khiết cao, thời gian ngắn.
 Nhược điểm: Tổng hợp Magnesi lactat theo phương pháp này thường tạo
dạng racemic Magnesi lactat, dung môi hóa chất sử dụng gây ô nhiễm môi trường.
Phương pháp được áp dụng rộng rãi tạo Magnesi lactat cho các ngành công
nghiệp khác: tổng hợp chất phụ gia thực phẩm, chất dẻo, sản phẩm khác [34].
1.3.2. Phương pháp vi sinh vật
Cơ sở của phương pháp vi sinh vật là tiến hành lên men trong điều kiện kị
khí hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic. Trong quá trình
chuyển hóa các vi sinh vật nhờ có hệ enzym lactat dehydrogenase chuyển pyruvat
thành acid lactic.
Việc bổ sung các chất đệm Magnesi vào môi trường lên men dần dần hoặc
ngay từ ban đầu sẽ tạo ra muối Magnesi lactat tan trong môi trường lên men. Sau
khoảng thời gian thích hợp tiến hành thu dịch lên men, xử lý dịch lên men, kết tinh
và tinh chế để thu sản phẩm. Thực chất phương pháp lên men vi sinh vật tạo
Magnesi lactat là quá trình lên men tạo acid lactic.
Phương pháp sinh tổng hợp Magnesi lactat từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm

hơn so với phương pháp tổng hợp hóa học như:
- An toàn với môi trường do các dư phẩm của quá trình được tận dụng để
làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc hoặc phân bón.
- Nhiệt độ sản xuất thấp, năng lượng sản xuất thấp, thiết bị và quy trình sản
xuất đơn giản, dễ áp dụng trong điều kiện kinh tế Việt Nam.
- Tận dụng được các sản phẩm thừa của ngành thực phẩm, vậy nên giá
thành sản phẩm rẻ.
- Tạo được sản phẩm tinh khiết dạng Magnesi L – lactat [36].
1.4. Phương pháp bất động tế bào và ứng dụng
1.4.1. Nguyên tắc
Là phương pháp giữ hoặc cố định tế bào ở những vị trí xác định về mặt
không gian mà không làm thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng.


9

Các tế bào này có thể sử dụng nhiều lần và sử dụng liên tục.
1.4.2. Các phương pháp bất động tế bào
Có thể chia phương pháp bất động tế bào ra thành bốn phương pháp: phương
pháp liên kết với chất mang, phương pháp liên kết ngang, phương pháp bẫy và kết
hợp các phương pháp trên [17].
 Phương pháp liên kết với chất mang
Bản chất của phương pháp liên kết với chất mang là phương pháp liên kết
giữa các chất xúc tác sinh học với các chất mang không tan được trong nước thông
qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt.
Đặc tính của vật liệu làm chất mang là có độ cứng cơ học, tính chất vật lý - hóa học
ổn định và có sự ổn định về mặt sinh học, đặc biệt là chúng không gây độc với tế
bào vi khuẩn. Chất mang thường dùng các polysaccharid không tan trong nước
(cellulose, dextran, dẫn xuất agarose…), các protein (gelatin, albumin…), các
polymer nhân tạo (polystyrene, nhựa trao đổi ion, polyurethane…) và các vật liệu

vô cơ (thủy tinh, ceramic…).
Phương pháp đồng hóa trị được sử dụng thường xuyên để bất động các
enzym, tuy nhiên ít dùng trong cố định tế bào vì tác nhân cần cho sự hình thành liên
kết đồng hóa trị thường là các chất độc với tế bào [17].
 Phương pháp tạo liên kết ngang
Phương pháp này không sử dụng chất mang để cố định tế bào mà mỗi tế bào
được liên kết với tế bào khác bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet, tác nhân
tạo liên kết ngang như glutaraldehyd, các diisocyanat…Các nhóm amino của
glutaraldehyd tạo các liên kết ngang liên kết các tế bào với nhau, các tác nhân nhóm
diisocyanat (toluen diisocyanat…) tạo liên kết ngang bằng cách liên kết nhóm urea
với các nhóm amino. Trong các chủng vi sinh vật thì Escherichia coli (là chủng vi
khuẩn có enzym aspertase hoạt tính cao) và Bacillus coagulans được cố định theo
phương pháp này [16].
 Phương pháp bẫy


