Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cỏ seo gà

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



PHAN THỊ THANH MAI

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT
PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




PHAN THỊ THANH MAI

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT
PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Người hướng dẫn:
PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
Nơi thực hiện:
Viện kiểm nghiệm nghiên cứu
Dược và trang thiết bị y tế Quân đội



HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương
pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ Cỏ seo gà”, ngoài
sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Thái Nguyễn
Hùng Thu – Trưởng bộ môn Hóa phân tích và độc chất, người đã dành nhiều thời
gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS. Nguyễn Duy Chí – Chủ nhiệm
Khoa kiểm nghiệm Hóa học – Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang thiết bị
y tế Quân đội, người đã rất nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến DS. Nguyễn Hải Đường và các anh chị
Khoa kiểm nghiệm Hóa học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Khoa nghiên cứu kiểm
nghiệm Dược liệu cùng các cán bộ Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang
thiết bị y tế Quân đội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là

những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi tận tình
trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Phan Thị Thanh Mai



MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Thành phần hóa học 2
1.1.3. Tác dụng dược lý 4
1.1.4. Công dụng 5
1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 5
1.2.1. Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid 5
1.2.2. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid 6
1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-
D-glucopyranosid] 7
1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd 8
1.2.5. Kaempferitrin 9
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

1.3.2. Máy HPLC 11
1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 12
1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC 13
1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 15
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17
2.1.2. Dung môi, hóa chất 17
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 17
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử 19
2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu 20
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 20
2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích 21
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 23
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24
3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 24
3.1.1. Độ ẩm của dược liệu 24
3.1.2. Hiệu suất chiết cắn toàn phần 24
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 25
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký 25
3.2.2. Lựa chọn pha động 26
3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng 26
3.2.4. Lựa chọn bước sóng phát hiện 26
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC
KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 29
3.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ
TRONG CỎ SEO GÀ 33
3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký 33

3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp 35
3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 37
3.4.4. Độ đúng 41
3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 44
3.5. SƠ BỘ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ
SEO GÀ 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47
KẾT LUẬN 47
ĐỀ XUẤT 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AEPM: Dịch chiết Cỏ seo gà (aqueous extracts of P.multifida Poiret)
DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector)
DMSO: Dimethyl sulfoxid
HDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng cao mang Cholesterol (High Density
Lipoprotein Cholesterol)
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid
Chromatographic)
HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High-Performance
Liquid Chromatographic – Mass Spectrometry)
IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
LDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng thấp mang Cholesterol (Low Density
Lipoprotein Cholesterol)
LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)
NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

S/N: Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)
SKĐ: Sắc ký đồ
STT: Số thứ tự
UV – VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible)








DANH MỤC BẢNG

Danh mục các bảng
Trang
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu
24
Bảng 3.2. Một số thông số trên phổ DAD của các chất nghiên cứu
28
Bảng 3.3. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lưu
33
Bảng 3.4. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic
34
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM3
35
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM12
36
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM18
36

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM15
37
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM9
37
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM3
38
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM12
38
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM18
39
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM15
40
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM9
40
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với PM3
41
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với PM12
42
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với PM18
42
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với PM15
43
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng với PM9
43
Bảng 3.20. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 5 hợp chất phân
tích
44
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (g/mL)
44
Bảng 3.22. Kết quả xác định nồng độ chất phân tích trong các dung

dịch thử
45
Bảng 3.23. Kết quả xác định hàm lượng các chất có trong cây Cỏ seo
gà
46
DANH MỤC HÌNH

Danh mục các hình
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC
11
Hình 1.2. Cấu tạo detector mảng diod (DAD)
15
Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm
với các hệ dung môi khác nhau
25
Hình 3.2. Phổ DAD của các chất nghiên cứu
27
Hình 3.3. Phổ UV – VIS của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo
gà
27
Hình 3.4. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu
29
Hình 3.5. SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ seo gà
29
Hình 3.6. SKĐ của hợp chất PM3 phân lập được từ Cỏ seo gà
30
Hình 3.7. SKĐ của hợp chất PM12 phân lập được từ Cỏ seo gà
30
Hình 3.8. SKĐ của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo gà

