Tài liệu GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC - phần 2 doc

CHƯƠNG IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP
Trong vài thập niên gần đây, CNSH đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể trong
nông nghiệp. Những tiến bộ của CNSH trong nông nghiệp là các kỹ thuật nuôi cấy mô,
lai tạo giống mới, phân sinh học và kiểm soát sinh học và những tiến bộ của CNSH trong
chăn nuôi.
4.1. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào
Bản chất của công nghệ nuôi cấy mô tế bào là các tế bào thực vật (các tế bào từ
mô phân sinh, tế bào trần protoplast) được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng vô
trùng. Từ những vật liệu trên sẽ thu được khối mô sinh trưởng nhanh, vô tổ chức gọi là
mô non (callus ). Từ mô non sẽ tái sinh thành một cây non hoàn chỉnh và tạo ra rất
nhiều bản sao đồng nhất về di truyền gọi là dòng vô tính (cloned plant) trong một thời
gian ngắn. Qui trình nuôi cấy mô tế bào có thể tóm tắt như sau:
Hình 4.1: Tóm tắt qui trình nuôi cấy mô tế bào (Theo Primrose 1991)
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào có những ưu điểm sau:
- Có khả năng nhân nhanh một lượng lớn cây con trong một thời gian ngắn với
chất lượng đồng nhất về mặt di truyền, do đó cho năng suất cao và đồng đều.
Ví dụ: trong 1 cm
3
môi trường nuôi cấy có thể chứa tới 1 triệu tế bào và về
nguyên tắc 1 tế bào có khả năng tái sinh thành một cây con hoàn chỉnh. Hoặc
từ một củ khoai tây sau 8 tháng có thể nhân đủ giống cho 40 ha.
- Bằng công nghệ nuôi cấy mô có thể tạo ra những con giống hoàn toàn sạch
bệnh virus, vi khuẩn, nấm, nhất là các bệnh do virus gây ra khó phát hiện và
có tốc độ lan rất nhanh.
- Với kỹ thuật nuôi cấy mô người ta có thể rút ngắn thời gian đưa một giống
mới ra sản xuất đại trà xuống còn 1 vài năm. Trong khi đó nếu sử dụng theo
công nghệ cũ phải mất 10 năm.
- Bằng cách chọn lọc những tế bào có một số đặc tính ưu việt, ta có thể đẩy
nhanh tốc độ lai giống nhằm tạo ra giống cây mới với tính trạng mong muốn.
22
Lắc trong Auxin và THÂN

MT dung cytokininauxin thấp auxin cao
Dịch thấp cytokinin cao
PROTOPLAST CELLS CALLUS CÂY CON
MT rắn MT rắn cytokinin thấp cytokinin cao
auxin cao
Giữ trong RỄ
Môi trường rắn
Với auxin và Lắc trong
Cytokinin thấp MT dung
Đưa vào mt Lắc dịch enzyme thuỷ phân
THÂN CALLUS CELLS PROTOPLAST
RỄ
enzyme thuỷ phân
- Với cây giống nuôi cấy mô dễ dàng vận chuyển một lượng lớn cây con trong
một không gian nhỏ, làm giảm chi phí vận chuyển, hiệu quả và nhanh chóng.
Ví dụ: 1m
3
có thể chứa được từ 3000 – 10.000 cây giống hoặc một hộp nuôi
cấy có thể nhân được từ 30.000 – 50.000.
Tuy nhiên công nghệ nuôi cấy mô cũng có một số nhược điểm nhất định:
- Có thể bị thiệt hại lớn bởi mức độ nhiễm, có thể nhiễm do môi trường hoặc
nhiễm do mô ban đầu.
- Cây con có tỷ lệ chết cao do chuyển từ điều kiện tối ưu trong in vitro ra môi
trường tự nhiên. Ơ điều kiện in vitro có nhiệt, ẩm, vô trùng, ánh sáng và dinh
dưỡng thích hợp nên cây con sinh trưởng tốt, khi đưa ra môi trường tự nhiên
thì gặp phải những điều kiện khắc nghiệt hơn nên cây con dễ bị sốc và chết.
Để giảm tỷ lệ chết người ta phải đưa cây in vitro ra điều kiện trung gian là nhà
kính trước khi đưa ra môi trường tự nhiên.
- Giá thành cây con cao, do áp dụng công nghệ nuôi cấy mô đòi hỏi những
trang thiết bị, hoá chất đắt tiền, tiêu tốn điện , nước cao và công nghệ nuôi cấy

