tiểu luận Tạo hoa hồng xanh bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

PHẦN I. MỞ ĐẦU
Hoa hồng (Rosa chinensis Jacq.) là loài thực vật thuộc Phân họ Hoa hồng
(Rosoideae) Họ hoa hồng (Rosoideae) Bộ Hoa hồng (Rosales) thuộc Lớp Hai lá
mầm (Dicotyledonae) hay Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida). Cây hoa hồng là cây
bụi hoặc cây leo lâu năm thân bụi mềm, cành có nhiều gai, hoa càng đẹp thì cành
có nhiều gai, lá kép lông chim, có khía răng, hoa có cánh do nhị đực phát triển
thành. Hạt hoa hồng tụ trong đế hoa, phát triển thành quả. Tuy nhiên cây hoa hồng
thường được nhân giống bằng cách giâm cành, chiết cành hoặc ghép chứ không
gieo hạt. Hoa hồng đa phần có nguồn gốc bản địa châu Á, số ít còn lại có nguồn
gốc bản địa châu Âu, Bắc Mỹ, và Tây Bắc Phi. Hoa hồng được trồng làm cảnh và
lấy tinh dầu. Hoa hồng là biểu tượng của tình yêu và mang nhiều ý nghĩa trong các
nền văn hóa khác nhau. Hoa hồng xanh tồn tại rất hiếm trong tự nhiên và là biểu
tượng cho tình yêu vĩnh cửu. Hoa hồng xanh dương là màu của trời và biển. Nó đi
liền với cảm giác sâu thẳm, vững vàng và yên bình. Nó còn là màu của sự trung
thành, tin tưởng, thông thái, tự tin, thông minh. Vì vậy hoa hồng xanh luôn là quà
tặng quý hiếm và mang ý nghĩa đặc biệt. Nhưng hoa hồng xanh không tồn tại
trong tự nhiên vì hoa hồng thiếu gen tạo nên màu xanh của hoa. [12].
Công nghệ di truyền (công nghệ gene – gene technology) bao gồm các kỹ
thuật hiện đại được thực hiện trên axit nucleic (AND và ARN) nhằm nghiên cứu
cấu trúc của gen, điều chỉnh và biến đổi gen, nhằm tách, tổng hợp và chuyển các
gen mong muốn vào các tế bào vật chủ mới để tạo ra cơ thể sinh vật mới mang
nhũng đặc tính mới, cũng như tạo ra sản phẩm mới. Để thực hiện được công nghệ
di truyền, các thực nghiệm đều cần phải sử dụng AND tái tổ hợp[1]. Do đó, công
nghệ AND tái tổ hợp là công nghệ nền tảng, cơ bản nhất của công nghệ di truyền,
có ứng dụng rất lớn trong công nghệ chuyển gen. Mục đích của công tác chọn
giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng di truyền của cây trồng, vật nuôi...nhằm
nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp. Trong công tác cải tạo giống
cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc để cải tạo nguồn gen
1

của sinh vật. Tuy nhiên, do quá trình lai tạo tự nhiên, con lai thu được qua lai tạo
và chọn lọc vẫn còn mang luôn cả các gen không mong muốn do tổ hợp hai bộ
nhiễm sắc thể đơn bội của giao tử đực và giao tử cái. Một hạn chế nữa là việc lai
tạo tự nhiên chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong loài. Lai xa, lai khác loài gặp
nhiều khó khăn, con lai thường bất thụ do sai khác nhau về bộ nhiễm sắc thể cả về
số lượng lẫn hình thái giữa bố và mẹ, do cấu tạo cơ quan sinh dục, tập tính sinh
học... giữa các loài không phù hợp với nhau. Nhờ những thành tựu trong lĩnh vực
DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở
ngại nói trên. Triển vọng của công nghệ chuyển gen là rất lớn, cho phép tạo ra các
giống vật nuôi, cây trồng... mang những đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi
cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự
nhiên, không thể luôn luôn có được[1, 2]. Một trong những phát minh mang tính
cách mạng trong kỹ thuật di truyền là kỹ thuật ARNi được ứng dụng trong nghiên
cứu cơ bản và các lĩnh vực khác nhau trong công nghệ sinh học như kiểm soát
bệnh virus, tạo cơ thể chuyển gen sản xuất sinh dược và trị liệu đối với các bệnh
hiểm nghèo như ung thư , AIDS….Kỹ thuật ARNi do 2 nhà khoa học người Mĩ
Andrew Fire và Craig Mello phát minh về cơ chế gây bất hoạt gen bởi RNAi được
đăng trên tạp chí Nature năm 1998 và đạt giải Nobel năm 2006. Kỹ thuật ARNi đã
và đang được các nhà khoa học ứng dụng trong lĩnh vực nông ngiệp như chuyển
gen thực vật giúp cải tiến cây trồng và giá trị dinh dưỡng trên các đối tượng thực
vật: lúa mạch, gạo, bông, đay sợi, tinh dầu có giá trị dinh dưỡng cao.., thay đổi
màu sắc hoa : hoa khổ sâm, hoa hồng. Các nhà khoa học tại Florigene (Australia)
và Suntory (Nhật Bản) đã được nghiên cứu thành công trong việc tạo hoa hồng
xanh – giảm hoạt động của gen cyanidin trong hoa hồng và cẩm chướng bằng
công nghệ RNAi và công nghệ AND tái tổ hợp chuyển gen delphinidin tạo màu
xanh vào hoa hồng, khắc phục sự vắng mặt của gen này trong tự nhiên [4 ]. Do
vậy, em đi sâu tìm hiểu về đề tài tiểu luận của mình là:“ Tạo hoa hồng xanh bằng
công nghệ ADN tái tổ hợp ”.

