Khảo sát khả năng sống sót của Lactobacillus sporogenes trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAI THỊ HƢỜNG
MÃ SINH VIÊN: 1101250

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA
Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ
TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAI THỊ HƢỜNG
MÃ SINH VIÊN: 1101250

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA
Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ
TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Kiều Thị Hồng
2. DS. Tô Ngọc Sắc
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dƣợc

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới
ThS. Kiều Thị Hồng, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Tô Ngọc Sắc đã
đóng góp nhiều ý kiến quý báu, luôn động viên và tận tình giúp đỡ em thực hiện
đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn quan tâm, giúp đỡ em trong suốt
quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người
luôn bên em động viên, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong học tập và
trong cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Mai Thị Hƣờng


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................1
CHƢƠNG 1 . TỔNG QUAN ..............................................................................2

1.1.

ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC…………………………….…2

1.2.

Các vi sinh vật thƣờng dùng trong các chế phẩm probiotic....3

1.3.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và
Việt Nam…………………………………………………….…..3

1.4.

Lactobacillus sporogenes..……………………………………....5

1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa điều kiện nuôi cấy…….….6
1.4.2. Vai trò của Lactobacillus sporogenes……………………………9
1.4.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về L. sporogenes……..10
1.5. Phƣơng pháp đông khô………………………………………..11
1.5.1. Khái niệm……………………………………………………….11
1.5.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô………………….………..11
1.5.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp đông khô……………….…..12
1.5.4. Một số tá dược thường dùng trong đông khô VSV…………….12
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU…………………………………………………………………………….14
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu……………………….….14
2.1.1. Nguyên vật liệu………………………………………………...14
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu…………………………15

2.1.3. Thiết bị…………………………………………………………16
2.2. Nội dung nghiên cứu……………………………………………16
2.2.1. Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes…....16
2.2.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trong
quá trình bảo quản……………………………………...……………..17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………..17
2.3.1. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng……………………17
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy………………………………………….17
2.3.3. Phương pháp xử lý dịch nuôi cấy thu sinh khối……...………...18
2.3.4. Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô…………...…………...18
2.3.5. Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (pp Ogietska)….…..18
2.3.6. Phương pháp đo hàm ẩm……………………………………….19
2.3.7. Phương pháp nuôi cấy thu bào tử trên môi trường rắn……..….19
2.3.8. Xác định số lượng vi sinh vật theo pp pha loãng liên tục……...20
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………...22
3.1. Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes…...22
3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trong
quá trình bảo quản…………………..………………...………………………33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………..38
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis

Bacillus subtilis

CFU

(Colony – Forming Unit) Số đơn vị khuẩn lạc

CPA
FAO

Cryoprotectant
(Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương thế

HMG-CoA giới
3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A
L. sporogenes Lactobacillus sporogenes
MRS

(de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
lactic

MT

Môi trường

Vòng/phút

(revolutions per minute) Vòng mỗi phút

VSV

Vi sinh vật

WHO

(World Health Organization) Tổ chức Y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Tên bảng, biểu
Bảng 1.1

So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus

Trang
7

sporogenes với các chi Bacillus và Lactobacillus
Bảng 2.1

Nguyên liệu pha môi trường

14

Bảng 2.2

Các thiết bị sử dụng trong đề tài

16

Bảng 3.1

Mật độ vi sinh vật có trong 1ml hỗn dịch bào tử

26

nuôi cấy trên môi trường MT4
Bảng 3.2

Mật độ L. sporogenes trong mẫu đông khô với các

28

thể tích nuôi cấy khác nhau
Bảng 3.3

Mật độ L. sporogenes trong mẫu đông khô theo

30

thời gian nuôi cấy
Bảng 3.4

Biến thiên mật độ VSV và hàm ẩm của mẫu đông
khô L. sporogenes trong quá trình bảo quản