10

Dựa vào tính chất vật liệu dùng để bẫy các tế bào vi khuẩn mà phương pháp
này được phân chia thành bốn dạng, đó là: dạng lưới, dạng nang nhỏ
(microcapsule), dạng liposome và dạng màng.
Với dạng lưới các chất xúc tác sinh học được bẫy trong các khuôn gel của
nhiều loại polymer khác nhau. Ở dạng microcapsule tế bào được gói trong các màng
polymer thẩm thấu nhân tạo tạo thành các nang nhỏ và dạng liposom các tế bào vi
sinh vật được bẫy trong các màng chất lỏng tạo ra từ hợp chất amphiphatic. Với
dạng màng chất xúc tác sinh học tách riêng khỏi môi trường bằng các màng siêu
lọc, màng lọc hoặc bằng các sợi rỗng [17]. Nguồn vật liệu tự nhiên là các
polysaccharide như: alginat, k-carrageenan, agar… trong đó alginat được sử dụng
phổ biến. Một số nghiên cứu gần đây về gel Calci-pectat cũng là một sự lựa chọn
mới cho cố định tế bào.

1.4.3. Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào
 Sản xuất kháng sinh
Kháng sinh là nhóm thuốc rất cần thiết cho cuộc sống con người và hầu hết
các kháng sinh thu được bằng con đường lên men vi sinh vật. Theo các phương
pháp truyền thống, các kháng sinh thường được sản xuất bằng phương pháp lên
men mẻ trong các bình lên men. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu suất sản xuất kháng
sinh người ta đã tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục. Điều này
khó có thể thực hiện được với các tế bào tự do, khi đó bất động tế bào trở thành giải
pháp hiệu quả nhất. Bằng phương pháp cố định tế bào nhiều kháng sinh đã được sản
xuất trên quy mô công nghiệp như: oxytetracylin, neomycin, cephalosporin,
pencicillin…
Ví dụ: để tổng hợp ampicilin và amoxicillin [hai kháng sinh được bán tổng
hợp từ hợp chất acid 6 - amino penicillanic (6-APA)] người ta tiến hành như sau:
cho penicillin G chảy qua các tế bào E. coli hoặc B. megatherium (có hoạt tính
enzym penicillinamidase cao) cố định trên các chất mang khác nhau, các vi sinh vật
này sẽ thủy phân penicillin G tạo hợp chất 6 – APA và từ 6 – APA tổng hợp nên
amoxicilin và ampicilin [8].


11

 Sản xuất các acid hữu cơ
Bên cạnh phương pháp tổng hợp hóa học, thì hiện nay một số acid hữu cơ
được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như: acid citric, acid lactic, acid
acetic… Ví dụ, để sản xuất acid citric hiện nay chủ yếu sử dụng các tế bào
Aspergillus niger trên các cơ chất khác nhau là alginat, agarose, polyacryamid, hoặc
có thể cho hấp phụ lên cột bọt polyurethane, bẫy vào các sợi rỗng và dùng các chất
mang cellulose xốp.… theo phương pháp lên men mẻ. Tuy nhiên, điểm bất lợi của
phương pháp này là khó có thể cung cấp đầy đủ oxy cho tế bào nên các tế bào tạo ra
dịch có tính nhớt trong quá trình phát triển, còn khi sử dụng phương pháp bất động

