Định lượng E. Coli bằng phương pháp MPN theo TCVN 7924 – 3 – 2008

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

MỤC LỤC

1


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

1. Đặc điểm của vi khuẩn E.coli:
1.1.

Giới thiệu về vi khuẩn E.coli:
Escherichia coli do Theodore Escherich
(1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, phát
hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc họ
vi khuẩn đường ruột. Trong các loài thuộc chi này,
E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quan
trọng nhất trong y học.
E.coli là một trong những thành viên chính
của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là
căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có
những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu.
E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi
sinh học nói riêng và sinh học nói chung.
Đường tiêu hóa của chúng ta, đặc biệt là ruột già, chứa hàng tỉ vi khuẩn, với hơn 500
loài khác nhau, nhưng không phải loài nào cũng gây hại và thậm chí chúng đang bảo vệ

chúng ta khỏi sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác. Escherichia coli (còn gọi là E.
coli) là một trong những vi khuẩn ký sinh trong đường ruột và chúng ta thường không biết
sự có mặt của nó có ở đó. Theo các nhà khoa học, E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm
ưu thế nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Vi khuẩn này cần thiết
trong quá trình tiêu hóa thức ăn. Bình thường chúng không gây hại, chỉ khi bị thải ra môi
trường bằng đường phân, chúng trở nên gây độc tính và khi quay trở lại cơ thể con người
bằng đường ăn uống qua thực phẩm bị ô nhiễm chúng thường gây khó chịu và đau bụng, rối
loạn tiêu hóa. Khi bị nhiễm E.Coli sẽ gây ngộ độc cấp tính, tiêu chảy, mất nước có thể dẫn
đến tử vong nếu không can thiệp kịp thời.Vi khuẩn nguy hiểm này cũng tiềm ẩn khắp nơi:
đất, nước bị ô nhiễm (được sử dụng để rửa thực phẩm) và chúng có trong móng tay, bàn tay
của những người chế biến thực phẩm không rửa sạch tay. E.Coli là trực khuẩn (hình que) có
700 loại, thường sống ở mọi môi trường, nhiều trong ruột non, ruột già của con người và
động vật.

1.2.

Nguồn gốc và tên gọi:

2


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Năm 1885, tại München, một bác sĩ nhi khoa là Theodor Escherich . rất quan tâm đến
phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert kock về vi khuẩn Cùng với việc nghiên
cứu bệnh tiêu chảy,Escherich lưu ý tới một vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí
nghiệm lâm sàng.Vi khuẩn do Escherich phát hiện từ trong tã lót của trẻ em được công bố
với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới

chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá. Tuy nhiên, vi
khuẩn được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau
đó.Đến năm 1991, vi khuẩn được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.(viết tắt
là E. Coli ). Việt Nam E. coli còn được gọi là vi khuẩn đại tràng, hoặc trực khuẩn đại tràng.
Những chủng nguy hiểm của E.coli thường là nguyên nhân của 80% số trường hợp nhiễm
trùng đường tiết niệu, bệnh có thể hủy hoại thận, và là nguyên nhân đứng hàng thứ hai về
gây bệnh viêm màng não và nhiễm trùng máu ở trẻ sơ sinh. E.coli cũng đứng đằng sau nhiều
bệnh truyền nhiễm liên quan đến thực phẩm khi người ta phát hiện loại khuẩn này cũng có
trong nhiều sản phẩm thịt và rau củ quả tươi sống từng được bón phân. Đây cũng là loại
1.3.

khuẩn lây nhiễm rất dễ dàng giữa người với người qua đường chân-tay-miệng…
Cấu tạo của vi khuẩn E.coli:
E.coli là trực khuẩn gram âm, có hai đầu tròn, kích thước từ 0,5→3 micromet. Di
động bằng tiêu mao, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul.

3


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Đặc điểm hình thái:
Là trực khuẩn Gram âm, di động, không sinh nha bào.
Phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp

1.4.

