Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý đến khả năng hình thành bào tử của Bacillus clausii

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH HIỀN
Mã sinh viên: 1101178

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI
GIAN NUÔI CẤY VÀ NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ
ĐẾN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH
BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH HIỀN
Mã sinh viên: 1101178

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI
GIAN NUÔI CẤY VÀ NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ
ĐẾN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH
BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đàm Thanh Xuân
2. DS. Nguyễn Thị Thu Phƣơng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dƣợc

Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô
giáo TS. Đàm Thanh Xuân, người thầy đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt những kiến
thức quý báu, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh, DS. Nguyễn Thị Thu Phương
cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã giúp đỡ, góp ý
cho em những ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa
luận này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức nhiệt tình của các anh chị kỹ thuật
viên trong bộ môn Công nghiệp Dược.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy cô giáo trong
trường đã tận tình dạy dỗ và dìu dắt em trong năm năm học tại trường.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ủng hộ, khích lệ và hết
lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận
còn nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Phạm Thị Thanh Hiền


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1 Probiotics ...................................................................................................... 2
1.1.1 Đại cương về probiotics ............................................................................... 2
1.1.2 Bào tử ........................................................................................................... 4
1.2 Bacillus clausii .............................................................................................. 7
1.2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái của Bacillus clausii ........................................... 7
1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii. ..................................................................... 9
1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan tới B.clausii. .................................................. 12
1.3 Phƣơng pháp đông khô. ............................................................................ 13
1.3.1 Khái niệm về phương pháp đông khô. ....................................................... 13
1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô ....................................................... 13
1.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô ............................................... 14
1.3.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô ......................................................... 14
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị. ............................................................ 15
2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất. ................................................................................. 15
2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu. ........................................................ 16
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ. .................................................................................... 16
2.2 Nội dung nghiên cứu. ................................................................................ 17
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được
sinh khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii. ............................................................. 17
2.2.2 Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu
Bacillus clausii ở dạng bột đông khô. ....................................................................... 17


2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu. ......................................................................... 17

2.3.1 Hoạt hóa và nhân giống. .............................................................................. 17
2.3.2 Phương pháp xử lý sinh khối thu bào tử trong môi trường lỏng. .............. 18
2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu bào tử trên môi trường rắn. ............................. 19
2.3.4 Xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tục......... 19
2.3.5 Phương pháp cân xác định lượng sinh khối và bào tử thu được. ............... 21
2.3.6 Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật. .............. 21
2.3.7 Phương pháp nhuộm màu quan sát tế bào sinh dưỡng và bào tử (phương
pháp Ogietska). ......................................................................................................... 21
2.3.8 Phương pháp xác định hàm ẩm của bột đông khô. ...................................... 22
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. ........................... 23
3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu
đƣợc sinh khối dƣới dạng bào tử Bacillus clausii. ............................................ 23
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành bào
tử B. clausii. .............................................................................................................. 23
3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng tạo bào
tử của B. clausii. ........................................................................................................ 28
3.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng và độ ổn định của nguyên liệu ở
dạng bột đông khô chứa Bacillus clausii. .......................................................... 34
3.2.1 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu ở dạng bột đông khô
chứa B. clausii. .......................................................................................................... 34
3.1.2 Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa B.
clausii………………………………………………………………………………35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

ARN

Acid Ribonucleic

ATCC
CFU
DSM

American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật
Hoa Kì)
Colony Forming Unit
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí
hiệu chủng giống thuộc bộ sưu tập vi sinh vật và tế bào của Đức)

ĐK

Đông khô

FAO

Food and Argiculture Organization

MT1

Môi trường canh thang

OD

Optical Density (mật độ quang)

SD

Standard Deviation

v/p

Vòng/Phút

VSV

Vi sinh vật

WHO

World Heath Organization


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT TÊN BẢNG

Trang

1

Bảng 1.1 Khả năng kháng kháng sinh của chủng Bacillus clausii

10

2

Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii

11

3

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

15

4

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

16

5

Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng và sinh bào tử của B. clausii theo