30
Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập được từ Cỏ seo gà
31
Hình 3.10. SKĐ của hợp chất PM9 phân lập được từ Cỏ seo gà
31
Hình 3.11. Kết quả so sánh phổ DAD của pic tương ứng với thời gian
lưu của chuẩn và thử PM3
32
Hình 3.12. Kết quả chồng phổ DAD của pic một số chất nghiên cứu
trên sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn và của mẫu thử
32
Hình 3.13. SKĐ của mẫu trắng
34




1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, trên thế giới, nhu cầu về dược liệu, thuốc y học cổ truyền và hoạt
chất chiết xuất từ dược liệu có xu hướng ngày càng tăng, nhất là ở các nước đang
phát triển. Nền y học cổ truyền của nước ta có một lịch sử phát triển lâu đời và
phong phú. Từ xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý để phòng
bệnh và chữa bệnh. Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, từ những kinh nghiệm do nhu
cầu của thực tiễn, số lượng cây, con được đưa vào làm thuốc ngày càng tăng.
Cỏ seo gà, còn được gọi là Phượng vĩ, Phượng vĩ thảo, Cỏ luồng có tên khoa
học là Pteris multifida Poir., họ Seo gà (Pteridaceae). Theo y học cổ truyền, Seo gà
có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lương huyết, lợi thấp,
chỉ lỵ được dùng chữa kiết lỵ mạn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết

niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở, ngứa, bệnh ngoài da,
ung thư [3].
Tuy nhiên, cho đến nay có rất ít công trình khoa học nghiên cứu tổng thể về
loài thực vật này. Năm 2012, NCS. Nguyễn Duy Chí đã nghiên cứu, phân lập được
một số hợp chất từ Cỏ seo gà thu hái tại Ba Vì, Hà Nội. Để đánh giá tiềm năng và
góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu, đề tài “Bước đầu nghiên cứu xây dựng
phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ Cỏ seo
gà” đã được thực hiện nhằm các mục tiêu:
1. Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã
phân lập được từ cây Cỏ seo gà bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng các
hợp chất trên trong mẫu Cỏ seo gà thu hái được.






2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Pteris multifida Poir., họ Seo gà (Pteridaceae).
Tên đồng nghĩa: Pteris serrulata L.f.
Tên khác: Phượng vĩ thảo, cỏ luồng [3], theo gà, phượng vĩ [5].
Tên nước ngoài: Spider brake (Anh) [3].
Cây thảo, cao 20-40 cm, có thể hơn [3]. Thân rễ nằm ngang dưới mặt đất,
chừng 3-4 cm, hình cong queo, sần sùi, nhiều mấu, hơi cứng, vị hơi ngọt, đắng và
tê, mùi thơm hắc [5]. Lá mọc thẳng từ thân rễ, xẻ sâu hình lông chim hai lần, nhẵn,

gân lá rõ, có hai loại: lá không sinh sản ngắn, màu lục nhạt hơi vàng, các thùy to
nhỏ không đều mọc đối nhau, mép hơi khía răng, có đầu tròn, riêng thùy tận cùng
thuôn dài thành mũi nhọn; lá sinh sản dài, màu đen sẫm gồm các thùy hình dải
thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt, mép lá gập lại mang túi bào tử dày đặc ở
trong; cuống lá rất dài, màu nâu nhạt ở gốc, hơi vàng ở phía trên [3].
Bào tử hình bốn cạnh, hơi tròn, màu vàng nhạt, có nhiều u sần nhỏ [3].
Mùa sinh sản: tháng 5 – 10 [3].
Cỏ seo gà mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nước ta, thường gặp nhất
ở trên những vách đá, vách đất, xung quanh thành giếng, ven đường đi, những nơi
thoáng ẩm và mát. Còn thấy mọc cả ở Trung Quốc, Nhật Bản [5].
Bộ phận dùng làm thuốc của cây là thân rễ và lá [5].
1.1.2. Thành phần hóa học
Năm 1996, từ Pteris multifida Poir. (Polypodiaceae), Woerdenbag HJ và cộng
sự đã phân lập bằng sắc ký cột silica gel thu được 2 hợp chất diterpen là: entkauran-
2β, 16α-diol và ent-kaur-16-en-2β, 15α-diol. Cả 2 chất này đều có tác dụng gây độc
với tế bào u báng Ehrlich [37].
Năm 2006, Hao-Bin Hu, Xu-Dong Zheng và Hong Cao đã phân lập được 2
hợp chất xanthon glycosid mới là 1-hydroxy-4,7-dimethoxy-8-(3-methyl-2-
butenyl)-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-[β-D-glucopyranosyl-(13)]-β-
3