37°C, phát triển được ở nhiệt độ từ 5-40°C, pH thích hợp là 7,0 - 7,2. Hiếu khí và kỵ khí tuỳ

tiện.
Có trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải.
Đi vào cơ thể theo phân người hoặc nhiễm vào thực phẩm.
Gây nhiễm trùng đường tiết niệu, sinh dục, nhiễm trùng đường gan - mật, nhiễm
khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm
màng não mù ở trẻ sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết.
Tính chất nuôi cấy:

1.5.

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể
phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tùy ý.Có thể
phát triển ở nhiệt độ từ 5-40 oC.Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37oC. Trong điều kiện thích
hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Cấy vào môi
trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm
đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có váng mỏng. Những ngày sau,dưới đáy ống có
thể thấy lắng cặn.E.coli không mọc trên canh thang Selenit. Trên môi trường thạch thường,
sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã cóthể quan sát được khuẩn lạc.Sau 24 giờ khuẩn
lạc có kích thước khoảng 1,5mm. Hìnhthái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp
dạng R, hoặc M. Trên môi trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu,E.coli có khuẩn lạc
màu vàng (như trên thạchlactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey). Không mọc
được trên môi trường SS. Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng
lọc nhanh,như EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton.
Phân loại:

1.6.

E.coli được chia thành 5 loại:
•
•

•
•
•
1.7.

Enteroaggreative
Enterohemorrhagic
Enteroinrasire
Enteropathogenic
Enterotoxigeni.
Tính chất hóa sinh:
Lên men nhiều đường kèm theo sinh hơi.
4


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Thử nghiệm IMViC: Dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác,
gồm có các phản ứng.
Phản ứng sinh indol (I): E. coli có indol (+).
Phản ứng đỏ metyl (M): E. coli có phản ứng đỏ metyl (+).
Phản ứng Voges Proskauer (V): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả năng sinh ra
acetyl - metyl cacbinol E.coli có phản ứng Voges Proskauer âm tính.
Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (C) E.coli phản ứng citrat âm tính.
Đặc điểm kháng nguyên và độc tố:
Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tố gây

1.8.

tan huyết và phù thủng.
Độc tố của E.coli: Loại E.coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh hơn
loại không giáp mô. Kháng nguyên K có 13 loại KA, KB, KL. Ví dụ công thức kháng
nguyên của một E.coli là: O55K5H21F5.
Nội độc tố đường ruột: Gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt. Cả hai loại này
đều gây tiêu chảy. Loại chịu nhiệt ST (Thermostable): gồm các loại STa, STb. Loại không
chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1, LT2.
Những dòng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều loại huyết thanh khác nhau
nhưng thường gặp nhất là các loại O6H16, O8H9, O78H12, O157.
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn E.coli:

1.9.

Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm theo độc tố
của chúng. E.coli gây tiêu chảy thường gặp các nhóm sau:
−

Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các type thường gặp O26:B6, O44, O55:B5,

O112:B11, O124, O125:B5, O142 là nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi.
− Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gây bệnh cho trẻ em, người lớn do tiết ra 2 độc tố
ruột ST và LT.
o LT hoạt hóa men adenyl cyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP
(cyclicadenozin 5’ monophosphat). Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl- và bicarbonat tách ra
khỏi tế bào đồng thời ức chế Na+ bên trong tế bào. Hậu quả là gây tiêu chảy mất nước.
o Độc tố ST: hoạt hóa men Guanyl Cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’
monophosphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước gây ra tiêu chảy.
Những dòng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảy trầm trọng và
kéo dài.

