Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình bào chế liposome amphotericin b quy mô 20 lọ mẻ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ QUỲNH TRANG
MÃ SV: 1101529

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B QUY MÔ 20 LỌ/MẺ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ QUỲNH TRANG
MÃ SV: 1101529

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B QUY MÔ 20 LỌ/MẺ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. Ths. Nguyễn Văn Lâm
2. ThS. Nguyễn Tuấn Quang
Nơi thực hiện:
Bộ môn Bào chế

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:
ThS. Nguyễn Văn Lâm
ThS. Nguyễn Tuấn Quang
Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, cho em phương hướng, giúp em
giải quyết thắc mắc và khó khăn, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành
khóa luận.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật
viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để
em hoàn thành khóa luận.
Nhân đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các
phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy
bảo em trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp
đỡ, động viên em trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Đỗ Thị Quỳnh Trang


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 2

1.1.

1.2.

Amphotericin B ........................................................................................ 2
1.1.1.

Công thức hóa học ..............................................................................2

1.1.2.

Đặc tính lý hóa ....................................................................................2

1.1.3.

Tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng .................................................2

1.1.4.

Một số chế phẩm tiêm của AmB trên thị trường .................................3

Liposome Amphotericin B ..........................................................................3
1.2.1.

Khái niệm liposome .............................................................................3

1.2.2.

Thành phần L-AmB .............................................................................4

1.2.3.

Ưu- nhược điểm của L-AmB ...............................................................5

1.2.4.

Phương pháp bào chế .........................................................................6

1.2.4.1.

Phương pháp bào chế L-AmB thô………………………………6

1.2.4.2.

Đồng nhất và làm giảm KTTP L-AmB…………………….........8

1.2.4.3.

Đông khô L-AmB………………………………………………..9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16
2.1.

Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ......................................16
2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu .......................................................................16

2.1.2.

Nguyên liệu.......................................................................................16

2.1.3.

Phương tiện nghiên cứu ....................................................................16

2.2.

Nội dung nghiên cứu..................................................................................17

2.3.

Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................17
2.3.1.

Bào chế L-AmB .................................................................................17

2.3.2.

Giảm KTTP L-AmB bằng phương pháp siêu âm que .......................18


2.3.3.

Đông khô L-AmB ...............................................................................18

2.3.3.1.

Quy trình đông khô L-AmB……………………………………18

2.3.3.2.

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công thức và quy trình đến

đặc tính L-AmB đông khô……………………………………………………19
2.3.4.

2.4.

Phương pháp đánh giá chất lượng L-AmB .......................................19

2.3.4.1

Phương pháp đánh giá hỗn dịch L-AmB………………………19

2.3.4.2.

Phương pháp đánh giá L-AmB đông khô……………………...21

Điều kiện thí nghiệm..................................................................................22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................ 23
3.1.

Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố quy trình bào chế đến đặc tính L-

AmB……………………………………………………………………………..

3.2.

3.1.1.

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ cất quay đến đặc tính L-AmB ........23

3.1.2.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hydrat hóa đến đặc tính L-AmB 24

Khảo sát biện pháp làm giảm KTTP đến đặc tính L-AmB ...................25
3.2.1.

3.3.

23

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến đặc tính L-AmB .....25

Khảo sát ảnh hưởng của công thức và quy trình đến đặc tính L-AmB

đông khô……………………………………………………………………...........27
3.3.1.

Khảo sát ảnh hưởng của loại và tỷ lệ TD bảo vệ đến đặc tính L-AmB

đông khô ……………………………………………………………………...27
3.3.2.

Khảo sát ảnh hưởng của sự phân bố TD bảo vệ ở 2 bên màng đến đặc

tính L-AmB đông khô…...…………………………………………………………...32

3.3.3.

Khảo sát ảnh hưởng tốc độ làm lạnh đến đặc tính L-AmB đông

khô.....................................................................................................................34
3.4.

Đề xuất quy trình đông khô L-AmB ........................................................37

3.5.

Bàn luận………………………………………………………………….38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 40


DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
Từ/ cụm từ đẩy đủ

STT

Viết tắt

1

AmB

2

AmBD

3

AUC

4

BP

5

Chol

Chol

6

Cmax

Nồng độ đỉnh

7

DC

8

DĐVN

9

DSC

Quét nhiệt lượng vi sai

10

ĐK

Đông khô

11

DM

Dung môi

12

DSPG

Distearoylphosphatidylglycerol

13

HSPC

Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

14

kl/kl

khối lượng/khối lượng

15

kl/tt

khối lượng/thể tích

16

KTTP

17

L-AmB

18

NSX

Nhà sản xuất

19

PDI

Chỉ số đa phân tán

20

TD

Tá dược

22

Te

Nhiệt độ eutecti

23

Tg’

Nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh

24

TKHH

25

USP

Dược điển Mỹ

27

XRD

Nhiễu xạ tia X

Amphotericin B
Amphotericin B desoxycholat
Diện tích dưới đường cong
Dược điển Anh

Dược chất
Dược điển Việt Nam

Kích thước tiểu phân
Liposome Amphotericin B

Tinh khiết hóa học


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu

Tên bảng biểu

Trang

Bảng 1.1

Một số chế phẩm tiêm của AmB trên thị trường

03

Bảng 2.1

Nguyên liệu

16

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của tốc độ cất quay đến đặc tính L-AmB