24

thời gian nuôi cấy
6

Bảng 3.2 Số lượng VSV trong các mẫu đông khô sau khi xử lý ở

30

các nhiệt độ khác nhau
7

Bảng 3.3 So sánh khả năng tạo bào tử của Bacillus clausii với

31

Bacillus subtilis theo phương pháp nuôi cấy trong môi trường rắn và
xử lý sinh khối để thu bào tử.
8

Bảng 3.4 Gía trị hàm ẩm và số lượng VSV trong thời gian bảo quản
của mẫu đông khô chứa B. clausii.

36


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

TÊN HÌNH

Trang

1

Hình 1.1 Sự hình thành bào tử vi khuẩn

5

2

Hình 1.2 Cấu tạo bào tử vi khuẩn

6

3

Hình 1.3 Vi khuẩn Bacillus clausii

8

4

Hình 1.4 Bào tử vi khuẩn B. clausii dưới kính hiển vi (độ phóng đại

8

1000 lần)
5

Hình 3.1 Lượng sinh khối và bào tử B. clausii thu được theo thời

25

gian
6

Hình 3.2 Hình ảnh tế bào và bào tử của B. clausii sau thời gian nuôi

26

cấy 1 ngày và 4 ngày (dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần)
7

Hình 3.3 Hình ảnh tế bào và bào tử của B. clausii trước và sau khi

29

xử lý nhiệt (dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần)
8

Hình 3.4 Biến thiên số lượng VSV B. clausii theo nồng độ Mn2+ và

30

nhiệt độ xử lý.
9

Hình 3.5 Biến thiên hàm ẩm và số lượng VSV B. clausii trong mẫu
đông khô trong thời gian bảo quản.

37


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đường ruột con người chứa một lượng rất lớn hệ vi sinh vật với khoảng hơn 100
tỉ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi (như các loài thuộc chi Lactobacillus,

Bifidobacterium) và vi sinh vật có hại (như Clostridium, Staphylococcus…). Hệ vi sinh
vật đường ruột thường xuyên chịu tác động bởi các yếu tố như chế độ ăn, sự lão hóa,
dùng kháng sinh,… làm mất cân bằng giữa vi khuẩn có hại và vi khuẩn có lợi, tạo điều
kiện cho vi khuẩn có hại lấn át và gây bệnh, điển hình là bệnh tiêu chảy. Vì vậy việc
duy trì sự cân bằng của hệ vi sinh đường ruột là vô cùng quan trọng trong việc hỗ trợ
các chức năng về tiêu hóa cũng như miễn dịch. Sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi
probiotic nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột, phòng và trị bệnh được sử dụng khá
phổ biến và ngày càng có xu hướng gia tăng cả về số lượng và dạng bào chế. Tuy
nhiên, theo các báo cáo gần đây, khoảng 50% sản phẩm probiotic trên thị trường Việt
Nam không đủ về số lượng vi sinh vật còn sống, thậm chí không có vi sinh vật sống.
Sự bất cập này xảy ra có lẽ là do các nghiên cứu trong nước về quy trình nuôi cấy tạo
nguyên liệu probiotic cung cấp cho sản xuất thuốc còn hạn chế 5 7.
Trong các chế phẩm probiotic, một sản phẩm hiện đang rất được ưa sử dụng là
Enterogermina chứa Bacillus clausii dạng bào tử (đăng ký ở Italy năm 1958). Tuy
nhiên rất khó để tìm thấy các tài liệu công bố về quy trình sản xuất và xử lý sinh khối
để thu được bào tử Bacillus clausii độ tinh sạch cao. Để giải quyết vấn đề này chúng
tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý
đến khả năng hình thành bào tử của Bacillus clausii ”, với các mục tiêu sau:
1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được sinh
khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii.
2. Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu ở dạng
bột đông khô.