5


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
−

NHÓM 7

Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những E.coli này bám lên niêm mạc và làm tróc niêm
mạc gây loét niêm mạc do đó gây tiêu chảy có đàm lẫn máu (giống Shigella). Các chủng này
có thể lên men hay không lên men đường lactose và có phản ứng lysin decarboxylaza âm

−

tính. Thường gặp các type O125, O157, O144…
Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa gây tiêu chảy vừa là nguyên nhân gây
viêm đại tràng xuất huyết (hermorrhagic colilic) và làm tổn thương mao mạch gây hiện
tượng sưng phù (ederma) rất nguy hiểm đến tính mạng (do biến chứng). Nhóm VETEC bao
gồm các type: O26, O11, O113, O145, O157 ; đây là ngoại độc tố vetec gây tiêu chảy. Các biến
chứng trên do vi khuẩn tiết ra một trong 2 loại ngoại độc tố VT1 (verocytoxin) và VT2 gây
tác động thần kinh.
Gần đây người ta phát hiện chủng E.coli mới ký hiệu là E.coli O157:H7. Chủng này
đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gần đây (theo CDC, Center
for Disease Control and prevention của Mỹ) :
Năm 1982, lần đầu tiên người ta ghi nhận được nguồn bệnh do E.coli O157:H7. Năm
1985, người ta nhận thấy triệu chứng hoại huyết có liên quan đến chủng O157:H7. Năm
1990, bùng nổ trận dịch từ nguồn nước nhiễm chủng E.coli O157:H7. Năm 1996, xảy ra trận
dịch khá phức tạp ở Nhật Bản do uống nước táo chưa diệt khuẩn.
2. Tình hình ngộ độc E.coli hiện nay:

− Theo thống kê ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam: Mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500

vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 – 200 ca tử vong.
− Bộ Y tế 30/6/2014: Toàn quốc ghi nhận có 90 vụ ngộ độc thực phẩm với 2636 người mắc,
−

2035 người đi viện và 28 trường hợp tử vong.
Nguyên nhân ngộ độc là do vi sinh vật, độc tố tự nhiên là 27 vụ (30%) và hóa chất.
Trong đó: Một trong những loại ngộc độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường

gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli.
 Một số vụ tiêu biểu trong năm 2014:
• 1/06/2014: 170 công nhân Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nienhsing có biều hiện đau bụng,
buồn nôn, phải nhập viên sau bữa trưa tại công ty. Kết quả điều tra, xử lý chi cục An toàn vệ
sinh thực phẩm tỉnh Thái Bình xác định nguyên nhân khiến số công nhân trên phải nhập viện
là do ăn phải những suất cơm nhiễm vi khuẩn E.coli và Coliforms.
• 24/09/2014: Vụ 114 người bị ngộ độc thực phẩm ở Gia Lai: Thịt bò nhiễm E.coli vượt quá
giới hạn. Kết quả xét nghiệm phát hiện mẫu nước nhiễm E.coli là 100 coliforms/100ml cao
6


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

gấp 100 lần giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Mẫu thịt bò có chỉ số E.coli/g là 6,68.10 5 cao
hơn giới hạn cho phép là 5.103.

Hình 1.

Hình minh

họa ngộ

độc thực

phẩm

7


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Các phương pháp phát hiện E. Coli:
Phương pháp truyền thống:
• Đinh lương E. Coli bằng phương pháp MPN
3.

3.1.

Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất) còn được gọi là phương
pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Hai hệ thống MPN
- Hệ thống 9 ống
- Hệ thống 15 ống
•

Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Dùng để xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu

 Ưu điểm:

Xác định được những tế bào sống
Định lượng chọn lọc số VSV
Có thể xác định VSV ở mật độ thấp

 Nhược điểm: Quy trình phức tạp, sử dụng nhiều dụng cụ, tốn thởi gian.
• Phương pháp màng lọc:

Thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi thử nghiệm
môi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp.
 Ưu điểm:
Xác định được mật độ VSV cụ thể trong một thể tích mẫu lớn
 Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn

8


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
3.2.

NHÓM 7

Phương pháp hiện đại:
Phương pháp PCR
Là một phương pháp để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự DNA ban đầu,
khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hang triệu bảng sao nhờ hoạt động
của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này.

