Nghiên cứu điều kiện thuỷ phân tinh bột sắn để sản xuất polymaltose de 30 bằng phương pháp enzyme

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề Tài
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN TINH BỘT SẮN ĐỂ SẢN
XUẤT POLYMALTOSE DE 30 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME
Người hướng dẫn:

TH.S VŨ THỊ THUẬN

Sinh viên thực hiện:

NGÔ THỊ TRANG

Lớp:

1203

Hà Nội – 2016


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề Tài
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN TINH BỘT SẮN ĐỂ SẢN
XUẤT POLYMALTOSE DE 30 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME

Người hướng dẫn:

TH.S VŨ THỊ THUẬN

Sinh viên thực hiện:

NGÔ THỊ TRANG

Lớp:

1203

Hà Nội – 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm
ơn các thầy cô giáo cùng toàn thể cán bộ khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở
Hà Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo tận tình trong thời gian học tập tại trường, nơi trang bị kiến
thức giúp tôi bước vào cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới Ths. Vũ Thị Thuận, chủ nhiệm bộ môn
công nghệ đường bột- Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt
cho tôi những kinh nghiệm về chuyên môn và luôn giúp đỡ, động viên tinh thần cho
tôi. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các anh chị cán bộ trong phòng thí nghiệm đã
tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thiện luận văn này.
Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã
luôn động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình.
Do thời gian và trình độ hạn chế, không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất
mong được sự chỉ bảo và giúp đỡ của các thầy cô.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Ngô Thị Trang


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ POLYMALTOSE .................................................................... 3
1.1.1. Cấu tạo và tính chất.............................................................................................. 3
1.1.2. Ứng dụng của polymaltose .................................................................................. 4
1.1.2.1. Ứng dụng trong dược phẩm ......................................................................... 4
1.1.2.2. Ứng dụng trong thực phẩm ......................................................................... 5
1.2. TINH BỘT- NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT POLYMALTOSE .................... 5
1.2.1. Giới thiệu về tinh bột ........................................................................................... 5
1.2.2. Tinh bột sắn.......................................................................................................... 7
1.2.2.1. Cấu tạo và tính chất của tinh bột sắn ........................................................... 7
1.2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ................................................................ 7
1.3. ENZYM SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT POLYMALTOSE ........................... 8
1.3.1. Quá trình dịch hóa tinh bột bằng enzym α- amylase ........................................... 9
1.3.1.1. Giới thiệu enzym α- amylase và nguồn sinh tổng hợp ................................. 9
1.3.1.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym α- amylase. ..................................... 10
1.3.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới enzym α- amylase [5,9]..................................... 10
1.3.1.4. Giới thiệu một số enzym dịch hóa. ............................................................. 13
1.3.2. Quá trình đường hóa tinh bột bằng enzym pullulanase ..................................... 14
1.3.2.1 Giới thiệu enzym pullulanase và nguồn sinh tổng hợp ............................... 14
1.3.2.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym pullulanase ..................................... 16
1.3.2.3. Giới thiệu một số chế phẩm enzym pullulanase ......................................... 16
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 17

2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT ............................................................................. 17
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 17
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................. 17
2.1.3. Thiết bị ............................................................................................................... 17


2.2 PHƯƠNG PHÁP .................................................................................................... 17
2.2.1. Phương pháp phân tích ...................................................................................... 17
2.2.1.1. Xác định nồng độ chất khô bằng chiết quang kế ........................................ 17
2.2.1.2. Xác định pH bằng máy đo pH .................................................................... 18
2.2.1.3. Xác định nồng độ dịch bột bằng brome kế ................................................. 18
2.2.1.4. Xác định độ nhớt của dịch thủy phân bằng máy đo độ nhớt ...................... 18
2.2.1.5. Xác định độ ẩm của tinh bột sắn bằng máy sấy hồng ngoại ...................... 18
2.2.1.6. Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp Béc-tơ-răng .................. 18
2.2.1.7. Xác định hàm lượng đường khử (DE) theo phương pháp phân tích LaneEynon ........................................................................................................................ 19
2.2.1.8. Xác định một số đường glucose, maltose bằng phương pháp sắc kí lỏng
cao áp (HPLC) ......................................................................................................... 21
2.2.2. Phương pháp công nghệ ..................................................................................... 21
2.2.2.1. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình dịch hóa tinh bột ........ 21
2.2.2.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình đường hóa tinh bột ..... 21
2.2.2.3. Xây dựng quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn để sản xuất
polymaltose DE 30 ................................................................................................... 21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................... 22
3.1. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN DỊCH HÓA TINH BỘT LÀM NGUYÊN LIỆU
PHÙ HỢP CHO QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA TẠO POLYMALTOSE DE 30 .... 22
3.1.1. Lựa chọn enzyme dịch hóa thích hợp cho quá trình sản xuất polymaltose ....... 22
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của mức độ thủy phân tinh bột trong quá trình dịch
hóa đến quá trình đường hóa tạo polymaltose DE 30 ............................................ 23
3.1.3. Xác định nồng độ enzyme thích hợp trong quá trình dịch hóa tạo DE 10......... 25
3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ dịch bột đến quá trình dịch hóa tạo DE 10................. 26

