Nghiên cứu khả chống ung thư hoạt chất phân lập từ Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) Hậu phác (Magnolia officinalis Rehd Et wils, Magnoliaceae)

Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các
hoạt chất phân lập từ cây Vông nem
(Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) và
cây Hậu phác (Magnolia officinalis Rehd. Et
wils, Magnoliaceae)
Nguyễn Thị Ngọc Ánh
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung
Năm bảo vệ: 2012
Abstract: Tổng quan về ung thư , các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư , một
số dòng tế bào ung thư , chế phẩm Honokiol , Magnolol, Derrone và thuốc Taxol .
Khảo sát ảnh hưởng của ba chất Honokiol , Magnolol và Derrone lên sự tăng trưởng
của một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy đơn lớp 2D. Nghiên cứu ảnh hưởng của
Honokiol lên mô hình 3D khối cầu đa bào các tế bào ung thư. Bước đầu nghiên cứu
cơ chế tác động của Honokiol lên hệ thống vi sợi và tác động của ba chất lên hoạt
động của enzyme Aurora kinaza ở tế bào ung thư.
Keywords: Cây vông nem; Cây hậu phác; Hoạt chất phân lập; Khả năng chống ung
thư; Sinh học thực nghiệm; Hóa sinh học
Content
MỞ ĐẦU
Theo Tổ chức Y tế thế giới – WHO, có khoảng 12.7 triệu ca ung thư và 7,6 triệu ca tử
vong do ung thư được ghi nhận trong năm 2008, trong đó 56% số ca và 64% trường hợp tử
vong là ở các nước đang phát triển. Cũng theo dự báo của WHO, tới năm 2020, số người
mắc ung thư trên toàn cầu có thể tăng lên đến 15 triệu ca mới mỗi năm. Tỷ lệ chết do ung
thư có thể chiếm 25% tổng số ca tử vong. Theo số liệu công bố tại Hội thảo Quốc gia
phòng chống ung thư, năm 2010 Việt Nam có 126.300 ca mắc mới. Căn bệnh nan y này
đang tăng nhanh so với 10 năm trước [1].
Vốn là một đất nước được thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng
phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau. Từ nhiều thế kỷ
nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những

phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồ m cả thuốc chố ng ung thư. Bởi vậy, nghiên

1


cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có khả năng chữa ung thư là một
hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu tư tập trung nghiên cứu
trong nhiều năm nay. Trong xu hướng này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng
u của ba chất Honokiol, Magnolol được tách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis
Rehd. Et wils, Magnoliaceae và Derrone được tách chiết từ cây Vông nem Erythrina
orientalis L. Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp cho nhóm Nghiên
cứu Ung thư thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội nhằm mục đích:
Khảo sát ảnh hưởng của ba chất Honokiol, Magnolol và Derrone lên sự
tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy đơn lớp 2D.
Nghiên cứu ảnh hưởng của Honokiol lên mô hình 3D khối cầu đa bào các tế
bào ung thư.
Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác động của Honokiol lên hệ thống vi sợi và
tác động của ba chất lên hoạt động của enzyme Aurora kinaza ở tế bào ung
thư.

2


CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1.

Mô hin
̀ h 2D và 3D các tế bào ung thƣ

1.1.1. Nuôi cấy tế bào
Như ta đã biết, các thử nghiệm độc tính ban đầu được tiến hành trên sinh thiết khối u nuôi
cấy nhân tạo trong môi trường có thành phần không xác định, do vậy quá trình định lượng
rất khó khăn. Năm 1950, nhờ sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thành dạng đơn
lớp 2D trong đĩa Petri thủy tinh hoặc nhựa, kết hợp với sự phát triển của môi trường có
thành phần xác định về mặt hóa học nên quy trình sàng lọc thuốc được tiến hành đơn giản
hơn trên các tế bào nuôi cấy 2D này. Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép
chúng ta xác định được mối quan hệ đáp ứng liều giữa các dòng tế bào khác nhau với các
nồng độ thuốc thử khác nhau [9].
Các tế bào khi được phân lập đem nuôi cấy in vitro thường phát triển thành dạng hoặc trôi
nổi, hoặc bám dính, hoặc hỗn hợp cả 2 loại [4, 8, 9].
Sử dụng mô hình tế bào 2D có nhiều ưu điểm như thời gian sàng lọc ngắn, cho phép thao
tác với nhiều dòng tế bào, nhiều hợp chất khác nhau và dải nồng độ rộng cùng một lúc.
Tuy nhiên, mô hình này có nhược điểm là tương tác giữa TBUT với hợp chất chỉ theo một
chiều, thiếu sự tương tác giữa TBUT với hệ miễn dịch cũng như của hệ miễn dịch với hợp
chất. Như vậy mô hình này không mô phỏng được điều kiện in vivo của cơ thể [9].
1.1.2. Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thƣ
Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư, gọi tắt là mô hình spheroid, là một khối hình
cầu được tạo nên từ TBUT. Để tạo được mô hình này người ta tiến hành nuôi cấy giọt treo
các TBUT. Dưới tác dụng của trọng lực cùng với các liên kết giữa các tế bào, các TBUT
tập trung lại và liên kết với nhau tạo nên các khối cầu nhỏ. Sau đó các khối cầu nhỏ này
được đưa vào các đĩa nuôi cấy chứa môi trường nuôi cấy tương ứng, đã phủ một lớp giá đỡ
bên dưới [4, 9].
So với mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp thì cấu trúc của spheroid gần giống với hệ thống in
vivo hơn. Các nghiên cứu gần đây cho thấy các tế bào được nuôi cấy trong mô hình 3D
biểu hiện các đặc tính khác so với khi nuôi cấy 2D. Những sự khác biệt này được coi như
là yếu tố giúp mô hình 3D phản ánh tốt hơn sự tương tác giữa các TBUT với môi trường in
vivo.
1.2.

