Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2 thí nghiệm vi sinh vật học nguyễn đức lượng, phan thị huyền, nguyễn ánh tuyết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ Hồ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG (Chủ biên)
PHAN THỊ HUYỄN - NGUYỄN á n h t u y ế t

٠

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TẬP 2

THỈ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

NHÀ XUẤT BÀN
^‫ = ^ ؛‬D Ạ I HQC Q٧tfc GIA TP. Hổ CHÍ MINH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP H ồ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
N gu yễn Đức LưỢng (Chủ biên)
Phan Thị Huyền ٠Nguyễn Ánh Tuyết

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TẬP 2

/

THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
(Tái bản lần thứ nhất)

ĨPƯ٠

ữl‫؛‬oTậí
'5 .H Ư

J

10020452
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIA
TP HỒ CHÍ MINH - 2006


GT.02.SV(V7)
:12‫ﺱ‬
1.2006‫ﺭ‬75٠11
ĐHOG.HCM-OÍB

SV.GT.594-06 (T)


MỤC LỤC
9

LƠỈNÓỈDẢIỈ
Chương ĩ : NHỮNG NGƯYẺN TẮC c ơ BẢN CỬA PHÒNG .rHÍ NGHIỆM

Bài 1 :
Bài 2:
2.1
2.2

VI SINH VẬT HỌC

.11
Nội qui phòng thi nghiệm vi sinh vật học
11
Những dụng cụ١
trang thiết bị cơ bản cUa phOng thi nghiệm vi sinh vật học 12
Các dụng cụ thòng thường
12
Kinh hiển vi các loại
15

Chương 2.- CHUA n bị m ò i TRƯỜNG VÀ ĐIỂU KIỆNNGHIÊN c ứ u VI SINH VẬT 20

Bài ٠
3: Chuá’n bị dụng cụ nuOi cấy
3.1 xư ‫ ﺭﺩﺍ‬dụng cụ
32‫ﺀ‬Bao gói dụng cụ
3.3 Khứ trUng dụng cụ
Bài 4: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dùng cho những nghiên ،ứu cơ bản về
vi sinh vật học
4.1 Chuâ.n bị nguyên vật liệu
4.2 Lam trong mồi trường
4.3 Diều chinh pH cUa mồi trường
4.4 Phân phối môi trương vào dụng cụ chứa
4.5 Vô khuẩn môi trường
4.6 Làm thạch nghiêng, thạch dứng và thạch dĩa
4.7 Báo quản và kiểm tra môi trường
4.8 Chuấn bi mỏi trương nuOi cấy dUng trong nhừng nghiên cứu về sinh ly,
sinh hóa cUa vi sinh vật,
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP, BẢO QUẢN GIỐNG ١
^ SINH VẬT

Bài 5:
5.1
5.2
5.3
5.4

Phương phấp phân lập giống vi sinh vật
Chuẩn bị tang siirh và pha loãng mẫu
Câ'y mẫu và u mẫu
Phổt hiện và chọn khuẩn lạc dặc trưng
Kiếm tra tinh thuần khiết cUa một giống vi sinh vật
Bai 6: Phương pháp bảo quản giOng vi sinh vật

Chương 4: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

Bài 7:
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5

cưu HÌNH THÁI VI SINH VẬT

Nghiên cứu hình thai vi khuẩn
Nhuộm Gram
Nhuộm bào tử
Nhuộm,vỏ nhầy
Nhuộm tiên mao

Nhuộm các thế' ấ'n nhập

20
20
21
22

27
27
27
27
27
28
28
29
29
30
30
30
30
32
32
34

36
38
39
41
43
44

45


Bài 8: Nghén cứu hinh thái nảm m١ea
Ba‫ ؛‬Nghièn cứu hinh thai nấm 8ỢÍÌ

Giống Aspergillus 9.1
Giống Penicillium9.2
Giống Alternaria9.3
Giống Fusarium9.4
Giống Cladosporium9.5
Ba‫ ؛‬Nghỉén cứu hinh tha! tảo :10
Bai 11: Nghièn cứu hlnh thai xạ hhuỉán
Chương 5: CAC PHƯƠNG PHÁP KIEm tra SỐ> lương \ ٦ SINH ^Ậ.1'
Bà! 12: Xác định trực tiep sỗ' lượng tế b٤٥o bà‫؛‬ng buOng đ٠ẽni h(')ng ‫ ا‬٠
‫ا‬٧
Bai 13: xac định gian tiep sO' lượng tie ba.0 bàmg cach đỉếnn so lưưug cáo khuan ‫ﻋﺎ‬.،0
phat tr‫؛‬è'n trẽn mồ‫ ؛‬trường thacbì
Nguvèn tồc13.1
each t 13.2‫؛‬èn banh
Gachdèni13.3
Bài 14: D.inh lương vi S i n h vảt bàng phươmg pjbap doí một dọ quang
Vật l 14.1‫؛‬du،،g cu và n١ôỉ trường :nuĩối cay Ọu١
Cách t 14.2‫^؛‬n hanh
Chitơng 6: PHIÍƠNG PHAP NGHIEN cưu ;SI,NH LV. SIJNH HOA VI SINH VẢT
Bai 15: Cac thi nghiéin k‫؛‬ng lííío siiih khOi cua vi sjnh v(،t:e'm ira kha n٥

49
so :9

50
51
53
53
55
5‫؟‬
59
60

62
62
62
64
65

66
‫؛ﻉ‬6
68
68

Bài 16: Các thi nghiệm kiem tra kha nànỉg phiảỉ;i gtiai c;ổc hop clìàt hữu co
khOng chưa n‫؛‬tơ cua vi sinh vặt
69
Qua trinh lèn men rượu {Ethanoh 16.1
69
Qua trinh lén men lactic16.2
72
Qua trinh lén men butvric16.3
73
Qua trinh lèn men acetic 16.4

75
Quá trinh phần g 16.5‫؛‬a‫ ؛‬cellulose
76
Ba‫ ؛‬cac thi nghiệm kiếm tra kha nầaig p :17‫؛‬hàn gia‫ ؛‬cắc hợp chat hừu cơ
chứa n it. cUa vi sinh vật
77
Qua trinh amonium hỏa protein 17.1
77
Qua trinh amoniUm hOa urea 17.2 '٠
79
Qua trinh nitrate hóa17.3
80
Qua trinh phản nitrate hOa
sa 17.4
Bai 18: Phưmtg phap phân lập va nuOi ca'y cồc nhóm vi sinh vật tham gia vảo
sự chuyến hOa cac chat khoáng
32
Vi sinh vột tham gia vầo sự chuyen h0)a ca(c hợR) chả.t luư hu۶ nh 18.1
32
Vi sinh vạt tham gia vảo sự chuyến hOa cd.c hợ 18.2‫ﺇ‬p cha'‫ ؛‬phospho
39
Vi khuẩũi sát18.3
‫ﺍﻭ‬
Vi khuấEi silicate18.4
92


Chưaì g ٢. PHƯƠNG PHAP NGHIEN cưu khả n à n g tạo sả n PHẤM bậc hai
ớ ١ơ SINH VẠT
91

BJi 19: Phương pháp nghièn cứu tổng hợp các chất khắng sinh ơ ٧ ‫ ؛‬sinh vật
1 1 .‫ ﻭ‬Nguyèn tẩc
lỡ.2 Nguyèn liệu, dụng cụ và hóa chất
19.3 Cach tiến hhnh
Bai 29: Phương phdp nghièn cứu tổng hợp các chất kích thích sinh trương
ơ ĩhực vật
B;i، 21; Phương phap nghièn cứu tổng hợp các acidamin ơ vi sinhvật
Bài 22: Phương phap nghiên cứu tổng hợp vitamin B12ơ vi sinh vật
Chương ‫ﻻ‬.' PHƯƠNG PHAP NGHIEN cưu VA t h u n h ậ n sin h khối
VI SINH v Ạt
Bin 23 Thu ،،hjn sinh kho'‫ ؛‬nà'm men banh mi
Bài 21 Thu nhạn sinh kho'‫ ؛‬thuO'c trừ sâu sinh học
Ba، 25 Thu nhdn sinh kho'‫ ؛‬phan sinh học
Chương 9: PHƯƠNG PHAP THU NHẬN VA XAC ĐỊNH HOẠT TINH ENZYM
TI, '١٦ SINH V.^T
Bui 26: Phương phap fhu nhíịn chè' phà'n١ enzyme vi sinh vẶt tho từ phương phdp
nuO‫ ؛‬c.a'v be mat
Bí'11 27: Phương phap thu nhận cho' phOm enzyme vi sinh vặt tho từ phương phap
nuOl cd'y chim
Bi'،، 28: Thu nhdn che'phả'm enzyme ban tinh khio't
Ba، '29: cac phươíig phap kiOm tra h.ạt tinh enzyme vi sinh v.t
29.1 Phương phap kiO'm tra hoạt tinh amylase
29.2 Phương phap kiOm tra hoạt tinh protease
29.3 Phương phap kiOm tra hoạttinh cellulase
29.4 Phương pháp kiOm tra hoạt tinh urease
29.5 Phương pháp kiOm tra hoạt tinh pectinase