3.1.5. Ảnh hưởng của thời gian dịch hóa tinh bột sắn tạo dịch có DE 10 .................. 27
3.1.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình dịch hóa ................................ 28
3.1.7. Xác định ảnh hưởng của pH tới quá trình dịch hóa ........................................... 29


3.2. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ĐƯỜNG HÓA THÍCH HỢP ĐỂ TẠO
POLYMALTOSE DE 30 ............................................................................................. 30
3.2.1. Lựa chọn enzyme thích hợp cho quá đường hóa tạo tạo polymaltose. .............. 30
3.2.2. Xác định nồng độ enzyme promozyme D2 thích hợp trong quá trình đường hóa
tạo polymaltose DE 30................................................................................................ 31
3.2.3. Xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình đường hoá .......................... 32
3.2.4. Nghiên cứu điều kiện pH thích hợp cho quá trình đường hoá ........................... 34
3.2.5. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình đường hóa....................................... 35
3.2.6. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình đường hoá ..................................... 36
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG DỊCH POLYMALTOSE.............. 38
3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ THỦY PHÂN TINH BỘT SẮN
TẠO DỊCH POLYMALTOSE CÓ DE 30. ................................................................ 39
3.4.1. Quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE 30 ........ 40
3.4.2. Thuyết minh sơ đồ quy trình công nghệ ............................................................ 40
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 42


NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

Arg

Arginine

cP (CentiPoise)

Đơn vị đo độ nhớt

Da (Dalton)

Đơn vị trọng lượng phân tử

DE (Dextrose Equivalent)

Số đương lượng đường khử quy ra glucose

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

HPLC (High performance

Sắc kí lỏng cao áp

liquid chromatography)
IPC

Phức hợp sắt-polymaltose

KNU/g

Đơn vị đo hoạt lực enzyme

TB

Tinh bột

Trp

Tryptophan

Tyr

Tyrosine


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số tính chất của enzyme pullulanase ...... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mỗi loại enzyme đến kết quả dịch hóa.................................22
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của DE dịch hóa đến quá trình đường hóa tạo polymaltose.......24
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình dịch hóa .............................. 25
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa .............................. 26
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian dịch hóa đến chất lượng dịch hóa ......................... 27
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ dịch hóa đến chất lượng dịch hóa .......................... 28
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa .................................................... 29
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của enzyme đường hóa đến quá trình đường hóa ....................... 30
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ Promozyme D2 đến quá trình đường hoá .............. 31
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất trong quá trình đường hóa ....................... 33
Bảng 3.11. Xác định pH thích hợp cho quá trình đường hóa ........................................ 34
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình đường hóa ...................................... 36
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình đường hóa ..................................... 37
Bảng 3.14. Kết quả phân tích chất lượng dịch polymaltose .......................................... 38

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1.Cấu tạo polymaltose ......................................................................................... 3

Hình 1.2. Cấu tạo của Amylose ....................................................................................... 6
Hình 1.3. Cấu tạo của Amylopectin ................................................................................. 6
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose DE
30....................................................................................................................................40


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

MỞ ĐẦU
Tinh bột là nguồn nguyên liệu dồi dào chứa trong các loại rau, củ, quả và ngũ
cốc, có vai trò quan trọng trong việc cung cấp các dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể.
Ngoài ra tinh bột còn được sử dụng làm nguyên liệu chính trong các ngành công
nghiệp như: thực phẩm, dược phẩm, dệt. Một trong những loại nguyên liệu được sử
dụng phổ biến nhất là tinh bột sắn. Hiện nay, cây sắn đang được dần chuyển đổi từ cây
lương thực thực phẩm sang cây công nghiệp có lợi thế cạnh tranh cao, nhờ đó sản
lượng tinh bột sắn mỗi năm ngày càng tăng. Sản lượng lớn, giá thành rẻ so với các loại
tinh bột khác tinh bột sắn dần khẳng định vị thế của mình trở thành nguồn nguyên liệu
chính trong sản suất công nghiệp. Ngoài ra, tinh bột sắn còn được biết đến là nguồn
nguyên liệu sản xuất polymaltose để ứng dụng trong tạo phức sắt- polymaltose (IPC).
Phức sắt- polymaltose có khả năng chữa bệnh thiếu máu - căn bệnh đang được quan
tâm hàng đầu trên thế giới. Thiếu máu do thiếu sắt là căn bệnh khá phổ biến ở trẻ em
và phụ nữ mang thai, thiếu máu làm ảnh hưởng đến các chức năng như hệ miễn dịch,
hệ thần kinh, suy giảm nhận thức…. Phức sắt- polymaltose được giới chuyên gia trên
Thế Giới đánh giá rất cao do khả năng hấp thu tốt và độ an toàn của chúng, nó đã được
sản xuất rộng rãi trên quy mô công nghiệp tại nhiều quốc gia. Ở Việt Nam, phức sắtpolymaltose (IPC) hầu hết là hàng nhập khẩu do nguồn nguyên liệu sản xuất IPC chưa
được nghiên cứu và sản xuất. Vì vậy việc nghiên cứu và sản xuất polymaltose để ứng
dụng trong sản xuất phức sắt- polymaltose - bào chế thuốc chống thiếu máu phục vụ
nhu cầu trong nước là vấn đề rất cần thiết mang tính khoa học và thực tiễn cao.