Chế phẩ m Honokiol, Magnolol, Derrone

1.2.1. Honokiol (H) và Magnolol (M)
Vỏ cây và rễ của các loài thuộc họ Ngọc lan Magnoliaceae đã được sử dụng như một
phương thuốc cổ truyền ở Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật bản. Trong số các hợp chất tách
chiết được từ các loài cây này, các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến hai chất Honokiol và
Magnolol. Đây là hai đồng phân của một hợp chất chứa gốc phenol được tách chiết từ vỏ
cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd. Et wils, còn gọi là Hậu phác bắc. Honokiol (3,5'diallyl-4,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm khoảng 1-5% trọng lượng vỏ cây và Magnolol (5,5'-

3


diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm khoảng 2-10% đều có công thức cấu tạo là C18H18O2
với trọng lượng phân tử M = 266,33.
1.2.2. Derrone (D)
Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano) isoflavone) có công thức hóa học là
C20H16O5, M = 336,1 là hợp chất được tách chiết từ cây Vông nem Erythrina orientalis
(L.) Murr.,. Trong công trình nghiên cứu được công bố vào tháng 6 năm 2012, Hayet
Edziri và cộng sự đã chứng minh Derrone có tác động kháng khuẩn với vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli với nồng độ trong khoảng từ 7,81 – 15,62
µg/mL. Ngoài ra, Derrone cũng thể hiện tính kháng nấm mạnh với các loài thuộc họ
Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL và có tính độc với dòng tế bào ung thư gan HepG2. Tuy
nhiên, các cơ chế chuyên sâu về tác động của Derrone lên tế bào vẫn còn chưa được biết rõ
[3, 5].

4


CHƢƠNG 2 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu
-

Các dòng TBUT HCT116, Hela, MCF7 và KPL4 do Nhóm nghiên cứu Ung thư
thực nghiệm – Bộ môn Tế bào, Mô, Phôi và Lý sinh – Khoa Sinh học – Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.

-

Mẫu Honokiol (H), Magnolol (M) và Derrone (D) do Viện Dược liệu Trung
ương cung cấp, dạng dung dịch đồng nhất lưu trữ ở nồng độ 20.000µg/mL
trong dung môi DMSO và đ ối chứng dương Taxol, dạng thương phẩm
30mg/5mL, tương đương 6.000µg/mL.

2.2.

Phƣơng pháp thử độc tính MTS

MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl)
- 2H - tetrazolium) khi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ được tế bào chuyển hóa,
tạo ra một sản phẩm formazan tan trong môi trường nuôi cấy tế bào, hấp thụ ánh sáng tối
đa ở bước sóng 490-500 nm trong đệm PBS. Lượng formazan tạo ra sẽ được định lượng
bằng lượng ánh sáng ở bước sóng 490nm bị hấp thụ và tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống
trong môi trường nuôi cấy đó. Phương pháp MTS thường được coi là phương pháp MTT 1
bước, có tính tiện lợi cao do chỉ cần bổ sung thẳng chất vào môi trường nuôi cấy tế bào mà
không cần bất kỳ bước rửa hay chuẩn bị nào khác.
2.3.

Phƣơng pháp thử độc tính trên mô hình spheroid



Tạo giá thể cho khối spheroid



Tạo khố i spheroid bằ ng phương pháp gio ̣t treo và hạ giọt treo



Với thí nghiệm theo dõi tốc độ sinh trưởng của khối spheroid: Theo dõi hàng
ngày và thay môi trường, chụp ảnh 2 ngày/lần cho đến khi khối spheroid phân
rã. Đo kích thước khối spheroid và tính thể tích khốidựng đường cong sinh
trưởng để biết quy luật tăng trưởng của khối spheroid.