35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

Trang

Hình 1.1

Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn L.sporogenes

6

Hình 1.2

Cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes

8

Hình 3.1

Hình ảnh nhuộm Ogietska của Lactobacillus

23

sporogenes tại thời điểm 96 giờ
Hình 3.2

Hình ảnh nhuộm quan sát bào tử của Lactobacillus

25

sporogenes sau khi nuôi cấy trong môi trường tạo
bào tử MT4
Hình 3.3

Hình ảnh nhuộm quan sát bào tử của Bacillus

25

subtilis sau khi nuôi cấy trong môi trường tạo bào tử
MT4
Hình 3.4

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ L.sporogenes

28

trong mẫu đông khô vào thể tích nuôi cấy
Hình 3.5

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ L. sporogenes

31

trong mẫu đông khô vào thời gian nuôi cấy
Hình 3.6

Hình ảnh khuẩn lạc của L. sporogenes pha loãng ở

34

nồng độ 10-6 sau 2 tuần bảo quản
Hình 3.7

Hình ảnh khuẩn lạc của L. sporogenes pha loãng ở

34

nồng độ 10-7 sau 2 tuần bảo quản
Hình 3.8

Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ VSV và hàm ẩm
của mẫu đông khô L. sporogenes trong quá trình bảo
quản

35


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotics là các lợi khuẩn có nhiều giá trị thiết thực đối với sức khỏe con người
như: ức chế các vi sinh vật gây bệnh trong đường tiêu hóa, cải thiện khả năng
dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol… Trong thời gian gần
đây, các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotic đã có sự
tăng mạnh mẽ về số lượng.
Lactobacillus sporogenes là một chủng vi khuẩn có nhiều đặc tính nổi trội để
có thể sử dụng làm nguyên liệu cho các chế phẩm probiotic: có khả năng sinh
bào tử giúp chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường, do đó làm
tăng tỉ lệ sống sót và tăng hiệu quả điều trị; có khả năng lên men đồng hình tạo
acid L (+) lactic mà cơ thể có thể chuyển hóa hoàn toàn được... [8].
Hiện nay đông khô là phương pháp rất tốt để bào chế các chế phẩm có dược
chất kém bền với nhiệt độ, dễ bị phân hủy hoặc các chất mang bản chất sinh học.
Các VSV sau đông khô có khả năng sống sót cao trong quá trình bảo quản, đặc
biệt là các vi sinh vật probiotics như: Lactobacillus và Bifidobacterium
Xuất phát từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài : “Khảo sát khả năng

sống sót của Lactobacillus sporogenes trong quá trình tạo nguyên liệu đông
khô ”. Nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes.
2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình
bảo quản.


2

1.1.

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
Đại cƣơng về probiotics
Vào đầu thế kỷ 19, những vai trò tích cực của 1 số vi khuẩn lần đầu tiên

được quan sát bởi nhà khoa học người Nga Metchnikoff (1845-1916). Ông nhận
thấy rằng: Những người nông dân Bungari thường xuyên sử dụng sữa lên men
lactic acid thường sống mạnh khỏe và có tuổi thọ cao. Cùng thời đó một giáo sư
ở viện Pasteur – Pari cũng nhận thấy: 1 số vi khuẩn như Clostria có sẵn trong
đường ruột trong quá trình phân giải protein sinh ra 1 số chất gây nhiễm độc
ruột (như phenol, indols và amoniac...), khi sử dụng sữa lên men với vi khuẩn
lactic acid thì đường ruột không còn bị nhiễm độc nữa. Giáo sư cho rằng: do quá
trình lên men lactose tạo độ pH thấp và vì thế mà ức chế sự phát triển của các vi
khuẩn phân giải protein.
Từ những khám phá ban đầu đó, giới khoa học bắt đầu quan tâm nghiên
cứu nhóm vi khuẩn có lợi này. Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu
tiên vào năm 1953 bởi Kollath. Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc
từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [16]. Năm 1989,
Fuller đã đưa ra một định nghĩa khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ
sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện

cân bằng hệ vi sinh đường ruột”. Năm 1992, Havenaar đã mở rộng định nghĩa
về probiotic: “Probiotic là các vi khuẩn đơn lẻ hay hỗn hợp các vi sinh vật sống
khi được dùng cho người hoặc động vật sẽ có ảnh hưởng có lợi cho sinh vật
chủ bằng cách cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột” [40].
Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới
(FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về Probiotics ở thời
điểm hiện tại như sau: “Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ


3

thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [33],
[39]. Tuy nhiên, không phải tất cả những vi sinh vật sống có lợi nào cũng là
probiotics. Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất
để chọn chủng VSV probiotics sử dụng dưới dạng thực phẩm và dược phẩm là
chủng khuẩn đó phải có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và phải có khả năng
phát triển trong ruột. Do trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotics phải đối
mặt với nhiều điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng bất
cứ sản phẩm chứa probiotics nào cũng phải chứa ít nhất 106 cfu/ml tế bào vi sinh
vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng vì liều điều trị tối thiểu mỗi ngày được
đề xuất là từ 108 ÷ 109 tế bào [19], [37].
1.2.

Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotic
Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotic là:

Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Trong đó,
Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất.
1.3.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam
Việc sử dụng thực phẩm có chứa các vi sinh vật có lợi cho cơ thể đã được

biết đến từ lâu, tuy nhiên việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng
probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỉ 20. Năm 1998,
Apajalahti và cộng sự đã thực hiện những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và
quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật [11].
Netherwood và cộng sự (1999) [35]; Gong và cộng sự (2002) [21]; Yoon
và cộng sự (2002) [41] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu
trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới
tác động của probiotics. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo


4

nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật
đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ.
Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu
biết của con người về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế. Có một số
tác giả cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự
kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản
xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng
sinh…), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn
dịch ruột [28], [36].
Trong thời gian gần đây đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản
phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotics. Probiotics ngày càng
được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống
như bột, cốm, viên nang… hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng
khác như viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các

vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn. Để cải thiện số lượng
vi khuẩn sống sót trong suốt quá trình bảo quản và trong môi trường có độ pH
thấp trong cơ thể, trên thị trường đã có các sản phẩm probiotics được bao tới thế
hệ 1,2,3… [3].
Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, chúng phải
chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất
nhiều và không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây tác
dụng. Việc đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất,
bảo quản, lưu hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản; do vậy đã
có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông khô tạo


5

bột, áp dụng phương pháp lên men 2 bước, phương pháp vi nang hóa, phương
pháp sử dụng kết hợp với tá dược bảo vệ [20].
Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nước ta là công ty trách
nhiệm hữu hạn một thành viên Pasteur Đà Lạt, công ty trách nhiệm hữu hạn một
thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang, với một số chế phẩm hay gặp trên thị
trường như Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver với
chủng vi sinh vật Bacillus subtilis. Thị trường chế phẩm probiotics của Việt Nam
hiện nay đã phát triển, không chỉ lớn về số lượng mà còn đa dạng về chủng loại
vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm probiotics đã được hạ
nhiều lần.
1.4.

Lactobacillus sporogenes
Lactobacillus sporogenes được phân lập bởi B.W. Hammer tại Phòng thí

nghiệm nông nghiệp Iowa (Mỹ) vào năm 1915 và được biết đến lần đầu tiên

dưới tên gọi Bacillus coagulans do một đợt bùng phát của việc một sản
phẩm đặc biệt của sữa bị đông vón hàng loạt [22]. Năm 1932, vi khuẩn này
lại được Horowitz và Wlasowa phân lập và đặt tên là Lactobacillus sporogenes
[30]. Đến năm 1957, vi sinh vật này được phân loại lại trong Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology dựa trên các đặc tính sinh hóa và danh pháp
chính xác hiện tại là Bacillus coagulans [14]. Do vi khuẩn này có các đặc điểm
của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, nên vị trí phân loại của nó giữa hai
họ Lactobacillaceae và Bacillaceae vẫn còn gây nhiều tranh cãi [24]. Ngày
nay, vi khuẩn này được biết đến với cả hai tên gọi trên, nhưng tên gọi
Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều hơn trong các chế phẩm
thương mại xuất hiện trên thị trường. Do nguồn gốc của giống vi sinh vật
trong khóa luận, tên gọi Lactobacillus sporogenes sẽ được sử dụng.


6

1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, điều kiện nuôi cấy
Lactobacillus sporogenes tồn tại trong tự nhiên ở hai dạng: dạng tế bào
sinh dưỡng và dạng bào tử.
1.4.1.1.Tế bào sinh dƣỡng
 Đặc điểm hình thái:
 Lactobacillus sporogenes được mô tả là trực khuẩn Gram dương, hình
que, có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử [22], [25].
 Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở
dạng chuỗi ngắn [22], [25].

Hình 1.1. Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes
Lactobacillus sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi
Lactobacillus và Bacillus, bảng dưới đây so sánh các đặc tính cơ bản của
Lactobacillus sporogenes với hai chi này.