94
94
94

95
96
97
98
103
103
105
105

108
108
110
111
112
112
115
121
124
126

Chương 10: PHƯƠNG PHÁP KIEm tra một s ổ ^ SINH VẬT GÀY BỆNH

130

Bài 30: Phương phap kiếm tra Escherichia coli và cắc collform khác
30.1 Phương phap xac định colifonn và Exoli
30.2 Phat h‫ ﺇ‬ện nhanh sự cỏ mặt cUa E.coỉi trong thực phẩm đống lạnh
íkhOng kế cac loai ^áp xác) bằng phương phap MUG
Bai 31; Phương phap kiẻ.m tra Salmonella
Bai 32; Phương phap kiếm tra Shigella

Bài 33; Phưỉmg phấp kiếm tra Vibrio cholerac
Bai 34: Phương phap .kié'm tra Vibrio parahaeniolyticus
Bai 35: Phương phap kiẻ.m tra Aeỉvnionas hydrophila
B a 3 6 ‫ﺇ‬: Phương phap kiem tra Ycrsiiiia enterocolitica

130
131
134
143
160
164
171
176
181


Bài 37: Phương pháp kiểm tra Listeria
Bài 38: Phương pháp kiểm tra Staphylococcus aureus
00.1 Đêm khuán lạc trên thạch đìa - phương pháp cấy gạt
38.2 Phương pháp MPN
Bài 39: Phương pháp kiểm tra enterotoxin tạo bởi vi khuẩn Staphylococcus
Bài 40: Phương pháp kiểm tra Bacillus cereus
Bài 41; Phương pháp kiểm tra Clostridium botulinum
Bài 42: Phương pháp kiểm tra Clostridium pcrfriiigens
Bài 43: Phương pháp kiếm tra Campylobacter

187
193
194
197

197
204
209
214
217

Chương 11: PHƯƠNG PHÁP NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG GIỐNG VI SINH VẬT

229

Bài
Bài
Bài
Bài
Bài

44:
45:
46:
47:
48:

Phương pháp huấn luyện thích nghi
Phương pháp lai
Phương pháp gây đột biến bàng tác nhân hóa học
Phương pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lỷ
Thí nghiệm biến nạp d vi sinh vật

Chương 12: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI MỘT s ố VI SINH VẬT
THƯỜNG SƯ DỰNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài 49: Phân
loại một số vi khuẩn
49. ĩ Phần loại Pseudonumas
49.2 Phân loại Aceíoòacíer
49.3 Phản loạỉ Vỉòno
49.4 Phân loại Spirillum
49.5 Phân loại ProiGus
49.6 Phân loại Sa/mo?ií٠//o
49.7 Phần ìoãi Rhizobiuni
49.8 Phân loại Azotobacter
49.9 Phản loạỉ BeỤerinckia
49.10 Phân loại Aeoíomanas
49.11 Phân loại Shigella
49.12 Phân loại Brevibacterỉum
49.13 Phân loại Streptococcus
49.14 Phân loại Leconostoc
49.15 Phân loại Lactobacillus
49.16 Phân loại Bacillus
49.17 Phân loại Clostridium
49.18 Phân loại Mycobacterium
Bài 50: Phâni loại một số nấm men
50.1 Khóa phân loại nấm men đến giống cũa Lodder
50.2 Khóa phân loại nấm men đến giống của Kudriavtxev
50.3 Khóa phân loại nấm men đến giống của Phương Tâm Phương

229
230
231
231
232

234
234
234
240
241
242
243
43^‫؛‬
244
244
244
245
245
246
247
249
249
250
252
259
260
262
265
266


50.4 KhOa phân loạ‫ ؛‬các loài nấm men
50.5 Khóa phân loại các loài nấm men trong giống Saccharomyces
50.0 KhOa phân loại cắc loài nấm men trong giống phụ Saccharomyces
Bai 51: Phânloạimộtsốxạ'khuấ'n

51.1 KhOa phân loại xạ khuẩn cUa Krassilnikov
51.2 KhOa phân loại xạ khuầ'n cUa Waksman
Bài 52: Phán loại một số nấm mốc
52.1 KhOa phân loại nấm thường gặp
52.2 Bang phân loại dến nhOm
52,5 GiOng Pcìiicillium

269
290
291
292
292
307
321
321
355
373

Chương 13: MỘT SỐ MÒI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
THƯỜNG SỬ DỤNG

405

A Mồi trường nuôi cấy vi khuẩn
B Môi trường nuối cấy nấm men
c Môi trường nuOi cấy nấm mồ'c (nấm sợi)
D Mói trường nuồi cấy xạ khuẩn
E Môi trưởng nuõỉ cấy tá.

405

44‫ﺁﻉ‬
446
447
448

Chương 14: DUNG DỊCH VẢ THƯỐC THƯ

449

Chư'ơng 15: CẮC CHẤT NHUỘM MÀU

460

TAi l iệ u THAM KHÀO

463


LỜI NÓI ĐẦU
Vi sinh udt học là môn khoa học nghìên cứa oề các qui luật cUa
gìới sinh odt \)ô cUng nhồ bé. Cdng nghệ oi sinh odt học Id khoa học Ung
dụng cdc qui luật đó odo ‫ ﺍ ﺅ ﺝ‬sống od la một t ٣ong ndm hudng phdt t ٣lển
rdt mạnh cUa cdng nghệ sinh học.
THÍ NGHIỆM VI SINH VẶT HỌC đuợc blèn ,'soạn nhdm glUp
sinh olên, cdn bộ ks thudt ngdnh sinh oật học١ cdng nghệ 'thực p ١١,dm od
cdng nghệ sinh học:

Những k5 ndng thục ^^dnh co bdn oè ol sinh odt học*١
K5 ndng oè cOng nghệ ol sinh oật to n g phOng thl nghiệm.
Bao gồm todn bộ k5 thudt: pldn Idp, phdn loạl٠ tu^iền cÍLọn, glữ ^ổngi

" Cdc phương phdp nghlèn cứu thu nhận sàn phdm bdc 1, bậc 2;

- Các phương phdp kiềm t ٣ a qud t ٣ lnh t٣ ao dổl chdt ồ ol sinh oật‫؛‬
- Các phương phdp ddnh gia chdt lượng sdn pl^dm cUa ol sinh od٤ Đáỵ là tập 2 của bộ tai liệu THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH
HQC t ٣ ong Chương trtnh ddo tqo k5 sư ngdnh cdng nglLệ sinh hqc
T٣ ường Đạl hqc Bdch khoa-B ql h‫ ؟‬c Quổc gla thdnh phố Hồ Chl Minh.
Sách na‫ ﻻ‬cỏ tliể cd nỉ^ững sal sdt ìioặc không ááp ứng hỂt ^?èu cdu cUa
người sử dụng, chúng tôi hy vọng sẽ nhận dược nìúểu ‫ ﺭﺩ‬kiến đóng góp
cda bqn đqc.
Mọi ‫ ﺭﺩ‬kiển dồng góp xin gửi về:
Bộ môn Công nghệ sinh học
Trường Đạỉ học Bách khoa ·ẳĐại học Quốc gia TP Hồ Chi Minh
268 1 ‫ ﻵ‬Thường Klệt٠ Quận 10, TP HCM
Tcl: 8 639 341 - 0913 742 766
Chủ bỉên
PGS.TS Ngu‫ ﺓﻻ‬n Bức Lương