23

Bảng 3.2

Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5

Bảng 3.6

Ảnh hưởng của thời gian hydrat hóa đến các đặc tính của LAmB
Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến các đặc tính của LAmB
Ảnh hưởng của TD bảo vệ đến các đặc tính của L-AmB ĐK
Ảnh hưởng của sự phân bố TD bảo vệ 2 bên màng lipid kép
đến các đặc tính của L-AmB ĐK
Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh đến các đặc tính của L-AmB
ĐK

24

25
27
33

35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

Số hiệu

Trang

Hình 1.1

Cấu trúc của L-AmB

03

Hình 1.2

Phân tử HSPC và DSPG

04

Hình 1.3

Giản đồ pha của hệ saccarose- nước

10

Hình 1.4

Cơ chế thay thế nước

12

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình 3.3

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tốc độ cất quay đến KTTP
và phân bố KTTP L-AmB
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian hydrat hóa đến
KTTP và phân bố KTTP L-AmB
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến
KTTP và phân bố KTTP L-AmB

23

24

26

Phổ DSC ghi nhận sự kết tinh nước khi làm lạnh mẫu LHình 3.4

AmB sử dụng TD bảo vệ khác nhau. Tốc độ làm lạnh

29

5oC/phút
Phổ DSC đánh giá sự nóng chảy của tinh thể nước đá khi
Hình 3.5

gia nhiệt mẫu liposome đông lạnh sử dụng TD bảo vệ khác

30

nhau
Hình 3.6
Hình 3.7
Hình 3.8

Phổ DSC của quá trình gia nhiệt mẫu L-AmB ĐK sử dụng
saccarose làm TD bảo vệ
Phổ XRD của saccarose và mẫu L-AmB ĐK
Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP mẫu L-AmB sau
ĐK

31
32
34

Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP trước

Hình 3.9

và sau ĐK với tốc độ làm lạnh khác nhau (M1: nito lỏng,

35

M2: quy trình thông thường)
Hình 3.10

Phổ DSC thu được khi làm lạnh nhanh L-AmB

36


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tình trạng nhiễm nấm xâm lấn là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây
tử vong trên bệnh nhân ung thư và bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Amphotericin Bmột hoạt chất kháng nấm phổ rộng là lựa chọn đầu tay trong điều trị tình trạng này.
Tuy nhiên, nó có thể gây ra một số tác dụng không mong muốn như suy thận hay
tan máu.

Liposome Amphotericin B- một hệ mang thuốc có chứa lipid của
Amphotericin B đã được nghiên cứu và cho thấy nhiều ưu điểm, như: làm giảm độc
tính cấp tính và tăng dung nạp lên 9 lần so với Amphotericin B desoxycholat. Nó
cũng làm tăng nồng độ trên mô và giảm nồng độ thuốc ở huyết tương, do đó tăng
hiệu quả điều trị [37].
Tại bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội, đã có một số nghiên cứu
bào chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp hydrat hóa film. Tuy nhiên,
các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào hoàn thiện công thức và bước đầu

tiến hành đông khô Liposome Amphotericin B. Để bổ sung thêm cho nghiên cứu
trước đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình bào
chế liposome Amphotericin B quy mô 20 lọ/mẻ” với 2 mục tiêu:
1.

Bào chế và khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố quy trình đến đặc

tính liposome Amphotericin B tạo thành.
2.

Xây dựng công thức và quy trình đông khô liposome Amphotericin B.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Amphotericin B

1.1.1.

Công thức hóa học

Công thức phân tử: C47H73NO17
Khối lượng phân tử: 924,08
pKa: 5,5; 10

1.1.2.

Đặc tính lý hóa

 Lý tính:
Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam, hầu như không tan trong nước (< 0,1
mg/ml ở 21oC), không tan trong cloroform hay ethanol; tan trong dimethyl
sulphoxyd, dimethylformamid và methanol [1].
 Hóa tính:
- AmB có hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm carboxylic tự do, do
đó có tính lưỡng tính, tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid clohydric
hoặc dung dịch kiềm [1].
- Dung dịch 0,0005% trong methanol ở vùng sóng từ 300-450 nm có 3 cực đại
hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,570,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,9 [2].
1.1.3.

Tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng

Dược lý và cơ chế tác dụng: AmB gắn vào ergosterol màng tế bào nấm tạo
kênh ion làm rò rỉ các ion K+, Ca++, Na+ và phân tử nhỏ từ trong tế bào nấm ra
ngoài, gây chết tế bào. AmB có tác dụng kìm nấm với: Absidia spp, Aspergillus
spp, Basidiobolus spp, Blastomyces dermatitis spp,…[27].
Chỉ định:
 Dạng tiêm tĩnh mạch: dùng điều trị nhiễm nấm nặng toàn thân do
Aspergillus, Candida, Cryptococcus…


3

 Dạng lipsome hoặc phức hợp lipid: dùng trong trường hợp thất bại với AmB
thông thường hoặc dùng AmB thông thường có nguy cơ gây suy thận [1].
Liều dùng: AmB chủ yếu dùng tiêm tĩnh mạch với liều thông thường: bắt đầu

là 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể
tới 1,5 mg/kg/ngày [3].
1.1.4.