Dglucopyranosylxanthon và 1,3-dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)-6-O-
α-L-rhamnopyranosyl-(12)-[β-D-glucopyranosyl-(13)]-β-D-
glucopyranosylxanthon cùng với 6 hợp chất khác là quercetin,
dehydrogoniothalamin, vanillin, dihydroechioidinin, saucerneol D, licoagrochalcon
D [20].
Năm 2008, Xu-dong Zheng, Hao-bin Hu, Huai-sheng Hu đã phân lập được
hợp chất neolignan glycosid mới là Multifidosid A: rel-(7S,8S)-Δ7'-2,9'-Dihydroxy-
5'-methoxy-7,3'-dioxy-8,4'-neolignan-4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-
glucopyranosid và 4 chất khác là scaphopetalon, (−)-isolariciresinol 3α-O-β-

apiofuranosyl-(1→2)-O-β-glucopyranosid, 6,7-dihydroxy-3'-methoxy-4',5'-
methylenedioxyisoflavon 6-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid,
polyporusteron I [39].
Năm 2008, Liva Harinantenaina và cộng sự đã phân lập được 4-caffeoyl
quinic acid 5-O-methyl ether, (2R,3R)-pterosin L 3-O-β-D-glucopyrannosid, β-
sitosterol β-D-glucopyranosid, apigenin 7-O-β-D-glucopyranosid, luteolin 7-O-β-D-
glucopyranosid, sucrose, caffeic acid, pterosin C 3-O-β-D-glucopyranosid, pterosid
C, 4,5-dicaffeoyl quinic acid, pterosid A, wallichosid và (2S)-5,7,3',5'-
tetrahydroxyflavanon [26].
Theo Wang WS, Wang ZQ, Zhou YW (2008), từ dịch chiết methanol của
Pteris multifida, sau khi phân lập, tinh chế bằng sắc ký cột pha thuận, sắc ký lớp
mỏng và sắc ký cột nhồi sephadex, đã thu được một sesquiterpen glycosid là
pterosin C-3-O-β-D-glucosid và 6 flavonoid là: apigenin, luteolin, apigenin-7-O-β-
D-glucosid, apigenin-7-O-β-D-glucosyl-4'-O-α-L-rhanrnosid, apigenin-4'-O-α-L-
rhanrnosid, luteolin-7-O-β-D-glucosid [36].
Năm 2008, Xin Ge và cộng sự đã phát hiện 6 hợp chất mới, trong đó có 3 hợp
chất ent-kauran diterpenoid là pterokauran M1, pterokauran M2, pterokauran M3 và
3 hợp chất C14 pterosin-sesquiterpenoid là multifidosid A, multifidosid B,
multifidosid C đồng thời cũng phân lập được 18 diterpenoid và sesquiterpenoid
khác đã biết [38].
4

Jicheng Shu và cộng sự (2012) đã phân lập được 2S,3S-acetylpterosin C và 2
hợp chất pterosin sesquiterpen mới là: 2R,3R-13-hydroxy-pterosin L 3-O-β-D-
glucopyranosid và 2R,3S-acetylpterosin C [15].
1.1.3. Tác dụng dược lý
Theo T.C. Wang, M.C. Ti, S.C. Lo, C.C. Yang (2007) dịch chiết Pteris
multifida có tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH, hydroxyl và có khả năng khử [34].
Năm 2008, Xin Ge, Guan Ye, Ping Li, Wen-Jie Tang, Jin-Li Gao và Wei-Min
Zhao đã phát hiện ra 6 hợp chất mới ở loài Pteris multifida, trong đó multifidosid A