7

Bảng 1.1. So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi
Bacillus và Lactobacillus [25]
Đặc tính
Catalase

L.sporogenes
+
s

Lactobacillus
-

Bacillus
+

Oxidase

-

-

+

Nitrate

-

-

+

Sinh bào tử

+

-

+

Khả năng di động

+

+/-

+

Sinh acid lactic

+

+

-

+

+/-

+

Acid meso-diaminopimelic
1.4.1.2. Bào tử

Khi gặp phải những điều kiện bất lợi trong quá trình sinh trưởng và phát
triển như: thành phần môi trường dinh dưỡng không thích hợp, tác động của
nhiệt độ, bức xạ, hóa chất… Lactobacillus sporogenes chuyển từ dạng tế bào
sinh dưỡng sang dạng bào tử, là thể nghỉ của vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh
trưởng. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm trở lại và phát triển thành tế
bào sinh dưỡng.
Bào tử của Lactobacillus sporogenes có hình elip, nằm ở một đầu tế bào
sinh dưỡng, có kích thước 0,9 – 1,2 µm × 1,0 – 1,7 µm [9]. Cấu tạo chi tiết của
bào tử Lactobacillus sporogenes được mô tả theo hình sau:


8

Hình 1.2. Cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes
Cấu tạo bao gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng ngoài (outer
coat), màng trong (inner coat), lớp vỏ dưới màng trong (cortex), màng vỏ
của vách tế bào mầm (cortical membrane of the germ cell wall), tế bào
chất sát nhập vào tế bào mẹ (incorporated mother cell cytoplasma), nguyên
sinh chất (core or protoplast), vật chất nhân (nuclear material) [9], [38].
Một số đặc tính của bào tử Lactobacillus sporogenes:
 In vitro
Bào tử Lactobacillus sporogenes bền với nhiệt và chịu được các tác động

bất lợi từ môi trường: chúng vẫn sống ngay cả sau khi xử lý nhiệt ở 100oC trong
20 phút trong dung dịch đệm phosphat pH 7 và có khả năng nảy mầm trở lại kể
cả trong dịch pha loãng của acid HCl (pH 4,6 – 5,6) hay của NaOH (pH 7,6 –
9,6), trong dịch muối (nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nước
cất; bào tử có khả năng chịu được kháng sinh gấp 2 – 8 lần so với tế bào sinh
dưỡng [9].
 In vivo


9

Sau khi được đưa vào cơ thể, Lactobacillus sporogenes xuống đến dạ dày
ở dạng bào tử. Dưới tác động của pH thấp và sự co bóp của dạ dày, các lớp màng
của bào tử hút nước và trương phồng lên; sự gia tăng hàm lượng nước làm tăng tỉ
lệ trao đổi chất trong bào tử, chồi hình thành và ló ra ngoài lớp màng của bào tử.
Khoảng thời gian trung bình từ lúc uống đến lúc bào tử nảy chồi trong tá tràng là
khoảng 4 – 6 giờ, khoảng 85% vi khuẩn ban đầu xuống được đến ruột, tại tá
tràng, bào tử nảy mầm và phát triển nhanh chóng. Bào tử Lactobacillus
sporogenes tồn tại trong ống tiêu hóa khoảng 7 ngày, sau đó được thải trừ ra
ngoài qua phân [9], [23].
1.4.2. Vai trò của Lactobacillus sporogenes
Lactobacillus sporogenes có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật
gây bệnh. Hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng đường ruột cấp tính gây ra bởi
vi khuẩn gây bệnh ở động vật; cho hiệu quả điều trị cao hơn khi phối hợp với vi
khuẩn probiotic truyền thống khi điều trị cho con người.
Lactobacillus sporogenes còn ngăn ngừa tiêu chảy có nguyên nhân liên quan
đến kháng sinh. Việc phối hợp điều trị cho thấy giảm số lượng bệnh nhân tiêu
chảy và rút ngắn thời gian tiêu chảy.Cải thiện sức khỏe đường ruột. Hiệu quả
trong việc giảm co thắt đường ruột, đau bụng và đầy hơi ở bệnh nhân bị hội
chứng ruột kích thích.Cải thiện đau bụng, chướng bụng và các triệu chứng

đường tiêu hóa.
Hơn thế nữa Lactobacillus sporogenes có thể liên kết với cholesterol trong ruột
và ức chế enzym sản xuất cholesterol HMG- CoA reductase, giúp làm giảm
tổng lượng cholesterol trong huyết thanh [23].


