Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm gan virút B (VGVR B) hiện nay vẫn là một bệnh rất phổ biến trên toàn
thế giới và luôn là một mối quan tâm lớn đối với công tác y tế của toàn cầu và cũng
như của Việt Nam. Bệnh có tỷ lệ mắc cao và thường gây nên những hậu quả nặng nề
như viêm gan mạn, xơ gan và ung thư tế bào gan nguyên phát.
Trên thế giới, có hơn hai tỉ người bị nhiễm vi rút viêm gan B (HBV), trong đó
có khoảng 350 - 400 triệu người bị nhiễm HBV mạn tính. Khoảng 25 đến 40% số
người bị nhiễm HBV mạn tính này tử vong sớm vì những biến chứng là xơ gan
và/hoặc ung thư gan. (Lee và CS 1997)
Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ cao của vi rút viêm gan B, ước tính có
khoảng 10 triệu người mang HBsAg nên viêm gan vi rút B là vấn đề quan trọng của
sức khoẻ cộng đồng. Tỷ lệ mang HBsAg cao nhất là lứa tuổi từ 41-50 chiếm 18,7%
trong khi lứa tuổi có tỷ lệ thấp nhất từ 0-10 là 10,7 %. Nhưng tỷ lệ HBeAg(+)
/HBsAg(+) của lứa tuổi 0 - 10 là 91 %. Theo diễn biến tự nhiên, tỷ lệ mất HBsAg
hàng năm là 1-2%, và chuyển đổi huyết thanh HBeAg chung là 9,6%.
Vào những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát
triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chẩn đoán gen nên chúng ta đã có
thể chẩn đoán được vi rút viêm gan B ở mức độ phân tử. Nhờ ứng dụng các kỹ thuật
về phân tích DNA của HBV mà chúng ta có thể giải quyết được các hạn chế của các
kỹ thuật miễn dịch kinh điển. Các kỹ thuật sinh học phân tử này bao gồm các xét
nghiệm HBV – DNA : kỹ thuật PCR, Realtime – PCR (PCR với thời gian thực) và
bDNA (khuyếch đại tín hiệu), xác định các kiểu gene của HBV và xác định các đột
biến kháng thuốc.
Cho đến nay, 2 vấn đề mới nổi lên và đang được quan tâm trong việc chẩn đoán
HBV là vai trò thực sự của kiểu gen vi rút viêm gan B và sự đột biến của vi rút B
trong quá trình diễn tiến tự nhiên của bệnh cũng như dưới tác động của thuốc đặc trị.
Để xác định kiểu gene của HBV hiện nay có nhiều phương pháp. Đó là:
www.khotrithuc.com

1


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

+ Phương pháp giải trình tự gene (Sequencing)
+ Phương pháp lai trên pha rắn như Test INNO – LIPA.
+ Phương pháp realtime – PCR technique.
+ Phương pháp PCR đa mồi.
+ Phương pháp PCR – RFLP.
Tuy nhiên mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm riêng. Phương pháp giải
trình tự gene, lai trên pha rắn, kỹ thuật Realtime – PCR và PCR đa mồi có ưu điểm
xác định các kiểu gene của HBV một cách chính xác do sự thiết kế các cặp mồi đặc
hiệu. Nhưng có nhược điểm là công tác chuẩn bị mẫu mất nhiều thời gian và bên cạnh
đó cần phải có những trang thiết bị hiện đại do đó giá thành cho một xét nghiệm còn
cao.
Phương pháp PCR – RFLP là sử dụng các enzyme giới hạn TasI và SspI cắt các
trình tự đã biết của sản phẩm PCR nhân đoạn gene của HBV. Qua đó xác định kiểu
gen của HBV thông qua phân tích tính đa hình của các đoạn giới hạn. Đây là một
phương pháp đơn giản dễ thực hiện không cần những trang thiết bị đắt tiền do đó đáp
ứng được yêu cầu về mặt giá thành và cũng rút ngắn được thời gian.
Chính vì những lý do đó chúng tôi tiến hành đề tài ” Nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B” với các mục tiêu:
1. Hoàn thiện qui trình kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của HBV.
2. Bƣớc đầu xác định sự phân bố các kiểu gene của HBV ở nhóm bệnh nhân
nghiên cứu.