2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1 Probiotics
1.1.1 Đại cƣơng về probiotics
1.1.1.1 Khái niệm

Probiotics là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là „dành cho sự sống‟,
dùng để chỉ các loài vi sinh vật mang lại những tác động có lợi cho con người và cho
vật chủ. Năm 1989, Fuller đã đưa ra định nghĩa về probiotics: „„Probiotics là hỗn hợp
vi khuẩn sống mà khi cung cấp cho cơ thể vật chủ sẽ đem lại hiệu quả có lợi thông qua
sự cân bằng hệ vi sinh đường tiêu hóa‟‟ 37.
Probiotics từ lâu đã được phát hiện và sử dụng làm thực phẩm cho con người.
Nhóm các vi khuẩn sinh lactic được Elie Metchnikoff (1845 – 1916) phát hiện khi ông
nghiên cứu mối liên quan giữa chế độ ăn có sử dụng sữa lên men với sự khỏe mạnh và
kéo dài tuổi thọ của người dân Bulgary 37. Cùng thời gian đó, lần đầu tiên
Bifidobacterium cũng được tìm thấy trong phân của những trẻ sơ sinh bú mẹ bởi bác sỹ
người Pháp Henry Tissier 37.
Theo WHO và FAO, để có được hiệu quả thực sự thì VSV trong các chế phẩm
probiotic cần phải đi qua được môi trường dạ dày và đến được vị trí tác dụng trên
đường tiêu hóa. Chính vì thế, các probiotic luôn phải có ít nhất 108 – 109 cfu/ml tế bào
VSV sống 35 36.
Ngày nay, probiotics được đưa vào rất nhiều các chế phẩm khác nhau từ thuốc
cho tới thực phẩm chức năng. Ngoài các chi quen thuộc như Lactobacillus,
Bifidobacterium, Bacillus,… còn rất nhiều chi cũng đang được nghiên cứu và ứng dụng
rộng rãi. Enterogermina (chế phẩm đăng ký tại Italy năm 1958) chứa probiotic Bacillus
clausii cũng là một chế phẩm hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường.


3

1.1.1.2 Probiotics đối với sức khỏe
Theo các nghiên cứu đã công bố về lợi ích của probiotics, probiotics có các tác
dụng sau:
 Tác dụng dinh dưỡng
Một số vi khuẩn probiotic có khả năng sinh các enzym ngoại bào như amylase,
protease (B. clausii), lipase (Bifidobacteria)… giúp tiêu hóa thức ăn hay các vi khuẩn

thuộc nhóm lactic có khả năng phân giải chất xơ tạo ra các chất mà cơ thể có thể tiêu
hóa được 16 17 54.
Sản phẩm sữa chua chứa vi khuẩn probiotic có hoạt tính beta-galactosidase, giúp
cải thiện tiêu hóa lactose và loại trừ các triệu chứng không dung nạp ở những người
kém hấp thu lactose 47.
 Khả năng phòng và trị bệnh
- Sử dụng các VSV probiotic có tác dụng làm giảm tiêu chảy do rotavirus, giảm
tiêu chảy do kháng sinh và do thuốc nói chung. Chế phẩm chứa các loại VSV như
Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, nấm men làm giảm đáng kể
sự phát triển của bệnh tiêu chảy liên quan kháng sinh. Một số nghiên cứu cho rằng chi
nấm men Saccharomyces boulardii được sử dụng hiệu quả cho bệnh do Clostridium
difficile gây ra 44.
- Bệnh không dung nạp lactose: Người thiếu men lactase nếu tiêu thụ một lượng
lactose lớn sẽ gây ra các triệu chứng đầy hơi, buồn nôn, tiêu chảy. Tuy nhiên tình trạng
này sẽ được cải thiện đáng kể nếu họ sử dụng sữa lên men, do trong sữa lên men lượng
lactose đã giảm đi đáng kể, ngoài ra sữa lên men còn chứa một lượng lactase có nguồn
gốc từ vi sinh vật giúp tiêu hóa đường lactose 47.
- Viêm đại tràng giả (do Clostridium difficile) : khi dùng Lactobacillus sẽ ngăn
ngừa tái phát cho bệnh nhân viêm đại tràng giả đã được điều trị. Sử dụng probiotics
không thay thế được thuốc kháng sinh nhưng có thể xem như là một phương tiện để
sửa chữa những thiếu sót trong cơ thể vật chủ bởi chế độ ăn uống và môi trường, stress;


