TỔNG QUAN về CLOSTRIDIUM BOTULINUM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÁO CÁO
TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Môn học: Vi sinh đại cương
GVHD: Vương Thị Việt Hoa

Sinh viên: Nguyễn Văn Nhi
MSSV: 13139119
Lớp: DH13HH
I. Đặt vấn đề
Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 1


Từ xa xưa, con người đã biết đến sử dụng vi sinh vật và ứng dụng của vi sinh vật
trong thực phẩm. Các quá trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm ...
đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật. Khi khoa học phát triển,
biết rõ vai trò của vi sinh vật, thì việc ứng dụng vi sinh vật trong sản suất ngày càng rộng
rãi có hiệu quả.
Trong tự nhiên ngoài nhưng vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật có hại như:
những chuẩn vi khuẩn gây bệnh cho người, cây trồng, động vật thuỷ sản, nhóm vi sinh
vật gây hư hỏng thực phẩm, gây ô nhiễm môi trường xung quanh. Chính vì vậy ta cần
phải tìm hiểu toàn bộ những gì có liên quan đến vi sinh vật để chúng ta sử dụng tối đa
đặc tính có hại và đề phòng những ảnh hưởng của chúng đem lại.

II. Tổng quan

*Tổng quan về độc tố vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm
Thực phẩm chứa những thành phần dưỡng chất, thích hợp cho sự phát triển của
một số lớn vi sinh vật. Chúng tồn tại tồn tại trong thực phẩm có thể gây hư hỏng hay gây
bệnh cho người. Các loại vi sinh vật thường gặp nhất trong công nghệ thực phẩm là nấm
mốc, vi khuẩn, nấm men,..
*Giới thiệu về Clostridium botulinum
*Lịch sử phát hiện
Vào năm 1895, Emile Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện ngộ độc botulin
ở dăm bông và ruột già của người bị chết do ngộ độc thịt.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 2


Hình: Emile Van Ermengem.
Đến năm 1896, Emile Van Ermengem tìm ra mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn
Clostridium botulinum), một loại sống kị khí, có nha bào, rất khó bị tiêu diệt. Sau này,
các tác nhà khoa học khác còn thấy chúng trong đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người.
Chúng có chất độc botulin, làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt là đến các
tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh
sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là
gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong cao (70%).
Chúng có nhiều loại A, B, C, D, E nhưng loại A, B, E cho độc tố mạnh nhất.
Nhưng sau đó những bằng chứng về kiểu hình và kiểu gen đáng kể tồn tại để chứng minh
tính không đồng nhất trong các loài. Điều này đã dẫn đến việc phân loại lại của
Clostridium botulinum loại G giống như là một loài. Năm 2003 bộ gen của Clostridium
botulinum được công bố (công trình của viện Sanger với Tiến sĩ Roger Huston và Tiến sĩ
M. Peck).

*Phân loại

Hình: Vi khuẩn Closridium botulinum.
Phân loại Closridium botulinum:
Ngành: Firmicutes.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 3


Lớp: Clostridia.
Bộ: Clostridiales.
Họ: Clostridiaceae .
Chi: Clostridium
Clostridium botulinum gồm có 7 chủng tùy thuộc vào loại độc tố A, B, C, D, E,
F, G. Khi phát triển trên thực phẩm, Clostridium botulinum tiết các loại độc tố gây ngộ
độc và nguy hiểm, gây chết người do tác động lên hệ thống thần kinh. Trong số này các
loại A, B, E và F gây bệnh ở người.Types C and D cause disease in animals. Các loại C
và D gây bệnh ở động vật.Type G has not yet been confirmed to cause illness in humans
or animals.8, 4 Type A is the most potent toxin known and an estimated dose of this toxin
required to cause death in humans vary between 0.1 to 1.0 micrograms. Loại G chưa
được xác nhận để gây bệnh ở người hay động vật.
*Đặc điểm
*Đặc điểm chung
Clostridium botulinum là vi khuẩn kỵ khí có thể di động da dạng, tồn tại ở trong
đất, phân động vật, ruột cá. Chúng là vi khuẩn sinh độc tố botulin là nguyên nhân gây tê
liệt cơ, phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 26-280C, sinh khí hydro sulfur (H2S) và sinh hơi.
Có đặc điểm chung về kiểu hình là hình thành những nội bào tử nhiệt và kháng cự hóa

học, sự hiện diện của gram dương trong cơ cấu các tế bào sinh dưỡng, có sự trao đổi chất
kỵ khí làm lên men. Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum chủ yếu là đặc trưng bởi khả
năng sản xuất độc tố ngoại bào protein nhiều hơn bất kỳ nhóm vi khuẩn nào khác.
*Đặc điểm nuôi cấy/sinh hóa
Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum không thể phát triển ở pH acid thấp hơn
4,5. Nồng độ muối trên 1% có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. Clostridium
botulinum không thể sử dụng lactose như một nguồn carbon chính. Clostridium
botulinum cũng có thể được chia thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc điểm sinh hóa
và sinh lý. Những nhóm này bao gồm:
Nhóm I – nhóm này bao gồm:
- Chủng độc tố loại A.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 4