www.khotrithuc.com

2

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

TỔNG QUAN
1. TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B
1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới.
Trên thế giới, có hơn hai tỉ người bị nhiễm HBV, với ước lượng 350-400 triệu
người bị nhiễm HBV mạn tính. Khoảng 25 đến 40% số người bị nhiễm HBV mạn tính
này chết sớm vì xơ gan và/hoặc ung thư gan.
Ba phần tư số người mang HBV sống ở châu Á; tỷ lệ người mang HBV mạn
tính ở Trung Quốc và Ðông Nam Á ở mức cao từ 8% dân số trở lên. Nhiễm HBV
cũng phổ biến ở châu Phi hạ Sahara. Tỉ lệ lưu hành HBV ở mức trung bình tại vùng
Ðịa Trung Hải, Nhật Bản, và một phần Ðông Âu. Nhiễm HBV tương đối ít gặp, ảnh
hưởng dưới 2% dân số, tại phần lớn Tây Âu, châu Úc và châu Mỹ. Mặc dù vậy, hàng
năm có khoảng 300.000 người tại Hoa Kỳ và có đến một triệu người châu Âu bị
nhiễm bệnh.
Sự khác biệt về tỉ lệ lưu hành toàn cầu là do khác biệt về các đường lây truyền
HBV chính. Ở các vùng bệnh lưu hành địa phương như châu Á và Tây Phi, lây truyền
HBV thường xảy ra trong thời kỳ chu sinh, với tỉ lệ lây truyền cho trẻ sơ sinh cao đến
90% từ các bà mẹ có HBsAg và HBeAg dương tính. Cách lây truyền này cũng xảy ra
ở những vùng có tỉ lệ lưu hành thấp, chủ yếu là ở những người nhập cư từ các vùng có
bệnh lưu hành địa phương. Hơn nữa, nhiễm bệnh ở tuổi càng nhỏ, thì cơ hội trở thành
người mang HBV mạn tính càng cao.
Các chương trình tiêm chủng tuy thành công, nhưng vẫn thường gặp các trường
hợp mới nhiễm HBV tại nhiều nước có mức độ lưu hành địa phương cao, và có hàng
triệu người đã nhiễm siêu vi mà đối với họ những văc-xin hiện dùng không có tác
dụng. Do đó, can thiệp điều trị là phương án duy nhất đối với những người có bệnh
gan thật sự do nhiễm HBV.
www.khotrithuc.com

3


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

1.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam.
Tại Việt Nam , rất nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV ở
nước ta cho thấy Việt Nam nằm ở vùng dịch lưu hành cao. Tại Hà Nội, theo Hoàng
Thuỷ Nguyên và cs, Trần Thị Chính và cs, Phan Thị Phi Phi và cs, tần suất nhiễm
HbsAg của người lớn bình thường lần lượt là 15 – 26%, 14,4% và 13,9. Tại thành phố
Hồ Chí Minh, theo Trần Văn Bé và Bửu Mật, thì tỷ lệ này là 9,3. Ở qui mô nghiên cứu
cộng đồng, đã có 2 công trình khảo sát tỷ lệ mang HbsAg bằng các biện pháp nghiên
cứu dịch tễ học. Công trình của Lê Vũ Anh được tiến hành năm 1988 tại cộng đồng
dân cư Hà Nội bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng trên 1.304 người,
HbsAg(+) là 148, tần suất mang HbsAg la 11,35  0,02 %. Công trình của Châu Hữu
Hầu tiến hành ở một huyện vùng đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp lấy
mẫu nhiên theo cụm với 1.801mẫu, tỷ lệ mang HbsAg là 11 2%.
Gần đây cũng có một số nghiên cứu tỷ lệ mang HbsAg trong cộng đồng. Theo
Phạm Hoàng Phiệt nghiên cứu 9087 người tại thành phố Hồ Chí Minh năm 1995 thấy
có 1341 người mang HbsAg(+) chiếm tỷ lệ là 14,8%. Một nghiên cứu khác tại Thanh
Hoá năm 2003 trên 1579 người có 266 người mang HbsAg(+) chiếm tỷ lệ 16,8  1,8.
Nghiên cứu tai thừa thiên Huế năm 2006 tỷ lệ người mang HbsAg dao động từ 4 đến
21,2% và tỷ lệ khác nhau ở các lứa tuổi khác nhau.
2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC KIỂU GENE CỦA HBV.
2.1. Vi rút viêm gan B và cấu tạo bộ gene của vi rút viêm gan B.
Vi rút viêm gan B(HBV) thuộc họ Hepadnaviridae là những virút có kích thước
nhỏ. Đây là virut viêm gan duy nhất có acid nhân là DNA (các viruts khác đều là
RNA).
Cấu tạo của HBV dưới kính hiển vi điện tử có 3 loại tiểu thể khác nhau: Tiểu thể