và multifidosid B được chứng minh có tác dụng ức chế đáng kể đối với tế bào
HepG2 (ung thư biểu mô tế bào gan) và K562 (ung thư máu). Từ kết quả của nghiên
cứu này, có thể sử dụng Pteris multifida như thuốc dân gian để điều trị ung thư [38].
Harinantenaina L, Matsunami K, Otsuka H. (2009) nghiên cứu in vitro đưa ra
kết luận: dịch chiết P. multifida Poiret có tác dụng chống oxy hóa thể hiện ở khả
năng thu dọn các gốc tự do như: anion superoxid, 2,2'-azinobis (3
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); tạo phức chelat với các ion kim loại chuyển
tiếp (Fe
2+
, Cu
2+
); chống lại sự kích thích của FeCl
2
/H
2
O
2
lên quá trình peroxyd
hóa acid linoleic, phá vỡ phản ứng dây chuyền của sự peroxyd hóa lipid nên có tác
dụng chống peroxyd hóa lipid [21].
Năm 2010, Wang TC, Lin CC, Lee HI, Yang C, Yang CC đã phát hiện Cỏ seo
gà có tác dụng làm hạ lipid máu trên chuột ăn chế độ giàu cholesterol: giảm
triglycerid, LDL-Cholesterol và tỷ lệ LDL-Cholesterol/HDL-Cholesterol huyết
tương, giảm cholesterol, triglycerid gan; đồng thời có tác dụng tăng đào thải lipid và
các sản phẩm chuyển hóa qua đường tiêu hóa [35].
Theo Kuang-Ping Lan và cộng sự (2011), dịch chiết P. multifida Poiret
(AEPM) có tác dụng thu dọn các gốc tự do α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, hydroxyl,
Fe
2+
và khả năng khử mạnh. Các chất chống oxy hóa trong AEPM bao gồm acid

ascorbic, β-caroten, tocopherol (dạng α-, β- và δ-) và phenol toàn phần, trong đó
thành phần chống oxy hóa chính là phenol toàn phần. Đây là các chất chống oxy
hóa hiệu quả, sự có mặt và lượng chất ảnh hưởng đến tác dụng chống oxy hóa.
5

Dựa trên những kết quả thu được từ nghiên cứu này, AEPM là chất bảo vệ có thể
giúp cơ thể con người chống lại sự phá hủy của quá trình oxy hóa [22].
Năm 2013, Yu C, Chen J, Huang L. đã công bố nghiên cứu về tác dụng chống
ung thư của flavonoid toàn phần trong Pteris multifida Poir. trên chuột mang khối u
H22, kết luận rằng các flavonoid toàn phần này có tác dụng ức chế rõ ràng trên khối
u H22 được cấy; cơ chế hoạt động của nó có thể liên quan với việc cải thiện chức
năng miễn dịch và tăng cường khả năng chống oxy hóa ở chuột [42].
1.1.4. Công dụng
Toàn cây seo gà có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt,
lương huyết, lợi thấp, chỉ lỵ. Rễ có vị ngọt, đắng hơi tê, mùi thơm hắc [3].
Toàn cây seo gà được dùng chữa kiết lỵ mạn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột,
viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở,
ngứa, bệnh ngoài da. Nước sắc lá seo gà có tác dụng chữa bỏng [3].
Rễ, lá sao vàng, tán nhỏ đun với dầu vừng thành thuốc dầu bôi chữa một số
bệnh ngoài da của trẻ em [5].
Ở Trung Quốc, Pteris multifida Poir. đã được sử dụng chủ yếu như một loại
thuốc dân gian truyền thống để điều trị bệnh eczema (chàm), nôn ra máu, viêm ruột,
tiêu chảy, lỵ trực trùng và có tác dụng chống ung thư và kháng khuẩn [14].
Pteris multifida Poir. có tác dụng hạ sốt, giải độc, chống viêm, kháng sinh,
giải nhiệt, tác dụng chống gây đột biến và chủ yếu được sử dụng như loại thuốc dân
gian để điều trị bệnh tả, lỵ và trĩ nội [24].
1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ
1.2.1. Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid

Tên khoa học: Maltol-3-O-β-D-glucopyranoside.