- Những biến dạng thủy phân protein của độc tố loại B và F.
- Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF
Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh hơi cong với lông roi có
lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 40 0C, sản xuất những bào tử với khả
năng chịu nhiệt cao, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là
0,94 - 4,6.
Nhóm II – nhóm này bao gồm:
- Chủng độc tố loại E.
- Những biến dạng không thủy phân protein nhưng phân giải đường của độc tố
loại B và F.
Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông
rung rải rác, là nhóm ưa lạnh nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 18 – 25 0C, sản xuất bào tử với

khả năng chịu nhiệt thấp, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong
nước là 0,97 - 5.
Nhóm III – nhóm này bao gồm:
- Chủng độc tố loại C và D.
- Những sự biến dạng nói chung là không có thủy phân protein.
Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông
rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 40 0C, sản xuất những bào tử với khả năng
chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước
vẫn chưa biết.
Nhóm VI – nhóm này bao gồm: thủy phân protein của chủng độc tố loại G.
Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông
rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 40 0C, sản xuất những bào tử với khả năng
chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước
vẫn chưa biết.
*Cấu trúc của Clostridium botulinum
*Cấu trúc tế bào

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 5


Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương (+),kích thước khoảng 0,3 –
0,7µm × 3,5 – 7,0 µm, không có có roi. Sinh bào tử, bào tử thường to hơn chiều ngang
của tế bào.
a. Thành tế bào
Thành tế bào giúp duy trì hình thái của tế bào, giúp tế bào đề kháng với áp suất
thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có
phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực

khuẩn thể.
Thành phần
b.

Bảng 2.1: Thành phần của vi khuẩn gam (+).
Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của tế bào

Peptidoglycan

30-95

Acid teicoic (Teichoic acid)

Cao

Lipid

Hầu như không có

Protein

Không có hoặc có ít

Màng sinh chất
Màng sinh chất vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo
bởi 2 lớp phospholipid, chiếm 30-40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong,
ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60-70% khối lượng của màng. Đầu phosphat của PL
tích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ
nước. Có các chức năng chủ yếu sau đây:
- Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất

- Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào.
- Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của bao
nhày (capsule).
- Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quang
hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng)
- Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 6


Hình : Cấu trúc của đầu và đuôi của phospholipid.
c. Tế bào chất
Là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước.
Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều
nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp. Bào quan đáng lưu ý trong tế bào chất là
ribosom. Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của tế
bào chất, gồm 2 tiểu phần (50S và 30S) kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S (S là đơn
vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng khi ly tâm cao tốc).

Hình: Ribosom ở vi khuẩn.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 7

Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạt
glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt dị
nhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh...
d. Thể nhân
Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có
hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng
thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là 1 nhiễm sắc thể duy nhất
dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép
e. Bao nhầy
Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid và
protein. Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid
2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic... Ý nghĩa sinh học của
bao nhầy là:
- Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn.
- Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn.
- Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...).
- Giúp vi khuẩn bám vào giá thể.
*Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum
Clostridium botulinum sẽ tiết ra một độc tố sinh học mạnh ức chế sự phóng thích
hoạt động của các bó cơ, tác động đến nơi tiếp hợp cholinergic qua trung gian Calcium
vào khe synape làm mất khả năng chi phối hóa học tại chổ và mất hoạt động thần kinh
của sợi nơron vận động trong thoi cơ. Hoạt chất này tác động tại nơi tiếp hợp thần kinh
cơ nên ngăn cản sự phóng thích acetylcholine và gây ra liệt.
Độc tố của Clostridium botulinum tác dụng qua 3 giai đoạn: Kết nối, thâm nhập,
ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh. Độc tố này không ảnh hưởng vào sự
tổng hợp hay dự trữ acetylcholine nhưng ảnh hưởng vào sự phóng thích chất này ở sợi
tận

Nguyễn Văn Nhi
13139119

cùng tiền tiếp hợp.