Với thí nghiệm kiểm tra tác động của H lên khả năng tạo khối spheroid: Sau khi
tạo giá thể, tiến hành tạo giọt treo bằng môi trường có chứa H nồng độ (NĐ)
5µg/mL và môi trường có chứa H NĐ 10µg/mL. Hạ giọt treo xuống các giếng
chứa môi trường hoặc môi trường chứa H với nồng độ tương ứng. Theo dõi và
tính thể tích khối, dựng đường cong sinh trưởng của khối spheroid ở ba mẫu

5


khác nhau và so sánh sự khác biệt xem liệu H có ảnh hưởng đến quá trình tạo
khối hay không.


Với thí nghiệm theo dõi tác động của H lên quá trình tăng trưởng khối spheroid:
Sau khi tạo giá thể, tạo giọt treo và hạ giọt treo, tiến hành chia các giếng có
chứa các khối spheroid đồng đều, phát triển khỏe mạnh thành ba nhóm mẫu:
Đối chứng sinh học (ĐCSH), mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, và mẫu ủ H NĐ
20µg/mL. Theo dõi và tính thể tích khối, dựng đường cong sinh trưởng của
khối spheroid xem H có tác động lên quá trình sinh trưởng của khối spheroid
hay không.

2.4.

Phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang
Nồng độ thuốc thử:


H: 10 µg/mL và 20 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên actin)



H, M, D: 10 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên Aurora kinaza)



Nhuộm mẫu theo các bước như sau:
o Cố định mẫu bằng PFA 4% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
o Đục màng tế bào bằng TrytonX 0,5% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
o Block các liên kết không đặc hiệu và bộc lộ các liên kết đặc hiệu bằng cách
ủ mẫu với BSA 5% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
o Nhuô ̣m kháng thể 1, 2 và nhân với thuốc nhuộm tương ứng

6

CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

Kế t quả khảo sát đô ̣c tính trên mô hình 2D

3.1.1. Với dòng HCT116
Sau 48h ủ, ngay ở nồng độ thứ nhất (5µg/mL) H đã có tác dụng rõ rệt: 80% các tế bào co
tròn lại. Ở nồng độ thứ hai (10µg/mL) các tế bào chỉ còn là các chấm tròn nhỏ và không
còn sự khác biệt rõ rệt về hình thái với 3 nồng độ 20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL còn lại.
Magnolol (M) tác động rõ rệt đến tế bào HCT116 theo xu hướng tương tự ngay từ nồng độ
5µg/mL và cũng không có sự khác biệt rõ rệt về hình thái ở 4 nồng độ 10 µg/mL,
20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL còn lại.
Với Taxol, sau 48h ủ, ở nồng độ thứ nhất 0,003µg/mL tế bào đã có xu hướng co lại so với
mẫu ĐCSH. Xu hướng này tăng rõ rệt theo chiều tăng nồng độ, các tế bào co lại thành
dạng tròn và nhỏ dần từ nồng độ 0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL đến 30µg/mL.
3.1.2. Với dòng Hela
Quan sát dưới KHV cũng cho thấy mức độ ảnh hưởng của H lên dòng Hela xuất hiện rõ rệt
bắt đầu từ nồng độ thứ ba (20µg/mL) sau đó tăng dần ảnh hưởng cho đến nồng độ thứ năm
(50µg/mL). Với mẫu Hela ủ Taxol, các tế bào có xu hướng co dần lại khi tăng dần nồng độ
thuốc thử. Tác động của Taxol có thể thấy rõ rệt ngay từ nồng độ thứ nhất (0,003µg/mL)
và đến nồng độ cuối cùng (30µg/mL) tế bào thành dạng chấm tròn nhỏ.
3.1.3. Với dòng MCF7
Tế bào MCF7 có kích thước lớn, đang ở trạng thái khỏe mạnh và mật độ vừa phải. Với
dòng MCF7, H chỉ có tác dụng ở các nồng độ cao, bắt đầu từ nồng độ thứ ba (20µg/mL)
trở đi. Tại các nồng độ này, sau 48h ủ với mẫu, các tế bào không trải rộng trên bề mặt nuôi
cấy mà bị co tròn lại, liên kết lỏng lẻo, một số trôi nổi trong môi trường nuôi cấy. Nhiều tế
bào không còn sáng màu mà nhăn nheo và trở nên đậm màu. Đây chính là các tế bào chết.
Số lượng các tế bào này ở nồng độ thứ năm (50µg/mL) chiếm tỷ lệ lớn nhất so với các