6

Công thức phân tử: C
12
H
16
O
8
(M = 288,26 g/mol) [12].
1.2.1.1 Tính chất vật lý
Dầu màu nâu sẫm [30], IR ν
max
KBr
: 3350, 1650, 1620, 1260, 890, 705 cm
-1
[30],
[α]
D
= -50,0
o
(c = 0.36, CH
3
OH–H
2
O (5 giọt), 5 ml) [29].
1.2.1.2. Nguồn gốc
Theo [30], từ 10 kg lá Abies koreana (Pinaceae) phân lập được 54,6 mg
Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid.
Năm 2013, Djimtombaye BJ và cộng sự đã phân lập được Maltol-3-O-β-D-
glucopyranosid từ toàn cây Astragalus halicacabus [9].

Từ 3,0 kg phần trên mặt đất khô của cây Elsholtzia rugulosa (Lamicaeae)
phân lập được 52,2 mg Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [18].
Từ 12 kg bột dược liệu thô Drynaria fortunei phân lập được 11,5 mg Maltol-
3-O-β-D-glucopyranosid [25].
Từ 4 kg củ của cây Smilax bockii (Liliaceae) phân lập được 15 mg Maltol-3-
O-β-D-glucopyranosid [17].
980 g bột dược liệu khô cây Scleranthus uncinatus Schur.(Illecebraceae) phân
lập được 7,2 mg Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [29].
1.2.2. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid

Tên khoa học: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside-7-O-β-D-glucopyranoside.
Công thức phân tử: C
27
H
30
O
15
(M = 594 g/mol).
1.2.2.1. Tính chất vật lý
Chất rắn vô định hình, màu vàng. [α]
D
25
: -72
o
(c = 0,42, MeOH);
IR ν
max
(neat): 3400, 1654 cm
-1
[21].

7

1.2.2.2. Nguồn gốc
Năm 1997, Mohamed Sharaf và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid từ một số loài
thuộc chi Cleome: Cleome amplyocarpa Barr. and Murb., C. brachycarpa Vahl., C.
chrysantha Decne., C. droserifolia (Forssk.) Del. [27].
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid còn được
tìm thấy ở trong cây Chenopodium murale [10].
Năm 2007, từ 8,1 kg toàn bộ cây tươi Sword Brake fern (Pteris ensiformis
Burm.) phân lập được 30,0 mg Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-
glucopyranosid với hàm lượng 2,62 ± 0,02 mg/g khối lượng cắn [43].
1.2.2.3. Tác dụng dược lý
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid có tác dụng
thu dọn các gốc cation tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và ABTS
.
+

(ABTS là 2,2
’
-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) [43].
1.2.2.4. Phương pháp định lượng
HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm×250 mm); pha động: methanol
và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%, tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút
và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [43].
1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-
D-glucopyranosid]

Tên khoa học: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-

2)-β-D-glucopyranoside].
Công thức phân tử: C
32
H
38
O
19
[24] (M = 726 g/mol).
8

1.2.2.1. Tính chất vật lý
Chất rắn vô định hình màu vàng, [α]
D
25
: -60
o
(c = 0.35, MeOH),
IR ν
max
(neat): 3410, 1650 cm
-1
[43].
1.2.3.2. Nguồn gốc
Từ 8,1 kg toàn bộ cây tươi Sword Brake fern (Pteris ensiformis Burm.) phân
lập được 37,5 mg Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-
(1-2)-β-D-glucopyranosid] với hàm lượng 2,41 ± 0,04 mg/g khối lượng cắn [43].
1.2.3.3. Tác dụng dược lý
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-
glucopyranosid] có tác dụng thu dọn các gốc cation tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl) và ABTS

.+
(ABTS là 2,2
’
-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic
acid) [43].
1.2.3.4. Phương pháp định lượng
HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm× 250 mm); pha động: Methanol
và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%, tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút
và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [43].
1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd
OH
OH
H
O
1
2
3
4
5
6

Tên khoa học: 3,4-dihydroxybenzandehyde.
Công thức phân tử: C
7
H
6
O
3
(M = 138,12 g/mol).
1.2.4.1. Tính chất vật lý

Bột màu trắng, T
o
nc
: 152-154
o
C [7].
1.2.4.2. Nguồn gốc
Năm 2007, Buniyamin A. Ayinde, Doris N. Onwukaeme và Eric K. Omogbal
phân lập được 3,4-dihydroxybenzandehyd từ vỏ thân cây Musanga cecropioides
9

