Nghiên cứu quá trình lên men FED BATCH corynebacterium glutamicum thu nhận l lysine

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thanh Hương

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
FED-BATCH Corynebacterium glutamicum
THU NHẬN L-LYSINE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh-2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thanh Hương

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
FED-BATCH Corynebacterium glutamicum
THU NHẬN L-LYSINE
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh-2014

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực.
Việc tham khảo nghiên cứu của các tác giả khác đều được trích dẫn rõ ràng.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014
TÁC GIẢ LUẬN VĂN
Nguyễn Thanh Hương


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành được luận văn và được bảo vệ luận văn, em xin gửi đến Cô,
PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương lời cảm ơn sâu sắc nhất. Em xin cảm ơn Cô.
Con cảm ơn Mẹ đã cho con một chỗ dựa vững chắc để con có thể vượt qua mọi
khó khăn.
Em xin cảm ơn chị hai, anh rể và các cháu đã luôn ủng hộ em cả về tinh thần
và vật chất để em có được ngày hôm nay. Em cảm ơn chị hai đã luôn ở bên em.
Em cảm ơn Cô Minh Tâm đã giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Cô Ly Tao, cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công
nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho
em trong quá trình em tiến hành thực nghiệm tại đây.
Em xin cảm ơn các Thầy, Cô đã tham gia giảng dạy lớp Cao học Sinh học Thực
nghiệm K23, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã ở bên tôi.
Xin chân thành cảm ơn.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014
TÁC GIẢ LUẬN VĂN
Nguyễn Thanh Hương

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 3
1.1. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine ............................................................................ 3
1.1.1. Khái niệm ...................................................................................................... 3
1.1.2. Quá trình lên men .......................................................................................... 3
1.1.3. Các hình thức lên men ................................................................................... 3
1.2. Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum ....................................................................11
1.2.1. Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại ......................................................... 12
1.2.2. Đặc điểm sinh lý .......................................................................................... 13
1.2.3. Đặc điểm sinh hóa ....................................................................................... 13
1.2.4. Đặc điểm di truyền ...................................................................................... 14
1.3. Amino acid L-lysine ....................................................................................................16
1.3.1. Đặc điểm ...................................................................................................... 16
1.3.2. Vai trò và ứng dụng ..................................................................................... 17
1.3.3. Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn .................................................................... 19
1.3.4. Bản chất quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở vi khuẩn
Corynebacterium glutamicum ...................................................................... 20
1.3.5. Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium
glutamicum ................................................................................................... 23
1.4. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài ................ 26
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 29
2.1. Nguyên liệu .................................................................................................................. 29

2.2. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................................... 33
2.2.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống ............................................ 33
2.2.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu
nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm .......................... 33
2.2.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu
nhận L-lysine ................................................................................................ 35
2.3. Phương pháp phân tích thí nghiệm ............................................................................. 36
2.3.1. Phương pháp vi sinh .................................................................................... 36
2.3.2. Phương pháp hóa sinh ................................................................................. 38
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 39
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................................... 40
3.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống ........................................................... 40
3.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine
bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm ............................................................ 42
3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine .50
3.3.1. Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất ............................................... 50
3.3.2. Khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất................................................................. 53
3.3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu
nhận L-lysine ................................................................................................ 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 65
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1

Các hóa chất phân tích ...............................................................................29

Bảng 2.2

Các thiết bị sử dụng trong đề tài ................................................................30

Bảng 2.3

Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài...........................................31

Bảng 2.4

Các mức thí nghiệm sàng lọc .....................................................................34

Bảng 2.5

Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu ...........34

Bảng 3.1

Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 ...............40

Bảng 3.2

Kết quả thí nghiệm sàng lọc ......................................................................42

Bảng 3.3

Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát ....................................................43

Bảng 3.4

Kết quả thí nghiệm khởi đầu ......................................................................44

Bảng 3.5

Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu ..................................................45

Bảng 3.6

Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD ..........46

Bảng 3.7

Khả năng sử dụng đường của Corynebacterium glutamicum ...................52

Bảng 3.8

So sánh lên men batch và fed-batch........................................................... 61