nồng độ còn lại.
Với mẫu ủ Taxol, sự biến đổi hình dạng tế bào có thể quan sát được rõ ràng ngay từ nồng
độ đầu tiên (0,003µg/mL), tiếp đó sự khác biệt về hình thái quan sát được là không lớn với
3 nồng độ sau (0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL) nhưng đến nồng độ thứ năm (30µg/mL),
các tế bào hầu hết không còn độ bóng, ở dạng tròn ép dẹt vào bề mặt đĩa nuôi cấy.
3.1.4. Với dòng KPL4
Cả ba chất Honokiol, Magnolol và Derrone đều có xu hướng tác động làm ức chế tăng sinh
mạnh mẽ dòng KPL4 ở nồng độ thứ ba (20 µg/mL). Ở nồng độ này, hình thái tế bào ở cả
ba mẫu thay đổi khá giống nhau so với mẫu ĐCSH và các mẫu ủ với nồng độ thấp hơn.
Với Taxol, KPL4 bị tác động làm biến đổi hình thái rõ rệt ngay từ nồng độ đầu tiên (0,003
µg/mL). Mức độ biến đổi này được duy trì ở ba nồng độ kế tiếp, chỉ đến nồng độ thứ năm
(30 µg/mL) hình thái tế bào mới thay đổi rõ rệt một lần nữa. Các tế bào lúc này có kích
thước rất nhỏ, mất đi hẳn độ sáng bóng bình thường. Kết quả đo chỉ số hấp thụ ánh sáng tại
bước sóng 490 nm cũng cho kết quả tương đồng.

7


Bảng 1: Tổng hợp giá trị IC50 và chỉ số tương quan R2 của Honokiol, Magnolol, Derrone
và Taxol
Chất
H
M
D
Taxol

HCT116
IC50
(µg/mL)
2

0,2
0,4

R2
0,93
0,97
0,95

Hela
IC50
(µg/mL)
31,63

R2

0,94

MCF7
IC50
(µg/mL)
17,8

R2

4,3

0,99

5,6

0,97

0,93

KPL4
IC50
(µg/mL)
8,3
14,8
17,8
8,9

R2
0,91
0,96
0,93
0,93

Tất cả các giá trị IC50 này đều có chỉ số tương quan R2 >0,9, đảm bảo đủ độ tin cậy.
Honokiol, Magnolol và Derrone khi thử trên cùng dòng tế bào đều cho giá trị IC 50 cao hơn
so với Taxol ngoại trừ với dòng KPL4, Honokiol cho giá trị IC 50 tương đương với Taxol.
Với Honokiol, chỉ số IC50 giảm dần đối với dòng Hela, MCF7, KPL4 và HCT116, bước
đầu cho thấy độc tính của nó tăng dần tương ứng. Chỉ số IC50 thu được với Hela cao hơn,
chỉ số với MCF7 nằm trong khoảng, và với KPL4, HCT116 thì thấp hơn các giá trị IC50 đã
công bố [2, 6, 7]. Với Magnolol và Derrone, giá trị IC50 thu được cũng nằm trong khoảng
các giá trị IC50 đã từng công bố [3].
3.2.

Kế t quả nghiên cƣ́u tác đô ̣ng của Honokiol trên mô hinh
̀ 3D

3.2.1. Kết quả theo dõi sự tăng trƣởng khối spheroid MCF7
Kết quả ghi nhận được cho thấy khối spheroid MCF7 có xu hướng phát triển mạnh về kích
thước từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt treo và tăng tiếp cho đến ngày thứ 17, sau đó giảm dần
với tốc độ chậm hơn. Trong khoảng thời gian này, cấu trúc của khối spheroid cũng ổn định
dần, viền đậm và rõ nét hơn, spheroid tròn hơn; cấu trúc lõi hoại tử xuất hiện từ ngày thứ 5
sau khi hạ giọt treo. Viền phân cách giữa lõi hoại tử với phần tế bào tăng sinh bên ngoài
khối rõ dần, lõi hoại tử tăng dần diện tích một cách tương quan với sự tăng thể tích khối.
Sau ngày thứ 17, đi cùng với suy giảm kích thước là cấu trúc khối spheroid trở nên bất ổn:
viền ngoài không còn rõ nét, khối tròn mất dần, cấu trúc liên kết giữa các tế bào trong khối
trở nên lỏng lẻo dần và các tế bào bong dần ra khối spheroid.
3.2.2. Kết quả kiểm tra tác động của Honokiol lên quá trình tạo khối spheroid
MCF7
Sau hai ngày tạo giọt treo với môi trường chứa H ở các nồng độ 5µg/mL và 10µg/mL,
quan sát dưới KHV chúng tôi nhận thấy: tất cả các giọt treo tạo bởi môi trường chứa
10µg/mL H đều không tạo thành khối spheroid, các tế bào được đưa vào tạo khối đã chết
và nằm phân tán trong giọt treo. Điều này cho thấy H tác động mạnh đến tế bào MCF7 khi
ở trạng thái huyền phù, so với kết quả kiểm tra tác động ở mô hình 2D thì ở nồng độ
10µg/mL, chỉ số tăng sinh của tế bào MCF7 hoàn toàn không bị suy giảm.
Với các giọt treo còn lại ở các mẫu ĐCSH và H nồng độ 5µg/mL đều hình thành giọt treo
và chưa thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa hai mẫu này. Ở ngày thứ 5, các khối spheroid ủ H
có kích thước tương đương với mẫu ĐCSH nhưng lõi hoại tử đã xuất hiện rõ rệt hơn, chưa
có viền phân định rõ ràng với lớp tế bào tăng sinh bên ngoài. Đến ngày thứ 7, các tế bào ở