2

PHẦN II. NỘI DUNG
CHƯƠNG I. SỰ HÌNH THÀNH MÀU SẮC CỦA HOA
I.Vai trò của màu sắc hoa
Màu sắc của hoa đóng vai trò quan trọng trong thụ phấn bằng cách thu hút
côn trùng thụ phấn, như côn trùng và các loài chim, ngoài ra còn giúp bảo vệ hoa
chống lại tác động bất lợi từ tia cực tím. Màu hoa cũng là hấp dẫn đối với con
người và là một đặc điểm quan trọng của hoa đặc trưng cho từng loại hoa[8, 10].
II. Anthocyanin tạo nên màu sắc cánh hoa
Anthocyanin là những hợp chất glycoside của athocyanidin. Anthocyanin
bao gồm các chất flavonoid, carotenoids và betalains. Các chất này khác nhau bởi
số lượng và vị trí của nhóm hydroxyl trong phân tử, mức độ methyl hóa của nhóm
hydroxyl, bản chất, vị trí của các nhóm đường gắn vào phân tử, số nhóm acid
mạch thẳng hay mạch vòng gắn vào phân tử[11].
Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH, các chất màu và
sự có mặt của nhiều yếu tố khác. Tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ
thuộc mạnh nhất vào pH của môi trường. Thông thường khi pH của môi trường < 7
các athocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh. Ở pH = 1 các athocyanin
thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH = 4-5 chúng có thể chuyển
sang dạng không màu, ở pH 7- 8 thì có màu xanh. Anthocyanin có bước sóng hấp
thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 - 540nm. Độ
hấp thụ liên quan trực tiếp đến màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào
pH của dịch bào, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ
hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin cành lớn khả năng hấp thụ cành mạnh.[11]
Anthocyanin bao gồm các chất: carotenoid, betalains, flavonoid. Trong đó
carotenoid có vai trò chủ yếu để tạo nên màu vàng và màu da cam ở hoa hướng
dương và hoa cà chua. Betalains hình thành nên màu vàng ở cánh hoa bằng cách
kết hợp với các hợp chất chứa nitơ là dẫn xuất từ tyrosine và chỉ được tồn tại
trong hoa bộ cẩm chướng. Flavonoids quy định một loạt các màu sắc của hoa từ

vàng nhạt sang màu đỏ, màu tím và màu xanh. Các con đường sinh tổng hợp
flavonoid có nhiều hướng để di truyền màu hoa có màu sắc đa dạng. Trong đó có
3


sáu anthocyanidins lớn : pelargonidin, cyanidin, peonidin (3'O-methyl cyanidin),
delphinidin, petunidin (3 'delphinidin O-methy) và malvidin (3', 5' delphinidin Odimethy). Vì số lượng nhóm hydroxyl trong các nhóm được tăng lên do sự hấp thu
của ánh sáng của quang phổ hấp thụ nên có thể nhìn thấy các bước sóng ánh sáng
dài hơn. Cực đại ở dung dịch HCl-methanol 0,01% của pelargonidin, cyanidin và
delphinidin là 520, 535 và 546 nm tương ứng cho mỗi sắc tố. Sự biến đổi của
anthocyanidins chủ yếu là kết quả glycosyl hóa và acyl hóa anthocyanins. Bên
cạnh đó các cấu trúc của anthocyanins, những thay đổi của không bào pH, tương
tác giữa các phân tử (sự liên kết của anthocyanins với đồng sắc tố anthocyanin
với polyphenol), sửa đổi sau tổng hợp anthocyanins, tạo phức kim loại và hình
dạng tế bào đều tham gia vào hình thành nên màu sắc của hoa. Anthocyanins tạo
nên màu đỏ đồng đều ở cánh hoa khi pH trong không bào thấp, có thể tạo nên
màu xanh của cánh hoa nhưng không đồng đều và ổn định khi pH không bào có
tính axit. Các yếu tố tương tác và quá trình tạo phức kim loại góp phần ổn định
anthocyanins và màu sắc hoa, đặc biệt là màu xanh.[5,8,9]
III. Cơ chế hình thành màu sắc của hoa
Cơ chế hình thành màu sắc của hoa có sự tham gia của các enzym, các tiền
chất và sự điều khiển của các gen tổng hợp anthocyanin [6, 11].
Các tiền chất để tổng hợp của tất cả các chất flavonoid, bao gồm cả
anthocyanins, là malonyl-COA và p-coumaroyl-COA. Các enzyme đầu tiên tham
gia sản xuất flavonoid là chalcone synthase (CHS). Enzyme này xúc tác theo từng
bước trong phản ứng ngưng tụ của ba đơn vị acetate bắt đầu từ malonyl-CoA với
p-coumaroyl-CoA để tạo thành 4, 2', 4', 6- tetrahydroxychalcone. Tiếp theo với sự
xúc tác của flavanone 3-hydroxylase (F3H) (một loại enzime thuộc 2-oxoglutarate
dioxygenases) sẽ xúc tác phản ứng hydroxyl hóa naringenin để chuyển hóa sang
dihydrokaempferol (DHK). DHK sau đó có thể được hydroxy hóa bởi flavonoid 3'hydroxylase (F3'H) để tạo thành dihydromyricetin (DHQ) hoặc bởi flavonoid 3’ 5'hydroxylase (F3’5'H) để sản xuất dihydromyricetin (DHM). F3'5’H cũng có thể