hình cầu nhỏ có đường kính 22 nm. Tiểu thể hình ống (hình que) có đường kính 20 –
22 nm và dài từ 40 – 400 nm. Tiểu thể hình cầu lớn có đường kính là 42 – 45 nmcòn
gọi là tiểu thể Dane, chính là virút hoàn chỉnh.
www.khotrithuc.com

4


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Bộ gene của HBV là một phân tử DNA vòng có cấu trúc mạch kép không hoàn
toàn, kích thước 3,2 Kb, nó được cấu tạo bởi 2 sợi có chiều dài không bằng nhau.
Chuỗi dài nằm ngoài mang điện tích âm, tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài
có định là 3,2 Kb và mã hoá cho các thông tin di truyền của virút. Chuỗi ngắn nằm
trong, có cực tính dương thay đổi và chỉ bằng 50 – 80% chiều dài sợi âm. HBV có cấu
trúc đặc biệt nhỏ gọn, có được sự tiết kiệm trong cấu trúc bộ gene bằng cách sắp xếp
những miền giao của các gene: S, C, P và X cho nên có khả năng tổng hợp được nhiều
loaị Protein quan trọng của virút.

www.khotrithuc.com

5


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

2.2. Sự phân bố các kiểu gene của HBV.
Có 2 cách phân loại HBV: Kiểu huyết thanh (Serotype) và kiểu gen (Genotype).
Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr và ayw dựa vào
các kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg). Tuy nhiên những ý nghĩa

của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều. Với sự phát triển của sinh học phân
tử, ngày nay người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu trên bộ gen của HBV và
phân loại HBV thành 8 kiểu gene được đặt tên từ A đến H dựa vào sự khác nhau trên
8% của toàn bộ bộ gen HBV (Kidd-Ljunggren et al., 2002; Kramvis et al., 2005;
Norder et al., 2004; Okamoto et al., 1988; Schaefer, 2005).
Sự phân bố các kiểu gene của HBV phụ thuộc vào các vùng địa lý khác nhau.
+ Kiểu gene A chủ yếu ở Mỹ, bắc và trung Âu.
+ Kiểu gene B và C chủ yếu ở châu Á.
+ Kiểu gene D chủ yếu ở Nam Âu, vùng Địa Trung Hải và Ấn Độ.
+ Kiểu gene E chủ yếu ở châu Phi đặc biệt ở vùng hạ Sahara.
+ Kiểu gene F chủ yếu ở Nam Mỹ và Polynesia.
+ Kiểu gene G có ở Mỹ, châu Âu bao gồm các nước Pháp, Đức và Hà Lan.
+ Kiểu gene H chỉ có ở Nam và Trung Mỹ.
www.khotrithuc.com