Page 8


Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum.
*Bệnh và các triệu chứng
Nguồn lây bệnh: Các thực phẩm dễ bị nhiễm Clostridium botulinum thường là rau
quả ướp muối, hoặc chế biến mứt tại gia đình, các bán thành phẩm từ thịt, cá hoặc một
vài đồ hộp không đảm bảo yêu cầu vệ sinh khi chế biến và khử khuẩn.
Biểu hiện bệnh: Thời kỳ ủ bệnh thường là 12 - 36 giờ nhưng cũng có thể từ 2 giờ
đến 8 ngày với các triệu chứng đau bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt, khó
nuốt, khó thở... nếu bệnh kéo dài từ 4 - 8 ngày tỷ lệ tử vong tới 60%-70%. Ngộ độc
Clostridium botulinum còn phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như yếu tố môi trường, đặc
tính thực phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt và ăn uống của cá nhân mà nguồn
thực phẩm gây ngộ độc cũng khác nhau. Ở Nga, ngộ độc chủ yếu do cá, ở Mỹ do đồ hộp
rau quả, ở Đức do ăn các thức ăn làm bằng thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc
xích...
Các triệu chứng: bệnh xuất hiện với các dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là liệt thần
kinh do tổn thương thần kinh trung ương và hành tủy. Triệu chứng sớm nhất là liệt mắt,
cơ mắt, có biểu hiện song thị như nhìn một hóa hai; bị liệt vòm họng, lưỡi, yết hầu biểu
hiện rối loạn lời nói rồi mất tiếng, mất phản xạ nuốt; bị liệt dạ dày, ruột dẫn đến táo bón,
chướng bụng, giảm sự tiết dịch,... Bệnh nhân có thể không sốt nhưng mạch nhanh, mạch
có thể tăng nhanh nhưng nhiệt độ cơ thể vẫn bình thường, có hiện tượng mạch-nhiệt phân
ly.
Các loại thực phẩm nhiễm Clostidium botulinum: phát hiện trong đồ hộp (thịt, cá,
patê, xúc xích, rau quả...), lạp xưởng, thịt đùi lợn, cá ướp muối hoặc phơi khô rồi xông
khói... thức ăn chế biến sẵn và mật ong. Thực phẩm nhiễm Clostridium botulinum rất khó
nhận biết bằng cảm quan, chỉ nhận biết được sau khi sử dụng qua những dấu hiệu lâm

sàng.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 9


*Sự phân bố của Clostridium botulinum
Clostridium botulinum và bào tử của nó được phổ biến rộng rãi trong môi trường
xảy ra chủ yếu trong đất và trầm tích biển. Chúng bao gồm:
- Đất trồng trọt và đất rừng.
- Cặn dưới đáy suối, hồ và ven biển nước.
Tỷ lệ Clostridium botulinum trên toàn thế giới thay đổi tùy theo khu vực địa lý, mà
nhiều khả năng có liên quan đến thành phần vật lý và hoá học của đất và các vi sinh vật
tại nơi đó. Ví dụ các loại ưa lạnh và loại không thủy phân protein của nhóm B và E được
tìm thấy phổ biến trong đất có độ lạnh hơn thông thường và cặn dưới đáy trong khi
những loại thủy phân protein ưa nhiệt độ trung bình của nhóm A va B đã được tìm thấy
phổ biến trong đất ẩm.
Ngoài ra, mầm bệnh và bào tử của nó có một số nơi khác như:
– Trong đường tiêu hóa của loài cá, chim và dạ dày động vật có vú.
– Mang và nội tạng của động vật có vỏ như cua và loài sò hến.
– Trong mật ong của loài ong.
– Bào tử Clostridium botulinum kháng cự đối với những sự căng thẳng môi

trường và (thì) cũng được tìm thấy trong vài thức ăn, bụi, những chất xịt (bình
xịt), chất thải và những môi trường khác.
*Tình hình nhiễm Clostridium botulinum trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam
hiện nay
– Tai Việt Nam: Hiện nay trong sinh hoạt hàng ngày, các loại thực phẩm đóng

hộp có mặt khá phổ biến trên thị trường và được rất nhiều người tiêu dùng sử
dụng. Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quan
tâm đến vấn đề dự trữ các loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó
khăn có thể xảy ra. Một trong những thực phẩm thường được dự trữ là các loại
thực phẩm đóng hộp. Nếu khi mua và sử dụng các loại đồ hộp không cẩn thận,
con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển ở trong loại thực
phẩm này. Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn
Clostridium botulinum có trong đồ hộp, có thể gây tử vong.
Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 10


–

Tại một số nơi trên thế giới: 161 dân làng ở tỉnh Nan (miền Bắc Thái Lan)
đã phát bệnh sau khi ăn măng tre muối muối chua ở một lễ hội. Nhân viên y tế
Thái Lan cho rằng dịch bệnh ở tỉnh Nan là do bảo quản măng tre không tốt đã
tạo ra vi khuẩn Clostridium botulium có độc tố chết người. Độc tố trong vi
khuẩn Clostridium botulinum là một trong những độc tố mạnh nhất và có thể
sử dụng làm vũ khí sinh học. Độc tố này gây tử vong do nó làm tê liệt các cơ
hô hấp làm người bệnh không thở được.