chuyển đổi DHQ từ DHM. Ít nhất ba enzyme cần thiết để chuyển đổi các màu sắc
dihydroflavonols (DHK, DHQ, và DHM) từ anthocyanins. Việc đầu tiên của
4


những

enzyme xúc tác

là giảm dihydroflavonols từ flavan9,4-cis-diol

(leucoanthocyanidins) bởi dihydroflavonol4-reductase (DFR). Sự oxy hóa và
đường hóa của leucoanthocyanidins sẽ tạo ra các sản phẩm khác nhau như các
pelargonidin tương ứng màu gạch đỏ, cyani-din tương ứng màu đỏ, và sắc tố màu
xanh delphinidin. Các con đường sinh tổng hợp anthocyanin được thể hiện tổng
quát ở hình 1[11].

Hình 1. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp flavonoid để tạo nên màu sắc của
hoa.
Anthocyanidin 3-glucosides có thể được biến đổi hơn nữa trong nhiều loài
bởi sự glycosyl hóa, methyl hóa và acyl hóa, được minh họa trong hình 2[11].

5


Hình 2. Kiểm soát quá trình di truyền và sự biến đổi của Anthocyanin ở
Petunia.

6

Các gen tổng hợp enzim tham gia vào tổng hợp màu sắc hoa ở một số cây được
thể hiện ở bảng 1. Bao gồm các gen: c2, whp, NA, An3, Hf1

Bảng 1. Các gen tổng hợp enzim tham gia vào tổng hợp màu sắc hoa cây
ngô, cây kim ngư thảo, cây dạ yên thảo.
Các gen điều hòa màu sắc hoa ở các cây ngô, cây kim ngư thảo, cây dạ yên
thảo được thể hiện ở bảng 2. Bao gồm các gen CSH, DRF, 3GT, ANS.

7


Bảng 2. Các gen điều hòa màu sắc hoa ở các cây ngô, cây kim ngư thảo, cây dạ
yên thảo.
CHƯƠNG II. AND TÁI TỔ HỢP
I. Khái niệm AND tái tổ hợp.
AND tái tổ hợp (recombinant DNA) là AND được tạo ra từ hai hay nhiều
nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử AND tái tổ hợp được tạo nhờ kỹ thuật
ghép nối các đoạn AND của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của
các loài khác nhau[1,2].
II. Nguyên lý tạo AND tái tổ hợp
Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen ở
thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn
gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định:
+ Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A. tumefaciens hoặc Ti plasmid của
Arhzogennes làm vecter đưa AND vào tế bào. Ti platmid gồm hai thành phần: TDNA và vùng Vir.
+ T- DNA có thể chuyển từ Argobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà
có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào, T- DNA chứa gen
điều hòa sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokikie), gen tổng hợp các chất opine và gen
gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazo lặp lại, bất kì đoạn nào trong vùng này cũng

8


có thể xâm nhập vào phân tử AND thực vật. Trong plasmid vị trí của T + DNA
được giới hạn bởi bờ vai và bờ phải, vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm
6 nhóm từ VirA đến VirG và Vire có tác dụng làm tăng tần số biến nạp. Để thiết
kế vector dung trong biến nạp: Trước hết là cắt bộ gen điều hòa sinh trưởng cục bộ.
Sau đó gắn thêm chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển
phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng gắn gen cần biến nạp.
+ Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen thực vật gồm
có 2 loại: vector liên hiệp và vector nhị thể. Vector liên hiệp: vector liên hiệp dựa
trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên hợp gồm có: Vị trí ghép các gen
quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ
thị kháng sinh giúp cho chọn lọc trong vi khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn
lọc hoạt động được ở tế bào thực vật. Như vậy vector liên hợp được hình thành từ
một plasmid mang trình tự AND mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen
và vùng bờ lặp lại của T – AND. Sau tái tổ hợp, một vecter liên hợp được tạo ra và
dùng cho chuyển gen vào thực vật. Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng
biệt: một cung cấp T- AND đã mất độc gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có
khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất
mang gen chọn lọc ở thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. khi
plasmid này được đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những sực
vản phẩm mang gen vir có thể đưa T – AND vào tế bào thực vật, mặc dù T- AND
nằm trên phân tử AND khác.
+ Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả, đặc điểm là
chuyển gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều giống lúa chuyển
gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Xác định thông số chuyển gen:
• Tìm ra thời gian lây nhiễm vi khuẩn tối ưu
• Tìm ra thời gian đồng nuôi cấy tối ưu
• Tìm ra nồng độ Acetosyringone thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi vi