Chương 1
NHỮNG NGUYÊN TẮC

cơ bàn

CÙA PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
BÀ11: NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
Vi sinh vật là những cơ thế sống có kích thước vô cùng nhỏ bé mà mắt thường không
thẻ thấy được. Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích cho cuộc sống con người là
nhừng giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người. Chính vì thế.
người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh cần phải tuân thủ các qui tắc cơ bản
sau đáy:

1- Phái chuân bị cho mồi buối thí nghiệm bằng cách đọc bài kỹ và làm quen với các
qui tắc và phương pháp có liên quan đến bài thí nghiệm, nhằm sử dụng thời gian một cách
hiệu quả. đồng thời giảm thiểu tối đa các rủi ro có thế. xảy ra trong khi làm thí nghiệm.
2- Không án. uống, hút thuốc, nói chuyện ồn ào khi đang tiến hành thí nghiệm.
3- Phải luôn mặc áo blouse trong phòng thí nghiệm, tuyệt đối không để môi trường
hay vật phấm cổ vi sinh vật dấy lên quần áo, giấy tờ và dụng cụ cá nhản. Đồng thời cQng
phải chủ ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm.
4- Chi đem những đồ vật cho phép vào phòng thí nghiệm, như tài liệu hướng dẫn
thực hành, sổ sách ghi chép, và các vật liệu thí nghiệm khác. Tất cả các thứ khác như áữ
khoầc. túi xách, sách vớ... phái đặt đúng nơi qui định, cách xa nơi làm thí nghiệm.
5“ Trước lúc bắt đầu làm thí nghiệm, phải sát trùng bề mặt bàn thí nghiệm bằng các
hóa chất sát trùng đá chuẩn bị sẳn và lau khô bằng giấy vệ sinh. Lặp lại công việc này lần
nừa sau khi đả hoàn thành thí nghiệm,
6.
Tất cả các vật liệu và hóa chất thí nghiệm ngoài tên vật liệu, hóa chất còn phải
ghi chính xác tên người làm thí nghiệm, tên lớp học và ngày làm thí nghiệm, dể tránh
nhầm lần khi sứ dụng và vứt bỏ vật liệu, hóa chất.
7- Chú ý, phải hết sức thận trọng để không làm đổ, vỡ. hư hóng các trang thiết bị và
dụng cụ.
8- Phái chú ý cẩn thận khi sử dụng đèn cồn. Không được đốt đèn cồn khi không sứ
dụng. Thao tác cấn thận tránh làm bỏng tay và gây hỏa hoạn.
9- Tất cá các vật liệu bị nhiễm bẩn cần phải được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử
dụng lại. Các vật liệu cần khử trùng phải được đặt đúng nơi qui định.
10- Khi kết thúc thí nghiệm, cần phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sứ dụng theo
đúng qui trình và phái sắp xếp chúng vào đúng nơi qui định.
1 1 . Sau mỗi lần làm thí nghiệm, phải rửa tay sạch sè trước khi rời phòng thí nghiệm.
12. Trong trường hợp nếu có tai nạn hay bị thương, lập tức báo cho cán bộ phòng thí
nghiêm đê có thể chữa chạy kịp thời.

12

Chương 1

BÀI 2: NHỮNG D ٧ NG

cụ, TRANG

TìHlỂT BỊ

V IS I^ H

٧ẬT

cơ BẢN

CÙA PHÒNG TH! NGHIỆM

HỢC

2.1 CÁC DỤNG CỤ THÔNGTTHƯỜNG

]· Các dung cụ thủy tinh

1- ỏng Ịigliíệni. dược dUng de chưa mồi trường nuôi cấv V‫ ؛‬Sìiih vật. cO hodc khòng cổ
nút đậy bàng bông gOn. bần hay nắp b^iig nhưa.
2- Lọ thủy tinh: chưa hóa chất, mOi trưởng nuOl cấ.Y vl sinh vồt. cố nắp dậy bàng
nhựa hay klm loại. Ngoai ra cùng cO lọ thuy tinh có nút bản hay nUt mài.
3- Pipet: cO nhiểu lo,ại như pipet cO vach chia dọ, plpet Pasteur, plpet tự dỌngí dược 5‫ن‬
dụng de' lố'y một thể tích nhá't dinh chat long nào do.

4.
٥
í'٥
Pcín. (hộp longí: gOm một náp va một day nho hơn lóng dược va() nhau, thường
dược sử d٧
ng dể chưa mOi trương thach nuO‫ ؛‬câ.y VI sinh vảt. nghiOn cưu cac dồc diOm hinh
thai le bOo vi sinh ٧
ạt.
5- Dủa tìiúy tinh: chu yêu dung de khuav ch^t loiig
6- Quc củy\ cO bOn ‫ا‬٠
‫ف‬
‫ا‬que cồ.y ٢
٠
ban:
٠ Quc vay I'()ng: cO dí١
.١
' CÍ'1.V bàng kim loai, cO đầu hinh vOng tron, dược sư dụng
trong C(1.V chuyOn ímòi trương long va ‫ﻊ‬
‫ﻟ‬0٢
‫ ا‬va cấv ria í tạo vuch) V‫ ؛‬sinh vột trén mOl
trường thach.
٠Qur ('Ii\ tlị(ĩỉig\ co dhy c(،'.v bằng kini ìoĩỊÌi hinh th٥ng٠dược sư dụng dé cố'.v trich sáu
(trong thiich dưng) hay trích ly ví sinh vật trên m٥i trương dộc.
. Quv cđy móc: cO dủ.v cày bàng kim loại, cO mOc. dược sư dụng de' cỏy cdc loíii nố'm vố
xạ khuẩn.
٠ Quc ،٠‫ ﻟﺪن‬trang

(que gạt): dược sư dụng dè' phấn b٥
' déu d‫ا‬ch chứa vi kh٧
a'ji trèn bé

mặt m٥
i trương thọch.
7٠
Cốc bêsc (c٥
'c d٥
't^. binh cầu dóy bằng và dổy trơn, binh tam giiic {Erìcnmcycri vdi
nhiều dung tích khác nhau, dược sư dụng dè' chứa ch4٠
t lOng. m٥
i trương hay dẻ' nuOi cồ.y,
nhản giOng vi sinh vẶt. Một sơ' cO kha nống chịu nhiệt dược sư dụng đế' dun chả.t lOng.
8٠
Đàn cồn: thương dược sư dụng trong các kỹ thuật vỗ trUng.
9Pliicn kinh {lamc kinh): dược sứ dụng dế lồm tiêu ban trong nghien cứu cac dặc
diế'm hinh thai, sinh. hóa. Iv cUa tế bảo vi sinh vặt,
10" Là kinlì ilamclì dUng de' dậy lèn vè't bOi trSn tiêu ban giup cho việc nghiên cứu,
quan sat vl sinh vật dưới kinh hièn vi.
11. Phicìì kinh /‫رة‬:
7‫ ا‬sư dụng trong nghiên cứu kha nâng dl dộng, sự hlnh thanh bao
t.ư va dặc dỉểrn về sinh sdn cUa te hao vi sinh vật,
12. Plìicrì kinh có kỉiliỉiR đcni Goriacp: dUng de' kie٠
،n tra sỏ lượng te' bao cO kích
thước lơn như na.m. bao tủ' níiin. tao,...
13* Ciioettc: ống lain bơng thuy tinh hay thạch anh. dược sư dụng trong cdc phCp do
mật độ quang cùa dung dịch ch‫؛‬lỊ long.