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên
môi trường phức hợp. (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử
quét . ............................................................................................................. 12
Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 . .......................... 15
Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα và lysCβ
được cấu tạo bởi bốn chuỗi poplypeptide giống hệt nhau . ......................... 16
Hình 1.4 Cấu trúc không gian và cấu tạo phân tử của lysine ..................................... 17
Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine ở vi khuẩn. ................ 20
Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine ở Corynebacterium glutamicum .............. 21

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ......................................................................... 32
Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) và hình
dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b). .................. 41
Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể hiện sự ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp
lên lượng L-lysine ........................................................................................ 48
Hình 3.3 Đồ thị tối ưu ................................................................................................. 49
Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong lên men
batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine ............................... 50
Hình 3.5 Khả năng hình thành sinh khối, L-lysine và lượng đường sót khi nuôi
cấy Corynebacterium glutamicum ở các nồng độ glucose khác nhau ......... 54
Hình 3.6 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong quá
trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum-B-0632 .................. 57
Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine trong lên men batch và fed-batch ................ 58
Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả năng sinh trưởng của Corynebacterium glutamicum
trong lên men batch và fed-batch ................................................................. 59
Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót trong lên men batch và fed-batch ............. 60


1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Amino acid rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của người và động vật, đặc
biệt là các amino acid không thay thế. Sự thiếu hụt amino acid nói chung và các amino
acid không thay thế nói riêng sẽ dẫn đến tình trạng bệnh lý. L-lysine là một amino acid
thuộc nhóm không thay thế được quan tâm nhiều hơn cả, vì có nhu cầu khá cao, nhưng
lại thường bị thiếu hụt nhất trong khẩu phần ăn. Mặt khác, L-lysine dễ bị phân hủy trong
quá trình chế biến thức ăn và cơ thể tuyệt đối không tổng hợp được. Do đó, thiếu Llysine rất phổ biến, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Thiếu L-lysine làm giảm tổng hợp protein cơ
thể, trẻ biếng ăn, chậm lớn, thiếu men tiêu hóa….
Hiện nay, việc sử dụng công nghệ vi sinh để sản xuất L-lysine là hướng đang được

quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, quy trình sản xuất vẫn còn ở quy mô phòng thí
nghiệm, số lượng các nghiên cứu về sản xuất L-lysine còn ít, chủng giống chưa đạt
chuẩn, năng suất thấp [1].
Với mục tiêu cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine, chúng tôi chọn giải
pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch. Đây là lý do chúng
tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium
glutamicum thu nhận L-lysine”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine từ chủng vi khuẩn Corynebacterium
glutamicum-B-0632.
3. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống
Đại học Quốc Gia Hà Nội.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống.
2. Tối ưu hóa môi trường lên men thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch
thực nghiệm.
3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine.


2

5. Phạm vi nghiên cứu
Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng trong lên men batch, tạo tiền đề cho bước đầu
khảo sát lên men fed-batch gián đoạn thu nhận L-lysine ở quy mô phòng thí nghiệm.
6. Đóng góp của luận văn
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các thông số tối ưu của quá trình lên
men batch và bước đầu thử nghiệm lên men fed-batch. Kết quả này sẽ là tiền đề cho các
nghiên cứu tiếp theo.
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

Về mặt khoa học: đề tài góp phần khẳng định ưu điểm của phương pháp lên men
fed-batch trong lên men tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thu nhận amino
acid L-lysine.
Về mặt thực tiễn: cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine.


3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine
1.1.1. Khái niệm
“Lên men” là thuật ngữ được sử dụng từ khá lâu, có nguồn gốc từ tiếng La tinh
“fervere” có nghĩa là “làm chín” để chỉ hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây
hoặc ngũ cốc. Trong lĩnh vực hóa sinh, lên men được hiểu là sự tạo thành năng lượng từ
các quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, trong lĩnh vực vi sinh vật học, cụm
từ này lại được dùng để chỉ chung cho quá trình tạo ra sản phẩm bằng cách nuôi cấy vi
sinh vật thích hợp [28].
1.1.2. Quá trình lên men
Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kỵ khí. Quá
trình lên men bắt đầu từ sự phân giải các hợp chất chứa carbohydrate thành đường
glucose và kết thúc là sự tạo thành CO2 và một số hợp chất chứa carbon chưa được oxy
hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic,... Người ta thường dùng tên sản phẩm điển hình
tích lũy trong từng loại lên men để gọi quá trình lên men ấy. Ví dụ, quá trình lên men
tích lũy chủ yếu acid lactic thì gọi là lên men lactic (muối dưa, cà, làm sữa chua). Tuy
nhiên, có nhiều vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa không hoàn toàn cơ chất tạo ra
những sản phẩm giống như lên men kỵ khí, quá trình này cũng được gọi là lên men mà
thực chất là oxy hóa hiếu khí. Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa
quan trọng trong công nghiệp lên men, vì đã tạo ra những sản phẩm có giá trị [2].
1.1.3. Các hình thức lên men
Tùy theo cách phân loại mà có nhiều hình thức lên men khác nhau:

Theo tính chất môi trường: lên men dạng lỏng, lên men dạng rắn và bán rắn.
Theo đặc tính sử dụng oxy của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí và lên men kỵ
khí.
Theo trạng thái: lên men tĩnh (không khuấy trộn hay sục khí) và lên men động (có
khuấy trộn hoặc sục khí).
Theo mức độ kiểm soát của quy trình: lên men có kiểm soát (kiểm soát độ tạp
nhiễm, nồng độ cơ chất, pH…) và lên men không kiểm soát (tự nhiên).


4

Theo kỹ thuật lên men: lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục (continous) và
lên men dạng bán liên tục (fed-batch hay dạng mẻ có bổ sung).
Trong phần này, chúng tôi sẽ đề cập sâu hơn đến ba kỹ thuật lên men, đó là lên
men theo mẻ (batch), lên men liên tục và lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fedbatch).
1.1.3.1. Lên men theo mẻ
Lên men theo mẻ hay còn gọi là lên men batch. Đây là phương pháp nuôi cấy mà
trong suốt thời gian nuôi cấy, ta không thêm vào chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ
các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất, ngoại trừ ammoniac được thêm vào
để điều chỉnh pH (nếu có) [12], quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng không
gian nhất định. Vi sinh vật bắt buộc phải trải qua các pha sinh trưởng: pha lag, pha log,
pha ổn định và pha suy vong [2, 28].
Trong giai đoạn đầu (pha lag), gần như không có sự tăng trưởng đáng kể nào xảy
ra, chủ yếu là sự thích nghi của tế bào với môi trường mới. Trong thực tế sản xuất, cần
phải rút ngắn thời gian của pha này càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh
chóng bước vào pha tăng trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn.
Sau giai đoạn thích nghi là giai đoạn tăng trưởng và dần đạt đến tốc độ tối đa (pha
log) [28]. Sự tăng trưởng trong pha log được biểu diễn theo phương trình sau:
dx/dt = µx (1.1)
Trong đó: x là sinh khối vi sinh vật tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc độ

tăng trưởng (/giờ). Hằng số µ khác nhau tùy vào từng giai đoạn trong chu kỳ tăng
trưởng.
Từ phương trình (1.1) ta có:
dx/x = µdt


𝑡

𝑡

∫𝑡𝑡 𝑑𝑑/𝑥 = µ ∫𝑡𝑡 𝑑𝑑

 lnxt – lnxto = µ(t-to)

Trong đó, xto là lượng sinh khối ban đầu, xt là lượng sinh khối sau khi nuôi cấy t
giờ.
Trong pha log, chất dinh dưỡng còn nhiều, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật
trong điều kiện tối ưu nhất sẽ có µmax khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc rất lớn


5

vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và các sản phẩm do quá trình sinh
trưởng của chính vi sinh vật tạo ra. Nếu duy trì việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường
nuôi cấy ở pha log thì tăng trưởng vẫn đạt được tốc độ cao.
Sự tăng số lượng tế bào trong pha log diễn ra theo cấp số nhân với cơ số 2 theo
phương trình sau:
N = N0. 2n
Với N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ
 lg(N/N0) = n.lg2