III. Các phương pháp phát hiện Clostridium botulinum
*Phương pháp truyền thống
Thử nghiệm độc tố Clostridium botulinum trong chuột
Trong tất cả những phương pháp pháp hiện và xác định độc tố botulinum trong
thực phẩm thì trong phương pháp phát hiện trên cơ thể chuột là tiêu chuẩn duy nhất để

xác định độc tố.
Sự hiện diện của chất độc được phát hiện bằng cách tiêm vào chuột trích xuất từ
thực phẩm rồi sau đó quan sát cho đặc tính triệu chứng của bệnh ngộ độc khi chuột chết
sau khoảng thời gian 48 giờ.
A. Thiết bị và vật liệu
1. Tủ lạnh.
2. Khăn khô sạch.
3. Đèn Bunsen.
4. Gạc thấm vô khuẩn có thể mở.
5. Cối và chày vô trùng.
6. Chiếc kẹp vô trùng.
7. Những ống hút được nút bởi bông vô trùng.
8. Thiết bị pipet cơ khí (không bao giờ được hút pipet bằng miệng).
9. Những ống nghiệm nuôi cấy.
10. Bình kỵ khí.
11. Dây cấy vòng.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 11


12. Vườn ươm 35 - 280C.
13. Bình mẫu vô trùng.
14. Những cái giá treo đồ ống nghiệm nuôi cấy.
15. Những tiêu bản hiển vi.
16. Kính hiển vi.
17. Đĩa petri vô trùng 100 mm.
18. Máy ly tâm ống.

19. Máy ly tâm, làm lạnh, tốc độ cao.
20. Tripsin.
21. Những ống tiêm 1 và 3 ml, gạc thấm vô khuẩn,với 25 số đo, 5/ 8 cái kim inch để tiêm
thuốc chuột.
22. Chuột nặng 16-24 G.
23. Những cái lồng chuột, thức ăn, những bình lấy mẫu nước,…
24. Lọc Millipore kích thước lỗ 0,45 μm.
B. Môi trường và thuốc thử
1. Dung dịch cồn iốt (4% iốt trong 70% ethanol).
2. Canh gan thịt.
3. Dung dịch Trypticase trích xuất từ peptone-men glucose, canh thịt (TPGY) hoặc với
trypsin (TPGYT).
4. Lagg volk hoặc lagg volk agar kỵ khí.
5. Gạc thấm vô khuẩn, bộ đệm phốt phát chất gien, độ pH 6.2.
6. Ethanol tuyệt đối.
7. Chất phản ứng nhuộm gam tím crystal violet hoặc dung dịch methylene blue.
8. Nước muối sinh lý học vô khuẩn.
9. Chế phẩm thuốc kháng độc các loại AF (lấy từ CDC).
10. Dung dịch Trysin.
11. Dung dịch Sodium hydroxide 1 N.
12. Dung dịch Axít clohiđric 1 N.
C. Chuẩn bị mẫu