10

1.4.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về L. sporogenes
Lactobacillus sporogenes thể hiện đặc tính của cả hai chi Lactobacillus và
Bacillus. L. sporogenes được phân lập và mô tả lần đầu tiên vào năm 1933 bởi
Horowitz-Wlassowa và Nowotelnow, sau đó được phân loại lại thành Bacillus
sporogenes. L. sporogenes là vi khuẩn Gram dương, di động, xếp đơn lẻ hoặc
hiếm gặp hơn, tồn tại thành các chuỗi ngắn với độ dài khác nhau. Bào tử của L.
sporogenes là tế bào hình elip nằm tại một trong các cực của tế bào, có khả năng
chịu nhiệt và các điều kiện môi trường bất lợi, nảy mầm ngay cả trong dung dịch
HCl hoặc NaOH loãng [25]
Lactobacillus sporogenes có thể phát triển tối ưu ở nhiệt độ 35-50°C và
pH trong khoảng 5.5 và 6.5. Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy tiện (hay hiếu
khí không bắt buộc), lên men maltose, mannitol, raffinose, sucrose và trehalose,
sinh axit nhưng không sinh khí. Những đặc điểm này cho thấy chúng phát triển
tốt trong môi trường acid và nhiều báo cáo cho thấy chúng thường là nguyên
nhân gây hỏng các sản phẩm từ sữa, rau quả do sản sinh một lượng lớn acid
lactic [25]. L. sporogenes còn được sản xuất axit lactic và các sản phẩm khác
như: enzyme chịu nhiệt và dung môi hữu cơ có thể được ứng dụng trong sản xuất
công nghiệp [41].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về L. sporogenes (hay Bacillus coagulans)
còn khá ít hoặc chưa được công bố nhiều. Năm 2005, tại trường Đại học Nông
lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trần Hạnh Triết đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm
sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes [9].

11

1.5. Phƣơng pháp đông khô
1.5.1. Khái niệm:
Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng
cách thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà
không qua trạng thái lỏng. Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật
liệu thành thể rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu. Như vậy, đông
khô được thực hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp
(thường là âm). Chế độ làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước. Ở áp suất nhất
định, nhiệt độ thăng hoa của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng
hoa cũng tăng [10], [27], [29].
1.5.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô
 Giai đoạn lạnh đông: Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc
được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ
trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới
nhiệt độ điểm ba của ẩm [10], [27], [29].
 Giai đoạn thăng hoa: Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng
thời tiến hành hút chân không. Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ
thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ
trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng [10], [27], [29].
 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của
vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng. Quá trình sấy trong
giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị sấy chân không bình
thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai
đoạn thăng hoa [10], [27], [29].

12

1.5.3. Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp đông khô
 Ưu điểm: Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển
trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với
các phương pháp sấy khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ
được hoạt tính sinh học; bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không
làm biến chất albumin…; giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng
có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu [27].
 Nhược điểm: Giá thành thiết bị cao. Vận hành phức tạp, đòi hỏi người
thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao. Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản
phẩm tăng cao. Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng
khi yêu cầu sản phẩm phải có chất lượng cao [27].
1.5.4. Một số tá dƣợc thƣờng dùng trong đông khô vi sinh vật
Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để giữ được độ
sống sót của vi sinh vật với nồng độ cao [12]. Tuy nhiên, trong quá trình này, vi
khuẩn vẫn gặp phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông.
Một số nghiên cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển
nước thành băng là nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào. Các tinh thể
nước đá lớn hình thành bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm
tăng nồng độ chất tan bên ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng
dẫn đến một số tình trạng như thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất
lớp màng kép hay phá hủy các cơ quan trong tế bào. Tiếp theo là sự hình thành
các tinh thể nước đá bên trong tế bào. Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong
tế bào vẫn chưa rõ ràng, nhưng có thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự
hình thành bong bóng khí trong tế bào và phá vỡ bào quan [13]. Một số nghiên
cứu khác lại cho rằng nước kết tinh và nhiệt độ thấp làm biến tính protein và tổn


13

thương màng vi khuẩn tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại,
độ nhạy cao hơn với không khí và mất khả năng sinh sản [26]. Để ngăn chặn
hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá
dược bảo vệ trong quá trình đông khô [12].
Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất
được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào
trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm
khô [26].
Một số tá dược được sử dụng trong đông khô bao gồm: sữa gầy là sữa béo
đã loại bỏ các acid béo, thành phần gồm lactose (chủ yếu), acid amin, các
vitamin và khoáng chất; các loại đường như glucose, lactose, dextrin glucose,...
Các acid amin: arginin, acid glutamic,... Peptid, protein, dịch chiết sinh học tự
nhiên và polyme.
Trong nghiên cứu này tá dược được sử dụng là sữa gầy:
Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành
phần có chứa không quá 0,5% chất béo. Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa
gầy: 32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose.
Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có
thể thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường protein. Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại
đi. Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra
một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của
tế bào ở mức thấp nhất [15].
Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa giúp ổn định pH trong quá
trình đông khô [26].