Những n g u y ẽn tâc cơ bản cUa phOng th ‫ ؛‬n g h ‫؛‬ệm vi sin h v ậ t h ọc

13

2· Một 8ố các dụng cựỳ th iết bị khác
1- Cân kỹ thuât: dùng dể cổn hốa châ't١ vật liệu vè cóc thành phẩn mối trướng nuO‫؛‬
cấy vi sinh vặt.
2- Cản phán tích: dUng dể cản hốa chất, vật liệu vồ cốc thầnh phần mói t ٣'íờng nuôi
cấy vi sinh vật vdi lượng nhồ va cắn độ chinh xác cao.
3- Bếp điện: cắn thiê't dể dun nóng va chuẩn bị mOi trưởng nuOi cấy vi sinh vật.
4٠
Tủ lạnh: dược sứ dụng dế bảo quản vi sinh vật, hốa chất va mOl trường trong một
thdi gian ngắn.
5- Tủ cấy vô trung: cO khOng gian vO trUng dược sư dụng dể cá'y vi sinh vật. nhớ hệ
thOng den tư ngoại hay bộ phận thOi khi vO trUng.
6- Tủ ấm: cố chế độ ổn định nhiệt độ dược 6‫ ﺉ‬dụng dể ủ vi sinh vật tại nhiệt độ thích
hợp cho sự sinh trưởng va phat triển cUa chUng.
'7٠
Tủ sấy: dược 5‫ ﻥ‬dụng dể sá'y kho, khư trung cac dụng cụ thi nghiệm chịu dươc sức
nOng kho (chU yếu !à dựi)g cụ thuy tinh) sau khỉ rửa sạch va de thật ráo.
8٠ Nồi hấp tiệt trùng {autodavcr .thiet Ъ] nay ca.p nhiOt bằng hơ‫ ؛‬nước ơ Up suat
cao. dược sử dụng dể hâ'p khử trùng mOi trương, một sO' các nguyên liệu và các loại dung
cụ thi nghiệm.
9٠
Nổi chưng cách thủy: cố kha nang chiu nhiệt thương dược 8‫ ﻥ‬dụng dế dun cha.v thỉĩch.
10. Bc điểu nhĩột: thương chda nước và dươc cai dạt ở nhiệt độ nhat định dể'ổn dinh
nhiệt độ cho nhtog thi ngh‫(؛‬٠m can sư On định về nhiệt độ.
11. Bc lắc ổri ìihict: sứ dung dt lác môi trương trong nuOi cấy vi sinh vật ơ một nhivl
độ thích hợp, nhằm ổn d‫؛‬nh nhiệt độ cán thiCt va dảm bảo tinh dOng nhat cua mOi trường
cho vi sinh vật sinh t^ỏng.
12- Mdy ly tám: thiè.t bị nầy dươc sư dung de tach các chat ỏ các pha ràn ٠ lOng ra
khOi nhau, như tach sinh khOi te' bào ra IthOl mOl trương nuOl ca'y٠ hay tach ^ac tiểu phần
trong các thanh phồn tè' bao cỏ độ láng khac nhau.

13‫ ﺍ‬Máy do ‫ ﺹ‬: dược sừ dụng dế xac định nhanh độ pH cUa dung dịch hay mOi trương
nuOi cả'y vi sinh vật.
Ngoai СЙС dụng cụ. thiết bị cơ ban trén١ phơng thi nghiệm vi sinh vệt cơn có thể cO

các dụng cụ. thiết bỊ khác như k‫ ؟‬p gắp dể lố'y mẫu, b٥p cao su sư dụng v٥ i pipet,.,., kinh
hiển vi chụp ảnh» máy do mặt độ quang, mồy sác ky, diện di.....
Một sểTđiểm cồn lưu ý khi sử dụng cốc th‫؛‬é't bị
1.
Đối với tu lạnỉi tỏ ‫'ﻻﺀ‬
khi bảo quản hOa chat, mOi trương nuOi cả'y hay giOng vi
sinh vặt hoặc u vi sinh vật, ngươi làm thl nghiệm cần phai lam dâ'u tèn va ngày thi
nghiệm lên những thư nảy đế' tranh gây nhảm lản. mât mất va cần phai dạt chUng ngan
náp. gọn gang dể hạn chè' đổ vỡ.
2 ٠ớ'‫؛‬
٥ với ‫ ﻻﺀ‬cấy tổ trùng: dể dảm bdo vO trUng, dơn tư ngoại phải dược bặt sang lièn

tục. chi tất trươc khi cả'y 1 giơ. Sử dung chổi va giẻ rièng dể quGt và lau chUi tU cồ.y.


14

Chương 1

3‫ ا‬Đối vởi tủ sấy: chỉ sấy các dụng cụ, không sâ'y môi trường. KhOng dược sấy các
vật dụng dề chảy như dây thun, nhựa.... Không dể tủ hoạt dộng khi không sứ dụng.
4- Đối với cân kỹ thuật: không dược cân trực tiếp môi trường và hóa Chất trèn dĩa
cân. Khi cân xong phải trả cân về vị tri 0 và khOa cân lại. KhOng dược dể hất cứ vật gì
trên cân khi không sử dụng cân.
5- Đối với nổi hấp tiệt trùng: người làm thi nghiệm khi sử dụng nồi hấp cần phải
rât cẩn thận dể tránh bị bỏng. Phải sử dụng găng tay bằng vải dày khi làm việc với nồi

hâ'p và tuân theo các hướng dần sử dụng nồi hấp một cách nghiêm ngặt. Thời gian, nhiệt
độ và áp suâ't sử dụng dể tiệt trUng bằng nồi hấp không giống nhau dô'i với các môi
trường nuOl cấy dem khử trUng có cấc thể tích khác nhau. Ví dụ: da số các môi trường
nuôi cấy vi sinh vật trong phOng thi nghiệm khi dem hấp khử trUng trong ống nghiệm
10 ml và các binh tam giác 50 - 200 ml thi chỉ cần 15 phut (I 2 1 c , latm), cOn trong các
binh tam giác 500 ml: 20 phut, 1000 ml: 25 phUt. ớ cấc diều kiện hấp khử trUng này, cả
tê' bào sinh dưỡng lẫn bào tư vi sinh vật dều bị tiêu diệt.
٧

-

' " ‫ ﺍ ﺫ ﺫ‬: ‫ ﺉ‬٠,

\ ٠
‫ﻢ‬
‫ﺑ‬
Các loai liộp lồng Petri

Các loai blnli tam giác

/

ự

a) Ld hínli

b) Phiến kirih

/
JŨằ

/

( §

ự

‫د‬
a> Que gạl

b)

N|
‫ ﺣﻼه‬cấy

Ph .tển kinh ١õra

ỉ


N h ữ n g n g u y ê n tắc cơ b ả n củ a p h ò n g th í n g h iệm vi sin h v ậ t h ọ c

Cân phân tích

Tủ sấy

15

Bể lắc Ổn nhiệt

Hình 1.1: Một số dụng cụ và trang thiết bị cơ bản thường thấy
trong phòng thi nghiệm vi sinh
2.2 KÍNH HIỂN VI CÁC LOẠI

Các loại kính hiển vi được sử dụng trong nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về
các đặc điềm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của chúng. Việc lựa chọn loại
kính hiển vi để nghiên cứu phụ thuộc vào mục đích cụ thể của từng nghiên cứu. Tuy vậy,
kính hiển vi quang học nền sáng là loại kính được sử dụng phồ biến nhất và dễ sử dụng
nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản.
i- Cấu tạo
Có rất nhiều loại kính hiển vi được sử dụng trong phòng thí nghiệm đế quan sát
những mẫu vật có kích thước rất bé. Tuy nhiên, việc lựa chọn kính hiển vi đế sử dụng phụ
thuộc vào từng mục đích nghiên cứu cụ thể, chẳng hạn:
Kính hiển ưi quang học nền sáng: được sử dụng để nghiên cứu, quan sát các đặc điểm
hình thái, cấu tạo và sinh lý nói chung của tế bào vi sinh vật, độ phóng đại có thề lên đến
1000 lần. Đây là dụng cụ được sử dụng phổ biến nhất và dễ sử dụng nhất trong các phòng
thí nghiệm vi sinh vật. Tuy nhiên, không thể sử dụng loại kính hiển vi này để quan sát các
mẫu vật có kích thước 0,2 pm.
Kính hiển vi quang học nền đen: tương tự như kính hiển vi nền sáng, nhưng loại
kính này có thể giiíp quan sát các câu trủc khó phân biệt của tế bào vi sinh vật nhờ
vào câu trúc đặc biệt của bộ tụ quang với một đĩa chắn sáng ngán không cho ánh sáng
đi vào thấu kính một cách trực tiếp; ánh sáng phản xạ bởi mẫu vật di vào thấu kính
của vật kính và vì thế mẫu vật xuất hiện màu sáng trên nền đen. Kính này giúp quan
sát tố٠
t các vi sinh vật sô،ng nhưng không thể quan sát được bằng kính hiển vi nền sáng
và không dễ nhuộm.
Kính hiển vi đối pha: loại kính này củng tương tự kính hiển vi nền sáng nhưng

chỉ khác là câu tạo đặc biệt của tụ quang. Bộ tụ quang được gắn với một màng chắn
hình vòng khuyên cho phép ánh sáng xuyên trực tiếp qua tụ quang, hội tụ lên mẫu vật