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 12


- Kiểm tra sơ bộ: Mẫu được giữ lạnh cho đến khi thử nghiệm, trừ các loại thực

phẩm đóng hộp chưa mở, mà không cần phải được làm lạnh. Trước khi thử nghiệm, ghi
tên sản phẩm, tên nhà sản xuất hoặc chủ sản xuất, nguồn gốc của mẫu, loại container và
kích cỡ, nhãn mác, lô hàng sản xuất, mã sản xuất, và tình trạng của container. Làm sạch
container đánh dấu với mã số nhận dạng của phòng thí nghiệm.
- Thực phẩm rắn và lỏng: Chuyển giao các loại thực phẩm vô trùng lỏng. Ngoài
ra, cấy miếng nhỏ các sản phẩm trực tiếp vào canh môi trường với chiếc kẹp vô trùng.
Cấy các loại thực phẩm lỏng trực tiếp vào canh môi trường với pipet vô trùng. Dự trữ
mẫu sau khi nuôi cấy cho vào ống nghiệm để dành sau này có thể sử dụng lại.
- Mở các loại thực phẩm đóng hộp: Kiểm tra bề ngoài các sản phẩm và mùi. Ghi
nhớ bất kỳ bằng chứng nào về sự phân hủy. Đừng nếm các sản phẩm dưới bất kỳ trường
hợp nào.
D. Phát hiện Clostridium botulinum
Tăng sinh
Loại oxy ra khỏi môi trường bằng cách đun sôi môi trường 10 – 15 phút và làm
lạnh nhanh và không cần lắc đều. cấy 2 ống môi trường thịt được đun với 1 – 2 g thực
phầm rắn hoặc 1 – 2 ml thực phẩm lỏng trong 15ml moi trường tăng sinh, ủ ở 350C.
Cấy 2 ống TPGY như trên,Incubate at 28°C. ủ ở 280C. Use TPGYT as alternative
only when organism involved is strongly suspected of being a nonproteolytic strain of
types B, E, or F. Sử dụng TPGYT thay thế khi sinh vật phân hủy thuộc nhóm không
phân giải protein của các loại B, E, hoặc F. Tiêm thêm chất dẫn truyền độc tố từ dưới bề
mặt canh môi trường. Sau 5 ngày ủ bệnh kiểm tra các canh môi trường gồm kiểm tra độ
đục, sinh hơi và phân hủy các hạt thịt, mùi.
Kiểm tra môi trường nuôi cấy dưới kinh hiển vi, nhuộm gram bằng crystal violet
hoặc dung dịch methylene blue. Quan sát hình thái học của sinh vật và lưu ý sự tồn tại
của các tế bào Clostridium botulinum điển hình, phạm vi hình thành bào tử và vị trí của
các bào tử trong các tế bào. Vào thời điểm quan sát nếu thấy có độc tố thi ta làm theo
mục F bên dưới. Thông thường, sau khi ủ 5 ngày là thời kỳ thích hợp cho sự hình thành

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 13


độc tố botulin. Nếu sau 5 ngày mà không phát hiện thấy độc tố thì ta nên ủ thêm 10 ngày
nữa để phát hiện những bào tử nảy mầm trễ trước khi đem bỏ mẫu thử.

Phân lập
Clostridium botulinum được phân lập từ dịch tăng sinh hoặc mẫu gốc nếu sự hình
thành bào tử được tốt.
Tiền xử lý mẫu trước khi cấy ria
Thêm 1 thể tích cồn tuyệt đối, 1 hay 2 ml vào môi trường tăng sinh, trộn đều và ủ
trong 1h ở nhiệt độ phòng.
Xử lý bề mặt môi trường nuôi cấy
Sử dụng dây cấy vòng khử trùng cấy lên môi trường phân lập để thu được khuẩn
lac riêng lẽ. Nếu cần thiết, để có khuẩn lạc riêng lẽ có thể pha loãng môi trường. Ủ 35 OC
trong khoảng 48 h trong điều kiện kỵ khí.
E. Lựa chọn các vùng C. colonies botulinum điển hình
.Chọn lọc
Select about 10 well-separated typical colonies, which may be raised or flat, smooth or
rough. Lựa chọn khoảng 10 khuẩn lạc đặc trưng có đặc điểm là lồi hoặc. On egg yolk
medium, they usually exhibit surface iridescence when examined by oblique light.Trên
môi trường lagg vokl, chúng thường có sáng ở bề mặt khi quan sát dưới ánh sáng. This
luster zone, often referred to as a pearly layer, usually extends beyond and follows the
irregular contour of the colony.Vùng sang thường kéo dài ra rộng và đường viền bất định
là các vùng Clostridium botulinum. Besides the pearly zone, colonies of Vùng sáng
khuẩn lạc của Clostridium botulinum loại C, D, và E bình thường bao quanh bởi một khu
vực rộng (2-4 mm) kết tủa màu vàng. Colonies of types A and B generally show a
smaller zone of precipitation.Khuẩn lạc của loại A và B nói chung có vùng phát triển nhỏ
hơn. Considerable difficulty may be experienced in picking toxic colonies since certain

other members of the genus produce colonies with similar morphological characteristics
but do not produce toxins. Khó khăn nhất là khi chọn các vùng chứa độc tố thì cũng có