 n = lg(N/N0). 1/0,301
 n = lg(N/N0). 3,32
Thời gian thế hệ được tính bằng công thức sau:
tg = t/n
với t là thời gian vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ.
Hằng số tốc độ phân chia K là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy:
K = n/t
Pha cân bằng, lượng sinh khối tạo thành có thể được tính bằng công thức:
x = Y.(si – sr)
Trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm
lượng cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại. Sự tăng trưởng sẽ ngừng lại (µ
=0) khi sr = 0 hoặc trong môi trường nuôi cấy có sự tích lũy những chất độc đối với vi
sinh vật. Giá trị Y giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một đơn vị cơ chất thành sinh
khối vi sinh vật. Có thể dùng Y để tính toán một lượng cơ chất cần thiết để thu được
một lượng sinh khối nhất định. Y thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy như: nhiệt
độ, pH, lượng oxy, giới hạn nồng độ cơ chất…Theo Monod (1942), sự suy giảm tăng
trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào hàm lượng cơ chất được thể hiện qua phương
trình:
µ = µmax. sr/(Ks+sr)
Trong đó, Ks là hằng số sử dụng cơ chất. Khi sr = 0 thì µ = 0, nghĩa là vi sinh vật
bước vào giai đoạn cân bằng trong chu kỳ sinh trưởng. Đối với một cơ chất nhất định,
mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau [28].


6

Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa. Nguyên nhân
là do điều kiện bất lợi của môi trường như: nguồn dinh dưỡng cạn kiệt làm giảm quá
trình trao đổi chất, sự tích lũy một số sản phẩm trao đổi chất gây độc cho vi sinh vật
(acid) và một số enzyme (amilaza, proteinaza…) ngoài chức năng xúc tác các quá trình

tổng hợp còn tham gia vào quá trình phân giải tế bào vi sinh vật. Các nguyên nhân trên
dẫn đến sự chết của hàng loạt các tế bào [2].
Kỹ thuật lên men theo mẻ (batch) được sử dụng để sản xuất sinh khối, sản phẩm
sơ cấp và sản phẩm thứ cấp. Hiện nay, phương pháp này vẫn đang được sử dụng phổ
biến do có một số ưu điểm sau: đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổ sung thêm bất
kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, vì vậy, giảm khả năng bị nhiễm cũng như
chi phí. Tuy nhiên, phương pháp này cho sản lượng thấp do vi sinh vật không được
cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanh chóng bước vào pha suy vong khi nguồn
cơ chất cạn kiệt. Để nâng cao sản lượng, ta cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng trong
suốt pha sinh trưởng của vi sinh vật. Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch)
và lên men liên tục đã khắc phục được nhược điểm của lên men theo mẻ.
1.1.3.2. Lên men liên tục
Trong nuôi cấy theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua 4 pha tuần tự: pha thích nghi (pha
lag), pha tăng trưởng (pha log), pha cân bằng và pha suy vong, nhưng đối với nuôi cấy
liên tục, pha log được duy trì bằng cách bổ sung liên tục nguồn dinh dưỡng vào nồi lên
men và một lượng dịch chứa vi khuẩn tương ứng được lấy ra. Khi đó, tốc độ nạp liệu và
tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ
nạp liệu [28]. Dòng chất dinh dưỡng nạp vào nồi lên men có liên quan đến thể tích nồi
lên men theo tốc độ pha loãng giới hạn (D) theo công thức sau:
D = F/V
Trong đó, F là tốc độ nạp liệu (L/giờ), V là thể tích nồi lên men (L), D là tốc độ
pha loãng hay hệ số pha loãng. Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ [2].
Tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong nồi lên men được biểu diễn qua phương
trình:
v+ = dx/dt = µx


7

Nếu vi sinh vật ngừng sinh trưởng, phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi nồi lên men với