6


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

2.3. Các phƣơng pháp xác định kiểu gene của HBV.
Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác định HBV
genotypes như giải trình tự chuỗi (sequencing), PCR - RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzymelinked Immunoassay). Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau.
+ Phương pháp giải trình tự gene có thể xem như có nhiều ưu điểm nổi bật vì bên
cạnh việc xác định được trình tự chuỗi các Nucleotids trong bộ gen của HBV để từ đó
so sánh với thư viện gen và xác định được HBV genotypes mà còn dựa vào kết quả
giải trình tự này chúng ta có thể xác định được một số dạng đột biến kháng thuốc của
HBV để từ đó có phát đồ điều trị tối ưu. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải có
các trang thiết bị đồng bộ đắt tiền và nhân lực có trình độ để vận hành khai thác do đó

chỉ ứng dụng được ở một số Labo có điều kiện.
+ Phương pháp PCR – RFLP là phương pháp sử dụng các enzyme giới hạn cắt các
trình tự đã biết sản phẩm PCR nhân đoạn gene của HBV sau đó đem sản phẩm cắt
điện di trên thạch Agarose 1,5% và phân tích tính đa hình của các đoạn giới hạn. Đây
là một phương pháp đơn giản dễ thực hiện do đó có thể thực hiện một cách thường qui
trong các phòng thí nghiệm có trang bị máy PCR thông thường.
2.4. Tình hình nghiên cứu các kiểu gene của HBV.
2.4.1. Tình hình nghiên cứu các kiểu gene của HBV trên thế giới.
2.4.2. Tình hình nghiên cứu các kiểu gene của HBV ở Việt Nam.

www.khotrithuc.com

7


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.
Các mẫu huyết thanh của bệnh nhân bị nhiễm HBV và các mẫu huyết thanh của người
bình thường. Bao gồm:
+ 30 mẫu huyết thanh của người bị nhiễm HBV.
+ 15 mẫu huyết thanh của người bình thường không bị nhiễm HBV.
2.2. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các sinh phẩm hoá chất chính.
Tên hoá chất

Hãng sản xuất

www.khotrithuc.com

8


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

1. Hoá chất dùng trong PCR
dNTPs

Fermentas (Đức)

2.2.2.

Agarose

Fermentas (Đức)

Các

Loading Dye

Fermentas (Đức)

máy

TBE

Sigma (Mỹ)

Thang chuẩn ADN

Fermentas (Đức)

Taq-ADN-polymerase

New England (Anh)

và
thiết
bị
chính

2. Hoá chất phục vụ giải trình tự gen
Big Dye Terminator V3.1

Applied BioSciences (Mỹ)

HiDi Formamid

Applied BioSciences (Mỹ)

Ethanol tuyệt đối

Fermentas

Tên máy, thiết bị

.

Hãng sản xuất

Tủ ấm ổn nhiệt

Sanyo (Nhật Bản)

Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700)

Applied BioSciences (Mỹ)

Máy PCR (Thermo cycle)

Bio-rad (Pháp)

Máy ly tâm ( Biofuge Primo R)

Heraeus (Mỹ)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)_

Thommas Scientitic (Mỹ)

Máy chụp ảnh Gel-Doc

Dolphin (Mỹ)

Tủ lạnh –200C, –800C.

Nuaire (Mỹ)

Lò vi sóng

Sanyo (Nhật Bản)

Tủ an toàn sinh học cấp II

Shelab (Mỹ)

Bể ổn nhiệt

Memmert (Đức)

Máy lắc Gyromax 737R

Amerex Instrument (Đức)

Máy lắc ngang reciprocating

Jeio – Tech (Hàn Quốc)

Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Nano Drop

Analitika (Đức)

Máy phân tích trình tự ADN ABI 3130 system

Applied BioSciences (Mỹ)

www.khotrithuc.com

9

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

2.2.3. Các primer dùng trong nghiên cứu.
Các primer đặc hiệu cho nhân đoạn gene vùng precore của HBV có trình tự tương ứng
là:
+ Cặp primer cho PCR vòng 1:
HBV_preC16a: 5’_CACCTCTGCCAATCATCTCT_3’
HBV_590as: 5’_CTGCGAGGCGAGGGAGTT_3’
+ Cặp primer cho PCR vòng 2:
HBV_A: 5’_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCAGTCC_3’
HBV_nonA_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCATCGT_3’
HBV_P1865_CÂGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCCTT_3’
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu.
Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp: Thực nghiệm labo có đối chứng dựa theo
phương pháp của Hannoune 1998 có cải tiến. (các chủng chuẩn đã được công bố trên
GeneBank).
Sơ đồ nghiên cứu
Tách DNA từ các mẫu huyết thanh
của bệnh nhân