Một số chế phẩm tiêm của AmB trên thị trường
Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AmB trên thị trường
Hàm

STT

Chế phẩm

1

Fungizone

50 mg

Abelcet

100mg/

DMPC: DMPG: AmB

Phức hợp

(ABLC)

20ml

(tỷ lệ mol 7:3:10)

lipid

Amphotec

50 mg,

(ABCD)

100mg

2

3

4

AmBisome
(L-AmB)

Thành phần

lượng

50 mg

AmB với natri
deoxycholat

Phức hợp AmB với
cholesteryl sulfate (tỷ lệ
mol 1:1)
HSPC:DSPG:Chol:AmB
(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)

1.2.

Liposome Amphotericin B

1.2.1.

Khái niệm liposome
.

Cấu trúc

Dạng BC

Micell

Bột ĐK

Phức hợp
lipid

Liposome

Hỗn dịch

Bột ĐK

Bột ĐK

Liposome là dạng đặc biệt của
vi nang và siêu vi nang, gồm
một nhân nước ở giữa được
bao

bọc

bởi

một

vỏ

phospholipid gồm một hay
nhiều lớp đồng tâm, kích thước
thay đổi từ hàng chục nm đến
Hình 1. 1 Cấu trúc của L-AmB [39]

hàng chục µm [6].


4

1.2.2.

Thành phần L-AmB

Vỏ liposome: gồm 2 thành phần là phospholipid và cholesterol.
 Phospholipid:
Phospholipid sử dụng trong L-AmB gồm phosphatidylcholin đậu nành
hydrogen hóa (HSPC) và distearoylphosphatidylglycerol (DSPG).

Hình 1. 2 Phân tử HSPC và DSPG [8]
- HSPC có các ưu điểm: bền về hóa học hơn phosphatidylcholin đậu nành
chưa hydrogen hóa do hạn chế được quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no,
giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ DC [11].
- DSPG ngoài vai trò tham gia tạo thành lớp lipid kép, còn giúp định hướng sự
sắp xếp của AmB trên màng: đầu thân nước hướng vào nhân nước hoặc hướng ra
môi trường bên ngoài; đầu thân dầu hướng vào bên trong lớp màng, tương tác với
đầu thân dầu của DSPG. Đồng thời, do sự tạo phức giữa phân tử AmB với DSPG
nên làm tăng hiệu quả mang thuốc và lưu giữ AmB trong liposome, tăng hiệu suất
quy trình [10].
Vũ Thị Quỳnh (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của DSPG đến KTTP và hiệu
suất quy trình bào chế L-AmB bằng phương pháp tiêm ethanol. Theo đó, với công
thức có DSPG, L-AmB có kích thước tương đối nhỏ (≈ 100 nm), hiệu suất > 80%,
với công thức không sử dụng DSPG, KTTP ≈ 200 nm, hiệu suất đạt 66% [10].
 Cholesterol
Chol có vai trò như một hệ đệm lỏng làm tăng tính cứng và giảm tính thấm
của lớp màng phospholipid đối với chất mang [6], [7], [34]; đồng thời làm tăng tính
ổn định của liposome: liposome không chứa Chol tương tác nhanh với protein huyết
tương (albumin, transferrin,...). Sự có mặt của Chol làm giảm tương tác này [34].


5

Dược chất

AmB được gắn thụ động trong quá trình tạo liposome nhờ hình thành liên kết
tĩnh điện với DSPG và liên kết với Chol trong thành phần vỏ phospholipid.
1.2.3.

Ưu- nhược điểm của L-AmB

Ưu điểm
Cấu trúc liposome đem lại cho L-AmB những đặc điểm riêng biệt về đặc tính
dược lý, độ an toàn và hiệu quả điều trị:
- Làm thay đổi dược động học của thuốc: L-AmB có kích thước nhỏ, có chứa
Chol, có tương tác tĩnh điện AmB-DSPG, do đó tăng thời gian lưu thông trong máu,
tăng Cmax và AUC 20-30 lần so với dạng quy ước (AmBD) [20]. Nghiên cứu của
Groll Ah và cộng sự (2000) trên thỏ bị viêm màng não do C.albicans với cùng một
liều L-AmB và AmB quy ước cho thấy: Cmax lần lượt là 62,02 và 0,99 mg/mL;
AUC trong 24 giờ lần lượt là 1141 và 10,03 µg.h/mL [21].
- Khả năng dung nạp tốt, giảm độc tính trên thận và các cơ quan khác. Nguyên
nhân có thể do AmB là hoạt chất thân dầu, nên sẽ nằm trong lớp màng phospholipid
kép. Hơn nữa, AmB liên kết với Chol thành phức hợp bền. Chỉ khi tiếp xúc với tế
bào nấm, do có ái lực cao hơn với Chol, AmB mới liên kết với ergosterol màng, gây
chết tế bào, phát huy tác dụng chống nấm. Nghiên cứu của Sabra và cộng sự (2001)
về độc tính cấp trên thận của AmB cho thấy: AmBD làm giảm 44% mức độ lọc cầu
thận và 65% lưu lượng máu đến thận ở chuột; trong khi với L-AmB, các thông số
này không thay đổi [28].
Do đó, L-AmB thường được chỉ định cho bệnh nhân: hoặc có tiền sử rối loạn
chức năng thận, được chuẩn đoán xác định hay nghi ngờ nhiễm nấm; hoặc xuất hiện
độc tính khi sử dụng; hoặc không đáp ứng với AmB thông thường. Một thử nghiệm
pha II, đa trung tâm sử dụng AmBisome để điều trị cho 26 bệnh nhân HIV nhiễm
Cryptococcus cho thấy: 67% bệnh nhân khỏi hoàn toàn, trong đó có những bệnh
nhân không hiệu quả khi điều trị AmB trước đó, hoặc không thể sử dụng AmB do
độc tính trên thận [19], [44].