tốc độ:
v− = - dx/dt = Dx
Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi sinh vật trong nồi lên men
trong nuôi cấy liên tục là sự chênh lệch giữa tốc độ tăng v+ và tốc độ giảm v−:
v = v+ - v− = (µ-D)x
Nếu µ>D thì v mang giá trị dương, nghĩa là mật độ vi sinh vật tăng. Ngược lại, nếu
µ0, nghĩa là mật độ tế bào không tăng cũng không giảm, quần thể vi sinh vật ở trạng thái
cân bằng động học. Nếu nồi lên men có thiết bị giúp duy trì cho µ = D ta sẽ thu được
quần thể vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa thường xuyên ở một mật độ
tế bào không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Làm được như vậy, không những
trạng thái sinh lý tế bào mà cả môi trường nuôi cấy đều ổn định và không phụ thuộc vào
thời gian. Điều này tạo điều kiện cho nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý tế bào [2].
Trong nuôi cấy liên tục còn chia thành nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:
Nuôi cấy dạng đa hệ thống: dịch chiết ra từ hệ thống lên men này sẽ được đưa
ngay vào một hệ thống lên men khác. Như vậy, có thể thay đổi được nguồn nguyên liệu
trong các giai đoạn khác nhau trong quá trình nuôi cấy.
Hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: dịch chiết ra trong quá trình lên
men, ngoài sản phẩm còn có một lượng lớn tế bào vi khuẩn. Nếu lượng tế bào này được
thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ làm tăng sản lượng lên men. Có thể
dùng phương pháp lọc hoặc ly tâm tách tế bào rồi bổ sung ngược lại vào nồi lên men.
Tuy nhiên, vấn đề chống tạp nhiễm là một trở ngại lớn khi thực hiện kiểu nuôi cấy này.
Kỹ thuật lên men liên tục bắt đầu bằng một mẻ (batch), khi tế bào vi sinh vật bước
vào pha log, quá trình lên men được chuyển từ nuôi cấy theo mẻ sang liên tục [12].
Nuôi cấy liên tục làm tăng đáng kể sản lượng mà không cần thêm nhiều bình lên
men. Điều này không những giảm chi phí sản xuất mà còn giảm chi phí đầu tư. Hirao và
cộng sự (1989) đã nuôi cấy liên tục chủng Corynebacterium glutamicum B-6 thu nhận
L-lysine. Chủng có thể sản xuất L-lysine ổn định trong 300 giờ với sản lượng 105g/L và
năng suất 5,6g/L/giờ. Trong đó, với hình thức lên men theo mẻ có bổ sung, sản lượng L-

8

lysine chỉ đạt 100g/L trong 48 giờ, năng suất không vượt quá 2,1g/L/giờ. Nghĩa là năng
suất khi lên men liên tục gấp 2,5 lần lên men theo mẻ có bổ sung [12].
Mặc dù cho năng suất cao hơn hẳn nhưng nuôi cấy liên tục vẫn có những hạn chế
sau:
Vấn đề tạp nhiễm là một trở ngại lớn trong suốt quá trình vận hành.
Nuôi cấy liên tục diễn ra trong một thời gian dài nên dễ xảy ra hiện tượng đột biến
ngẫu nhiên ở vi sinh vật. Các chủng đột biến phát triển nhanh hơn chủng bố mẹ trong
cùng điều kiện nuôi cấy nên cạnh tranh dinh dưỡng, dẫn đến giảm năng suất.
Một số quá trình lên men thu nhận amino acid (lysine) chia thành 2 pha rõ rệt: pha
tăng trưởng và pha sinh tổng hợp. Nuôi cấy liên tục có thể đạt năng suất không cao bằng
nuôi cấy theo mẻ hoặc theo mẻ có bổ sung do tế bào luôn bị giữ ở pha tăng trưởng [12].
Ngoài ra, quá trình lên men diễn ra trong thời gian dài sẽ tiêu tốn nhiều công sức
và nguyên liệu, do đó, năng suất cao nhưng chưa phải hiệu suất đã cao. Vì vậy cần cân
nhắc kỹ trước khi lựa chọn phương pháp này.
1.1.3.3. Lên men fed-batch
Lên men fed-batch còn gọi lên men theo mẻ có bổ sung, là hình thức trung gian
giữa lên men theo mẻ (batch) và lên men liên tục, trong đó, nguyên liệu được nạp vào
nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, sản phẩm chỉ được lấy ra khi quá trình kết thúc.
Tuy nhiên, dịch lên men cũng có thể được chiết ra trong quá trình vận hành.
Fed-batch ban đầu cũng như lên men batch nhưng sau một thời gian sẽ bổ sung
thêm môi trường mới với hàm lượng chất dinh dưỡng được kiểm soát trong suốt quá
trình nuôi cấy cho đến khi đạt được lượng sản phẩm tối đa [12]. Nguồn dinh dưỡng nạp
vào có thể giống môi trường nuôi cấy ban đầu hoặc là nguồn cơ chất. Đối với cơ chất,
nồng độ có thể tương đương môi trường ban đầu, hoặc cao hơn hoặc rất đậm đặc. Vì
vậy, lên men fed-batch thường cho năng suất cao hơn lên men batch trong cùng thời
gian và điều kiện lên men. Có thể chia hình thức lên men này thành 2 kiểu: lên men theo
mẻ bổ sung thay đổi thể tích và lên men theo mẻ bổ sung không thay đổi thể tích.