R.Brown (Moraceae) [7].
Theo Nova Syafni và cộng sự, từ 6,0 kg lá; 4,3 kg thân cây; 1,5 kg rễ cây
Trichomanes chinense L. tương ứng phân lập được 35 mg (chiếm 0,002% khối
lượng cắn), 33 mg (0,003% khối lượng cắn) và 8 mg (0,0007% khối lượng cắn) 3,4-
dihydroxybenzandehyd [28].
Ngoài ra 3,4-dihydroxybenzandehyde còn được phân lập từ nấm Phellinus
gilvus (Schwein) Pat. (Hymenochaetaceae), lan Cremastra appendiculata (D. Don)
Makino (Orchidaceae) và lá Vitis vinifera L. (Vitaceae) [28].
1.2.4.3. Tác dụng dược lý
3,4-dihydroxybenzandehyd được tinh chế từ quả Xanthium strumarium có tác
dụng ức chế phosphotransferase của CKII với IC
50
khoảng 783 μM. Nồng độ 300
μM 3,4-dihydroxybenzandehyd gây ra ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào ung
thư U937 ở người. Nó có thể có khả năng ức chế bệnh ung thư thông qua sự ức chế
hoạt động CKII [23].
3,4-dihydroxybenzandehyd được phân lập từ lúa mạch Hordeum vulgare có
tác dụng ức chế sự oxy hóa phá hủy DNA và quá trình apoptosis gây ra bởi H
2

O
2
.
3,4-dihydroxybenzandehyd có tác dụng thu dọn gốc DPPH (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl), hydroxyl, ROS nội bào. Nó cũng tạo phức chelat với Fe
2+
[11].
1.2.5. Kaempferitrin

Tên khoa học: Kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside.
Công thức phân tử: C
27
H
30
O
14
(M = 578,53 g/mol) [13].
1.2.5.1. Tính chất vật lý:
Tinh thể hình kim sáng bóng màu vàng nhạt [19].
Tan trong ethanol hoặc DMSO, t
o
nc
: 201-203
o
C [13].
10

1.2.5.2. Nguồn gốc
Kaempferitrin được chiết xuất từ lá Hedyotis verticillata [6].
Năm 2006, Kaempferitrin được chiết xuất từ Celastrus orbiculatus, C.

punctatus, C. paniculatus, Trichosanthes cucumeroides [32].
Từ 1,5 kg bột dược liệu khô cây Lotus lalambensis phân lập được 180 mg
Kaempferitrin [19].
Năm 2009, Yerra Koteswara Raoa và cộng sự đã chiết xuất được 156 mg
Kaempferitrin từ 500 g bột lá khô Cinnamomum osmophloeum [40].
1.2.5.3. Tác dụng dược lý
Kaempferitrin có tiềm năng chống viêm, có tác dụng ức chế một số chức năng
của đại thực bào tham gia vào quá trình viêm. Nó ức chế lipopolysaccharid,
interferon (IFN)-γ – tạo ra nitric oxid (NO) và các cytokin [yếu tố hoại tử khối u
TNF-α và interleukin (IL)-12] [31].
Kaempferitrin có tác dụng hạ đường huyết và tiềm năng chống oxy hóa (có
phản ứng cao với DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), ức chế hoạt động
myeloperoxidase và làm giảm quá trình peroxy hóa lipid – gây ra bởi gốc ascorbyl
[8], [16].
Nghiên cứu này đưa ra bằng chứng về tác dụng kép của Kaempferitrin là: vừa
cải thiện đề kháng insulin bằng cách hoạt hóa đường dẫn truyền insulin kinh điển
vừa tăng tiết adiponectin (kích thích tế bào mỡ tiết adipokin) [41].
Kaempferitrin có tác dụng chống rối loạn lipid máu: làm giảm cholesterol toàn
phần, triglycerid và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C) huyết tương ở chuột bị rối
loạn lipid máu [33].
1.2.5.4. Phương pháp định lượng
HPLC pha đảo với cột C18 Hypersil BDS (4,6mm×100 mm, 3 μm); pha động:
Acetonitril (A) và nước chứa 0,1% acid trifluroacetic (B) với tỷ lệ A:B = 10:90,
chạy gradient tuyến tính tới 30:70 trong 0-20 phút, duy trì trong 10 phút; tốc độ
dòng: 0,8 mL/phút; bước sóng 265 nm; nhiệt độ cột: 25ºC; khoảng tuyến tính: 5 –
100 μg/mL; độ tìm lại: 98% [40].
11

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dưới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân
bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với
pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các
yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi
lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của
chất phân tích.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký
khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc
ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1].
1.3.2. Máy HPLC
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động,
bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào
pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi.