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 14


những vùng khác của chi Clostridium botulinum với đặc điểm hình thái tượng tự nhưng
không sản sinh độc tố.
.Tiêm chủng
Use sterile transfer loop to inoculate each selected colony into tube of sterile
broth.Sử dụng dây cấy vòng chuyển cấy chuyển vô trùng để cấy chuyển mỗi vùng được
chọn vào ống nuôi cấy vô trùng. Inoculate Cấy Clostridium botulinum loại E vào canh
môi trường TPGY. Inoculate other toxin types of Cấy các loại độc tố khác Clostridium
botulinum vào canh trường gan xắt nhỏ hoặc môi trường thịt. Incubate as described in D1, above, for 5 days.Ủ như mô tả trong phần ở trên trong 5 ngày. Test for toxin
production as described in F, below. Sau đó xác định sự sản xuất độc tố như mô tả trong
phần F phía dưới. To determine toxin type, F-3, below.
Phân lập .
Cấy chuyển các chủng sinh độc tố trên 3 đĩa Restreak toxic culture in duplicate on
egg yolk agar mediummôi trường thạch lagg vokl. Incubate one plate anaerobically at
35°C.Ủ đĩa thứ nhất kỵ khí ở 35 ° C. Incubate second plate aerobically at 35°C. Ủ đĩa thứ
2 hiếu khí tại 35 ° C. If colonies typical of Nếu vùng điển hình của Clostridium
botulinum được tìm thấy chỉ trên đĩa kỵ khí (không có sự tăng trưởng trên đĩa hiếu khí)
thì các khuẩn lạc trên môi trường là thuần khiết. Việc phân lập Clostridium botulinum
thất bại do việc chọn khuẩn lạc đặc trưng. Repeated serial transfer through additional
enrichment steps may increase the numbers sufficiently to permit isolation.Lặp đi lặp lại
qua các bước tăng sinh có thể làm tăng số lượng đủ để quá trình phân lập.Store pure
culture in sporulated state either under refrigeration, on glass beads, or lyophilized.

F.Detection and identification of botulinal toxin Phát hiện và xác định các độc tố
botulin
.Chuẩn bị các mẫu thực phẩm. Culture one portion of sample for detection
of viable
Mẫu môi trường phát hiện có độc tố C. ; remove another portion for toxicity
testing, and store remainder in refrigerator. botulinum, lấy một phần để thử nghiệm độc
tính, và phần còn lại lưu trữ trong tủ lạnh. Centrifuge samples containing suspended

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 15


solids under refrigeration and use supernatant fluid for toxin assay.Ly tâm các mẫu có
chứa chất rắn lơ lửng trong điều kiện lạnh và sử dụng chất lỏng nổi trên mặt cho thử
nghiệm độc tố. Extract solid foods with equal volume of gel-phosphate buffer, pH 6.2, by
macerating food and buffer with pre-chilled mortar and pestle.
Xác định tính độc tố trong các mẫu thực phẩm hoặc môi trường
- Xử lý bằng trypsin: Độc tố của các loại không phân hủy protein, nếu có hiện
diện, có thể cần hoạt tính của trypsin để phát hiện. Do đó, việc xử lý dịch của thực phẩm,
thực phẩm lỏng hoặc nuôi cấy trên môi trường TPGY với trypsin trước khi kiểm tra độc
tố. Không xử lý môi trường nuôi cấy TPGYT bằng trypsin vì trong môi trường này đã có
chứa sẵn trypsin và việc xử lý nhiều có thể làm phân hủy hoàn toàn độc tố. Điều chỉnh lại
pH của dịch mẫu đến 6,2 bằng cách sử dụng NaOH hoặc HCl 1N. Thêm 0,2 ml dung dịch
trypsin vào 1,8 ml mỗi dịch mẫu cần kiểm tra độc tố. Ủ ở 35 – 37 0C trong 1 h và thỉnh
thoảng lắc nhẹ.
- Kiểm tra độc tố: .Conduct parallel tests with trypsin-treated materials and
untreated duplicaTiến hành thử nghiệm song song mẫu không xử lý trypsin với mẫu được
xử lý trypsisn. Dilute a portion of untreated sample fluid or culture to 1:5, 1:10, and