mô đòi hỏi các chuyên gia có tay nghề cao, chi phí về đào tạo lớn.
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào bao gồm các bước chủ yếu sau:
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Chọn mô cấy và xử lý mô
- Giai đoạn tạo chồi, tạo cây và nuôi cây
- Giai đoạn vườn ươm
4.1.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi theo từng loài, từng bộ phận nuôi cấy
như lá, chóp rễ, đỉnh sinh trưởng, … Vì vậy tùy đối tượng mà thành phần môi trường có
thể thay đổi ít nhiều. Tuy nhiên hầu hết các môi trường nuôi cấy mô bao giờ cũng có đủ 5
thành phần là nguồn carbon, khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin và kích thích
sinh trưởng.
• Nguồn carbon:
Nguồn carbon sử dụng thường là đường, có thể là glucose hoặc saccharose.
Thường dùng là đường saccharose với nồng độ từ 1-6%, phổ biến là 2%.
* Khoáng đa lượng:
Chủ yếu là các nguyên tố khoáng như N, P, K, Ca, Mg, Fe.
- Nguồn N thường dùng là KNO
3
, Ca(NO
3
)
2
, NH
4
NO
3
hoặc (NH
4
)

2
SO
4
. Mỗi một
loại cây khác nhau thích hợp với hai dạng đạm nitrat hoặc amon khác nhau.
- Nguồn P thường dùng nhất là NaH
2
PO
4
hoặc KH
2
PO
4
. Nồng độ thích hợp nhất là
từ 0,15 – 4,0 mM. Thường sử dụng nhất là 1mM.
- Nguồn K thường dùng ở dạng KNO
3
vừa cung cấp cho K vừa cung cấp N cho
cây. Ngoài ra các loại môi trường nuôi cấy thường dùng KH
2
PO
4
vừa cung cấp K và P.
- Ca thường dùng là CaCl
2
, Ca(NO
3
)
2
. Nồng độ Ca

+2
thường từ 1 – 3,5 mM.
23
- Nguồn Fe cung cấp dưới dạng FeCl
2
, FeSO
4
hoặc dạng chelat là EDTA.
* Khoáng vi lượng:
Có nhu cầu rất ít nhưng không thể thiếu được cho nhu cầu của cây. Tuy nhiên
trong agar chế biến từ rong biển cũng chứa một lượng khoáng vi lượng khá lớn cho cây.
Ngoài ra khoáng vi lượng có thể được cung cấp qua việc sử dụng nước máy pha môi
trường nuôi cấy. Các loại khoáng vi lượng là Mn, B, Zn, Mo, Cu, Co, I, …
* Vitamine:
Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô thực vật chủ yếu là các vitamin
nhóm B như B
1,
B
6
, B
2
, B
3,
B
5
, ngoài ra còn có biotin, axit folic, inositol.
* Chất kích thích sinh trưởng:
Các loại kích thích sinh trưởng thường dùng là:
- 2,4 D (Dichlorophenolxyacetic acid) nồng độ dùng : 0,20 – 0,25 mg/l
- α -NAA (Naphtylacetic acid): 0,1 – 5 mg/l

- IBA (indolbutylic acid): 1-5 mg/l
- β -IAA (Indolacetic acid): 5 – 20 mg/l
- Kinetin (6-Fucfuryl aminopurine): 0,1 – 2 mg/l
- GA (Gibberellic acid): 0,1 – 2 mg/l
- BA (6 –benzyl amino purin): 0,1 –2 mg/l
* Các chất hữu cơ khác:
- Nước dừa chứa nhiều myo-inositol và một số axit amin, đường có tác dụng kích
thích sinh trưởng thực vật. Lượng nước dừa thích hợp là 15 – 20% thể tích môi trường.
Thường sử dụng nước dừa già và nước dừa tươi.
- Nước chiết nấm men giàu các vitamine nhóm B, các axit amin .
Do nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy rất nhỏ, nhất là các loại khoáng,
vitamin, kích thích sinh trưởng, vì vậy để tiết kiệm, tiện lợi và chính xác người ta thường
pha các dung dịch mẹ có nồng độ đậm đặc, sau đó pha loãng nhiều lần.
Một số môi trường nuôi cấy mô cơ bản hiện nay:
• Môi trường MS:
Là môi trường giàu, dinh dưỡng cân bằng, thích hợp với nhiều loại cây.
Dung dịch
Mẹ
Hóa chất Nồng độ (g/l) Số ml/lit môi trường
24
A EDTA 0,80 28
Fe
2
(SO
4
)
3
0,38
B NH
4