Thải
Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC.

Hệ thống cấp
dung môi
Bơm
Bộ phận

tiêm mẫu
Cột sắc ký
Detector
Hệ thu nhận xử lý dữ
liệu (máy ghi, máy tính)
12

1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký [1]
1.3.3.1. Thời gian lưu t
R

Thời gian lưu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến
detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất.
Thời gian chết t
M
là thời gian lưu của chất không bị lưu giữ.
Thời gian lưu hiệu chỉnh t
’
R
= t
R
– t
M
.
1.3.3.2. Hệ số dung lượng k
’

Hệ số k
’
mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột. Hệ số k
’
còn được
gọi là hệ số phân bố khối lượng giữa hai pha:
'
S S S
RM
M M M M
C V V
tt
kK
C V V t


   


Trong đó: V
S
: thể tích pha tĩnh
V
M
: thể tích pha động
C
S
: nồng độ pha tĩnh
C
M

: nồng độ pha động
K: hệ số phân bố
k
’
phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất của hai pha và tỷ lệ V
S
/V
M

Thường lựa chọn điều kiện sắc ký để k
’
= 1 – 5.
1.3.3.3. Hệ số chọn lọc


Hệ số chọn lọc  đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.
Thường chọn  dao động từ 1,05 – 2. Nếu  quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.
1.3.3.4. Độ phân giải R
S
Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột
sắc ký:
   
1 2 1 2
2 ( ) ( ) 1,18 ( ) ( )
(W W ) (W W )
R B R A R B R A
S
A B A B
t t t t
R





Trong đó: R
S
: độ phân giải
13

(t
R
)
A
, (t
R
)
B
: thời gian lưu chất A, B
W
A
, W
B
: lần lượt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic
W
1/2A
, W
1/2B
: lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
R
S

 1,5 thì 2 pic coi như tách nhau hoàn toàn.
1.3.3.5. Số đĩa lý thuyết
Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý
thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa
pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc
ký.
2
54,5
2
16
2/1













W
t
W
t
N
RR

Trong đó : W là chiều rộng pic ở đáy pic
W
1/2
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic
1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC
1.3.4.1. Định tính [1]
Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:
 So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lưu
của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
 So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm
chuẩn đối chiếu.
 So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector DAD
(có hệ số match  0,995).
 Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức
(IR) hoặc số khối (MS).
1.3.4.2. Định lượng [2]
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:
14

 Phương pháp chuẩn ngoại
 Phương pháp chuẩn nội
 Phương pháp thêm chuẩn
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp
chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu

thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất
trong mẫu thử.
Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.
 Chuẩn hóa 1 điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử.
Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:
X
XS
S
S
CC
S


Trong đó: C
X
: nồng độ chất thử
C
S
: nồng độ chất chuẩn
S
X
(H
X
): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử
S
S
(H
S
): diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến
hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm
chuẩn. Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H)
pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để
tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách:
 Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy
ra được nồng độ của nó.
15

 Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều
cao) pic với nồng độ chất cần xác định.
S = a  C + b
S: Diện tích pic
a: Độ dốc của đường chuẩn
b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung
C: Nồng độ của chất thử
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:
Sb
C
a



Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong đoạn
tuyến tính của đường chuẩn.
1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)
Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, được dùng
phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190
– 800 nm) của các chất phân tích. Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ

đường kính 1 mm, chiều dài 10 mm. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau
đó được tách ra thành các bước sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã
tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser. Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất
định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc.
Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy
sắc ký. Giám sát hai pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic.

Hình 1.2. Cấu tạo detector mảng diod (DAD).
16

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của
hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên
cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể
cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian.
Ứng dụng: Đầu dò DAD cho phép lựa chọn bước sóng phù hợp nhất cho phân
tích, có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của
các chất, ngoài ra detector DAD dùng để xác định độ tinh khiết của pic [1].