1:100 in gel-phosphate buffer. Pha loãng một phần của mẫu chất lỏng không được xử lý
trypsin với nồng độ 1:5, 1:10 và 1:100 trong gel-phosphate buffer. Thực hiện tương tự
đối với mẫu được xử lý trypsinMake the same dilutions of each trypsinized sample fluid
or culture.. Mỗi độ pha loãng tiến hành Inject each of separate pairs of mice
intraperitoneally (ip) with 0.5 ml untreated undiluted fluid and 0.5 ml of each dilution of
untreated test sample, using a 1 or 3 ml syringe with 5/8 inch, 25 gauge needle.tiêm vào
mỗi cặp chuột ở bụng với 0,5 ml dung dịch không pha loãng và không được xử lý và 0,5
ml của mỗi độ pha loãng của mẫu thử nghiệm không được xử lý. Repeat this procedure
with trypsin-treated duplicate samples. Lặp lại thao tác này với mẫu được xử lý với
trypsin. Heat 1.5 ml of untreated supernatant fluid or culture for 10 min at 100°C.Đun
nóng 1,5 ml dịch nổi không được xử lý trong 10 phút ở 100°C. Làm lạnh mẫu đã gia
nhiệt và tiêm vào một đôi chuột Cool heated sample and inject each of a pair of mice with
0.5 ml undiluted fluid.0,5 ml dung dịch không pha loãng. These mice should not die,

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 16


because botulinal toxin, if present, will be inactivated by heating.Những con chuột này
không chết, bởi vì nếu có độc tố botulin, sẽ được bất hoạt bởi nhiệt.
- Observe all mice periodically for 48 h for symptoms of botulism.Quan sát tất cả
các con chuột định kỳ trong 48 h cho các triệu chứng của bệnh ngộ độc. Record
symptoms and deaths. Ghi lại các triệu chứng và tử vong. Typical botulism signs in mice
begin usually in the first 24 h with ruffling of fur, followed in sequence by labored
breathing, weakness of limbs, and finally total paralysis with gasping for breath, followed
by death due to respiratory failure. Dấu hiệu ngộ độc điển hình ở chuột bắt đầu xuất hiện
trong 24 h đầu tiên ở lông, tiếp theo khó thở, yếu chân tay, và cuối cùng tê liệt với thở
nhanh, sau đó là tử vong do suy hô hấp. Death of mice without clinical symptoms of

botulism is not sufficient evidence that injected material contained botulinal toxin. Cái
chết của con chuột mà không có triệu chứng lâm sàng của bệnh ngộ độc là không đủ bằng
chứng cho thấy chứa độc tố tiêm botulin. On occasion, death occurs from other chemicals
present in injected fluid, or from trauma. Đôi khi, cái chết xảy ra từ các hóa chất khác có
trong dung dịch tiêm, hoặc từ chấn thương.
It is necessary to have dilutions that kill and dilutions that do not kill in order to
establish an endpoint or the minimum lethal dose (MLD) as an estimate of the amount of
toxin preseNếu sau 48h quan sát, ngoại trừ tất cả những con chuột đã chết, lặp lại các thử
nghiệm độc tính bằng cách sử dụng dịch nổi được pha loãng ở nồng độ cao hơn. Cần phải
pha loãng dung dịch từ không giết chết con chuột đến giết chết con chuột để thiết lập một
liều tối thiểu gây chết người (MLD) trước khi ước tính số lượng độc tố có mặt. The MLD
is contained in the highest dilution killing both mice (or all mice inoculated). Các MLD
có độ pha loãng cao nhất giết chết cả hai con chuột (hoặc tất cả các con chuột được
tiêm),From these data, the number of MLD/ml can be calculated. từ những dữ liệu này số
ml / MLD có thể được tính toán.
*Store pure culture in sporulated state either under refrigeration, on glass beads, or
lyophilized.To determine toxin type, F-3, below.******

Phương pháp hiện đại

a. Phương pháp Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 17


Đựợc sử dụng để phát hiện độc tố hoạt tính sinh học và sự dò tìm độc tố không tích
cực.Những tiến bộ kỹ thuật trong vài thập niên vừa qua thúc đẩy sự phát triển của nhiều

kỹ thuật chuẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính xác các bệnh truyền nhiễm. Mặt
khác, sự phát triển của những kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa thao tác thực hiện.
Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng
nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết
thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên – kháng thể hoặc bằng cách sử
dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng
xạ hay enzyme).
Trong số các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch
dùng enzyme (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay: ELISA) được quan tâm nhiều
nhất do có tính đơn giản và hiệu quả cao. Phương pháp này có thể sử dụng cho hầu hết
các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là
sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của
kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ giữ lại trên bề mặt giếng. các
kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với
enzyme như horseradish peroxydase hay alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc
hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản
phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện
và định lượng kháng nguyên.
ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ kit thương mại và có thể được
cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh vật trong
thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh.
b. Phương pháp lai phân tử
Hiện nay nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật
và độc tố. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn gọi là phương pháp mẫu
dò, probes) và phương pháp PCR là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện
vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh
vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 18


Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự
tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở
lại bình thường. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với
một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi
trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Quá trình lai phân tử chiu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu
tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình
tự lai và lực ion của môi trường.
Ví dụ: Ở hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống này sử dụng que thử
với mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. mẫu dò là những
đoạn oligomer AND đánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình phân tích có thể chia
làm 6 bước:
1) Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA
2) Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate ở đầu 5` và 3` của phân tử được

đặt vào phản ứng.
3) Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của

mẫu dò.
4) Que thử được đặt trong ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng

enzyme
5) Sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo

màu.
6) Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450nm.

c. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp invitro để tổng
hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản
sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và
một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis mà cộng
sự phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện,

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 19


tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong
thực phẩm…
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là
trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc
tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn,
có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của đoạn mạch khuôn và nhờ hoạt động của
DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR
được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai
mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR,
ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ
được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm
bằng ethidium bromide và có thể thu nhận được đoạn DNA này cho các mục đích thao
tác trên gen. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những
thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn đủ để tạo
các mồi bổ sung chuyên biệt.

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
- Bước 1: Biến tính
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép,
phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn T m của phân tử, thường là 94 – 95 oC
trong 30 – 60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
- Bước 2: Bước lai
Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch
khuôn, nhiệt độ này khoảng 40 – 70oC, trong khoảng 30 – 60 giây.
-

Bước 3: Tổng hợp

Nhiệt độ được tăng lên đến 72 oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp
tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường
kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 20


Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bước như trên sẽ lặp lại nhiều lần, mỗi
lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. đây là sự khuếch đại theo cấp số
nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ sự khuếch đại sẽ tạo ra 10 6 bản sao. Sau phản
ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua
việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng
320nm).
Quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng
phương pháp PCR như sau:

- Bước 1: Tăng sinh trên môi trường không hoặc ít chọn lọc trong thời gian từ 10 –
20 giờ.
- Bước 2: Thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi
khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA)
với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý nhiệt ở 100 oC trong 10 phút,
ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR.
- Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR
- Bước 4: Điện di trên gel agarose 1,5% xem kết quả trên đèn UV.
*Biện pháp kiểm soát Clostridium botulinum trong thực phẩm
Không dùng đồ conserve đựng trong lon mà nắp đã phồng lên, hoặc chảy nước.
Cẩn thận với những món rau cải, tỏi ngâm dầu và được vô keo vô hũ tại nhà.
Nếu trường hợp tự làm conserve thì nguyên liệu tươi cần phải cất trong tủ lạnh và
phải quăng đi sau 10 ngày.
Không dùng thực phẩm hư, nổi bọt, thúi hoặc bốc mùi lạ lúc nấu.
Không nên ăn, nếu nghi ngờ đồ conserve không được vô keo vô lọ cẩn thận đúng
phép vệ sinh.
Không nên cho các cháu dưới một tuổi ăn mật ong kể cả loại sản phẩm đã có ghi
chú trên nhãn hiệu như…đã được hấp khử trùng pasteurized…
Giữ vệ sinh tối đa trong các giai đoạn làm đồ conserve tại nhà. Nếu có máy
autoclave để hấp khử thì lý tưởng nhất. Nếu ở nhà không có máy hấp autoclave chúng ta

Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 21


tạm áp dụng phương pháp nước nóng mỗi khi cần vô keo làm đồ conserve. Keo và nắp
cần được nấu trong nước sôi để diệt trùng. Sau khi bỏ nguyên vật liệu vào keo, đậy nắp
lại cho thật kỹ rồi sau đó đem bỏ vào một nồi nước thật sôi để khử trùng một lần chót.

IV. Kết luận
Clostridium botulinum là một vi khuẩn nguy hiểm vì chúng tiết độc tố botulin tác
động ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương gây tê liệt từng phần trên cơ thể rồi dần
toàn bộ cơ thể con người và động vật. Tuy nguy hiểm như vậy nhưng độc tố botulin cũng
có được vài ứng dụng ích lợi trong y khoa trị liệu: Độc tố A được sử dụng để trị những
xáo trộn thần kinh gây sự co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa ngái ngoài da, đau cơ vùng
mặt (douleur myofaciale), tiết quá nhiều mồ hôi (hyperhidrose), nhức đầu (migraine)...
Tuy bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum rất ít khi xảy ra nhưng không
phải vì thế mà chúng ta quên đi sự phòng tránh, mà phải tuân thủ những biện pháp kiểm
soát chúng vì độc tố của vi khuẩn này rất mạnh khi bi nhiễm tỷ lệ tử vong rất cao.

V. Tài liệu tham khảo
/> />
Nguyễn Văn Nhi
13139119

Page 22