Nested -PCR

Điện di sản phẩm PCR2 trên thạch
Agarose kiểm tra

Sản phẩm PCR
Nếu có band đặc hiệu cắt bằng enzyme

SspI
www.khotrithuc.com

10


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Nếu cắt là Genotype A hoặc B

Nếu không cắt là genotype từ C đến H

Cắt sản phẩm PCR vòng 2 bằng
enzyme TasI
Điện di kiểm tra, phân tích và xác định
các genotype (A - H) dựa vào các tính đa
hình các đoạn giới hạn

Sequencing kiểm tra

2.3.2. Các kỹ thuật cụ thể.
* Tách chiết DNA theo protocol của nhà sản xuất:
Sử dụng kít tách triết DNA của QIAgene (Đức)và qui trình cụ thể như sau:
1. Cho 20l Protease K vào tube eppendorf 1,5 ml. Sau đó cho 200l huyết thanh mẫu
vào.
2. Cho 200l buffer AL vào mẫu sau đó Vortex nhanh 15 giây.
3. Ủ ở nhiệt độ 560 C trong 10 phút. Spindown.
4. Cho 200l cồn tuyệt đối vào mẫu sau đó Vortex nhanh 15 giây rồi đem Spindown.
5. Chuyển toàn bộ sang tube QIAamp spin column. Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút sau
đó đổ bỏ dịch lọc ở dưới cột rồi giữ lại cột.

6. Cho 500l Buffer AW1. Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút sau đó đổ bỏ dịch lọc ở
dưới cột rồi giữ lại cột.
www.khotrithuc.com

11


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

7. Cho 500l Buffer AW2. Ly tâm 14000 rpm trong 3 phút sau đó đổ bỏ dịch lọc ở
dưới cột rồi giữ lại cột. Chuyển cột sang một tube vô trùng khác. Tiếp tục ly tâm
14000 rpm trong 1 phút.
8. Chuyển cột sang một tube eppendorf vô trùng khác. Sau đó thêm 200l Buffer AE
hay nước cất khử ion. Ủ nhiệt phòng trong 1 phút rồi ly tâm 8000 rpm trong 1 phút.
9. Thu DNA trong các tube và bảo quản ở - 200C.
2.3.3. Kỹ thuật Nested – PCR nhân đoạn gene vùng precore của HBV.
Kỹ thuật Nested - PCR nhân đoạn gene vùng precore của HBV được thực hiện
tương tự như ở các labo sinh học phân tử khác trên thế giới [], đã được tối ưu hoá tại
Trung tâm Sinh Y Dược học Học Viện Quân Y và xây dựng thành protocol của Phòng
Vi sinh vật và Các mầm bệnh sinh học.

Sơ đồ qui trình
Đo nồng độ ADN
của mẫu nghiên cứu
Tính toán giá trị các thành phần
phản ứng PCR

Tạo hỗn hợp phản ứng

Nhân gen theo chu trình nhiệt đã

được tối ưu hoá

Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu
www.khotrithuc.com

12


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Cụ thể
1. Sau khi đo nồng độ ADN template, tính và tạo các nồng độ ADN của các
mẫu như nhau để khi đưa vào hỗn hợp mix cùng một thể tích ADN template, và đạt
khoảng 100 ng trong 1 thể tích 25 µl phản ứng.
2. Tính các giá trị của các thành phần khác
Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR
PCR vòng 1
PCR system of R1

PCR vòng 2
x1

Vol (µl)

Water

16.3

PCR bufer (10X)

2.5

dNTP mix (5 mM)

F.Conc.

PCR system of R2
Water

1X

x1
Vol (µl)

F.Conc.