8


khối lớp vỏ spheroid này đã tách ra khỏi cấu trúc khối, toàn bộ khối thu hẹp lại về kích
thước trong khi các khối spheroid ở mẫu ĐCSH vẫn tiếp tục tăng trưởng bình thường.
3.2.3. Kết quả kiểm tra tác động của Honokiol lên sự tăng trƣởng của khối spheroid

MCF7
Với mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, đến ngày thứ 9 các khối spheroid đã có sự khác biệt rõ rệt với
mẫu ĐCSH. Lõi hoại tử của khối spheroid với mẫu này lớn dần lên và viền phân cách với
lớp tăng sinh bên ngoài mờ dần đi cho đến khi cả khối gần như sẫm đồng màu vào ngày
thứ 15. Trong khi đó lớp tăng sinh bên ngoài cũng thể hiện sự bất ổn như viền xù xì, màu
không còn sáng nhưng vẫn giữ được một độ “đặc” nhất định của khối. Sau khi toàn bộ
khối hoại tử thì các tế bào bắt đầu bong ra thành mảng.
Với mẫu ủ H nồng độ 20µg/mL, toàn khối spheroid thể hiện rõ rệt sự bất ổn khi lớp lõi
hoại tử gần như không tăng lên về kích thước trong khi lớp tế bào tăng sinh bên ngoài trở
nên lỏng lẻo hơn dẫn đến sự tăng kích thước của khối. Tuy nhiên, lớp tế bào này do tác
động của H ức chế tăng sinh nên lớp tăng sinh này cũng chuyển màu xám dần và gần như
ngừng tăng kích thước từ ngày thứ 13. Sau ngày thứ 15, các khối này cũng bị phân rã.
3.3.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của Honokiol lên hệ vi sợi actin

Kết quả cho thấy, quần thể tế bào HeLa sau khi ủ với Honokiol ở nồng độ 10 µg/mL có sự
thay đổi rõ rệt. Từ cùng một lượng tế bào ban đầu, sau 48h xử lý với chất, các tế bào phân
bố thưa thớt và rời rạc hơn so với đối chứng (do không tăng lên về số lượng, đồng thời
xuất hiện các tế bào chết). Các tế bào phần lớn có dạng sợi chứ không trải rộng hình sao,
chiều ngang bị thu hẹp nhiều so với đối chứng.
Khoảng cách giữa các tế bào lớn, đặc biệt giữa các tế bào cách xa nhau vẫn nối với nhau
bởi các sợi actin kéo dài. Sự tồn tại của dạng cấu trúc này có thể do ảnh hưởng của chất lên
quá trình phân chia tế bào chất dẫn đến sự phân tách hai tế bào sau quá trình nguyên phân
diễn ra không hoàn toàn, hai tế bào vẫn còn dính nhau bởi các sợi actin. Sự biểu hiện của
F-actin trong tế bào cũng thay đổi: Trong khi ở các tế bào đối chứng, hệ sợi actin phân bố
đều trên toàn bộ tế bào chất và màng tế bào, có thể quan sát được cấu trúc dạng sợi thì trên
rất nhiều tế bào HeLa xử lý với Honokiol, có thể dễ dàng nhận thấy hệ thống sợi actin kém
biểu hiện (tín hiệu huỳnh yếu hơn so với đối chứng), vùng tế bào chất tối màu, không quan
sát được actin tồn tại ở dạng sợi căng. Một số tế bào vẫn biểu hiện nhiều F-actin, tuy nhiên

các sợi actin trên các tế bào này lại tập trung nhiều ở màng tế bào hoặc thành các cụm chứ
không phân bố thành dạng sợi và liên kết thành mạng lưới như ở đối chứng. Như vậy có
thể thấy Honokiol đã ảnh hưởng rõ rệt lên sự biểu hiện cũng như cách sắp xếp, phân bố của
actin. Đồng thời sự tổ chức của actin cũng bị rối loạn, không tồn tại thành dạng mạng lưới
sợi mà co cụm thành tứng đám trên màng tế bào và cả ở trong tế bào chất. Đây có thể là
nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi hình dạng và thu nhỏ kích thước của tế bào.
3.4.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa Histon H3
tại vị trí Serine 10

Ở các tế bào đối chứng, toàn bộ tế bào phân chia ở các kỳ trước, giữa, sau và cuối của pha
M đều cho kết quả dương tính với kháng thể H3PS10, nghĩa là sự phosphoryl hoá H3 diễn
ra bình thường. Chúng tôi cũng quan sát thấy một số tế bào không phân chia vẫn biểu hiện
huỳnh quang, đây là các tế bào pha G2 chuẩn bị bước vào giai đoạn M. Ta biết rằng tất cả