4

làm cho vật chủ đề kháng hơn với bệnh tật và làm giảm tần suất sử dụng kháng sinh
44.
- Tác dụng lên bệnh viêm ruột hoại tử ở trẻ nhẹ cân non tháng, một nghiên cứu cho
thấy : chế độ ăn probiotics Infloran - sản phẩm chứa Lactobacillus acidophilus và
Bifidobacterium infantis kết hợp cùng sữa mẹ giúp giảm tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm

trọng của viêm ruột hoại tử so với trẻ chỉ dùng sữa mẹ đơn thuần 40.
- Phòng dị ứng: Lactobacillus GG đã có hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh dị
ứng sớm, chàm dị ứng ở trẻ em có nguy cơ cao 31 45.
- Bệnh lý về gan: Các vi khuẩn đường ruột gây ra các tín hiệu nội sinh làm giảm
tình trạng gan nhiễm mỡ do làm giảm tổng lượng axit béo tại gan và giảm alanine
aminotransferase huyết thanh. Vi khuẩn probiotic có thể lên men carbohydrat không
thể tiêu hóa và tạo các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những chất này ức chế sự tổng
hợp cholesterol trong gan, hoặc điều hòa lượng cholesterol trong huyết tương, vì vậy
làm giảm lượng cholesterol trong máu. Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và
cản trở sự hấp thu cholesterol từ đường ruột 57.
- Vi khuẩn có lợi làm tăng đáp ứng miễn dịch cả miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch
không đặc hiệu. Tăng cường chức năng đại thực bào, tăng số lượng và tăng hoạt động
của các tế bào diệt tự nhiên, tăng sản xuất kháng thể, tăng sinh tế bào lympho [31]57.
1.1.2 Bào tử
1.1.2.1 Sự hình thành bào tử
Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn nhóm Bacillus có khả năng hình thành nội bào
tử. Qúa trình bào tử hóa bắt đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức ăn
cạn kiệt hoặc có tích lũy sản phẩm có hại. Ở các loài thuộc chi Bacillus quá trình hình
thành bào tử tương tự nhau [3].


5

Hình 1.1 Sự hình thành bào tử vi khuẩn.
Qúa trình hình thành bắt đầu với tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành
chromosome riêng biệt. Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2
phần không đều.
Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất. Vỏ bào tử được hình thành.
Áo bào tử được hình thành. Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử.
Ba enzyme được biết đến đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành bào

tử là glutamine synthetase, RNA polymerase, và pyruvate kinase. Pyruvate kinase là
enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa phosphoenolpyruvate có vai trò trong cả
tăng trưởng (glycolysis) và hình thành bào tử. Glutamine synthetase là enzyme lớn chịu
trách nhiệm cho amoniac để hợp thành axit amin tham gia vào tạo thành bào tử bằng
các sản phẩm catabolic chứa nitơ 33.
Hầu hết vi khuẩn Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể cảm ứng tạo bào
tử. Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt,
đặc biệt là việc thiếu nguồn carbon, nito, hoặc phospho 3.