34.8

PCR bufer (10X)

5

1X

2

0.2 mM dNTP mix (5 mM)

4

0.2 mM

Primer pre16as(10pmol/l)

0.5

0.5 µM Primer A (10pmol/l)

1

0.5 µM

Primer 590as(10pmol/l)

0.5

0.5 µM Primer non A(10pmol/l)

1

0.5 µM

Primer 1865(10pmol/l)
Taq Polymerase (5U/µl)
DNA template
Total

0.2
3

1 unit Taq Polymerase (5U/µl)
N/a

25

1
0.2

1 unit

DNA template

3

N/a

Total

50

3. Chu trình luân nhiệt như sau:
3.1. PCR vòng 1:
Chu trình gồm 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4 bước:
www.khotrithuc.com

13


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Bước 1: Duỗi xoắn ADN cưỡng bức ở 940 C trong 5 phút.
Bước 2: Hạ nhiệt độ xuống 580 C và duy trì trong 45 giây để primer gắn vào
gen đích.
Bước 3: Nâng nhiệt độ lên 720 C và duy trì trong 7 phút để Taq DNApolymerase xúc tác phản ứng nối dài primer theo nguyên lý bổ xung với gen đích của
HBV để tổng hợp nên đoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN của gen đích ban đầu.
3.1. PCR vòng 2:
Chu trình gồm 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4 bước:
Bước 1: Duỗi xoắn ADN cưỡng bức ở 940 C trong 5 phút.
Bước 2: Hạ nhiệt độ xuống 580 C và duy trì trong 45 giây để primer gắn vào
gen đích.
Bước 3: Nâng nhiệt độ lên 720 C và duy trì trong 7 phút để Taq DNApolymerase xúc tác phản ứng nối dài primer theo nguyên lý bổ xung với gen đích của
HBV để tổng hợp nên đoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN của gen đích ban đầu.
4. Điện di sản phẩm PCR trên Agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc
trên máy đọc Gel- Doc.
Kết thúc giai đoạn PCR thu được kết quả: Đoạn DNA kích thước 527 bp.
2.3.4. Phản ứng cắt bằng enzyme SspI
Sử dụng enzym giới hạn FastDigest SspI để cắt sản phẩm PCR vòng 2. . Kết
quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được 2 phần mà sẽ tạo 1 vạch trên hình ảnh
điện di có kích thước khoảng 444 bp và 1 vạch là phần còn lại của sản phẩm PCR
vòng 2.
Protocol dùng FastDigest SspI []:
- 10X FastDigest buffer: 2μl
- FastDigest Enzym:
- PCR product:

1μl
10 μl

- Water, nuclease-free: vừa đủ 20μl
www.khotrithuc.com

14


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Ủ ở 37 trong 15 phút. Điện di trong agarose 1.5% kiểm tra band đặc hiệu.
Những mẫu nào có 2 vạch tương ứng với vị trí 444 bp và 80 bp thì là cắt.
2.3.4. Phản ứng cắt bằng enzyme TasI
Sử dụng enzym giới hạn FastDigest TasI để cắt sản phẩm PCR vòng 2. Protocol
dùng FastDigest TasI []:
- FastDigest buffer B:

2μl

- FastDigest Enzym:

1μl

- PCR product:

15 μl

- Water, nuclease-free: vừa đủ 30μl
Ủ ở 650C lắc 650 vòng/phút trong 15 phút. Điện di trên thạch Agarose kiểm tra,
phân tích và xác định genotype dựa vào tính đa hình của các đoạn giới hạn.
2.3.2.6. Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động
phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng
Sơ đồ qui trình:
Chạy PCR gắn BigDye

Tinh sạch BigDye

Biến tính HiDi

Chạy máy giải trình tự tự động ABI
3130 system

Phân tích trình tự gene
www.khotrithuc.com

15


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Thứ tự các bước thực hiện bao gồm:
* Chạy phản ứng PCR gắn BigDye:
Thành phần phản ứng:
+ BigDye Buffer 5X: 2 μl
+ BigDye terminator: 4 μl
+ Primer M13:

1 μl

+ DNA template:

0,8 μg

+ Nước cất khử ion:

vừa đủ 20 μl.