9


các quá trình chuẩn bị cho phân chia đều diễn ra ở G2, trong đó có quá trình khởi động của
sự cuộn xoắn nhiễm sắc thể, đó là lúc histone H3 bắt đầu được photphoryl hóa. Các tế bào
phân chia sẽ co tròn lại, màng nhân tiêu biến. Các NST cuộn xoắn và biểu hiện mạnh
H3PS10. Các tế bào ở kỳ trung gian trải rộng trên nền nuôi cấy, có dạng hình sao, không
biểu hiện sự photphoryl hóa Histon H3. Một số tế bào biểu hiện là các tế bào ở pha G2
chuẩn bị bước vào phân bào.
Trong số 03 mẫu chất thử tại nồng độ 10 µg/mL, chúng tôi nhận thấy có Derrone có biểu
hiện rõ rệt sự ức chế H3P ở mức độ tế bào. Các tế bào phân chia dù ở cùng một pha lại có
sự biểu hiện huỳnh quang rất khác biệt. Một số tế bào có tín hiệu rất mạnh, tương đương
với đối chứng, trong khi đó một số biểu hiện yếu hoặc gần như không biểu hiện. Đặc biệt ở
mẫu Derrone có sự giảm sút đáng kể tín hiệu huỳnh quang trên các tế bào ở cả ba kỳ: đầu

(prophase), đầu-giữa (prometaphase) và kỳ giữa (metaphase). Chúng tôi đếm số lượng tế
bào âm tính với tín hiệu huỳnh quang, hoặc tín hiệu yếu thì thu được tỷ lệ là 42% trên tổng
số tế bào phân chia. Đối với mẫu Honokiol và Magnonol, các tế bào phần lớn đều biểu
hiện mạnh H3PS10 ở tất cả các kỳ trong phân bào. Tỷ lệ tế bào biểu hiện yếu H3PS10 là
1,2 % ở mẫu Honokiol và 1,5 % ở mẫu Magnonol.
Derrone thuộc nhóm chất flavonoid, là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học. Rất nhiều
chất thuộc nhóm này đã và đang được ứng dụng trong điều trị ung thư. Kết quả nghiên cứu
này của chúng tôi cho thấy Derrone có ảnh hưởng ức chế sự phosphoryl hóa histon H3 tại
serine 10. Đây là cơ chất đã được chứng minh của enzyme Aurora B.

10


KẾT LUẬN
Từ nhưng kết quả thí nghiệm và phân tích trên đây, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
 Honokiol có độc tính với dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT 116, ung
thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF7 và KPL4 với chỉ số IC50 tương ứng là
2; 31,63; 17,8 và 8,3 µg/mL (R2 >0,9). Magnolol có độc tính với dòng tế bào
ung thư biểu mô ruột kết HCT116 và ung thư vú KPL4 với chỉ số IC50 tương
ứng là 0,2 và 14,8 µg/mL (R2 >0,9). Derrone có độc tính với dòng tế bào ung
thư vú KPL4 với chỉ số IC50 là 17,8 µg/mL (R2 >0,9).


Honokiol có tác động ngăn cản quá trình tạo khối spheroid của tế bào MCF7 ở
nồng độ 10µg/mL và ức chế tăng trưởng khối này ở nồng độ 10 và 20 µg/mL.



Honokiol tác động đến sự biểu hiện cũng như các sắp xếp, phân bố của hệ
thống vi sợi actin, làm tổ chức actin bị rối loạn, không tồn tại dạng mạng lưới

sợi mà co cụm thành từng đám trên màng tế bào và cả ở trong tế bào chất.
Derrone có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme Aurora kinaza.

KIẾN NGHỊ
 Nghiên cứu thêm cơ chế tác động của Honokiol, Magnolol và Derrone lên tế
bào.


Tiếp tục kiểm tra tác động của Honokiol, Magnolol và Derrone lên mô hình
2D, 3D các dòng tế bào ung thư khác và xem xét thử nghiệm trên mô hình in
vivo.

References
1.

Ahmedin Jemal, D., Phd, Freddie Bray P., Melissa M. Center M., Jacques Ferlay M.,
Elizabeth Ward P., and David Forman P. (2011), “Global Cancer Statistics”, CA: A
Cancer Journal for Clinicians, 61, pp. 69–90.

2.

Ahn, K.S., Sethi G., Shishodia S., Sung B., Arbiser J.L., and Aggarwal B.B. (2006),
“Honokiol Potentiates Apoptosis, Suppresses Osteoclastogenesis, and Inhibits
Invasion through Modulation of Nuclear Factor-κB Activation Pathway”, Molecular
Cancer Research, 4 (9), pp. 621-633.