6

Với Bacillus subtilis, một số nghiên cứu chỉ ra pH thích hợp để tạo lượng bào tử
nhiều nhất là từ khoảng 6 – 8 26. Mangan được cho là yếu tố kích thích quá trình tạo
bào tử ở một số vi khuẩn. Trong quá trình hình thành bào tử, ion mangan trong môi
trường sẽ bị oxy hóa thành mangan oxyd bám trên bề mặt bào tử tạo cho bào tử khả
năng kháng nhiệt 27. Theo N. Vasantha và Ernst Freese, Mn2+ là yếu tố cần thiết để
hình thành bào tử, chúng tham gia kích hoạt PGA-Mutase do đó ngăn cản sự tích tụ của
các ức chế 3-PGA và đảm bảo việc cung cấp các hợp chất carbon trong cả hai phần của
con đường chuyển hóa kết nối bởi PGA-Mutase 41 50. Quá trình hình thành bào tử
này thường mất khoảng 6 – 8 tiếng, tạo ra bào tử tự do có cấu trúc vững bền, chịu được
các điều kiện khắc nghiệt. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử lại nảy mầm tạo tế bào
sinh dưỡng 32.
1.1.2.2 Cấu tạo của bào tử
Bào tử gồm nhiều lớp bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN. Lớp áo ngoài,
lớp áo trong, vỏ bào tử, lõi.

Hình 1.2: Cấu tạo bào tử vi khuẩn.

7

Bào tử có các lớp bao bọc, bề mặt các lớp này xù xì với thành phần hóa học chủ
yếu là protein có nhiều glycin, tyrocin và cystein… Có chức năng bảo vệ lớp
peptidoglycan của bào tử khỏi tác nhân bên ngoài như enzym, UV, chất oxy hóa…
Lớp peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong giúp bào tử không bị khử
nước, tạo sự bền vững của dạng sống tiềm sinh. Lớp này tích điện âm, trong quá trình
nảy mầm, lớp này sẽ bị phân giải do enzym trong bào tử.
Lõi bào tử gồm các thành phần như protein bào tương, ribosom, thể nhân chứa
ADN 18.
Bào tử vi khuẩn có sức chịu đựng cao với môi trường xung quanh. Đó là do :


Nước trong bào tử ở trạng thái liên kết, ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ hơn.



Bào tử có một lượng calci dipicolinat liên kết với protein tạo thành phức chất

có tính ổn định cao hơn với nhiệt độ và sự thay đổi của môi trường. Bào tử còn chứa
protein acid hòa tan phân tử nhỏ (SASPs). Những protein này liên kết chặt chẽ và
ngưng tụ các ADN, có khả năng chống tia UV và các hóa chất gây tổn hại ADN.


Cấu trúc màng nhiều lớp, vỏ bào tử dày, làm giảm tính thẩm thấu của môi

trường tới bào tử, bào tử hạn chế sự trao đổi chất với bên ngoài 3.
Bào tử vi khuẩn gặp điều kiện thuận lợi về độ ẩm nhiệt độ, dinh dưỡng… sẽ nảy
mầm thành tế bào sinh dưỡng. Sự nảy mầm theo ba giai đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và
sinh trưởng 13.

1.2 Bacillus clausii
1.2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái của Bacillus clausii
 Phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey (1994) Bacillus clausii thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus clausii


8

 Phân bố: Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất
vườn hoặc đất sét (Bacillus clausii ATCC 31084, Bacillus clausii DSM 8716…) 27.
Ngoài ra có thể tìm thấy Bacillus clausii ở trong nước, trong bùn (Bacillus clausii MB9
được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ) 27.
 Hình thái: Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành
chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục.
Bacillus clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm.

Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus clausii

Hình 1.4: Bào tử vi khuẩn Bacillus
clausii độ phóng đại 1000 lần

 Sinh hóa: Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein,
gelatin và tinh bột nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Cho
phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat thành nitrit 10 53.
 Điều kiện nuôi cấy: Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình
nuôi cấy cần cấp khí.
Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50ºC. Mỗi chủng sẽ có nhiệt độ thích hợp