16

Chương 1

và qua một bán nhiẻu xạ trong thấu kính của vệt kính.Vệt kính và thị kính có thể làm
đổi pha dao động của ánh sáng chiếu vào, giUp quan sát rõ nét các câu trúc nhỏ như
tién mao. các lớp màng, không bào. ty thể,.... Với loại kính hiển vi này. mẫu vệt khỏng
cần phải được nhuộm, và thường dược sử dụng để kiểm tra các cả.u trúc bên trong của
tế bào sống.
Kinh hiển vi soi nổi: loại này tưcmg tự như kính hiển vi đối pha, nhưng sử dụng hai
chùm sáng được phán tách khỏi nhau nhd một số các lăng kính và cho hình ảnh ba chiều.
Nhờ vậy. mẫu vật có ảnh màu và không cần phải nhuộm.
Kinh hiển vi huỳnh quang: khác với bốn loại kính hiển vi trên, kính hiển vi loại
này không được chiếu với ánh sáng tráng mà là ánh sáng tử ngoại hay gẩn vùng tử
ngoại, và tiéu bản đã được nhuộm màu bới các chất huỳnh quang. Các cấu trúc khác
nhau trén tế bào sè phát quang với các màu sác khác nhau, vi thế giúp quan sát và
phán biệt chúng rõ ràng hơn.
Kinh hiển vi dồng ticu dicm: loai kính này sử dụng tia laser đé chiếu sáng một mặt
cua một mảu vặt riêng biệt. Trong các ứng dụng y học, tế bào có thể được quan sát với kính
hiển vi loại này với hình ánh hai chiéu hoặc ba chiều.
Kinh hiển vi điện từ: loại kính này sử dụng chùm tia điện tử với độ phán giải
cao. có bước sóng ngán cho phép quan sát các mồu vật có kích thước nho hơn 0,2 pm.
Có hai louỉ kinh hiển vi diện tứ cơ báni; kính hiển vi điện tử truyền suốt và kính hiển
VI difn tử quéx. Loại thứ nhát cho íỉnh hai chiéu, thường dược sử dụng đé quan sát
virus hay các cáu trúc cưc nhó bén trong các phán mòng cùa tẻ bào. Mầu vát khi dược
quan sát với kinh hiển vi loai này cổ thể được phóng đại từ 10000 ٠ 100000 lần. có khi
lén đến 1000000 lần. Loai thứ hai cho ầnh ba chiều, thường dược sử dụng để nghiẻn
cứu đặc điếm bề một của tè bào và virus. Mồu vệt có thể được phóng đại từ 1000 10000 lần.

Kính hiền vi quét có đầu dò bàng kim loại: giúp quan sát các chỗ lồi. lôm trên bề
mật mẫu vật. có độ phần giải cao hơn nhiều so với kinh hiển vi điện tử. Kinh hiển vi loại
này thường được sử dụng để quan sát các chip máy tính và các phản tử DNA.
Kính hiền vỉ áp lực nguyên từ có đẩu dò bàng kim loại và kim cương: có khả nàng ép
khi quan sổt dọc theo bề mặt mẳu vệt. giúp quan sát chi tiết cấu trúc của các phán tử sinh
học dưới hình ảnh không gian ba chiều.
Trong các phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản nói chung, dể quan sát các tế bào vi sinh
vật và hình thái của chúng, kính hiến vi quang học nền sáng là loại bước đầu được sử dụng
nhiẻu nhất.
Kinh hiển vi nền sáng là loại kính hiển vi trong dó vùng quan sát có màu sáng còn
mẫu vật có màu tối.
Kính hiển vi quang học nền sáng có cấu tạo cơ bản như sau (H.1.2)


N hừ n^ n g u y ên tắ c cơ b ản củ a p h ò n g thí n gh iệm v i sin h v ậ t h ọc

17

—٩
=
٥
^
r ١
١

11

13

1.

2.
345691011121314-

Chân kính
Ống kính
Trục mang ống kính
Thị kính
Vật kính
Bộ phần Chĩnh thô
Bộ ptón chỉnh tinh
Ốc nang tụ quang
Tụ quang
Kẹp giữ tỉẻu bản
Cần điều chỉnh ánh sáng
Đèn chiếu sáng

14

Hình 1,2: Kinh hiển vi quang học
a) Phẩn cơ học của kính hiển vi gồm có giá kính, bàn kính và ống kính. Giá kính là

chỗ dựa chủ yếu cho nhiều bộ phận khác như bàn kính, ống kính và trục mang ống kinh.
Bàn kính có thể chuyên động theo mặt phăng ngang nhờ các ốc vặn di chuyển bàn kính,
nhờ đó có thể chuyển bất kỳ vị trí nào trên tiêu bản vào giữa thị trường. Trên bàn kính.có
các kẹp giữ tiêu bản. Dưới bàn kính có một giá giữ bộ tụ quang., ống kính là một ống tròn
(kính một mắt) hay hai ống tròn (kính hai mắt) có thể di động theo hướng diều chỉnh của
ngiíời sử dụng. Ông kính có khả năng di chuyển lên. xuông nhờ các ốc điều chỉnh theo hai
chiều ngược nhau: ốc chỉnh thô (di chuyển nhanh) được chỉnh để tìm ảnh của vật; còn ốc
chỉnh tinh (di chuyển chậm) được chỉnh để có được ảnh rõ nét.
b) Bộ phận quang học của kính hiển vi là bộ phận quan trọng nhất, gồm có vật kính,

thi kính, kính tụ quang và gương phản chiếu. Trong đó, vật kính là phần quan trọng nhất،
- Vật kính: tạo ra ảnh thực phóng đại và ngược chiều với vật được quan sát. Kính
hiến vi thông thường có bốn vật kính tiêu sắc x4, xio, x40 và xioo. Vật kính xioo là vật
kính dầu. Khi quan sát các mẫu vật nhuộm màu với vật kính xioo thì cần nhúng chìm vật
kính vào dầu soi sử dụng cho vật kính hiển vi (có độ chiết quang tương đương với độ
chiết quang của thủy tinh, do đó ánh sáng đi qua không bị khúc xạ mà chiếu thẳng vào
vật kính).
- Thị kính: thị kính được ỉắp vào phía trên cùng của ống kính. Thị kính của kính
hiển vĩ thường được sử dụng hiện nay là thị kính hai mắt; độ phóng đại xio. Ảnh quan sát


18

Chương 1

dược dưới kính hiển vi quang học là ảnh ảo, ngược chiều với mẫu vật, với độ phóng đại
bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính và thị kính dang sử dụng.
c) Kính tụ quang: kính này nằm dưới bàn kính, có thể di chuyển được nhờ một ốc
diều chỉnh và có tác dụng để tập trung ánh sáng. Bên dưới kính tụ quang là hệ thống chắn
sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng chiếu vào.
d) Gương phản chiếu: bộ phận này được lắp phía dưới kính tụ quang, giúp hướng
chùm tia sáng đi vào kính tụ quang, có thể quay được để thu nhận ánh sáng.
Ánh sáng được truyền từ đáy thân kính, xuyên qua mẫu và vào vật kính. Ánh sáng có
thể được điều chỉnh bằng cách nâng hoặc hạ tụ quang, đóng hoặc mở chắn sáng, tăng hay
giảm ánh sáng của đèn.
Lưu ý:
- Cẩn thận khi nâng, hạ kính vì lá kính trên mẫu vật rất dễ bị vỡ.
- Vật kính dầu (xlOO) sau khi sử dụng xong cần phải chùi tigay bằng loại giấy lau dành
riêng cho nó. Đặc biệt không được dùng cồn hoặc dùng giấy vệ sinh chùi vào vật kính.
2- Cách sử dụng