khuẩn khi lây nhiễm
• Xác định môi trường tái sinh thích hợp nhất
9


• Kiểm tra mẫu chuyển gen: sử dụng chất X- gluc để phát hiện vật liệu biến
nạp có chứa gen [1,2].
III. Các bước tạo AND tái tổ hợp
Từ khi người ta khám phá ra thí nghiệm chuyển gen được thực hiện nhờ một
loại vi khuẩn đất Agrobacterrium tumefaciens có thể chuyển gen vào nhiều loại
cây trồng.
Kỹ thuật tái tổ hợp AND được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh
vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:
Bước 1 : Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào
cho để cung cấp AND.
Bước 2 : Tách chiết AND plasmid và AND tế bào cho. Bước này còn gọi là
phân lập gen.
Bước 3 : Cắt cả hai đoạn AND (AND plastmid và AND tế bào cho) bằng
cùng 1 loại enzim giới hạn (restriction enzym – RE).
Bước 4 : Trộn chung AND plastmid đã cắt với AND tế bào cho cũng đã bị
cắt bởi một loại enzim giới hạn như đã nêu ở bước 3.
Bước 5 : Bổ sung enzim nối ligase để tạo ra AND tái tổ hợp hoàn chỉnh.
Bước 6 : Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào vật chủ và nhân dòng.
Bước 7 : Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang AND tái tổ hượp
và theo dõi hoạt động, biểu hiện gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho.
Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật : để chuyển gen ta thực hiện các bước
sau:
 Chọn lọc các thể gen nạp trên môi trường chọn lọc
 Tái sinh cây biến nạp
 Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen ( PCR hoặc southern blot) và đánh

giá mức độ biểu hiện của chủng ( Norther lot, Western blot, ELISA hoặc các
thử nghiệm in vitro khác…..)
 Nguyện liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ, các mô
hoặc cây hoàn chỉnh.

10


Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot,
Nothern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen [2]. Sơ đồ
khái quát của quá trình tạo dòng AND tái tổ hợp được thể hiện ở hình 1.

CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ ARN CAN THIỆP
I. Khái niệm công nghệ gen bất hoạt gen ARNi
Công nghệ gây bất hoạt gen (ARN interfarance – RNAi), là công nghệ mới
mạnh mẽ chỉ cần một vài phân tử RNA sợi kép (ds ARN) của một tế bào cũng đủ
để phân hủy các mARN của một gen đặc thù. Kết quả thực nghiệm cho thấy công
nghệ RNAi có thể cho phép gây bất hoạt gen một cách có hiệu quat ở bất kỳ cơ thể
nhân thực nào. Nó có tác dụng điều hòa biểu hiện gen hiệu quả hơn mạnh gấp 1000
lần công nghệ gen đối nghĩa (antisense). Dựa trên thành tựu của chương trình
genomic, trình tự của hầu hết sinh vật nhân thực đã được xác định, từ đó con người
11


có thể thiết kế các dsARN tương đồng để gây bất hoạt mọi gen đích. Điều thú vị là,
cơ chế của sự im lặng gen cũng bảo vệ các sinh vật của hệ gen từ gene nhảy,
virus[3].
ARNi là quá trình làm câm gen một cách đặc thù, nó chỉ làm bất hoạt một
gen (gen đích) có những trình tự tương đồng với các tác nhân bất hoạt gen (các sợi
ARN ngắn khoảng 21 – 27 nucleotide)[4].

Thành phần cấu trúc để tạo ddRNAi là 1 đoạn gen cDNA xuôi gắn sau
promoter (chỗ bám của RNA polymerase để phiên mã) nối qua 1 đoạn ngắn với 1
đoạn cDNA tương tự nhưng ngược chiều và ở cuối là trình tự kết thúc terminator.
Khi được đưa vào tế bào, RNA polymerase tạo ra các đoạn ngắn RNA mạch kép
dạng ‘kẹp tóc’. Sau khi vào tế bào chất trình tự kẹp tóc bị cắt đoạn bởi Dicer, một
lạo enzim đặc hiệu cắt RNA mạch kép (dsRNA specific nuclease), gây nên sự tích
tụ siRNA mạch kép (21 bp dsRNA). Các siRNA này gắn vào phức hợp làm im
lặng (RNA – induced silencing complex – RISC). Với một mạch của siRNA gắn
phức hượp này tương tác với mRNA nội hay ngoại lai (endogenous ỏ exogenous)
dẫn đến cắt trình tự mục tiêu và phân hủy bản phiên mã như ở phần dưới hình[2].