6

- Do độc tính trên các cơ quan giảm, L-AmB có thể được sử dụng ở liều cao
(1-30 mg/kg/ngày) để điều trị nhiễm nấm hệ thống [24].
Nhược điểm:
Mặc dù có nhiều ưu điểm, việc sử dụng L-AmB vẫn hạn chế do:
- Một số phản ứng không mong muốn có thể xảy ra. Walsh Tj (2004) đã tiến
hành đánh giá hiệu quả và tính an toàn trong điều trị nấm của caspofungin so với LAmB. Kết quả cho thấy: L-AmB có nguy cơ làm tăng tai biến liên quan đến tiêm
truyền hơn caspofungin: giảm bạch cầu và sốt (51,6% so với 35,1%); ớn lạnh
(24,7% so với 13,8%), nôn (8,6% so với 3,5%), khó thở (4,2% so với 2,0%) [41].
- Chi phí điều trị cao hơn điều trị bằng AmB thông thường, trong khi các
nghiên cứu về chi phí - lợi ích chưa cho thấy hiệu quả vượt trội [14].
1.2.4.

Phương pháp bào chế

L-AmB thường được bào chế qua các giai đoạn:
- Bào chế liposome thô
- Đồng nhất và giảm KTTP
- Đông khô liposome
1.2.4.1. Phương pháp bào chế L-AmB thô
L-AmB đã được nghiên cứu bào chế bằng các phương pháp sau:
 Phương pháp tiêm ethanol
Cách tiến hành: AmB hòa tan trong DM thích hợp được trộn lẫn với hỗn hợp
gồm phospholipid và Chol hòa tan trong ethanol, sau đó tiêm nhanh vào pha nước;
kết hợp khuấy trộn hoặc siêu âm ở tốc độ phù hợp [10], [35].
Ưu- nhược điểm:
 Ưu điểm: quy trình bào chế nhanh chóng, dễ dàng, đơn giản, độ lặp lại cao,

tạo L-AmB có kích thước nhỏ mà không cần trải qua quá trình giảm KTTP.
 Nhược điểm: L-AmB thu được có nồng độ thấp, cần có biện pháp cô đặc thể
tích để tăng nồng độ liposome.
 Phương pháp bốc hơi pha đảo


7

Cách tiến hành: Phospholipid, Chol và AmB được hòa tan bằng DM hữu cơ
(cloroform, methanol,..), sau đó đem cất quay để loại bỏ DM. Hòa tan trở lại hỗn
hợp các thành phần bằng ether. Thêm pha nước (đệm phosphat, đệm Tris…) và siêu
âm trong thời gian thích hợp cho đến khi tạo thành hệ micell đảo phân tán đồng
nhất. Sau đó, bốc hơi từ từ dưới áp suất giảm để loại DM hữu cơ tới khi đạt điểm
giới hạn, các micell bị phá vỡ, phospholipid tái sắp xếp tạo cấu trúc lipid kép và
hình thành liposome [4], [29], [44].
Nhược điểm của phương pháp này là quy trình bào chế nhiều giai đoạn, LAmB tạo thành có kích thước lớn và không đồng nhất, do đó cần quá trình giảm
KTTP.
 Phương pháp hydrat hóa film
Cách tiến hành: Hòa tan phospholipid, Chol và AmB vào DM hữu cơ
(cloroform, methanol,...). Sau đó DM được loại đi bằng cách bốc hơi hoàn toàn
trong bình cầu tạo màng film mỏng. Hydrat hóa lớp film bằng dung dịch hydrat hóa
thích hợp (glucose 5%, đệm citrat,…) tạo hỗn dịch liposome [4], [8], [26].
Arvind G và cộng sự (2013) đã bào chế L-AmB theo phương pháp hydrat hóa
film, tiến hành khảo sát tỷ lệ DM methanol: cloroform và pH khi hình thành phức
hợp đến đặc tính L-AmB tạo thành. Kết quả cho thấy: tại pH = 3,0, với tỷ lệ
methanol: cloroform = 1: 2, L-AmB tạo thành có hàm lượng tạp thấp nhất [15].
Mai Thị Thùy Linh (2014) đã nghiên cứu bào chế L-AmB với TD theo tỷ lệ
mol HSPC: DSPG: Chol = 2: 0,8: 1,9, tỷ lệ dược chất/tổng số mol lipid đạt 9 mol%,
môi trường hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 cho KTTP nhỏ (< 300 nm), phân bố
kích thước hẹp (PDI < 0,2) và hiệu suất liposome hóa cao (≈ 90%) [8].

Ưu- Nhược điểm:
 Ưu điểm: tiện ích, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị kĩ thuật cao, dễ bổ
sung cải tiến, hiệu suất liposome hóa cao.
 Nhược điểm: liposome thu được từ phương pháp này thường nhiều lớp,
KTTP lớn và không đồng nhất. Do đó cần có quá trình làm giảm KTTP.