tế bào, việc vận chuyển oxy thuận lợi hơn nên hoạt động của bình lên men không bị
ảnh hưởng bởi tính nhớt này và làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất acid citric.
Lên men bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ
khác như: acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic và acid butyric.
 Sản xuất enzym
Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzym, đặc biệt phương pháp bất
động tế bào là kỹ thuật thích hợp nhất để sản xuất các enzym ngoại bào.
Trong số các enzym thì hai enzym thủy phân tinh bột là α-amylase và glucoamylase được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Trong phương pháp bất động tế bào,
tế bào vi sinh vật được bẫy vào trong polyacrylamid, Ca-alginat, agar và vài
polymer khác. Ví dụ, để sản xuất α – amylase người ta sử dụng tế bào Bacillus
cereus được bất động vào cơ chất Ca-alginat, sau đó các hạt được nhồi vào thiết bị
phản ứng tầng sôi để sản xuất liên tục α-amylase, với cách làm này hiệu suất phản
ứng tăng gấp 24 lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do. Ngoài ra, có thể sản xuất
α-amylase từ các tế bào biến đổi của Escherichia coli bất động trong k-carrageenan
có bổ xung thêm glycin. Ngoài 2 enzym trên các enzym quan trọng khác cũng được
nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như: invertase, lipase,
protease, Cyclodextrin-glycosyl-transferase (CGTase), cellulose, β- galactadase,
xylanase, dextron sucrase [20].
 Sản xuất alcol


12

Vi sinh vật được sử dụng phổ biến để sản xuất alcol bằng phương pháp bất
động tế bào là nấm men Saccharomyces cerevisiae và Zymomonas mobilis.
Phương pháp sử dụng là phương pháp bẫy, các tế bào nấm men S. cerevisiae
được bẫy trong gel Calci alginat, chúng được giữ trong mạng lưới gel để không bị
khuếch tán vào môi trường, trong khi đó glucose vẫn xâm nhập được vào trong gel
để biến đổi thành alcol etylic và CO2 đi ra ngoài. Ưu điểm của phương pháp này là:
hiệu xuất lên men đạt được cao hơn do duy trì được xúc tác tự nhiên của các enzym

trong tế bào, tế bào ít bị ảnh hưởng có hại của môi trường và quá trình lên men diễn
ra nhanh với dung dịch đường ở nồng độ cao [8], [9].
1.5. Alginat
Alginat là thuật ngữ thường để chỉ acid alginic, muối và các dẫn chất của acid
này. Alginat thường có nhiều ở các loài tảo nâu, rong mơ dưới dạng muối Ca2+,
Mg2+ và Na+, tham gia vào cấu trúc thành và màng tế bào.
1.5.1. Cấu trúc của alginat [37]
Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc
uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M).

Hình 1.4. Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic acid
Hai gốc uronic này có cấu tạo dạng ghế nhưng cấu hình khác nhau, acid
mannuronic có cấu hình C41, còn acid guluronic có cấu hình C14.

Hình 1.5. Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic acid


13

Hai monome gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid nhưng các liên kết
này không phải ngẫu nhiêu mà thành block:
Block homopolyguluronic:
Block homopolymannuronic:
Block liên hợp:

GGGG
MMMM

MGMG

Hình 1.6. Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG
1.5.2. Tính chất của alginat
 Độ hòa tan
Các muối kim loại hóa trị I (Na+, K+…), muối amoni, muối của các amin phân
tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước. Các muối của acid alginic với
các kim loại đa hóa trị ( Ca2+, Ba2+,… trừ Mg2+) không tan được trong nước. Các
muối alginat hòa tan được trong các dung môi thân nước như alcol, ceton…và dễ
hòa tan hơn khi đun nóng.
 Độ nhớt
Natri alginat khi tan trong nước sẽ tạo dung dịch có độ nhớt trong khoảng từ
10 – 3500 cps. Độ nhớt này tỷ lệ thuận với khối lượng phân tử trung bình của
alginat và nồng độ alginat sử dụng và giảm khi tăng nhiệt độ. Độ nhớt của dung
dịch alginat còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion kim loại trong dung dịch.
 Quá trình tạo gel của alginat
Khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II và III dung dịch alginat sẽ tạo gel,
các gel được hình thành ở các mức nhiệt độ dưới 1000C, chúng không tan chảy khi
đun nóng. Do có cấu hình dặc biệt nên đoạn mạch GGGG tạo thành dạng gấp nếp
như một cái vỉ trứng, khoảng không gian giữa các vỉ khi xếp lên nhau tương tự như