9

a. Lên men theo mẻ có bổ sung thay đổi thể tích
Hình thức lên men này, nguồn dinh dưỡng bổ sung có thể là môi trường lên men
ban đầu hoặc cơ chất có nồng độ tương đương môi trường ban đầu, khi bổ sung vào sẽ
làm thay đổi thể tích dịch lên men. Sinh khối tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình lên
men được trình bày theo phương trình:
xt = x0 + Y(si – sr)
trong đó, x0 là nồng độ giống nạp vào ban đầu. Khi sr = 0 và xt = xmax do x0<< xmax thì:
xmax = Y.si
Nếu tại thời điểm sr = 0, môi trường được bổ sung vào với D < µmax thì toàn bộ cơ
chất mới bổ sung vào được sử dụng ngay. Ta có:
F.si = µ.(X/Y) với X = x.V (X là tổng sinh khối)
Có thể thấy, tổng sinh khối tăng dần nhưng nồng độ tế bào hầu như không tăng.
Do vậy, µ = D. Đây được xem là trạng thái cân bằng. Khi thể tích dịch lên men tăng, tỷ
lệ pha loãng giảm thì:
D = F/(V0 + F.t)
Theo phương trình Monod, khi sr giảm thì D cũng giảm nên x sẽ tăng. Tuy nhiên,
trong hệ thống nuôi cấy theo mẻ bổ sung, ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si>> Ks nên trong
thực tế, sr thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái cân bằng ổn định, D < µmax và Ks << si
[28].
b. Lên men theo mẻ có bổ sung không thay đổi thể tích
Đối với hình thức lên men theo mẻ có bổ sung thay đổi thể tích, cơ chất được bổ
sung với nồng độ cao nên không làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men. Động học
hệ thống này được thể hiện qua phương trình:
dx/dt = G.Y
trong đó, G là tốc độ nạp cơ chất.
Do dx/dt = µx nên:

µx = GY


µ = GY/x

Nếu GY/x <µmax thì khi nạp thêm cơ chất sẽ được sử dụng ngay. Tuy nhiên, do
dx/dt > 0 nên:


10

xt = x0 +G.Y.t
Ngoài cách phân loại trên thì lên men theo mẻ có bổ sung còn được phân loại
theo kiểu nạp cơ chất, đó là lên men theo mẻ bổ sung liên tục và bổ sung gián đoạn. Đối
với lên men theo mẻ bổ sung liên tục, chất dinh dưỡng trong bình dự trữ được nạp vào
bình lên men với tốc độ không đổi. Nhờ hệ thống thông khí và khuấy cơ học, bình lên
men được cung cấp đầy đủ oxy, đảm bảo việc phân bố nhanh và đồng đều chất dinh
dưỡng trong dòng môi trường đi vào. Đối với lên men theo mẻ bổ sung gián đoạn, chất
dinh dưỡng mới được bổ sung vào bình lên men theo từng thời điểm đã được khảo sát.
Hình thức lên men theo mẻ có bổ sung đã giải quyết được một số nhược điểm của
lên men theo mẻ:
Trong công nghệ lên men amino acid thường đòi hỏi hàm lượng cơ chất cao để thu
được sản lượng cao. Hàm lượng đường cao trong dịch nuôi cấy ban đầu sẽ ức chế sự
sinh trưởng của tế bào vi khuẩn hoặc làm giảm lượng sản phẩm do sự hình thành các
sản phẩm khác như acetate và lactate. Nếu bắt đầu quá trình nuôi cấy với hàm lượng
đường thấp và bổ sung theo thời điểm thì pha lag có thể được rút ngắn, từ đó làm tăng
sản lượng.
Đối với những chủng đột biến khuyết dưỡng, nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu
quá cao sẽ làm tế bào sinh trưởng quá mức hoặc gây ra ức chế ngược, làm giảm sản
lượng. Trong trường hợp này, việc bổ sung chất dinh dưỡng theo mẻ với tỷ lệ nhất định

sẽ giúp thu được sản lượng tối đa. Hình thức này đã được sử dụng trong nuôi cấy chủng
Corynebacterium glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng thu L-phenylalanine và Ltyrosine.
Nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu cao gây ra sự phát triển quá nhanh của vi sinh
vật ở pha log, dẫn đến nhu cầu oxy của chúng vượt quá lượng oxy hiện có trong bình
lên men, làm giảm sản lượng. Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung giúp giữ hàm lượng
cơ chất ở mức dưới ngưỡng ức chế để cấp cho vi sinh vật trong quá trình sinh tổng hợp.
Lên men theo mẻ có bổ sung giúp giảm được vấn đề về nhiễm và đột biến so với
lên men liên tục, đạt năng suất cao hơn so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất.
Có nhiều nghiên cứu sản xuất amino acid được tiến hành bằng hình thức lên men vi sinh