 Ưu điểm

Thời gian cho kết quả nhanh
Nhận diện những VSV khó nuôi cấy
Hóa chất có sẵn, dễ tồn trữ
Ít tốn kém về mặt nhân sự

 Nhược điểm

Thực phẩm chứa chất ức chế, mật độ VSV thấp
Không phân biệt được tế bào sống và chết

Phương pháp ELISA
Là một kĩ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu xét
nghiệm.
 Ưu điểm

Độ nhạy cao
Cho kết quả nhanh

 Nhược điểm
3.3.

Không phân biệt được tế bào sống và chết

Phương pháp khác:
• Kỹ thuật màng Petrifilm
Đây là một phương pháp thử nhanh VSV trong thực phẩm
 Nguyên tắc

Phương pháp sử dụng đĩa cấy vi sinh môi trường khan và gel ẩm nước hòa tan. Mẫu
kiểm tra pha loãng đã được thêm vào đĩa với 1 tỉ lệ là 1ml/đĩa. Ấn miếng trải bằng nhựa đặt
lên tấm film, trải mẫu đều khắp diện tích 20cm2 . Chất làm đông làm đĩa được đông lại, đĩa
được ủ và sau đó đếm khuẩn lạc. Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ sự tang trưởng của vi sinh
vật trong thời gian ủ và số khuẩn lạc có thể đếm trực tiếp.
 Ưu điểm:

Dễ thao tác, cho kết quả nhanh chóng trong 24h
Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản
Thời hạn dùng lâu, không cần phương pháp khử trùng môi trường

9


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Định lượng E. Coli bằng phương pháp MPN theo TCVN 7924 – 3 – 2008
Phạm vi áp dụng:
4.

4.1.

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính
β-glucuronidaza bằng kỹ thuật cấy trong môi trường lỏng và tính số có xác suất lớn nhất
(MPN) sau khi được ủ ở 37ºC rồi ủ tiếp ở 44ºC.
Tiêu chuẩn có thể áp dụng cho:
−
−

Các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi
Các mẫu môi trường trong khu vực chế biến thực phẩm và vận chuyển thực phẩm.
Phương pháp này thích hợp để định lượng các tế bào Escherichia coli mà có thể đã

trải giai đoạn làm mất nước, đông lạnh, tiếp xúc với môi trường mặn (như nước biển) hoặc
bị hư hại do các chất tẩy rửa như các sản phẩm chứa clo.
CẢNH BÁO: Một số chủng Escherichia coli không phát triển được ở 44ºC và cụ
thể là các Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza như Escherichia coli O157 và một
số chủng E.coli gây bệnh khác bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này sẽ
không phát hiện được.
4.2.

Nguyên tắc:
Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một
lượng xác định của huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống
nghiệm1) chứa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép.
Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một
lượng xác định của huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống
nghiệm1) chưa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ đơn.
Sau đó, cấy các lượng xác định của các dung dịch mẫu thử pha loãng thập phân hoặc
huyền phù ban đầu vào môi trường tăng sinh lỏng nồng độ đơn trong cùng điều kiện trên.
Nuôi ấm các ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép và nồng độ đơn ở 37ºC trong
24 giờ. Kiểm tra các ống này về sự sinh axit và cho thấy lên men lactoza.
Từ mỗi ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc cho thấy có tạo thành axit sẽ được
cấy truyền vào môi trường thạch trypton-mật-glucuronid.

10

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Thạch trypton-mật-glucuronid được ủ ở 44ºC trong khoảng từ 20 giờ đến 24 giờ. Xác
định trên môi trường thạch trypton-mật-glucuronid sự có mặt các khuẩn lạc màu xanh hoặc
màu xanh da trời, chứng tỏ có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.
Số có xác xuất lớn nhất Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza [xem TCVN
6404 (ISO 7218)] được xác định theo số ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc được cấy
truyền có sinh các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời trên thạch mật glucuronid.
4.3.