14

chỗ đặt quả trứng. Các ion Ca2+ khớp vào khoảng trống này liên kết với các nhóm
chức carboxyl và các nguyên tử oxy để hình thành gel Calci alginat.

Hình 1.7. Liên kết của ion Ca2+ với alginat.
Độ bền của gel phụ thuộc:
- Chiều dài của các chuỗi tham gia liên kết (khối lượng phân tử.
- Tỷ lệ G/M và trình tự sắp xếp các gốc urat: block G càng nhiều thì gel càng bền.
- Ái lực liên kết polymer càng lớn thì gel càng bền.

1.6. Các nghiên cứu về Magnesi lactat
Peter Johannes Marie Baets và các cộng sự (2013) đã sản xuất Magnesi
lactat bằng cách lên men vi khuẩn sinh lactic B. coagulans trong môi trường chứa
nguồn nguyên liệu thực vật, lá cây Cọ dầu nhiệt đới (Elaeis guineen-sis và Elaeis
oleifera), có chứa 0,5% đến 9,5% carbohydrat và Magnesi hydroxyd để thu được
9,5% Magnesi lactat [38].
Jan Van Krieken và các cộng sự (2007) đã điều chế Magnesi lactat bằng cách
sử dụng một trong các hợp chất của Magnesi là Magnesi hydroxyd, Magnesi oxyd,
Magnesi carbonat duy trì môi trường lên men các carbohydrat ở pH 5 – 7 với
chủng vi khuẩn thích hợp [29].
Jan Van Krieken và các cộng sự (2005) đã thu được Magnesi lactat rất tinh
khiết từ dịch lên men sử dụng các nguồn carbohydrat tương đối thô như sucrose,
tinh bột (lỏng), rỉ đường, sử dụng Magnesi hydroxyd làm tác nhân trung hòa [28].
Ben - Yoseph Eliahu, Kogan Leni, Wajc Samuel (2000) sản xuất Magnesi
lactat từ vi sinh vật bằng phương pháp lên men đường, điều chỉnh pH về 6,5 bằng
cách thêm Magnesi hydroxyd, nhiệt độ 50°C [19].
Aharon Meir Eyal, Rod Fisher (1998) sản xuất Magnesi lactat thông qua việc
sinh tổng hợp acid lactic trong quá trình lên men của một chủng vi khuẩn thuộc chi