Trước hết phải chuẩn bị tiêu bản có vi sinh vật, sau đó cần phải điều chỉnh nguồn
ánh sáng và điều chỉnh vật kính.
a- Điều chỉnh nguồn ánh sáng
- Đưa vật kính vào vị trí có thể nhận được nguồn sáng;
- Cắm điện và bật công tắc đèii, nếu dùng ánh sáng đèn;
- Mắt nhìn vào thị kính đồng thời sử dụng tay phải điều chỉnh gương phản chiếu dể
tập trung nguồn sáng vào tâm điểm của thị trường quan sát. Điều chỉnh sao cho lượng ánh
sáng đi vào đạt tối đa.
6- Điều chỉnh vật kịnh ụậ kính ịụ quQng
- Chuẩn bị tiêu bản chứa mầu vật rồi đặt vào bàn Iđnh, cố định bởi các kẹp tiêu bản.
- Điều chỉnh kính tụ quang bằng tay trái: nâng kính lên ở mức hợp lý, tránh làm vờ
tiêu bản.
- Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh để có ảnh rõ nét nhất.
-Nhìn vào thị kính, điều chỉnh tiêu bản đe chọn được vùng cần quan sát.
- Di chuyển vật kính xuống gần tiêu bản với khoảng cách hỢp lý để cố ảnh rõ, tránh
làm vỡ tiêu bản.
- Nhìn vào thị kính, thận trọng điều chỉnh các ốc chỉnh thô, ốc chỉnh tinh cho đến
khi thấy được ảnh đẹp.
- Khi quan sát, có thể điều chỉnh vị trí của tiêu bản để quan sát phần mẫu vật theo ý muốn.
- Nếu sử dụng vật kính dầu, cần phải nhỏ một giọt dầu lên vị trí cần quan sát trên
tiêu bản. Sau đó, hạ từ từ vật kính dầu cho đến khi vật kính nhúng vào dầu, cẩn thận để
không làm vỡ tiêu bản. Điều chỉnh các ốc chỉnh thô và chỉnh tinh để có được ảnh rõ nét.
3- Bảo quản kính hiển vi
a- Khi sử dụng xong
- Nâng vật kính lên cao, lấy tiêu bản ra


N hững n gu yên tắc cơ bản củ a p h ò n g thí n gh iệm vi sinh v ậ t h ọ c

19

- Nếu sử dụng vật kính dầu thì phải sử dụng khán hoặc giấy lau dành riêng cho vật
kính dầu (hoặc sử dụng vải mềm lau hết dầu) sau đó thấm cylon hoặc xăng tốt lau thật
sạch (chú ý lau nhẹ, tránh làm xước vật kính).
- Xoay đứng gương phản chiếu, hạ tụ quang xuống, xoay điểm giữa của hai vật kính
gần nhau vào trục, xếp một miếng vải sạch đặt lên khay kính rồi hạ cho vật kính sát vào
lớp vải này.
- Cho kính vào hộp hoặc vào tủ kính.
- Đế tiêu bản vào nơi qui định. Nếu tiêu bản dính dầu, phải lau sạch dầu trước khi để
vào nơi qui định.
ò. Bảo quản kính hiển vi
- Phải giữ kính hiển vi thật sạch sẽ ở nơi khô ráo để tránh nấm sợi phát triển và bụi
bám vào.
- Trong thời gian không sử dụng, có thể lấy thị kính ra và đậy nắp ống kính lại. Để
nguyên vật kính.
- Nếu phần kính trên của thị kính bị bẩn, có thể sử dụng khán .mềm lau sạch.
- Khi vặt kính, thị kính bị nhiễm nhiều nấm sợi, nên nhờ cá٠
c chuyên gia về quang
học xử lý, không nên tự tiện lau chùi.
- Khi di chuyển kính hiển vi, phải thao tác nhẹ nhàng, cẩn thận. Một tay cầm thân
kính, một tay giữ đế kính. Chỉ nên di chuyển kính hiển vi khi thấy cần thiết.


Chương 2
CHUẨN B| MÔI TRƯỜNG VÀ ĐiỀU KIỆN NGHIÊN

cứu VI SINH VẬT

BÀI 3: CHUẨN BỊ DỤNG c ụ NUÔI CẤY

Quá trình chuẩn bị đụng cụ nuôi cấy gồm các công việc sau đây
- Xử lý dụng cụ;
- Bao gói dụng cụ;
- Khử trùng dụng cụ.
3.1 XỬ LÝ DỤNG CỤ

1· Nguyên tắc chung
Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật sạch và
trong, không bị nứt mẻ.
2- Phương ph áp xử lỷ
Để xử lý các dụng cụ, phải tiến hành qua hai giai đoạn:
- Trung tính dụng cự;
- Rửa dụng cụ.
'*a) Trung tính dụng cụ

- Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7 (để kiểm tra độ trung tính).
-,Hấp khử trùng dụng cụ ở 121 "C trong 15 phút bằng nồi hấp điện.
- Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra pK của nước trong dụng cụ.
- Nếu nước có pH kiềm thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2‫ ؛؟‬cho đến khi
kiêm tra lại và thấy nước có pH 7 thì mới thôi.
- Rửa kỹ bằng nưởc nhiều lần lí\ dùng được.
b) Phương pháp rửa dụng cụ

Nhìn chung các dụng cụ làm bằng thủy tinh có độ bền hóa học, chịu được nhiệt độ
cao, tấ t khác nhau về hình dạng và kích thước. Do đó, các loại dụng cụ khác nhau cần có
các phương pháp rửa khác nhau.
Phiến kính
- Với phiến kính cũ (đã dùng làm tiêu bản)

٠ Chùi

sạch mỡ hay vaseline trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen hoặc ngâm
tiêu bản vào dung dịch sulíurbicromate trong 48 giờ.
• Ngâm tiêu bản vào nước xà bông và đun sôi trong 1 giờ.
• Rửa nước, để ráo.
٠Ngâm tiêu bản vào cồn 90٧
trong 2 giờ.
٠Lau khô chúng bằng vải mịn rồi sây khô.
- Với phiến kính mới: cần kiểm tra độ pH và xử lý để đạt độ trung tính
Yêu cầu: các phiến kính sau khi rửa phải đạt tiêu chuẩn sạch nfỡ và trong.


C huẩn bị m ôi trư ờn g và đ iều k iệ n n g h iên cứ u vi sin h v ậ t

21

Ong nghiệm

Chưẩn bị các ^oại chổi khác nhan dể rửa các loại ống nghiệm.
- Với các ống nghiệm cũ da bị nhiễm khuẩn:
٠Hấp vô khuẩn ỏ 121.C trong 15 phut.
٠Lấy ra và đổ cắc vật phẩm trong ống nghiệm di.
٠Ngâm ống nghiệm vầo nưức ấm.
٠Rửa ống nghiệm bằng cấch:
+ DUng chổi chấm xà bống cọ xát vầo thầnh ống dều khắp nhiều lần.
+ Rủa nưởc 2-3 lần.
+ Up ống nghiệm cho thật rấo.nước và khô.
+ Sấy khô trong tủ ấm ở 40.C.
- Với các ống nghiệm khOng nhiễm khuẩn hay chứa cấc vi khuẩn không gây bệnh thi
không phải hấp khử trUng vầ tiến hầnh rửa như trên.

ĐXa Petri

٠
Bặt ngửa dĩa Petri trong lòng bàn tay trái.
- Tay phải dì١
١
ng giẻ chấm tro cd xầ bông xát vầo hai mặt cUa dĩa, các khe ớ chân dĩa
vầ thầnh dĩa.
- Rửa nước 2-3 lần.
- Up nghiêng cắc dĩa trong rổ nhựa cho thật khô.
Pipet

- BUng que hoặc dây thép nhồ rUt nUt bông ở dầu Idn pipet ra.
- Khứ trUng pipet ở 121.C trong 15 phut.
١
Ngâm vầo dung dịch sulfurbicromate trong 24 giở.
- Xát kỹ hai dầu vầ phần ngoầi pipet bằng giẻ vdi nước xà bông.
- DUng nước xả ngược đế' thông cặn pipet.
- Cám pipet trên giá, dầu nhọn đế’ lên trên.
Các dụng cụ thily tinh khác: gồm phễu, chai, lọ, binh cầu, binh tam giác١
...
- DUng giẻ với nước xà bOng dặc lác kỹ đế' rứa phần t١
١
ong dụng cụ.
- Rửa nước nhiều lần cho thật sạch vầ đế' rấo.
N^t I١à ổng cao su

- Phân loại cấc dụng cụ này theo kích thước to, nhỏ. tốt, xấu, sạch hay bấ'n.
- Ngâm từng loại riêng vầo nước ấm (50 - 80"c) trong 3-4 giờ.
- Rứa nước là nhiều lần.