khác nhau, ví dụ: chủng Bacillus clausii DSM 8716 có nhiệt độ thích hợp là 30ºC,


9

chủng Bacillus clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40ºC… Khoảng pH nuôi cấy
thích hợp từ 7-10. Chủng Bacillus clausii KSM-K16 có pH thích hợp là 9,0.
Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon bao gồm: Glucose, Laribose, xylitol, galactose, dulcitol, sorbitol, meth1yl AD-mannoside, mannose, Nacetylglucosamine, D-tagose, 2-ketogluconate 10 53 55.
1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii.
Bacillus clausii là vi khuẩn an toàn, có ứng dụng chủ yếu trong chế phẩm
probiotic và sản xuất enzym đặc biệt là protease 28 39.
 Chế phẩm probiotic
Bacillus clausii là loài vi khuẩn hiếu khí, có khả năng tạo bào tử và bền vững
trong môi trường acid của dịch vị dạ dày. Bacillus clausii trên thị trường có bốn loài,
mỗi loài kháng một loài kháng một số kháng sinh nhất định. Enterogermina® là chế
phẩm chứa Bacillus clausii của Ý. Nó là hỗn vi sinh vật bao gồm bốn chủng kháng
thuốc kháng sinh OC, NR, T và SIN 22 46 52 49. Sự phân biệt bốn chủng
Bacillus clausii dựa trên protein 2-DE (proteomics). Proteomics là thành phần protein
ngoại bào (secretome) của bốn probiotic OC, SIN, NR, và T 19 20].


10

Báng 1.1 Khả năng kháng kháng sinh của chủng Bacillus clausii.

Kháng sinh

Số lƣợng chuỗi kháng sinh

Penicillin

4/4

Cephalosporin

4/4

Aminoglycosid (kanamycin, tobramycin, amikacin)

1/4 (SIN)

Macrolid

4/4

Tetracyclin

1/4 (T)

Chloramphenicol

4/4

Rifampicin

1/4 (NR)

Nhạy cảm với carbapenem, co- trimoxazole, fluoroquinolon, gentamicin,
glycopeptid, oxazolidinon, streptogramin.

Bacillus clausii thường được dùng trong các chế phẩm dược phẩm và một số thực
phẩm chức năng để bổ sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột, giúp phòng ngừa và
phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em, đặc biệt là sau khi dùng
kháng sinh kéo dài 46.


11

Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii
Dạng
bào chế
Hỗn
dịch,
viên
nang
Hỗn dịch

Tên thƣơng
mại

Thành phần

1

Enterogermina

Bào tử B. clausii

2

Ginkid

Bào tử B. clausii

3

Bazivic

Bào tử B. clausii,
B. subtilis,
Thuốc bột
B. licheniformis, Vitamin,
taurin, lysine, calci.

4

Spobio Cl

Bào tử B. clausii

Hỗn dịch

Bioimucan

Bào tử Bacillus subtilis,
Bào tử Bacillus clausii,
Bào tử Bacillus
coagulans, beta-glucan,
taurin, lycin, cholin,
kem, B1, B2, B5, B6,

B9, Canxi.

Công ty CP Dược
Thuốc cốm phẩm INFO Việt
Nam

Insotac

L. sporogenes,
B. clausii

STT

5

6

Thuốc bột

Nhà sản xuất
Sanofi-Synthelabo
S.P.A
Công ty CP Dược
phẩm Quốc tế
Abipha
Công ty TNHH
vaccin và sinh phẩm
Nha Trang
Công ty cổ phần
ANABIO

CT TNHH Dược
Phẩm
Mê Linh

 Sản xuất enzym
+ Một số chủng Bacillus clausii ví dụ: Bacills clausii KSM-K16 được sử dụng
trong sản xuất protease. Đây là một enzym quan trọng chiếm trên 65% thị trường các
enzym công nghiệp 38. Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như chất
tẩy rửa, công nghiệp thuộc da…. Cũng giống như các sinh vật Bacillus khác, Bacillus
clausii KSM-K16 tiết ra protease trực tiếp vào môi trường, đặc biệt là trong thời kỳ