14

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
2.1: Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1 Nguyên vật liệu:
 Chủng Lactobacillus sporogenes do Bộ môn Công Nghiệp Dược trường
Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
 Chủng Bacillus subtilis ATCC 6633 do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung
ương cấp.
Bảng 2.1: Nguyên liệu pha môi trường
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

Pepton

Merk-Đức; Ấn Độ

Cao thịt

Merk- Đức

Cao nấm men

Merk- Đức

K2HPO4

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Triamoni citrate

Trung Quốc

Acetat natri

Trung Quốc

Sữa gầy

Trung Quốc

Natri clorid

Trung Quốc

Thạch agar

Việt Nam

15

2.1.2. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
 Môi trường MRS lỏng (MT 1)
Glucose

2.0 g

Triamoni citrate

0.2 g

Pepton

1.0 g

K2HPO4

0.2 g

Cao thịt

1.0 g

MgSO4.7H2O

0.02 g

Cao nấm men

0.5 g

MnSO4.4H2O

0.005 g

Natri acetat

0.5 g

Nước máy vừa đủ

100 ml

 Môi trường MRS thạch (MT 2)
MT 2 = MT 1 + Thạch agar (2 g/100 mL môi trường)
 Môi trường canh thang (MT3)
Pepton

1.0

Cao thịt

0.5 g

Natri clorid

0.5 g

Nước máy vừa đủ

100 ml

 Môi trường sữa gầy:
Sữa gầy

10.0 g

Nước cất vừa đủ

100 ml

 Môi trường sản xuất bào tử (MT4) (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương)
Pepton

10.0 g

Cao nấm men

3.0 g

Cao thịt

3.0 g

Glucose

3.0 g

Mangan sulfat

0.001 g

Thạch

15.0 g

Nước

1000 ml


16

2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân phân tích

Đức ( Satorious)

Cân kỹ thuật

Đức ( Satorious)

Lò vi sóng

Hàn Quốc

Máy lắc

Đức

Máy ly tâm

Đức

Máy Vortex

Đức

Nồi hấp tiệt khuẩn

ALP- Nhật

Tủ cấy vô trùng

Trung Quốc

Tủ lạnh

Nhật

Kính hiển vi

Nhật

Tủ lạnh sâu

Đức

Thiết bị đông khô

Đức

- Các dụng cụ sử dụng: Ống nghiệm, bình nón, đĩa petri, đèn cồn…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes
- Khảo sát ảnh hưởng của lượng dịch nuôi cấy ban đầu đến số lượng L.
sporogenes trong nguyên liệu đông khô.
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến số lượng L. sporogenes trong
nguyên liệu đông khô.


17

2.2.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trong quá
trình bảo quản
- Đánh giá số lượng vi sinh vật và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời
gian bảo quản .
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường MRS thạch (MT2) theo công thức ở mục 2.1.2, đun nóng
làm đồng nhất các thành phần trong môi trường, phân phối vào các ống
nghiệm, mỗi ống 7 ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút. Đặt các
ống nghiệm nằm nghiêng, môi trường không lên quá 2/3 chiều cao của ống, để

yên cho đến khi mặt thạch đông lại. Dùng que cấy cấy giống từ khuẩn lạc vi
sinh vật sang ống thạch nghiêng, đặt nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 48 giờ [1],
[6].
Định kỳ cấy truyền giống sang môi trường thạch nghiêng mới sau mỗi 1 –
2 tháng nhằm giữ được hoạt tính vi khuẩn.
2.3.2. Phƣơng pháp nuôi cấy
 Hoạt hóa giống
Pha 100 ml môi trường MRS lỏng (MT1) theo công thức ở mục 2.1.2
vào bình nón dung tích 250 ml, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút, để nguội.
Dùng que cấy cấy một vòng khuẩn lạc từ ống giữ giống vào bình môi trường,
đặt trong máy lắc ở 37 oC và tốc độ lắc 110 vòng/phút trong 48 giờ [1], [5].