8

1.2.4.2. Đồng nhất và làm giảm KTTP L-AmB
L-AmB bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo và hydrat hóa film thường
là liposome nhiều lớp, không đồng nhất. Do đó cần làm giảm KTTP nhằm tạo
liposome kích thước nhỏ và phân bố kích thước hẹp, từ đó tăng độ ổn định vật lý,
tăng hiệu quả điều trị: liposome kích thước nhỏ (< 100 nm) bị hệ thống đại thực bào
bắt chậm hơn liposome có kích thước lớn (> 100 nm); đồng thời có thể dễ dàng đi
qua các khe kẽ trên màng tế bào vào bào tương và phát huy tác dụng tại tế bào đích
[33].
Các phương pháp đã được nghiên cứu làm giảm kích thước L-AmB là: siêu
âm que, đùn qua màng, đồng nhất hóa áp suất cao.
 Phương pháp đùn qua màng
Cách tiến hành: Nén hỗn dịch liposome qua màng lọc có kích thước xác định.
Khi đó, liposome có đường kính nhỏ hơn kích thước lỗ lọc sẽ dễ dàng đi qua;
liposome có đường kính lớn hơn kích thước lỗ lọc, một phần sẽ biến dạng khi đi qua
lỗ lọc, một phần dưới tác dụng của lực trượt sẽ bóc tách lớp vỏ ngoài, tạo liposome
có kích thước nhỏ và đồng nhất hơn.
Lê Nho Đán (2015) đã tiến hành khảo sát phương pháp này bằng thiết bị đùn
tay mini extruder. Mẫu được đùn lần lượt qua màng 400 nm-200 nm-100 nm, mỗi
mẫu đùn 29 lần. Sau khi đùn, KTTP giảm từ 700 nm xuống 200 nm, mẫu tương đối
đồng nhất. Tuy nhiên, thể tích mỗi lần đùn tay nhỏ (1ml), thời gian tiến hành lâu, do
đó không thể áp dụng trong công nghiệp [5].

 Phương pháp siêu âm que
Cách tiến hành: Que siêu âm được đặt ngập trực tiếp vào hỗn dịch liposome.
Liposome được làm nhỏ nhờ năng lượng của sóng siêu âm.
A.Manosroi cùng cộng sự (2004) sau khi bào chế L-AmB đã tiến hành siêu âm
que trong thời gian 30 phút. Kết quả thu được liposome có kích thước từ 115-364
nm, hiệu suất liposome hóa đạt trên 85% với tất cả các mẫu [26].


9

Hạn chế chính của siêu âm là: nhiệt lượng lớn sinh ra trong quá trình và tạp
kim loại từ đầu que có thể làm tăng thủy phân và oxy hóa phospholipid cũng như
ảnh hưởng tới độ bền của hoạt chất, không có sự đồng nhất giữa các lô mẻ.
 Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao
Cách tiến hành: Hỗn dịch L-AmB được nén qua khe hẹp có kích thước xác
định ở thiết bị đồng nhất hóa ở áp suất cao. Thường nén tuần hoàn nhiều vòng đến
khi thu được liposome có kích thước khoảng 50-100 nm.
Lê Nho Đán (2015) sau khi bào chế L-AmB bằng phương pháp hydrat hóa
film đã tiến hành khảo sát giảm KTTP bằng đồng nhất hóa áp suất cao. Kết quả sau
khi đồng nhất hóa kết hợp đùn qua màng polycarbonat 400 nm 2 lần ở áp suất 5000
psi, thu được L-AmB kích thước < 200 nm; PDI < 0,3 [5].
Tuy nhiên, liposome tạo ra không ổn định về mặt vật lí, hóa học và sinh học.
Do đó cần có biện pháp để ổn định chế phẩm trong quá trình bảo quản và sử dụng.
Một trong số những phương pháp đó là đông khô.
1.2.4.3. Đông khô liposome
1.2.4.3.1. Khái niệm
ĐK là quá trình làm khô chế phẩm ở điều kiện đặc biệt, trong đó chế phẩm
được đông lạnh, sau đó DM được thăng hoa trực tiếp (giai đoạn làm khô sơ cấp) rồi
giải hấp phụ (giai đoạn làm khô thứ cấp) để giảm hàm ẩm tới mức phù hợp nhằm
ngăn chặn phản ứng hóa học và sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình bảo

quản [38].
1.2.4.3.2. Các giai đoạn đông khô
Quá trình ĐK thường gồm 3 giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp, làm khô
thứ cấp.
 Giai đoạn đông lạnh
Là giai đoạn đầu tiên của quá trình ĐK. Trong giai đoạn này, chế phẩm được
làm lạnh tới nhiệt độ đủ thấp, nước dần tách ra dẫn đến tăng nồng độ của các thành
phần còn lại, độ nhớt của hệ tăng lên, đến một giới hạn thì phần dịch này sẽ hóa rắn
tạo dạng kết tinh, vô định hình hoặc kết hợp cả hai [16], [24].