NO
3
82,5 20
KNO
3
95,0
C
H
3
BO
3
1,24
5
KH
2
PO
4
34,0
KI 0,166
Na
2
MoO
4.
2H
2
O 0,050
CoCl
2.
2H
2

O 0,005
MgSO
4
74,00
MnSO
4
.7 H
2
O 4,46
ZnSO
4
.7 H
2
O 1,72
CuSO
4
. 5H
2
O 0,005
E CaCl
2
. 2H
2
O 88,00 5
Thiamin. HCl 0,02
Nicotinic acid 0,10
Piridoxin. HCl 0,10
Glycine 0,40
G NAA 0,10 1
H Kinetin 0,40 0,5

Để pha 1 lit môi trường MS cần tiến hành như sau:
- Cho 800 ml nước cất vào bình dung tích 2000 ml.
- Dùng pipet hút 28 ml dung dịch A, 20 ml dung dịch B, 5 ml C, 5ml D, 5 ml E,
5 ml F, 1ml G và 0,5 ml H vào khấy đều.
- Thêm 100mg myo-inositol.
- Dùng HCl hoặc NaOH 0,1 N chỉng pH đến 6,0.
- Thêm 20g Saccharose khấy cho tan
- Thêm 6 –8 g agar đun cho tan hết, chia đều ra các bình tam giác, đậy nút
bông, giấy và khử trùng.
• Môi trường White:
Là môi trường nghèo, cách pha chế tương tự như như môi trường MS, thành
phần môi trường như trong bảng.
Dung dịch
Mẹ
Hóa chất Nồng độ (g/l) Số ml/lit môi trường
25
A
Ca(NO)
3
. 4H
2
O 3,0
100
Na
2
SO
4
2,0
KNO
3

0,80
KCl 0,65
NaH
2
PO
4
0,19
B MgSO
4.
7H
2
O 75,0 10
MnSO
4
0,50
ZnSO
4
.7H
2
O 0,30
H
3
BO
3
0,15
KI 0,075
CuSO
4.
5H
2

O 0,001
Na
2
MoO
4
0,025
D Fe
2
(SO
4
)
3
0,25 10
E Thiamine 0,01 10
Pyridoxin 0,01
4.1.2. Chọn mô và xử lý mô:
Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ còn lại tất cả các mô của thực vật đều có
thể dùng làm mô cấy. Tuy nhiên những mô đang sinh trưởng mạnh như mô phân sinh
ngọn, chóp rễ, phôi đang phát triển, mô thịt quả non, lá non, cuống hoa, .. khi đặt trong
môi trường nuôi cấy thích hợp đều có khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh thành cây
con hoàn chỉnh.
Do mô cây tiếp xúc với môi trường ngoài nên mang nhiều vi khuẩn, nấm bệnh, vì
vậy trước khi đưa vào môi trường dinh dưỡng mô phải được vô trùng. Mô được rửa nhiều
lần dưới vòi nước, sau rửa nhiều lần với nước cất vô trùng và cuối cùng là xử lý hóa chất
dịet khuẩn và nấm. Có thể xử lý mô với cồn 70% trong 30 giây trước khi xử lý hóa chất.
Các hóa chất diệt khuẩn và nấm thường dùng:
Tác nhân vô trùng Nồng độ
%
Thời gian xử lý
(phút)

Hiệu quả
Canxihypochlorit 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypochlorit 2 5 – 30 Rất tốt
Hydroperoxit 10 – 12 5 – 15 Tốt
HgCl
2
0,1 – 1,0 2 – 60 TB
4.1.3. Giai đoạn tạo chồi, tạo cây, nuôi cây
Để tạo chồi, tạo cây và nuôi cây, môi trường nuôi cấy cần có tỷ lệ kích thích sinh
trưởng thích hợp. Mỗi loại cây cụ thể có tỷ lệ kích thích sinh trưởng riêng. VD: để tạo
26