- Phoi nắng 2-3 giờ rồi câ't di dUng dần.
3 2 ‫ ﺍ‬SAO ‫ﺓ‬
0 ‫ﺍ‬DỤNG c ụ

1- Ngu^ẽn tdc
٠
Dụng cụ dược bao gOi phải dảm bảo sạch và khô.
- Bao gối phai thật kin và cẩn thận đế' dụng cụ sau khi khư trUng vẫn dảm bảo sự vô
trUng trong lớp giấy gói và Iâ'y ra sử dụng dễ dàng.


22

Chương 2

2· Phương ph áp ٥٠٥ gói dụng cụ
Việc ban gói đụng cụ gồm hai khâu:
Làm nút bổìig: cho cấc ống nghiệm, binh tam giấc, pipet, que gạt.
Bao gói: cho hầu hết cấc dụng cụ thUy tinh.
٠
" Cách làm nút bông
Với cấc ống nghiệm:
- Lấy một miếng bông không thấm nước cuộn lại
- DUng khUc tre ấn vào đoạn giữa cuộn bông
- Xe u d ï ï .

٠NUt có kích thước, độ chặt vừa phải.
٠Đầu nUt trbn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm.
٠Lấy nUt ra hay dOng vào dễ dàng.
Vdi cấc chai, lọ, binh tam giác có kích thước lớn: cấch lầm tương tự nhưng lượng bông

sử dụng phải nhiều hơn và bọc bằng một lớp vải gạc.
Vói cấc pipet, dUng một sợi dây thếp nhỏ nhẻt một ít bông vào dầu lởn cUa pipet.
b- Cách bao gối đ p g cự

Vói cấc dụng cụ sau khi làm nUt bOng, cần dược bao gỏi phần cố nUt bông bằng giấy
dầu hay giấy bấo đế' khi hấp khử trUng nUt bông không bị ướt, dảm bảo diều kiện vô trUng
tốt hơn. Cổch lầm như sau:
- Cát các bâng giấy hlnh chữ nhật với kích thước tUy theo dụng cụ cần bao gOi.
٠
٠
Quấn bâng giấy quanh dầu cố nUt bOng.
٠ Gập ống giấy sốt vầo nUt bOng ở mặt trưởc và hai bên.
- Gập nốt phần giấy cồn lại và câi sâu vầo trong.
Yèu cảu\

- Phần giấy bao ngoằỉ phải chặt kin.
- Bao bàng giấy dầu với dụng cụ hấp ưởt.
- Bao bằng giấy bốo vdi dụng cụ sâ'y khô khi khử trUng.
Vdi cốc dụng cụ như pipet, dĩa Petri, que gạt phdi dUng giấy bao kin toần bộ. co thé'
thay giấy bao bằng một hộp nhôm kin dựng tất cả các d١
ing cụ trên dể khư trUng.
3.3 KHỬ TRÙNG DỤNG c ٧

1- Nguyên tắc
Sau khi khử trùng cần dắm bảo:
- Sự vô trUng tuyệt dối cho cấc vật phẩm và cấc dụng cụ.
“ Không lầm thay dổi châ't lượng mầu vật.
Bảo dảm an toần tuyệt dô'i cho con người.
2- Các phương phàp hhử trùng
Khi khử trúng bàng nhiệt, cốc tế bằo sinh dưởng cUa vi sinh vật cố thế' bị tiêu diệt dè

dằng trong khi cấc bảo tử vần cốn cỏ thể tồn tại ‫ ﻕ‬ngay nhiệt độ dỏ.
Khả nống chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vầo:


C huẩn bị m ôi trư ờn g và đ iều k iện n g h iên cứu vi sin h v ậ t

23

- Tính chất môi trường.
- Số lượng tế bào vi sinh vật.
- Độ pH của vật định khử trùng.
Do đó, để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả, cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất
và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và các bào tử của
chúng có trong dụng cụ cần khử trùng.
Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt.
a- Khử trùng bằng sức nóng khô (nhiệt khô)

Dưới tác dụng của sức nóng khô, các cấu tử của tế bào vi sinh vật bị oxy hóa, tế bào
bị khô hoàn toàn và chết.
Khử trùng bằng tủ sấy

- Phương pháp khử trùng này được thực hiện trong tủ sấy
- Cách tiến hành:
• Các dụng cụ khử trùng cần được bao gói cẩn thận và xếp vào tủ sấy.
٠Bật công tắc tủ để hoạt động.
٠Xoay các núm để điều chỉnh kim chỉ trên đồng hồ nhiệt độ và kim chỉ trên đồng hồ
thời gian tới các chỉ số mong muốn (160.C trong 2 giờ hay 180٥C trong 30 phút).
• Nhiệt độ và thời gian mong muốn sẽ được duy trì nhờ bộ phận điều khiển tự động.
٠Tắt tú sấy, để nguội tới 60٥
c mới mở tủ lấy dụng cụ. Tránh mở tủ lấy dụng cụ khi

nhiệt độ tủ đang còn cao sẽ làm các dụng cụ thủy tinh dễ bị nứt vỡ.
• Các dụng cụ sau khi sây mà giấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu.
Khử trùng bằng cá(h đổt qua lửa nung đỏ

٠
Phương pháp này dùng để khử trùng pipet, que cấy, đầu các ống nghiệm, miệng các
bình tam giác sau khi lấy nút bông ra.
- Cách khử trùng
٠Hơ dụng cụ t'.٠
èn ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại 3-4 lần. Dây cày phải được nung
thật đỏ hết .٩
hiều dài phần dây cấy.
• Đợi cho dụng cụ nguội mới được dùng để tránh vỡ dụng cụ và vi sinh vật không bị
tiêu diệt lf.hi lấy giống. Cũng có thể nhúng dụng cụ vào cồn 90. rồi đốt nhiều lần để
khử trù r.;.
٥٠

Khử tỉ ung bằng sức nóng ướt

ĩ- Đun sôi trong nước

- Phưc١ig pháp này dùng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, kéo, kẹp,
dao, côc thủy tinh, chai, lọ....
- Cách khử trùng
٠Dùng nước máy sạch đổ ngập dụng cụ.
٠ Đun sôi từ 30 phút đến 1 giờ.
Phương pháp này chỉ có tác dụng diệt tế bào sinh dưỡng chứ không diệt được bào tử
vi sinh vật. Để khắc phục hạn chế này, người ta pha thêm vào nước acid phenic 59(.

24

Chương 2

2- Đuĩi cách ٤‫ ﻻﺓﺍﺃ‬ỏ ĩiKièt áộ tKdp ( p K i l g pháp hhử, t.rừĩig Pasteur)

- P h ư ơ ‫ ؟‬nháp ‫ت‬
‫د‬
) tiung dế khử trUng cóc thực phẩm dễ biến tinh ở nhiệt độ cao như
sữa, bia, rượu, ...
- Cdch khử trùng: Đun ndng môi trường lên 60-75.C trong 15-30 phut hoặc dun aOng
lên 80.C trong 10-15 phut.
Phưmig phdp này chi cố khẳ năng ức chế cắc vi khuẩn khOng sinh bào tử.
3 ٠ Hdp gián đoan ở 100.C (phưang phdp Tyndal)

- Phương phdp nầy dUng dể hấp khử trUng một số loại môi trướng nuôi cấy men banh
mi, men gia sUc, mốc lầm nưởc chấm.... vầ những vi sinh vật tạo bầo tử khấc.
- each khử trUng:
٠Hấp môi trường ở lOO.C tư 30-40 phut.
٠Lấy ra dể tủ ấm 24 giờ cho cấc bầo tử cUa vi sinh vật nảy mầm.
٠Hấp môi trưởng lần thứ hai ở I00"c trong 30-40 phut dể tiêu diệt cấc bào tử vừa
nẩy mầm.
٠Lặp lại qua trinh nầy từ 3-4 lần.
- Kết quả: môi trường vừa dược vô trUng, vừa dảm bảo không bị biê'n dổi.
4 ٠ Khừ trtn g bdng hơi nước bão hOa ‫ ﺓ‬dp sudt cao

- Phương phấp nầy dược thực hiện trong nồi hấp tiệt trUng ở ap suất cao. Bó la thiê't
bị lầm bằng kim loại, chịu dược nhiệt độ vầ áp suất cao, cd khả nán٠
> tự dộng diều chinh ấp
suất vằ thdi gian tiệt trUng theo yêu cầu của người sử dụng.