Cơ chế hoạt động của ARNi được thể hiện qua sơ đồ sau:

12


Một số enzim quan trọng tham gia trong qua trình gây bất hoạt gen:
- Decier là một ribonuclease III giống như nuclease, được phát minh là chịu trách
nhiệm cho quá trình cắt dsARN thành các đoạn ARN ngắn.
-RISC là một tổ hợp phức tạp chứa ít nhất một protein họ argonaute hoạt động như
một endonuclease và có vai trò cắt mARN. Khả năng tương tác cảu phức RISC với
DNA (gen) hoặc với mARN phụ thuộc vào sự tương đồng giữa siRNA với mARN.
Khi tương tác với AND, RISC methul hóa DNA và biến đổi histone, dẫn đến ngăn
cản sự khởi động phiên mã. Khi tương tác với Marn , RISC tạo tín hiệu để RNase
phân hủy mARN.
- Enzyme tổng hợp ARN trên khuôn ARN (ARN deependent ARN polymerase –
RdRp): trong một số sinh vật, đặc biệt là cây trồng, giun tròn, nấm , một ARN –
polymerase phụ thuộc ARN (ARN dependent ARN polyerase (RdRP) đóng vai trò
quan trọng tạo nên các sợi dsARN, nhân bản các sợi siARN hoặc miARN .
- ARNi còn tham gia kiểm soát hoạt hóa gen ở giai đoạn phiên mã (TGS transcriptional gene silencing), các phân tử siARN ngăn cản phiên mã, khống chế

13


số lượng phân tử mARN. Cơ chế này xảy ra trong nhân và đích chịu tác động là
AND, gen (marker 2004, mimker 2007). Một vài enzyme tham gia quá trính này đã
được phát hiện:
+ Enzyme methyl hóa AND (AND methyl transferase) gắn nhóm methyl vào
cytosine (C) ngăn cản quá trình phiên mã.
+ Enzyme biến đổi các nhóm chức của protein (histone) nằm trong lõi nucleosome.
Ví dụ như gắn thêm nhóm methyl hoặc khử nhóm acetyl ở một số aminoacid đặc
biệt trên protein histone làm thay đổi cấu trúc không gian sợi nhiễm sắc, làm sợi
nhiễm sắc cuộn chặt ngăn cản phiên mã.
- Đặc tính của công nghệ ARNi: + ARN sợi kép là tác nhân gây ra hiện tượng làm
bất hoạt gen mạnh hơn là ARN đối nghĩa sợi đơn ( single – stranded antisense
ARN).

+ Có đặc tính đặc hiệu rất cao, chỉ làm bất hoạt

các mARN các trình tự tương đồng.
+ Có hiệu quả cao và mạnh chỉ cần một vài phân
tử ARN sợi kép là đủ để gây bất hoạt gen của tế bào hoặc virus.Có thể làm bất hoạt
cả nhóm gen.

+Có thể dịch chuyển từ tế bào này, mô này sang tế

bào này sang tế bào khác, mô khác trong mỗi cá thể và thậm chí từ thế hệ này sang
thế hệ khác.

+Có thể và thậm chí từ thế hệ này sang thế hệ

khác. Cơ chế bất hoạt gen ở cả hai giai đoạn khác nhau của biểu hiện gen giai đoạn
phiên mã(TGS) và giai đoạn sau phiên mã (PTGS)[4].
II. ARNi tạo hoa màu xanh
Phương pháp tiếp cận kỹ thuật di truyền được áp dụng cho một số cây cảnh
như đã phát triển hoa cẩm chướng xanh hoa bằng cách sử dụng kỹ thuật di truyền.
Các nhà khoa học tạo hoa khổ sâm màu trắng chuyển gen bằng cách ức chế các
enzym tổng hợp chalcone (CHS) sử dụng công nghệ gen antisense . Trong trường
hợp này, chỉ có 3 trong 17 dòng chuyển gen độc lập hiển thị màu trắng-hoa kiểu
hình, nhưng khác transform- kiến đã không dẫn đến sự ức chế thành công của gen
CHS biểu thức. Hơn nữa, không có nhà máy gentian chuyển gen với biểu hiện ức
chế sinh tổng hợp anthocyanin khác của gen, như dihydroflavonol 4-reductase
(DFR) và flavonoid 3’5’-hydroxylase (F3’5’H) gen, có cho đến nay được thu được
14


bằng antisense và ý thức đàn áp công nghệ (Nishihara et al., 2005). Các tần số thấp
của tên xuống quy định của các gen mục tiêu được cho là kết quả từ sự sử dụng cả
hai virus khảm súp lơ (CaMV) 35S promoter và công nghệ ức chế gen antisense.
Gene im lặng bởi RNAi cũng đã được sử dụng để sửa đổi các hoa màu trong một
số loài thực vật, trong đó có cây dã yên thảo, torenia và cây thuốc lá, hoa hồng
xanh[6, 7, 9].
CHƯƠNG IV. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ AND TÁI TỔ HỢP VÀ CÔNG
NGHỆ ARNi TRONG TẠO HOA HỒNG XANH
I. Cơ sở khoa học
Đa số hoa hồng sản xuất số lượng anthocyanins acylated rất nhỏ và hoa hồng
không sản xuất flavon. Độ pH không bào của tế bào biểu bì cánh hoa là thấp pH từ
3,69-5,78. Do đó, hoa hồng thiếu thành phần cần thiết để cánh hoa màu tím hoặc
màu xanh của cánh hoa. Mặc dù có thể có nhiều cách để tạo ra màu xanh của cánh
hoa hồng, các nhà khoa học đã lựa chọn sản xuất delphinidin trong cánh hoa hồng
vì delphinidin sinh tổng hợp được quy định bởi một đơn enzyme F3’5’H mà biểu