3.

Bai, X., Cerimele F., et al. (2003), “Honokiol, a Small Molecular Weight Natural
Product, Inhibits Angiogenesis in Vitro and Tumor Growth in Vivo”, Journal of

Biological Chemistry, 278 (37), pp. 35501-35507.


4.

Chakraborty, B.S. (2001), “7 - Cancer drug development - Key regulatory
considerations”, Health Administrator, 20, pp. 29-36.

5.

Chen, Y., Wu C., et al. (2010), “Honokiol induces cell apoptosis in human
chondrosarcoma cells through mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum
stress”, Cancer Letters, 291 (1), pp. 20-30.

6.

Chiang, C.-K., Sheu M.-L., et al. (2011), “Honokiol ameliorates renal fibrosis by
inhibiting extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in vitro”,
British Journal of Pharmacology, 163 (3), pp. 586-597.

7.

Chiang, C., Sheu M., et al. (2011), “Honokiol ameliorates renal fibrosis by inhibiting
extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in vitro”, British
Journal of Pharmacology, 163 (3), pp. 586-597.

8.

Dikalov, S., Losik T., and Arbiser J.L. (2008), “Honokiol is a potent scavenger of
superoxide and peroxyl radicals”, Biochemical Pharmacology, 76 (5), pp. 589-596.

9.

F, G., Ke G., and Eyers Pa E.A. (2006), “Validating Aurora B as an anti-cancer drug
target”, Journal of Cell Science, 119 (36), pp. 64-75.

10.

Fedoreyev, S.A., Bulgakov V.P., et al. (2008), “Isoflavonoid Composition of a Callus
Culture of the Relict Tree Maackia amurensis Rupr. et Maxim”, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 56 (16), pp. 7023-7031.

11.

Freshney, R.I. (2005), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5thth
edition, Willey Blackwell.

12.

Garcia, A., Zheng Y., et al. (2008), “Honokiol Suppresses Survival Signals Mediated
by Ras-Dependent Phospholipase D Activity in Human Cancer Cells”, Clinical
Cancer Research, 14 (13), pp. 4267-4274.

13.

Giet, R., Petretti C., and Prigent C. (2005), “Aurora kinases, aneuploidy and cancer, a
coincidence or a real link? ”, Trends in Cell Biololy, 15, pp. 241-250.

14.

Hanahan, D. and Weinberg Robert a. (2011), “Hallmarks of Cancer: The Next
Generation”, Cell, 144 (5), pp. 646-674.

15.

Hu, L., Hofmann J., Lu Y., Mills G.B., and Jaffe R.B. (2002), “Inhibition of
Phosphatidylinositol 3′-Kinase Increases Efficacy of Paclitaxel in in Vitro and in Vivo
Ovarian Cancer Models”, Cancer Research, 62 (4), pp. 1087-1092.

16.

Ja, P.F., D R., S R., E R.-B., and A C. (2009), “Aurora kinase inhibitors: a new class
of drugs targeting the regulatory mitotic system”, Clinical & Translational Oncology,
11 (12), pp. 787-798.

12


17.

Kim, S.C., Kim D.W., et al. (2001), “In vivo evaluation of polymeric micellar
paclitaxel formulation: toxicity and efficacy”, Journal of controlled release : official
journal of the Controlled Release Society, 72 (1-3), pp. 191-202.

18.

Kurebayashi, J., Otsuki T., et al. (1999), “Isolation and characterization of a new
human breast cancer cell line, KPL-4, expressing the Erb B family receptors and
interleukin-6”, British journal of cancer, 79 (5-6), pp. 707-717.

19.

Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al. (2010), “Honokiol Inhibits Epidermal Growth Factor
Receptor Signaling and Enhances the Antitumor Effects of Epidermal Growth Factor
Receptor Inhibitors”, Clinical Cancer Research, 16 (9), pp. 2571-2579.

20.

Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al. (2010), “Honokiol inhibits epidermal growth factor
receptor signaling and enhances the antitumor effects of epidermal growth factor
receptor inhibitors”, Clinical Cancer Research, 291 (1), pp. 20-30.

21.

Li, Z., Liu Y., et al. (2008), “Honokiol, a natural therapeutic candidate, induces
apoptosis and inhibits angiogenesis of ovarian tumor cells”, European journal of
obstetrics, gynecology, and reproductive biology, 140 (1), pp. 95-102.

22.

Lin, Y., Chen H., Ko C., and Chan M. (2007), “Effects of honokiol and magnolol on
acute and inflammatory pain models in mice”, Life Science, 81 (13).

23.

Lin, Y., Chen H., Ko C., and Chan M. (2007), “Effects of honokiol and magnolol on
acute and inflammatory pain models in mice”, Life Science, 81, pp. 1071 - 1078.

24.