10

Để hiểu rõ hơn về quá trình kết tinh trong giai đoạn đông lạnh, dưới đây là
giản đồ pha của hệ saccarose- nước:

Hình 1. 3 Giản đồ pha của hệ saccarose- nước [42]
Giả sử dung dịch saccarose ban đầu ở nhiệt độ phòng có nồng độ 20% (điểm
A). Khi làm lạnh từ từ dung dịch, đến điểm C, nước bắt đầu kết tinh, nồng độ của
saccarose tăng, điểm biểu diễn nồng độ dần dịch sang phải theo đường cong cân
bằng, độ nhớt của hệ tăng dần. Đến điểm E (điểm có nhiệt độ eutecti Te), do độ
nhớt cao, nên saccarose khó có thể kết tinh, dung dịch chuyển sang trạng thái quá
bão hòa. Tại điểm D, khi nhiệt độ của hệ đạt đến Tg’ (nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh
của dung dịch có nồng độ cao nhất- ở đây là dung dịch saccarose 80%, làm lạnh
hơn nữa cũng không làm tăng nồng độ saccarose trong dung dịch), hệ chuyển từ
trạng thái lỏng nhớt, đàn hồi cao sang trạng thái thủy tinh cứng, vô định hình [43].
 Làm khô sơ cấp
Trong giai đoạn này, nước sẽ được thăng hoa trực tiếp từ pha rắn sang pha hơi
bằng cách hạ áp suất của buồng ĐK xuống thấp hơn áp suất bão hòa của hơi nước.
98-99% nước được loại ra khỏi chế phẩm ở giai đoạn này.

 Làm khô thứ cấp
Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, hấp phụ trong khối bột sẽ được
loại bỏ bằng cách nâng nhiệt độ của buồng ĐK trong điều kiện áp suất thấp. Hàm


11

ẩm giảm tới mức tối ưu, đảm bảo độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo quản
[16].
1.2.4.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng
Kết quả của quá trình ĐK phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, cả yếu tố công thức
và yếu tố quy trình.
 Yếu tố công thức
 TD tạo khung
Với chế phẩm có hàm lượng dược chất nhỏ hơn 2% (kl/kl) có thể bổ sung TD
tạo khung để tạo khuôn cho chế phẩm, hình thành bánh ĐK có hình thức đẹp. Một
số TD tạo khung được sử dụng là:
 Manitol: Là TD tạo khung được sử dụng phổ biến nhất. Manitol có Te cao (1,4oC). Tuy nhiên, sự kết tinh có thể ảnh hưởng tới độ ổn định vật lí của chế phẩm .
 Lactose: Được sử dụng phổ biến làm TD tạo khung. Tg’ là -32oC. Mặc dù
vậy, lactose là đường khử, do đó có thể tham gia phản ứng Maillard với protein gây
mất ổn định chế phẩm.
 Saccarose: Tg’ là -31oC nhưng không là đường khử, nên không có phản ứng
Maillard. Có tỉ trọng cao hơn lactose, do đó có thể dẫn đến sụp đổ cấu trúc trong
quá trình ĐK [42].
 Trehalose: hay được sử dụng cho các chế phẩm sinh học, do có nhiều ưu
điểm như: ít hút ẩm, không có liên kết hydro nội phân tử nên có khả năng liên kết
nhiều với liposome, khả năng phản ứng thấp và Tg’ cao [43].
 TD bảo vệ
ĐK có thể tạo ra nhiều áp lực gây mất ổn định liposome. Do vậy cần bổ sung
các chất có vai trò bảo vệ trong giai đoạn đông lạnh (cryoprotectant) hoặc làm khô

(lyoprotectant). Ngoài việc là TD tạo khung, đường đôi hình thành dạng thủy tinh
vô định hình có hiệu quả trong việc ổn định liposome và protein trong quá trình ĐK
[16].
Để giải thích cho hiệu quả bảo vệ của đường, 2 giả thuyết đã được đưa ra và
công nhận rộng rãi là giả thuyết thay thế nước và giả thuyết thủy tinh hóa.


12

 Giả thuyết thay thế nước
Giả thuyết thay thế nước lần đầu tiên được đề xuất bởi Crowe, theo đó TD bảo
vệ làm giảm tương tác giữa nước và phospholipid rồi thay thế nước tạo liên kết
hydro với đầu phân cực của phospholipid, do đó duy trì khoảng cách giữa các đầu
phân cực và giảm lực Van der Waals giữa các chuỗi acyl của phospholipid, giúp
liposome không bị nứt vỡ trong quá trình đông lạnh và hydrat hóa trở lại [18].

Hình 1. 4 Cơ chế thay thế nước [18]
 Giả thuyết thủy tinh hóa
Khi nước đóng băng trong quá trình đông lạnh, TD bảo vệ hình thành dạng
thủy tinh hóa có độ nhớt cao và tính di động thấp, có khả năng ức chế sự thay đổi
liên quan tới giai đoạn chuyển pha của lipid. Chính vì vậy nó có thể giảm bớt tổn
hại màng do tinh thể băng, ngăn ngừa hiện tượng hợp nhất, kết tụ và tránh quá trình
chuyển pha lipid [18], [40].
 Hệ đệm
Kiểm soát pH của chế phẩm là cần thiết để tránh phân hủy dược chất trong quá
trình bào chế, bảo quản, và hoàn nguyên. Hệ đệm được sử dụng nên có nhiệt độ phá
vỡ cấu trúc cao, nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh cao, và không bay hơi. Citrat hay
được sử dụng do tồn tại dạng vô định hình, ít thay đổi pH nhất sau ĐK [42].
 Yếu tố quy trình
 Giai đoạn đông lạnh