hiện mạnh của nó không ảnh hưởng bất lợi đến thực vật. Delphinidin là một bước
tiến đột phá lớn trong công nghệ tao hoa hồng xanh. Sự biểu hiện của gen
delphinidin F3’5’H đã được tạo được thành công hoa viola có màu xanh Tuy
nhiên, sự hiện diện của pelargonidin và cyanidin-based anthocyanins có nguồn gốc
từ con đường nội sinh làm ngăn cản tạo màu xanh. Các nhà nghiên cứu đã phân
tích thành phần flavonoid của nhiềugiống để chọn giống đó sẽ trưng bày một màu
xanh khi delphinidin được tích lũy. Các biểu hiện quá mức của một gen F3’5’H
dẫn đến hiệu quả tích lũy của delphinidin và màu sắc thay đổi với t màu xanh trong
một vài trong số các giống được chọn. Hơn nữa, điều chỉnh làm giảm hoạt động
của hoa hồng gen DFR và biểu hiện quá mức của các gen DFR iris, cũng như các
biểu hiện quá mức của gen F3’5’H viola, dẫn đến hiệu quả hơn và hiệu quả cap
delphinidin sinh tổng hợp và tạo màu hoa xanh hơn và có thể di truyền qua các thế
hệ[6, 7, 11].
II. Vật liệu nghiên cứu.

15


- Hoa có nguồn gốc nuôi cấy mô tế bào thực vật của các giống hoa hồng đã
được sàng lọc và thu hoạch vườn ươm Keisei Rose (Sawara, Nhật Bản) trong
1997-2000. Thân cây lóng được thu hoạch từ cây hoa hồng được trồng trong nhà
kính và bề mặt đã được tiệt trùng bằng cách ngâm chúng trong một 5% (v/v dung
dịch natri hypoclorit cho 5 phút và sau đó xả lại bằng nước cất[7].
- Các mẫu cấy chiều dài khoảng 1 cm đã được chuẩn bị từ các lóng thân và
nuôi cấy ở 250C trong 16 giờ điều kiện trên trong một môi trường bao gồm các
muối khoáng Murashige và Skoog và vitamin, sucrose 30g/lít, agar 12g/ lít và 1mg
6-benzylami nopurine (BA) 1mg/ lít[7].
- Vector chuyển gen: vector nhị phân bao gồm: pSPB130,pSFL207, pSFL236 và
pSPB919, promoter (CaMV) 35S nguồn gốc từ pE2113. Hình 5. Vector chuyển
gen để biến đổi màu hoa[7].

- Đối tượng chuyển gen: là vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Agl0
-Gen cần chuyển:+ Torenia anthocyanin 5-acyltransferase cDNA (cơ sở dữ
liệu AB332099) được lấy từ thư viện cDNA Iris Hollandica DFR [7]

16


+ cDNA (AB332098) đã được nhân bản từ nó cánh hoa
cDNA Viola spp. chứa hai gen F3’5’H và 1 trong 2 gen (clone BP40) đã được sử
dụng trong nghiên cứu này(AB332097). [7]
III. Phương pháp nghiên cứu.
1. Xác định màu hoa và đo các pH của cánh hoa
-Màu hoa được đánh giá bằng cách sử dụng so sánh màu hoa với bảng giá
trị hệ thống CIE để xác định màu hoa và đo với máy quang phổ CM-2022 và các
số liệu được tính toán theo một 108 quan sát viên và D65 illuminants. Dữ liệu màu
được phân tích sử dụng Spectra Magic TM phần mềm kiểm soát màu. Màu sắc hoa
được chọn là gần nhất màu sắc với các số màu sắc phân loại trên RHSCC phiên
bản 2.1.1 [7]
- Độ pH của nước ép cánh hoa được đo với máy đo pH F-22 với một điện
cực 6069-10C .[7]
2. Phân tích các anthocyanins
Anthocyanins của hoa hồng được chiết xuất với 50% (v v) acetonitrile có
chứa axit trifluoroacetic (TFA) HPLC được tiến hành bằng cách sử dụng một
RSpak DE-413L cột và tốc độ dòng chảy của dung môi của 0.6mlmin/s; dung môi.
Hệ thống được sử dụng như sau: sau khi 15 phút rửa sạch 10-50% của acetonitrile
chứa 0,5% TFA với H2O trong 10 phút rửa sạch isocratic 50%, acetonitrile chứa
0,5%.TFA trong H2O được tiến hành trong 10phút và phát hiện anthocyanins với
một photodiode dò mảng SPD-M10A có thể đo độ hấp thụ ở 600-250 nm. Các thời
gian lưu của anthocyanins aromatically acylated là khoảng 19 phút. Phổ

anthocyanin được đo với một mảng photodiode. Anthocyanins, Aromatically
acylated được xác định vì chúng thể hiện một sự thay đổi sóng dài hơn ở 280 nm.
Phân tích TOF-MS và NMR [7] .
3. Phân tích các anthocyanidins
Chiết xuất dịch bào chuẩn bị được hòa tan trong HCl 6N (0.2ml) và giữ ở
1008C trong 20 phút. Các anthocyanidins thủy phân được chiết xuất với 0.ml 1pentanol. HPLC được thực hiện bằng cách sử dụng một ODS-A312. Vad phát
hiện phổ hấp thụ của sắc tố ở 600-400 nm trên SPD-M10A mảng photodiode dò.
17