Lisa A. Gurski, B., Nicholas J. Petrelli M., Xinqiao Jia P., and Mary C. Farach-Carson
P. (2010), “3D matrices for anti-cancer Drug testing and Development”, Oncology
Issues, January/February.

25.

Liu, S.H., Shen C.C., et al. (2010), “Honokiol inhibits gastric tumourigenesis by
activation of 15-lipoxygenase-1 and consequent inhibition of peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma and COX-2-dependent signals”, British Journal of
Pharmacology, 160 (8), pp. 1963-1972.

26.

Liu, Y., Chen L., et al. (2008), “Enhancement of therapeutic effectiveness by
combining liposomal honokiol with cisplatin in ovarian carcinoma”, International
Journal of Gynecological Cancer, 18 (4), pp. 652-659.

27.

Masters, J.R.W. (2002), Cancer cell lines, Vol. I, II, III, Kluwer Academic Publishers.

28.

Mayer, B., Klement G., et al. (2001), “Multicellular gastric cancer spheroids
recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric
carcinomas”, Gastroenterology, 121 (4), pp. 839-852.

13


29.

Miller, K., Wang M., et al. (2007), “Paclitaxel plus Bevacizumab versus Paclitaxel
Alone for Metastatic Breast Cancer”, New England Journal of Medicine, 357 (26), pp.
2666-2676.

30.

Minchinton, A.I. and Tannock I.F. (2006), “Drug penetration in solid tumours”,
Nature Reviews Cancer, 6 (8), pp. 583-592.

31.

Ota, T., Suto S., et al. (2002), “Increased mitotic phosphorylation of histone H3
attributable to AIM-1/Aurora-B overexpression contributes to chromosome number
instability”, The Journal of Cancer Research, 62, pp. 5168-5177.

32.

Panno, J. (2005), Cancer: The Role of Genes, Lifestyle, and Enviroment, Facts on File.

33.

Ponnurangam, S., Mammen J.M.V., et al. (2012), “Honokiol in combination with
radiation targets notch signaling to inhibit colon cancer stem cells”, Molecule Cancer
Therapy, 11 (4), pp. 963-972.

34.

Rolf Bjerkvig, P.D. (1992), Spheroid culture in cancer research, 1th edition, Informa
Healthcare.

35.

Rowinsky, E.K. and Donehower R.C. (1995), “Paclitaxel (Taxol)”, New England
Journal of Medicine, 332 (15), pp. 1004-1014.

36.

Ruddon, R.W. (2007), Cancer Biology, 4thth edition, Oxford University Press.

37.

S., R., M. C., and Wc. E. (2007), “Chromosomal passengers conducting cell division”,
Nature Reviews Molecular Cell Biology, (8), pp. 798-812.

38.

Shen, J.-L., Man K.-M., et al. (2010), “Honokiol and Magnolol as Multifunctional
Antioxidative Molecules for Dermatologic Disorders”, Molecules, 15 (9), pp. 64526465.

39.

Teicher, B.A. (1997), Anticancer Drug Development Guide.

40.

Teicher, B.A. (2001), Tumour Models in Cancer Research, Cancer Drug Discovery
and Deverlopment, ed. B.A. Teicher, Human Press, New Jersey.

41.

Vader G., L.S. (2008), “The aurora kinase family in cell division and cancer”,
Biochimica et Biophysica Acta, 1786, pp. 60-72.

42.

Vavilala, D.T., Ponnaluri V.K.C., Vadlapatla R.K., Pal D., Mitra A.K., and Mukherji
M. (2012), “Honokiol inhibits HIF pathway and hypoxia-induced expression of
histone lysine demethylases”, Biochemical and Biophysical Research
Communications, 422 (3), pp. 369-374.

43.

Wang, T.-H., Wang H.-S., and Soong Y.-K. (2000), “Paclitaxel-induced cell death”,
Cancer, 88 (11), pp. 2619-2628.

14


44.

Wu, S.-N., Yeh C.-C., Huang H.-C., and Yang W.-H. (2011), “Effects of Honokiol on
Membrane Electroporation-Induced Inward Current in Pituitary Tumor (GH3) Cells ”,
Journal of Natural Products, 4, pp. 115-124

45.

Wu, X., Chen X., and Hu Z. (2003), “High-performance liquid chromatographic
method for simultaneous determination of honokiol and magnolol in rat plasma”,
Talanta, 59 (1), pp. 115-121.

46.

Xu, H., Tang W., Du G., and Kokudo N. (2011), “Targeting apoptosis pathways in
cancer with magnolol and honokiol, bioactive constituents of the bark of Magnolia
officinalis”, Drug Discoveries & Therapeutics, 5 (5), pp. 202-210.

47.

Zang, R., Li D., Tang I.-C., Wang J., and Yang S.-T. (2012), “Cell-Based Assays in
High-Throughput Screening for Drug Discovery”, International Journal of
Biotechnologyfor WellnessIndustries, 1, pp. 31-51.

15