Bảng chuẩn bị thí nghiệm:
stt

4.4.

Dụng cụ, thiết bị

Ghi chú

1

Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc
khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

2

Tủ ấm

3

Tủ sấy hoặc buồng sấy thông
gió, hoặc tủ thổi không khí.

4

Tủ lạnh

5

Máy đo pH

6

Đĩa Petri

Đường kính khoảng 90 mm.

7

Ống nghiệm

Có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và
18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm.

8

Pipet xả hết

Có dung tích danh định 1 ml và 10 ml,
được chia vạch 0,1 ml

9

Vòng lấy mẫu

Bằng platin/iridi hoặc niken/crom, đường
kính khoảng 3 mm, hoặc các vòng lấy mẫu
vô trùng sử dụng một lần dung tích 10 µl.

Có thể duy trì nhiệt độ ở 37ºC ± 1ºC và
44ºC ± 1ºC
Có thể duy trì được nhiệt độ từ 25ºC ± 1ºC
đến 50ºC ± 1ºC
Dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị,
có thể duy trì nhiệt độ ở 5ºC ± 3ºC.
Có độ phân giải 0,01 đơn vị pH, có độ
chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25ºC.
Máy đo pH có thể được gắn với hệ thống
cân bằng nhiệt tự động hoặc bằng tay

Môi trường nuôi cấy:
• Môi trường glutamate khoáng cải biến (môi trường tăng sinh chọn lọc)
Thành phần:
a) Môi trường b) Môi trường
nồng độ kép

nồng độ đơn
11

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Natri glutamat

12,7 g

6,35 g

Lactoza

20,0 g

10,0 g

Natri focmat

0,5 g

0,25 g

L-xystin

0,04 g

0,02 g

L-(-)-axit aspactic

0,048 g

0,024 g

L(+)-arginin

0,04 g

0,02 g

Thiamin

0,002 g

0,001 g

Axit nicotinic

0,002 g

0,001 g

Axit pantothenic

0,002 g

0,001 g

Magie sunfat ngậm bảy phân tử nước

0,2 g

0,1 g

(MgSO4.7H2O)

0,02 g

0,01 g

Sắt (III) amoni xytrat

0,02 g

0,01 g

Canxi clorua ngậm hai phân tử nước (CaCl2.2H2O)

1,8 g

0,9 g

Dikali hydro phosphat (K2HPO4)

0,02 g

0,01 g

Bromocresol tía

5,0 g

2,5 g

1000 ml

1000 ml

Amoni clorua
Nước
Mục đích của từng thành phần trong môi trường:
−
−
−
−
−
−

Natri Glutamat , natri focmat: các chất dinh dưỡng cơ bản
Lactoza: nguồn đường để E. Coli lên men
Ion Mg2+ , các vitamin (như acid nicotinic, acid pantothenic), axit amin (như L-xystin,
L-(-)-axit aspactic, L(+)-arginin, Thiamin : giúp tăng tỳ lệ lên men
Phosphate: kiểm soát pH trong quá trình lên men của lactoza.
Amoni clorua: hỗ trợ quá trính sinh hơi
Chuẩn bị môi trường:
Hòa tan amoni clorua trong nước. Bổ sung các thành phần, hoặc môi trường hoàn

chỉnh khô còn lại, đun nóng nếu cần.