Hệ thống dung môi sử dụng như sau:acetic acid: methanol: water¼ 15: 20: 65.
Dưới những HPLC điều kiện, thời gian lưu giữ và delphinidin lớn nhất là 4.0min
và 534 nm, tương ứng với

các giá trị được so sánh với những delphinidin

chlorid[7].
4. Phân tích các flavonol
Chiết xuất từ cánh hoa đã được thủy phân trong 0.2ml của 0,1M potassium
phosphate đệm (pH 4.5) với 6U của b-glucosidase IU naringinase ủ trong 16 giờ ở
308C. Acetonitril (0.2ml, 90%) đã được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng, mà sau đó
phân tích bởi HPLC. HPLC được tiến hành bằng cách sử dụng một Develosil C30UG-5 cột và tốc độ dòng chảy của dung môi cới tốc độ 0.6ml/ phút [7].
5. Lai giống hoa hồng
Giống lai được thực hiện bằng cách sử dụng chuyển gen (LA / 919-4-10) là
một giống bố mẹ cho phấn hoa và có màu đỏ sậm, quả hồng được thu thập sau
100 ngày sau khi thụ phấn. Hạt nảy mầm được thực hiện bằng cách lột vỏ và
nhúng chúng vào giấy lọc ẩm trong đĩa nhựa. Các nước sử dụng cho các hạt giống
nảy mầm đã được tiệt trùng nước có chứa 1.0ml/ lít và 50mg/lít, 1kanamycin / lít,
và cây giống đã được trồng ra từ chậu cây với lá mầm có màu xanh lá cây[7,9].
III. Kết quả.

1.Màu sắc hoa.
Màu sắc hoa của họ là tương đối màu xanh giữa hoa hồng và trong phạm vi
thực tế từ màu hồng, đỏ tím đến màu xám,màu hoa cà. Cánh hoa chứa chủ yếu
cyanidin như một anthocyanidin, nhưng không chứa delphinidin. Cánh hoa chứa
một số lượng lớn các flavonol. Màu xanh của họ có thể là do một flavonol cao
hoặc tỷ lệ anthocyanidin, và flavonol có chức năng như đồng sắc tố[7].
2. Độ pH
PH của hoa hồng xanh cao hơn so với hoa hồng đỏ cũng có thể góp phần tạo
ên màu của hoa. Một số hoa hồng chứa một lượng nhỏ các chất dẫn xuất cyanidin
tiểu thuyết (rosacyanins) thể hiện màu xanh , nhưng mức độ đóng góp của họ cho
màu sắc hoa là không rõ ràng .Các tiêu chí để lựa chọn các giống chủ thể đạt được
hoa thay đổi màu sắc theo hướng xanh bởi delphinidin sản xuất là: (i) tích lũy
18


flavonol đó đã được dự kiến sẽ được đồng sắc tố; (ii) đã có một cao hơn không bào
pH; (iii) lý tưởng, không có F3’H; và (iv) tích lũy pelargonidin hơn là cyanidin.
Sự vắng mặt của delphinidin và myricetin khẳng định sự thiếu hụt của gen
F3’5H’[7].
3. Phân tích anthocyanins.
Số lượng anthocyanins tăng lên và màu hoa trở nên tối hơn. Các màu sắc của
những bông hoa vẫn đỏ tươi, có lẽ bởi vì độ pH của cánh hoa thấp hơn so với các
giống khác. Những kết quả này chỉ ra rằng delphinidin sản xuất đem lại một màu
xanh cho những bông hoa. Họ cũng tiết lộ rằng cả nội dung delphinidin và màu sắc
kết quả phụ thuộc vào các giống chủ. Một sản phẩm chủ đạo của delphinidin
không phải là luôn luôn dễ dàng để đạt được bởi quá mức của F30 50 Gen H ngay
cả trong các giống được chọn. Chỉ có một số anthocyanins (lên đến 44%) đã được
tiết lộ để được aromatically acylated bởi torenia 5AT giới thiệu gen. Những ảnh
hưởng của acyl hóa anthocyanin trên màu hoa không thể quan sát được bằng mắt
khi anthocyanins là một phần acylated vì 5-acyl hóa ca anthocyanin chỉ có bước