Chu trình nhiệt:
960C x 1 phút
(960C x 10 giây
500C x 5 giây
600C x 4 phút) x 25 chu kỳ.
40C: forever
* Tinh sạch sản phẩm PCR gắn BigDye:
Tinh sạch BigDye ở sản phẩm PCR trên bằng Ethanol và EDTA theo quy trình
của BigDye Terminater v3.1 [21]:
+ Cho 5 μl EDTA nồng độ 125 mg vào tận đáy tube chứa sản phẩm.
+ Cho thêm 60 μl ethanol tuyệt đối vào mỗi phản ứng.
+ Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
+ Ly tâm 2500g x 30 phút ở 40C
+ Bỏ nước nổi, thêm 60 μl ethanol 70% vào mỗi tube.
+ Ly tâm1650g x15 phút ở 40C.
+ Bỏ nước nổi.
+ Làm khô bằng Vacum Dry trong 15 phút ở 450C.
* Biến tính HiDi và chạy Sequening
Sản phẩm tinh sạch sau khi đã làm khô và hả hết hơi cồn, được thêm vào mỗi
tube 20 μl HiDi. Để ở 950C x 5 phút rồi 40C x 5 phút. Cuối cùng đưa toàn bộ sản
www.khotrithuc.com

16


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

phẩm đã biến tính vào máy giải trình tự tự động ABI avant 3130. Vận hành máy theo
đúng qui trình phần mềm đã cài đặt.
* Phân tích kết quả:
Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm của máy ABI avant 3130.
Sau đó đối chiếu với genbank xác định genotype của HBV. Xử lý số liệu thu
được theo phương pháp thống kê y học, sử dụng chương trình thống kê tin sinh y học.

www.khotrithuc.com

17


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả Nested – PCR
Sau khi chạy phản ứng PCR1 sẽ cho đoạn gen có kích thước 580bp. Sử dụng
sản phẩm này làm DNA template cho phản ứng PCR2. Khi điện di sẽ cho band đặc
hiệu ở vị trí tương ứng 527bp. Kết quả cụ thể ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả điện di sản phẩm Nested - PCR
Kết qủa

Số lượng

Tỷ lệ(%)

Có band đặc hiệu

55

100

Không có band đặc hiệu

0

0

Tổng số

55

100

527bp

Nhận xét: 100% các mẫu có band đặc hiệu tương ứng với 527bp
3.2. Kết quả cắt bằng SspI
Bảng 3.2: Kết quả cắt sản phẩm Nested-PCR bằng enzym SspI
Kết qủa

Số lƣợng

Tỷ lệ(%)

Cắt

33

60

Không cắt

22

40

Tổng số

55

100

www.khotrithuc.com

18


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Nhận xét: Khi cắt bằng SspI có 60% số mẫu bị cắt thành 2 band tương ứng với
vị trí 440bp và 80bp. Có 40% số mẫu không bị cắt bởi enzym này. Như vậy 33 mẫu có
thể là genotype A hoặc B. Còn 22 mẫu không cắt thì kiểu gen là từ C đến H.
3.3. Kết qủa cắt bằng TasI
Bảng 3.3: Kết qủa cắt sản phẩm Nested-PCR bằng enzyme TasI
Genotype

Số lượng

Tỷ lệ(%)

B

33

60

C

22

40

Nhận xét: Khi cắt bằng enzyme TasI có 60% số mẫu cắt thành 2 band tương
ứng với vị trí 168 bp và 183 bp. Có 40% số mẫu cắt thành 2 band tương ứng với vị trí
www.khotrithuc.com

19


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

200 bp và 231bp. Đối chiếu với các đoạn giới hạn của các genotype của HBV thì 60%
là genotype B và 40% là genotype C. Kết qủa này cũng phù hợp với nghiên cứu của
Phạm Thu Thuỷ tại thành phố Hồ Chí Minh genotype B là 60% và genotype là 40%.
3.4. Kết quả Sequencing.
Bảng 3.4. Kết qủa sequencing
Genotype

Sequencing

Kết qủa

PCR - RFLP

B

15

15(=100%)

15

C

10

10(=100%)

10

Hình diagram genotype B

www.khotrithuc.com

20


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Hình ảnh khi đối chiếu trên GenBank của genotype B

Hình diagram genotype C

www.khotrithuc.com

21


Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Hình ảnh khi đối chiếu trên GenBank của genotype C

www.khotrithuc.com

22