15

Lactobacillus,

loài

Lactobacillus

delbrueckii,

hoặc

Lactobacillus

acidophilus. Nguyên liệu chính là các carbohydrat cùng với các nguồn dinh dưỡng
phù hợp, độ pH của dịch lên men thường được duy trì trên 4,5, tốt nhất trong
khoảng 6,0 - 6,5 bằng các muối cacbonat, bicacbonat của các kim loại kiềm thổ
Calci hoặc Magnesi [15].
Kolomaznik và các cộng sự (1995) nghiên cứu sản xuất Magnesi lactat bằng
cách bổ sung Magnesi oxyd, Magnesi hydroxyd hoặc Magnesi carbonat trong quá
trình lên men lactose tại pH 4,5 – 5,03 [31].
Ngoài các nghiên cứu về sinh tổng hợp, Magnesi lactat còn được tổng hợp
bằng phương pháp hóa học dùng làm nguyên liệu trong công nghệ thực phẩm, tổng
hợp Magie lactat từ acid lactic và Magnesi hydroxyd [14], [21].
Ở Việt Nam đã có các nghiên cứu được Nội sản xuất Magnesi lactat được
tiến hành tại trường Đại học Dược Hà Nội bằng cách lên men các vi khuẩn lactic từ
nguồn nguyên liệu hydratcarbon và bổ sung MgCO3 vào môi trường nuôi cấy.
Nghiên cứu đã lựa chọn được pH thích hợp và phương thức bổ sung MgCO3 trong
quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophillus để điều chế Magnesi lactat,
đồng thời kiểm tra tiêu chuẩn, định tính, định luợng sản phẩm Magnesi lactat tạo
thành [11] .
Mặc dù các nghiên cứu cố định tế bào vi khuẩn L. acidophilus trong gel
Calci alginat cũng như tổng hợp Magnesi lactat bằng cách lên men vi khuẩn sinh
lactic đã được thực hiện ở cả Việt Nam cũng như trên thế giới, song ứng dụng
phương pháp bất động tế bào vào lĩnh vực này thì ở Việt Nam chưa có công bố liên
quan nào. Vì vậy các nghiên cứu được thiết kế với mục đích bước đầu ứng dụng tế
bào cố định vào lên men vi khuẩn L. acidophilus để tổng hợp Magnesi lactat.


16

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị máy móc
 Chủng giống: Lactobacillus acidophilus (ATCC 4653) – Bộ môn Công
Nghiệp Dược
 Nguyên liệu, hoá chất
Bảng 2.1 Nguyên liệu và hoá chất sử dụng
Sodium alginat

Cao thịt

Glucose

Pepton

Sữa béo

Cao nấm men

Natri clorid

Amoni sulfat

CaCO3

K2HPO4

KI

MgSO4.7H2O

Acid sulfuric

MnSO4.4H2O

Calci clorid

CH3COONa

Natri thiosulfat

MgCO3

 Máy móc thiết bị
Bảng 2.2 Máy móc, thiết bị và dụng cụ sử dụng
Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Tủ cấy

Sanyo (Nhật)

Nồi hấp

ALP (Nhật)

Tủ ấm CO2

Sanyo (Nhật)

Tủ lạnh

Daewoo (Hàn Quốc)

Cân kỹ thuật

Sartorius (Đức)

Cân phân tích

Satorius (Đức)

Tủ ấm thường

Memmert (Đức)


17

Tủ sấy

Daihan (Hàn Quốc)

Bể điều nhiệt

HHS (Trung Quốc)

Đĩa petri, buret, bình định mức, pipet, pipetman, ống nghiệm, đầu côn, dụng cụ pha

chế…

 Một số môi trường sử dụng
-

Môi trường MRS lỏng
Bảng 2.3 Môi trường MRS lỏng
STT

Thành phần

Khối lượng STT

Thành phần

Khối lượng

1

Pepton

1,00g

6

CH3COONa.3H2O

0,50g

2

Cao thịt

1,00g

7

K2HPO4

0,20g

3

Cao nấm men

0,50g

8

MgSO4.7H2O

0,02g

4

Glucose

2,00g

9

MnSO4.4H2O

0,005g

5

Triamoni citrate

0,20g

10

Nước máy vđ

100ml

Điều chỉnh pH=6,3-6,5

-

Môi trường lên men
Bảng 2.4: Môi trường lên men

-

STT

Thành phần

Khối lượng STT Thành phần

Khối lượng

1

Glucose

7,0g

6

MnSO4

0,001g

2

Sữa béo

2,6g

7

FeSO4

0,001g

3

Cao nấm men

1,3g

8

MgSO4

0,03g

4

(NH4)2SO4

0,2g

9

Nước máy vđ

100ml

5

KH2PO4

0,25g

Điều chỉnh pH=6,3-6,5

Môi trường MRS đặc = MRS lỏng + thạch (2%)

 Các dung dịch sử dụng
Các dung dịch được pha theo hướng dẫn của Dược Điển Việt Nam IV