sóng dài hơn 4nm[7].
4. Để đánh giá hiệu quả của việc chuyển hướng của con đường từ cyanidin để
delphinidin.
Phấn hoa của LA / 919-4-10 được lai với hạt giống ban đầu. và so sánh màu cánh
hoa. Các hồng hoa hồng giống Lavande (A, trái và B, a) đã được biến đổi với
pSPB919. Các cây chuyển gen quả bao gồm LA / 919-4-10 sản xuất hoa màu tím
biến đổi gen màu) có chứa 98%. Một số hoa hồng biến đổi gen có nguồn gốc từ
pSPB919 thường có màu nhạt hơn hoa và chứa một lượng giảm của
anthocyanidin[7].
5. Phân tích phân tử của gen tăng LA / 919-4-10
Các kết quả phân tích của lai phân tử ở LA / 919-4-10 được thể hiện trong
hình. 6A. Các bảng điểm của F3’5’H và gen iris DFR đã được quan sát để có kích
thước nguyên vẹn, trong khi ban nhạc kích thước chỉ nhỏ hơn của hoa hồng DFR
mRNA. Can thiệp RNA nhỏ (siRNA) khoảng 23 bp đã được phát hiện khi sử dụng
DFR cDNA của .Những kết quả này cho thấy những bông hoa hồng nội sinh DFR
19


mRNA bị suy thoái thành công bởi các RNAi băng giới thiệu của hoa hồng DFR
(Fig. 6B). Phân tích phía Nam của LA / 919- 4-10 với F3’5’H viola, iris DFR, tăng
DFR và nptIIgen chỉ ra rằng thực vật có chứa đơn bản sao T-DNA trong đó thể
hiện giống với bố mẹ ban đầu[7].

20


PHẦN III: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Hoa màu chủ yếu được xác định bởi anthocyanins. Hoa hồng do không có
gen tổng hợp (F3’5’H) một enzyme quan trọng sinh tổng hợp delphinidin. Các yếu

tố khác đồng sắc tố và độ pH không bào cũng ảnh hưởng đến màu. Nhờ sử dụng
công nghệ ARNi mà delphinidin không phân biệt loại thực vật, có thể sử dụng
những đoạn ARN nhỏ làm giảm hoạt động của dihydroflavonol 4-reductase (DFR)
nội sinh một biểu hiện quá mức ở hoa hồng và chuyển gen DFR của Iris và
F3’5’H của Viola vào hoa hồng để tạo màu xanh [4,7].
2. Kiến nghị
Tạo hoa hồng xanh là một bước tiến quan trọng trong công nghệ tạo màu sắc
hoa bằng kỹ thuật di truyền mà cụ thể là công nghệ ARNi. Tạo được màu hoa
mong muốn và có thể di truyền được qua các thế hệ mà không làm ảnh hưởng tới
các gen khác. Do vậy công nghệ này cần nghiện cứu và áp dụng trên nhiều đối
tượng cây trồng khác [4].

21


TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tham khảo viết bằng tiếng việt
[1].Trịnh Đình Đạt(2008). Công nghệ sinh học tập 4: Công nghệ di truyền, NXB
giáo dục.
[2]. Phạm Thành Hổ (2005). Nhập môn công nghệ sinh học, NXB giáo dục.
[3]. Đỗ Năng Vịnh(2007). Công nghệ can thiệp ARN (RNAi) gây bất hoạt gen và
tiềm năng ứng dụng to lớn. Tạp chí công nghệ sinh học.
II. Tài liệu tham khảo viết bằng tiếng nước ngoài
[4]. Abdolhamid Angaji, S., Sara Sadate Hedayati , Reihane Hosein poor , Sanaz
Samad poor, Shima Shiravi, Safoura Madani : Review article : Application of
RNA interference in plants . POJ 3(3):77-84, (2010) .
[5]. Antonio Ferrante, Alice Trivellini, Giovanni Serra, Colours Intensity and
Flower Longevity of Garden Roses. Research Journal of Biological Sciences 5 (1):
125-130, 2010.
[6]. Fukuchi-Mizutani, M., Okuhara, H., Fukui, Y., Nakao, M.,Katsumoto, Y.,

Yonekura-Sakakibara, K., Kusumi, T., Hase, T. and Tanaka, Y., : Biochemical and
molecular characterization of a novel UDP-glucose:anthocyanin 30-Oglucosyltransferase, a key enzyme for blue anthocyanin biosynthesis, from gentian.
Plant J. 132: 1652–1663
[7]. Katsumoto Y et al.,: Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway
successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin. Plant Cell
Physiol. 48, 1589–1600.( 2007)
[8]. Kenneth R. Markhama, Kevin S. Gould , Chris S. Winefield , Kevin A. itchell
Stephen J. Bloor , Murray R. Boase, : Anthocyanic vacuolar inclusions Ð their
nature and significance in flower colouration. Phytochemistry 55 : 327±336,
(2000).
[9]. Power, J.B., Lucas,J., A., Davey, M. R., : Marchant, R., Biolistic
Transformation of Rose (Rosa hybrida L.) Annals of Botany 81: 109-114, (1998).
[10]. Tanaka, Y. (2006) Flower colour and cytochromes P450. Phyochem. Rev. 5:
283–291.
22


[11]. Timothy A. Holton, Edwina C. Cornish: Genetics and Biochemistry of Ant
hocyanin Biosynthesis. The Plant Cell, Vol. 7, 1071-1083, American Society of
Plant Physiologis.
[12]. Wikipedia

23


24