13

Giai đoạn đông lạnh tạo ra nhiều áp lực gây mất ổn định chế phẩm như: làm
tăng nồng độ liposome dẫn đến kết tụ các tiểu phân, tinh thể băng tiếp xúc với lớp
màng lipid kép, phá vỡ tính toàn vẹn của màng [36]. Do đó cần tối ưu hóa các thông
số: tốc độ, thời gian, nhiệt độ làm lạnh.
 Tốc độ làm lạnh
- Thông thường, tốc độ làm lạnh nhanh sẽ tạo thành tinh thể băng có kích
thước nhỏ, đồng thời phân bố TD bảo vệ đồng nhất hơn, giảm phá hủy lớp màng
lipid kép. Tuy nhiên, tinh thể băng có kích thước nhỏ làm giảm diện tích lỗ thoát
khí, giảm tốc độ bay hơi, tăng thời gian làm khô sơ cấp; đồng thời có thể dẫn đến
tình trạng không đồng đều giữa các lọ hoặc các phần khác nhau trong một lọ.
- Làm lạnh chậm tạo tinh thể băng có kích thước lớn, tăng tốc độ giai đoạn
làm khô; tuy nhiên cũng làm tăng sự phá hủy lớp màng lipid kép. Đồng thời, nếu đá
kết tinh quá chậm sẽ kéo dài thời gian dược chất nằm trong dung dịch, làm tăng
hiện tượng kết tụ và hợp nhất tiểu phân, giảm độ ổn định của chế phẩm [18].
 Nhiệt độ đông lạnh
Để đảm bảo nước và các thành phần khác hóa rắn hoàn toàn, giai đoạn này
thường được tiến hành ở -40oC đến -50oC (nhỏ hơn Te của đa số hệ kết tinh và Tg’
của đa số hệ vô định hình) [16], [23] và cần duy trì ở thời gian thích hợp [22].
 Làm khô sơ cấp
Các thông số cần lưu ý là: áp suất, nhiệt độ, thời gian sấy sơ cấp.
 Áp suất buồng ĐK ảnh hưởng tới tốc độ bay hơi nước: áp suất buồng ĐK
càng thấp, tốc độ thăng hoa càng nhanh. Tuy nhiên, áp suất buồng thấp quá có thể
gây ra sự không đồng đều về nhiệt giữa các lọ. Thường duy trì áp suất trong khoảng
0,0665 mbar đến 0,2660 mbar [22].
 Nhiệt độ sấy sơ cấp phải nhỏ hơn Tg’ khoảng 5-10oC [13]. Trong giai đoạn
này, Tg’ của hệ thường thấp, nhiệt độ sấy càng cao thì nguy cơ phá vỡ cấu trúc của

hệ càng cao. Tuy nhiên, tốc độ bay hơi nước lại phụ thuộc vào nhiệt độ: khi tăng
nhiệt độ lên 5oC, tốc độ bay hơi tăng gấp đôi. Do vậy cần tiến hành ở nhiệt độ cao
nhất có thể để làm giảm thời gian sấy mà không làm hỏng cấu trúc bánh.


14

 Thời gian sấy sơ cấp: nếu chuyển sang giai đoạn sấy thứ cấp trước khi loại
hết tất cả nước đã đông lạnh trong chế phẩm có thể làm hỏng cấu trúc bánh [9],
[30], [31].
 Làm khô thứ cấp
Cần chú ý đến nhiệt độ và thời gian sấy thứ cấp:
 Nhiệt độ sấy thứ cấp: Ở giai đoạn này, Tg’ của hệ tăng mạnh, vì thế nhiệt độ
sấy cao ít gây phá vỡ cấu trúc bánh. Nhiệt độ sấy thứ cấp thường là +20oC đến
+40oC, tùy thuộc vào độ ổn định của dược chất dưới tác động của nhiệt.
 Thời gian sấy thứ cấp: Thông thường, sấy ở nhiệt độ cao trong thời gian
ngắn tốt hơn sấy ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài. Lí do là tỷ lệ nước hấp phụ
giảm nhanh tại nhiệt độ xác định, sau đó 3-6 giờ, hàm ẩm giảm rất ít [22].
1.2.4.3.4. Ưu- nhược điểm
Ưu điểm:
- Quá trình loại nước ở nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ phản ứng phân hủy và
phản ứng oxi hóa khử dược chất đáng kể so với các phương pháp khác.
- Sản phẩm ĐK nhanh hòa tan trở lại [16], [25].
- Thuốc được phân liều vào lọ ở dạng dung dịch trước khi ĐK nên dễ dàng đạt
được yêu cầu đồng nhất về hàm lượng dược chất.
- Dễ đảm bảo vô khuẩn cho chế phẩm hơn là việc đóng bột vào ống hoặc lọ vì
dung dịch chế phẩm có thể tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc ngay trước khi đóng
vào lọ để ĐK [16], [23].
- Chế phẩm ổn định trong thời gian dài [16].
Nhược điểm

- Thời gian tiến hành kéo dài, quy trình và thiết bị phức tạp, giá thành sản
phẩm cao [25].
- Nhiều thuốc có bản chất protein dễ bị mất hoạt tính hoặc phá hủy trong quá
trình đông lạnh.
- Nếu quá trình ĐK tạo ra chất rắn vô định hình và dạng này không ổn định thì
sản phẩm sẽ không đạt được chất lượng như mong muốn.