12

dinh dưỡng thấp, cùng với quá trình hình thành bào tử. Hoạt tính enzym protease đạt
được ở 55ºC và pH là 12,3 28 39.
 Sản xuất surfactants
Vi sinh vật Bacillus clausii 5B còn được nghiên cứu sinh tổng hợp biosurfactants
hiện đang được ứng dụng rộng lớn trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, nông
nghiệp và các ngành công nghiệp hóa dầu. Ưu điểm của biosurfactants là thân thiện
môi trường, độc tính thấp, phân hủy sinh học, khả năng tương thích môi trường tốt hơn,
tạo bọt nhiều hơn, tính chọn lọc cao, hoạt động cụ thể tại nhiệt độ khắc nghiệt, độ pH
và độ mặn 15.
1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan tới B. clausii.
Trên thế giới:
+ Gabriella Casuala and Simon M. Cutting tiến hành nghiên cứu tác dụng của
Enterogermina tới thành ruột của chuột cho thấy chế phẩm Enterogmina chỉ trong thời
gian ngắn đã gây đáp ứng miễn dịch ở chuột và loại bỏ vi khuẩn gây bệnh trong thành
ruột của chuột [21].

+ B. clausii còn được chứng minh có tác dụng tích cực, giúp điều hòa miễn dịch với trẻ
em bị dị ứng và nhiễm trùng đường hô hấp tái phát [23][24].
+ Nghiên cứu của Kobayashi cho kết quả enzyme M-protease sinh ra từ B. clausii
KSM-K16 có khả năng chịu nhiệt và tồn tại được pH cao [42].
Tại Việt Nam:
+ Trong Tạp chí khoa học của đại học Huế năm 2010 đã công bố thông tin B. clausii
B2/2 có khả năng bám dính đồng thời với vi khuẩn B. cereus và B. clausii B1 không
bám dính với B. cereus nhưng lại bám dính với Escherichia coli [2].
+ Tác giả Nguyễn Thị Bích Ngọc đã tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn vi
khuẩn B. clausii cho kết quả nguồn hydrat carbon thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn là
glucose 2% trong điều kiện hô hấp hiếu khí, thời điểm thích hợp thu sinh khối là sau 24
giờ nuôi cấy [9].


13

+ Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hiền cho kết quả 4 ngày là thời điểm B. clausii
hình thành bào tử nhiều nhất [4].
+ Nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Ngọc Bích cho thấy xử lý sinh khối B. clausii bằng
lysozym thu được bào tử tinh khiết và lớn [1].
+ Nghiên cứu của tác giả Phùng Thị Ngọc Huyền cho thấy tính ưu việt của mẫu
nguyên liệu bào tử B. clausii trong dung dịch NaCl 0,9% [8].
1.3 Phƣơng pháp đông khô.
1.3.1 Khái niệm về phƣơng pháp đông khô.
Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách
thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua trạng
thái lỏng. Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể rắn,
nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu. Như vậy, đông khô được thực hiện ở
môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp (thường là âm). Chế độ làm việc
phải thấp hơn điểm ba của nước. Ở áp suất nhất định, nhiệt độ thăng hoa của vật là

không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [14][43].
1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô
 Giai đoạn lạnh đông
Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên ngoài
buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời
làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm [14][43].
 Giai đoạn thăng hoa
Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không.
Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp
hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua
trạng thái lỏng [14][43].
 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại


14

Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng
thái lỏng. Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị
sấy chân không bình thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn
nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [14][43].
1.3.3 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp đông khô


Ƣu điểm
Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng

rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác
như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo vệ
nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ nguyên
được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại

trạng thái ban đầu [43].


Nhƣợc điểm

- Giá thành thiết bị cao.
- Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao.
- Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao.
Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản
phẩm phải có chất lượng cao [43].
1.3.4 Ứng dụng của phƣơng pháp đông khô
Đông khô được ứng dụng trong ngành dược: trong sản xuất các thuốc kháng sinh
(penicillin, cephalexin...); làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh vật.
Ngoài ra, đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong các
ngành công nghiệp thực phẩm, vi sinh, thú y... để bảo quản một số sản phẩm khác [43].