11

vật theo mẻ có bổ sung. Kết quả cho thấy, lượng amino acid thu được bằng hình thức
này cao hơn nhiều so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất [12].
Tuy nhiên, lên men fed-batch dạng liên tục đòi hỏi phải có thiết bị để kiểm soát
các yếu tố trong quá trình lên men, đồng thời đòi hỏi kỹ năng vận hành thiết bị lên men,
điều khiển quá trình. Các yếu tố cần được kiểm soát trong khi vận hành hệ thống là: tạp
nhiễm, sự tăng trưởng tế bào, pH, nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan, kiểm soát bọt, tốc
độ nạp liệu.
Có thể nói, hình thức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) đã khắc phục được
một số nhược điểm của lên men dạng mẻ và lên men liên tục. Bên cạnh đó, qua tổng
quan tài liệu, chúng tôi nhận thấy hình thức này phù hợp với mục đích thu nhận amino
acid L-lysine từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum. Vì vậy, chúng tôi chọn hình
thức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) để nâng cao năng suất thu nhận L-lysine
trong đề tài này.
1.2. Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium glutamicum được biết đến đầu tiên với vai trò là chủng chuyên
sản xuất acid glutamic, được phát hiện bởi một nhóm các nhà nghiên cứu người Nhật
vào giữa những năm 1950. Đầu tiên, Corynebacterium glutamicum có tên gọi

Micrococcus glutamicus No.534, sau này đổi thành Corynebacterium glutamicum [9].
Nghiên cứu sâu hơn về Corynebacterium glutamicum, các nhà khoa học đã khám phá ra
rằng, ngoài khả năng tiết acid glutamic, Corynebacterium glutamicum còn tiết nhiều
loại amino acid khác vào môi trường nuôi cấy như: lysine, methionine, arginine,
threonine…
Ngày nay, Corynebacterium glutamicum là một trong những vi khuẩn quan trọng
trong công nghiệp, sản xuất 2 triệu tấn amino acid mỗi năm, trong đó có khoảng 0,6
triệu tấn L-lysine [9]. Các nghiên cứu về Corynebacterium glutamicum vẫn đang được
các nhà khoa học trong và ngoài nước thực hiện với mục đích nâng cao năng suất thu
nhận amino acid, chủ yếu dựa trên kỹ thuật di truyền.


12

1.2.1. Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại
Dưới kính hiển vi phóng đại 400-1000 lần, tế bào Corynebacterium glutamicum có
dạng hình que ngắn điển hình, không đều. Tế bào sắp xếp dạng hình chữ V, một số xếp
song song, không di động, không hình thành bào tử [9].
Tế bào bắt màu tím khi nhuộm Gram và cho hiện tượng kéo sợi khi phản ứng với
dung dịch KOH 3%, chứng tỏ Corynebacterium glutamicum thuộc nhóm vi khuẩn
Gram (+).
Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch có dạng tròn đầy, trơn bóng, màu vàng nhạt,
kích thước 1-1,5 mm (sau một ngày nuôi cấy).

(a)

(b)

Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên môi trường
phức hợp. (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét [9].

Cấu tạo tế bào vi khuẩn có một lớp peptidoglycan dày, vách tế bào chứa arabino
galactan và acid mycolic có 26-36 carbon. Hàm lượng G:C là 54,1% [12].
Vị trí trong hệ thống phân loại của Corynebacterium glutamicum [37]:
Giới (kingdom): Bacteria
Ngành (phylum): Actinobacteria
Lớp (class): Actinobacteria
Bộ (order): Actinomycetales
Họ (family): Corynebacteriaceae
Chi (genus): Corynebacterium
Loài (species): Corynebacterium glutamicum