5- Nguvèn tdc hoat dộng

- Lầm gia tang nhiệt dể khử trUng cấc vật bầng hơi nưức bão hòa dưởi ap suất lơn
hơn ấp suất binh thường của khi quyển. Khi ấp suất hơi nươc tang thi nhiệt độ trong nồl
cUng tang theo nhơ hệ thống van rất chặt che.
- Mối quan hệ giữa ap suất ghi trẽn ap kế vơi nhiệt độ trong nồi biế'u hiện qua bảng
dươi day.
Áp suết (atm)

Nhỉệt độ (٥C)

Ap suấ.(atm)

Nh.ệỉ độ (٥C)

0

100

1,5

128

0.5
1,0

112

2,0

.134

121

Cdcìi sử dụng

- Chuẩn bị các dụng cụ chứa môi trường (ống nghiện), binh tam giác da dược bao gói
phần nUt bOng dể trấnh làm ướt nUt bông).
- Cho 3 lit nước vào nồi hấp rồi kiểm tra và diều ch.١
'nh mức nước cho phu hợp. LuOn
luOn kiế'm tra mức nước trong nồi hấp trước khi tiến hành khứ trUng.
- Xếp cấc dụng cụ vầo rổ inox và dưa vào nồi' hấp.
- BOng chặt nồi hấp.
- Cẩm phích diện.
- Biều chỉnh kim dồng hồ di‫ ؛‬n áp về chỉ số mong muốn.
- Bỉều chỉnh kim dồng hồ thơi gian khử trUng về chỉ sO mong muốn.


C huan b ị m ôi trư ờ n g và đ iề u k iệ n n g h iên cứ u v i sin h v ậ t

25

- Đống kin van xả.
- Bật công tắc khử trùng (hay nhấn nút start) сПа nồi hấp.
- Nhờ sự điều khiển cUa hệ thống tự dộng, quá trinh hấp khứ trUng dlền ra và kê't
thUc bằng còi báo hiệu.
" Chờ kim ổp ke' trơ vế sô' 0 mới mở nắp nồi từ từ. de’ nhiệt, độ hạ thá'p rồi lả'y dụng
cụ١
vật hệu da khư trUng ra.
- Kút phích diện (ĩigưng cung cấp diện cho nồi hấp).

- Dẩn nhàn ghi ngày, thấng, nấm khư trUng vầo dụng cụ hay nguyên vật liệu vừa khử
trUng de' tiện việc sứ dụng.
Chii ỷ: 0ê' dảm bảo an toàn và hiệu quả cUa công việc hấp khử trùng, người làm thi
nghiệm cần phải.
- Кіе'т tra lại nồi hâ'p trước khi sư dụng.
- Thận trọng thực hiện dUng qui trinh dược chl dẫn.
٠
Tránh cung cấp diện dột ngột đế' khOng gây vỡ dụng cụ, nguyên liệu hoặc gây nổ
nguy hlé'm.
- Trực tiê'p theo dồi quá trinh hâ'p khư trUng cho dến khi kết thUc vầ ngắt diện.
- Định kỳ kiếm tra châ't lượng dồng hồ áp ke'
và van an toàn.
Tdm lại. phương phấp hấp khứ trUng bằng
hơi nước bão hOa ở áp suâ't cao là phương pháp phồ'
biê'n vầ hiệu quả nhâ't trong các phương pháp khứ
trUng nhờ khả nâng tiêu diệt, dược cả te' bào sinh
dưỡng lẵn bào tư cUa vi sinh vật.
Gần dây, một sô' phOng thi nghiệm vi sinh
vật học cUa các viện vầ trường đã dược trang bị mơi
loại nồi hả'p ap suâ't cao dưới dạng tU hlnh khối chữ
nhật gọn, dẹp và tiện sử dụng hơn nhưng nguyên
tắc hoạt dộng vẵn giừ nguyên (Η.2 . 1 ).
Hình 2,1: Noi h r í p t ì ị í Ị t r ù ì ì ị *
c. Khư. tríuxg bũag cách tọc

Phương pháp nầy dUng đế' khư trUng các loại mOi trường khOng thích họ٠
p với phương
pháp khứ trUng ơ nhiệt độ cao (như mOi trương huyê't thanh, dung dịch albumin, doi khi cá
môi trường dường). Ngoài ra, cO the' dUng biện pháp này dể' tách các vi sinh vật với cẩc sẩn
phâ'm trao dổi châ't cUa chUng trong dung dịch nuOi câ'y.

Nguyen tấc: Cho dung dịch di qua màng lọc (cUa dụng cụ lọc) ma kích thước lỗ màng
nhỏ hơn kích thước vi sinh vật cần lọc. Nhơ do, dịch qua lọc dược vô trUng.
Cẩu tạo bììiìi lọc: Có râ't nhiều loại dụng cụ lọc khác nhau nhưng phô’ biê'n nhất la
binh lọc Seilz. Câ'u tạo cUa nó gồm ba bộ phận:
٠
Bộ phận trên có hình trụ đế' chứa dịch lọc (Ong lọc).
- Bộ phận ở dưới dể chứa dịch dã qua lọc.
- Bộ phận ơ giữa là màng lọc (quan trọng nhat).


26

Chương 2

Màng lọc bằng amiáng, hình tròn, dày khoảng 3-5 mm.
Cả ba bộ phận trên liên kết với nhau nhờ các ốc vít.
Bình lọc này có thê được nối với một bình tam giác có vòi hút chán khỏng dé tạo nên
sự chènh lệch áp suất giừa trên và dưới màng lọc do đó làm tăng tòc độ lọc.
Cách tiến hàìih lọc
- Hấp khứ trùng ống lọc, bình chửa dịch lọc và các phụ tùng kèm theo ở 1 atm trong

15 phút, ở Ĩ21‘'C.
* Đặt màng lọc vào giừa ống lọc và bình đựng dịch lọ.c rồi cố định 3 bộ phận này nhờ
các òc vír.
- Đò dịch lọc vào ống lọc.
- Nối bình đựng dịch lọc với bình tam giác được gắn với bình hút chán không. Trong
đoạn vòi nối có bông gòn đê hạn chế sự nhiễm trùng dịch lọc.
- Cho máy hút chân không hoạt động để đưa độ chênh lệch áp suất lêi: từ từ và dịch
lọc chảy thành từng giọt. Áp suất tạo ra không quá 35-40 cin thủy ngáa.
- Thời gian lọc không được kéo dài quá 30 phút.

- Lọc xong, lấy một ít dịch lọc cấy vào môi trường thạch - nước thịt peptone. đế trong
tù ấm 37..C. Kiêm tra độ vô trùng của dịch đã lọc.
٠
Bó màng lọc đi vì màng này chỉ được sử dụng 1 lần.
d ‘ Tử cấy vô trùng

Thiết bị này dùng để thực hiện các thao tác phán phối môi trường vào C£C dụng cụ. cáy
chuyền, phân lập và tuyến chọn vi sinh vật.
Nguyàn tắc: Bầu không khí bên trong tù
Cấy (nơi điển ra các thao tác Cấy chuyền, phân
lập..١
) luôn luôn đảm báo được sự vô trùng hay
ít nhất cùng hạn chế tối đa sự tồn tại cùa các
vi sinh vật không mong muốn cũng như bào tử
cùa chúng.
Cấu tạo

- Tủ kính có cửa đế đưa vào hay lấy ra các
dụng cụ.
٠
- Hệ thõng bơm và lọc không khí bên
ngoài thành không khí vô trùng thôi vào tú
đồng thời với bộ phận hút khí ra để đảm bảo
sự cân bằng áp suất trong và ngoài tủ
Hình 2.2; Tủ cấy vô trùng
(H.2.2).
Chứ ỷ: Khi tiến hành xong các thao tác
thực hành trong tủ, cần chuyển ngay các hóa chất, dụng cụ. nguyên vật li٥
u ra khỏi tù,
vô trùng lại rồi mới tắt các hệ thông bơm lọc khí cLÌa tủ.