Để tăng thời gian bảo quản của môi trường khô, có thể thêm natri glutamat một cách
riêng rẽ.
Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,7 ± 0,1 ở 25ºC.
12


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Phân phối môi trường này theo từng lượng 10 ml vào các ống nghiệm có kích thước
16 mm x 160 mm (6.6) trong trường hợp môi trường nồng độ đơn và phân phối vào các ống
nghiệm có kích thước 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm (6.6) trong trường hợp môi
trường nồng độ kép.
Khử trùng 10 min ở nhiệt độ 116ºC trong nồi hấp áp lực (6.1). Cách khác có thể đun
nóng ở 100ºC trong 30 min trong ba ngày liên tiếp.
•

Môi trường thạch trypton-mật-glucuronid (môi trường chọn lọc thứ hai)
Thành phần:

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym
Muối mật No.3
Axit-5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid
(BCIG)
Dimetyl sulfoxit (DMSO)b
Thạch

20,0 g
1,5 g

114 µmola
3 ml
9 g tới 18 g c
1000 ml

Nước
a
Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni
b

Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải. Cần sử dụng trong tủ hút khói.

Vì độc tính đó nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng.
c

Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

Mục đích của từng thành phần trong môi trường:
−
−

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzyme: cung cấp chất dinh dưỡng
Muối mật No.3: tinh thể màu tím ức chế VSV gram (+) nhưng cho phép trực khuẩn

−

gram (-) phát triển.
Dimetyl sulfoxit (DMSO): ức chế VSV gram (+) nhưng cho phép trực khuẩn gram (-)

phát triển.

− Axit-5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG): là một chất nền tạo nên sự
hình thành sắc tố. Hầu hết các E. Coli dương tính -glucuronidaza sẽ phân cắt BCIG
tạo các khuẩn lạc màu xanh theo cơ chế:
13


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

−
−

NHÓM 7

Thạch: chất làm rắn môi trường
Nước: thành phần cần thiết cho sự phát triển của VSV, dung m6oi hòa tan các chất
trong môi trường
Chuẩn bị môi trường:
Hòa tan BCIG trong dimetyl sulfoxit. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước

và đun đến sôi.
Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25ºC, nếu cần.
Khử trùng môi trường 15 min ở nhiệt độ 121ºC trong nồi hấp áp lực.

14


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
4.5.

NHÓM 7

Quy trình phân tích:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng và
nôi trường.
Chuẩn bị mẫu thử:
• Đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng rồi cân chính xác 10g/25g
• Đối với mẫu lỏng hút 10ml/25ml
 Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo … Cân 10g (hoặc 25g) mẫu cho vào cối sứ

nghiền nát, sau đó cho vào túi nylon (PE) vô trùng hoặc bình erlen dung tích 200ml đã có
sẵn bi thủy tinh và 90ml (hoặc 225ml) dung dịch pha loãng đã tiệt trùng. Lắc đều, để lắng
cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng .
 Đối với sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… Cân 10g (hoặc 25g) mẫu (cả cái lẫn
nước) cho vào túi dập để dập mẫu. Thêm 90ml (hoặc 225ml) dung dịch pha loãng vô trùng
vào túi dập mẫu chứa mẫu, lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha
loãng .
 Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… có thể hút trực tiếp mẫu
hoặc pha loãng tùy theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10ml mẫu cho vào túi dập mẫu,
thêm 90ml dung dịch pha loãng vô trùng vào túi dập mẫu chứa mẫu, lắc đều, ta có độ pha
loãng .
 Đối với các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE, đặt vào khay tráng
men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để ra đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, hoặc giải
đông ở 2 - 5oC trong 18 giờ; hoặc 45oC trong 15 phút nếu cần (liên tục lắc bình chứa mẫu
nếu có thể để tăng tốc độ giải đông)
 Có thể dung máy dập mẫu (Stomacher) để xử lý mẫu rắn
 Dung dịch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1% nước đệm photphat, nước muối
sinh lý (0.85%) trong buffer nếu cần.
 Đối với mẫu đổ hộp: phải kiểm tra dạng bên ngoài xem hộp có bị phồng không, biến dạng,
bị hở các mối ghép không? Ghi lại các nhận xét trên. Lau chùi bằng cồn phía ngoài, đưa
vào phòng vô trùng để kiểm tra. Chú ý chỉ kiểm cha các hộp hồng có yêu cầu.

Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín của
bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm nghiệm.
Dung dịch pha loãng ban đầu:

15


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Huyền phù, dung dịch hoặc nhũ tương thu được sau khi cân hoặc đong một lượng sản
phẩm cần kiểm tra (hoặc mẫu thử được chuẩn bị từ sản phẩm) đã được trộn với một lượng
dung dịch pha loãng lớn gấp chín lần, nếu cần, sử dụng máy trộn và chú ý để cho các hạt to
lắng xuống, nếu có.
Các huyền phù, dung dịch hoặc nhũ tương thu được bằng cách trộn một thể tích xác
định của dung dịch pha loãng ban đầu với thể tích dung dịch pha loãng lớn gấp chín lần và
bằng cách lặp lại các thao tác này với các độ pha loãng tiếp theo đã chuẩn bị cho đến khi thu
được các dãy dung dịch pha loãng thập phân thích hợp để cấy vào môi trường.
Dung dịch pha loãng:
Trong quá trình phân tích chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất
hoặc nước đã khử ion vô trùng, trừ khi có các quy định khác
Có thể tham khảo thêm các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên
quan đến sản phẩm cần xác định.

Pha đủ số lượng các độ pha loãng để đảm bảo rằng tất cả các ống nghiệm ứng với độ
pha loãng cuối cùng cho kết quả âm tính.
Bước 2: Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc
Về nguyên tắc chung, theo quy trình cần ba ống cho mỗi độ pha loãng. Đối với động
vật nhuyễn thể có vỏ tươi sống hoặc các sản phẩm đặc biệt khác và/hoặc khi yêu cầu độ

chính xác cao hơn của kết quả thì cần cấy năm ống cho mỗi độ pha loãng.
Nếu ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép. Dùng pipet vô
trùng cho vào mỗi ống 10 ml mẫu thử ở dạng lỏng, hoặc 10 ml huyền phù ban đầu trong
trường hợp mẫu thử ở dạng khác.
Nếu ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ hơn. Dùng một pipet
vô trùng mới cho vào mỗi ống 1 ml mẫu thử ở dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu
(dung dịch pha loãng đầu tiên) khi mẫu thử ở dạng khác.

16


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Bước 3: Ủ ấm
Ủ các ống nghiệm chứa môi trường chọn lọc nồng độ kép đã cấy và các ống chứa môi
trường chọn lọc nồng độ đơn đã cấy trong tủ ấm ở 37ºC trong 24 giờ ± 2 giờ.

17


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Bước 4: Cấy truyền
Từ mỗi ống đã ủ theo cho thấy có axit, có màu vàng, thì cấy truyền vào đĩa thạch
trypton mật glucuronid và ria cấy để thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ.

18


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Bước 5: Ủ
lần

hai
Ủ các đĩa đã

cấy

theo từ 20

giờ

đến 24 giờ

trong

tủ ấm ở

44ºC.

Không

chồng

cao quá ba

đĩa.
Bước 6:
Kiểm

tra các đĩa
Sau thời gian

ủ quy

định, kiểm

tra các

đĩa về sự có

mặt

các khuẩn

lạc có

màu tối hoặc

màu

xanh nhạt

hoặc màu xanh da trời, điều này chứng tỏ rằng có mặt Escherichia coli dương tính βglucuronidaza.

19


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

20


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

Bước 7: Kết quả
Các ống chứa môi trường tăng sinh nồng độ đơn hoặc nồng độ kép được ủ, sau khi
cấy truyền và ủ lần hai cho thấy có các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời trên môi
trường thạch chọn lọc được coi là ống dương tính.
Đếm số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN.

21


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

NHÓM 7

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7924-3 : 2008 (ISO/TS 16649-3 : 2005) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi – phương pháp định lượng escherichia coli dương tính β-glucuronidaza – phần 3:
kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl β-d-glucuronid
[2] Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm ,Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm
TP.HCM, 2014.

22