15

1.2.4.3.5. Một số nghiên cứu về đông khô L-AmB
S.P.Shah và cộng sự (2004) đã nghiên cứu bào chế L-AmB dạng bột xông hít
bằng phương pháp bốc hơi pha đảo. Liposome tạo thành đem ĐK với các TD bảo
vệ khác nhau. Kết quả khảo sát cho thấy, saccarose với tỷ lệ khối lượng lipid:
saccarose là 1: 5 đem lại hiệu quả bảo vệ tốt nhất. Sản phẩm sau khi tạo dạng bột
xông hít thì hiệu suất nang hóa là 22,5 ± 2,2% (AmB 1) và 16,8 ± 2,2% (AmB 2).
L-AmB tạo ra có tuổi thọ trên 1 năm, bảo quản ở 2-8ºC [32].
Lê Nho Đán (2015) đã nghiên cứu bào chế L-AmB bằng phương pháp hydrat
hóa film, sau đó khảo sát và lựa chọn saccarose với tỷ lệ khối lượng lipid: saccarose
là 1: 8 làm TD tạo khung, đồng thời xây dựng quy trình ĐK L-AmB: đông lạnh ở 50oC trong vòng 8 giờ; làm khô sơ cấp: giữ tại -35oC trong vòng 20 giờ, tốc độ gia
nhiệt 0,25oC/ phút, áp suất 0,03 mbar; làm khô thứ cấp: giữ tại 25oC trong vòng 8
giờ, tốc độ gia nhiệt 0,25oC/ phút, áp suất 0,03 mbar. Bột ĐK sau khi phân tán lại
cho hỗn dịch màu vàng nhạt, không có tiểu phân kích thước lớn có thể quan sát
bằng mắt thường, không lắng cặn, KTTP nhỏ (185,4 nm), đồng nhất (PDI = 0,255),
hiệu suất liposome hóa cao 96,78% [5].
Vũ Thị Quỳnh (2015) đã bào chế L-AmB bằng phương pháp tiêm ethanol, sau
đó nghiên cứu và lựa chọn được TD bảo vệ là saccarose-manitol (2: 1 kl/kl) với tỷ
lệ khối lượng lipid: đường là 1: 8. Bánh ĐK tạo thành đạt về cảm quan, thời gian
pha lại ngắn (khoảng 15 giây), KTTP sau pha lại khoảng 153,2 nm, tương đối đồng
nhất (PDI 0,258) [10].

16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu

- Liposome Amphotericin B.
- Thuốc tiêm liposome Amphotericin B đông khô.
2.1.2.

Nguyên liệu
Bảng 2.1. Nguyên liệu

TT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Acid citric

Trung Quốc

TKHH

2

Acid hydroclorid đặc

Trung Quốc

TKHH

3

Amphotericin B

Trung Quốc

USP

4

Cloroform

Labscan – Thái Lan

NSX

5

Chol

Trung Quốc

NSX

6

Distearoyl phosphatidylglycerol

Lipoid – Đức

NSX

7

Lactose

Trung Quốc

BP

8

Manitol

Trung Quốc

BP

9

Methanol

Trung Quốc

DĐVN

10

Natri hdroxyd

Trung Quốc

TKHH

Lipoid – Đức

NSX

Trung Quốc

BP

Phosphatidylcholin đậu nành
11

hydrogen hóa (hydrogenated

soy phosphatidylcholin)

12

2.1.3.

Saccarose

Phương tiện nghiên cứu

- Hệ thống cất quay Rovapor R-210 (Buchi - Đức), bình cầu NS 29/32, dung
tích 2000 ml (Buchi - Đức).


17

- Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern - Anh).
- Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific - Mỹ).
- Máy siêu âm que UP200Ht (Hielscher - Đức).
- Máy đông khô Labocono Freezone Triad 740030 (Labconco - Mỹ).
2.2.

Nội dung nghiên cứu

- Bào chế L-AmB bằng phương pháp hydrat hóa film và khảo sát ảnh hưởng
của một số yếu tố quy trình đến chất lượng L-AmB tạo thành.
- Khảo sát phương pháp làm giảm KTTP bằng máy siêu âm que UP200Ht
(Hielscher- Đức).
- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công thức và quy trình đến đặc tính LAmB ĐK.
2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.

Bào chế L-AmB

- Bào chế L-AmB bằng phương pháp hydrat hóa film theo công thức và quy
trình được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của Mai Thị Thùy Linh: tỷ lệ
dược chất/ tổng số mol lipid đạt 9 mol%, tỷ lệ Chol là 40% so với tổng lượng lipid và
HSPC: DSPG = 2: 0,8, dung dịch hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 có hoặc không kết
hợp với TD bảo vệ [8].
- Công thức cho mẫu 80 ml:
Amphotericin B …………………………………………..110,8 mg
DSPG………………………... ………………………….178,0 mg
HSPC…………………………………...………………...451,6 mg
Chol ………………………………………………………206,2 mg
- Quy trình bào chế L-AmB:
 Cân và hòa tan DSPG trong hỗn hợp methanol: cloroform tỷ lệ 1: 1, điều
chỉnh đến pH 1-2 bằng dung dịch HCl 2,5N trong methanol ở 60oC (1).
 Cân và phân tán AmB trong methanol ở 60oC (2).
 Cân và hòa tan HSPC và Chol trong hỗn hợp methanol: cloroform tỷ lệ 1: 1
(3).