15

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị.
2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất.
 Nguyên liệu: Chế phẩm Enterogermina chứa Bacillus clausii.
 Hóa chất.
Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất pha môi trƣờng
Hóa chất

Hóa chất sử dụng thu bào tử

Xuất xứ

Hóa chất

Xuất xứ

Pepton

Ấn Độ

Lysozym

Viện kiểm nghiệm

Cao thịt

Merck – Đức

KH2PO4

Trung Quốc

NaCl

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc

Thạch bột

Việt Nam

KCl

Trung Quốc

Glucose

Trung Quốc

NaCl

Trung Quốc

 Các dung dịch sử dụng trong đề tài: Pha theo DĐVN IV.
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,6:
Pha dung dịch KH2PO4 0,2M (100ml): Hòa tan 2,72 g KH2PO4 trong vừa đủ 100
ml nước cất.
Pha dung dịch NaOH 0,2M (100ml): Hòa tan 8,0 g NaOH trong vừa đủ 100 ml
nước cất.
Trộn 50,0ml dung dịch KH2PO4 0,2M với 42,8ml dung dịch NaOH 0,2M rồi
thêm nước cất vừa đủ 200ml.
- Dung dịch KCl 1M: Hòa tan 7,45g KCl trong vừa đủ 100ml nước cất.
- Dung dịch NaCl 1M: Hòa tan 5,84g NaCl trong vừa đủ 100ml nước cất.
- Dung dịch lysozym 1mg/ml: Hòa tan 0,100g lysozym trong vừa đủ 100ml
nước cất tiệt trùng.

16

- Dung dịch NaCl 0,9%: Hòa tan 9,0g NaCl trong vừa đủ 1000ml nước.
-

Ngoài ra còn 1 số dung dịch: dung dịch đỏ Fuchsin, dung dịch Xanh

methylen, dung dịch HCl 0,5%, dung dịch H2SO4 1%.
2.2.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu.
 Môi trường canh thang (MT1)

Pepton

1.0 g

Cao thịt

0.5 g

NaCl

0.5 g

Nước máy vừa đủ

100 ml

 Môi trường thạch thường (MT2) = MT1 + 1,8g thạch.
 Môi trường sản xuất bào tử (MT3) theo Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.

Pepton

10.0 g

Cao nấm men

3.0 g

Cao thịt

3.0 g

Glucose

3.0 g

Mangan sulfat

0.001 g

Thạch

15.0 g

Nước cất vừa đủ

1000ml

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ.
Bảng 2.2: Các thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tủ cấy vô trùng

Bioair (Italy)

Tủ ấm

Memmert (Đức)


17

Tủ lạnh sâu

Đức

Tủ lạnh

Toshiba (Nhật)

Tủ sấy

Memmert (Đức)

Tủ lắc

Bioshake (Đức)

Máy ly tâm

Rotofix (Đức)

Nồi hấp tiệt khuẩn

ALP – Nhật

Máy vortex

IKA (Đức)

Lò vi sóng

Daewoo (Hàn Quốc)

Cân kĩ thuật

Đức

Bình nón, đĩa petri, ống nghiệm, đầu côn, pipet,
cốc có mỏ, ống ly tâm, giấy lọc…

2.2 Nội dung nghiên cứu.
2.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu đƣợc
sinh khối dƣới dạng bào tử Bacillus clausii.
2.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành bào tử B.
clausii.

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng hình thành
bào tử của B. clausii.
2.2.2 Đánh giá đƣợc một số chỉ tiêu chất lƣợng và độ ổn định của nguyên liệu
Bacillus clausii ở dạng bột đông khô.
2.2.2.1 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa
B. clausii.
2.2.2.2 Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa B. clausii.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.3.1 Hoạt hóa và nhân giống.
 Hoạt hóa giống từ ống giống