Polymalose là sản phẩm thủy phân từ tinh bột, dễ tan trong nước, có cấu trúc
polyme mạch thẳng bao gồm các phân tử D-glucose liên kết với nhau, có công thức cấu
tạo (C6H10O5)n với khối lượng phân tử dao dộng tương đối lớn khoảng 25000- 32000
Dalton, gồm từ 3- 20 gốc glucose liên kết với nhau chủ yếu là liên kết α-1,4 glucoside.
Polymaltose được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chế biến dược
phẩm và thực phẩm. Để tổng hợp các phức sắt- polymaltose (IPC) đạt được hiệu quả
và chất lượng cao thì nguồn nguyên liệu polymaltose phải có giá trị DE thích hợp cho
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

quá trình tạo phức. Đây là một phần nghiên cứu thuộc đề tài cấp nhà nước của Viện
Công nghiệp Thực phẩm. Theo nghiên cứu này, polymaltose có mức độ thủy phân phù
hợp nhất là DE 30. Với DE 30, polymaltose cho hiệu suất gắn kết và hiệu suất thu hồi
trong quá trình tạo phức IPC đạt kết quả tốt nhất.
Để chủ động nguồn nguyên liệu polymaltose trong sản xuất phức sắtpolymaltose (IPC) và tránh phụ thuộc vào việc nhập khẩu thì việc nghiên cứu công
nghệ sản xuất polymaltose DE 30 là rất cần thiết. Quá trình sản xuất polymaltose DE
30 bao gồm quá trình thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose và quá trình thu hồi
sản phẩm polymaltose dạng bột. Nhưng do thời gian thực tập có hạn nên chúng tôi chỉ
đặt vấn đề:
“Nghiên cứu điều kiện thủy phân tinh bột sắn để sản xuất polymaltose DE 30 bằng
phương pháp enzym”
Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu được điều kiện thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose bằng
phương pháp enzyme đạt chất lượng DE 30, glucose (G1)

maltose oligomers (G

3)

3%, maltose (G2)

15%,

80%.

Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu các điều kiện dịch hóa tinh bột làm nguyên liệu phù hợp cho
quá trình đường hóa tạo dịch polymaltose DE 30.
Nghiên cứu các điều kiện đường hóa tạo dịch polymaltose DE 30.
Xây dựng quy trình công nghệ thủy phân tinh bột sắn tạo dịch polymaltose
DE 30.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ POLYMALTOSE
1.1.1. Cấu tạo và tính chất
Polymaltose là sản phẩm thủy phân bằng tinh bột, có cấu trúc polyme mạch

thẳng bao gồm các phân tử D-glucose liên kết với nhau, có công thức cấu tạo:
(C6H10O5)n với khối lượng phân tử dao động tương đối lớn từ 25000-32000 Dalton,
gồm từ 3-20 gốc glucose liên kết với nhau chủ yếu bằng liên kết α-1,4 glucoside [36].

Hình 1.1. Cấu tạo polymaltose (liên kết α-1,4 glucoside, n=1-18)
Polymaltose là một dạng của maltoolygosaccharide, nó được sản xuất từ tinh bột
sắn với sự tham gia của vi sinh vật và được ứng dụng nhiều trong thực phẩm và dược
phẩm bởi các tính chất sau [9,26,34]:
• Độ ngọt thấp chỉ bằng 30% so với đường saccharose dung dịch 10% ở nhiệt
độ 250C, do đó có thể thay thế đường saccharose trong các thực phẩm để
giảm độ ngọt sản phẩm mà không ảnh hưởng đến hương vị sẵn có của sản
phẩm.
• Tác dụng chống táo bón.
• Đặc biệt, polymaltose là một dạng polysaccharide mạch thẳng nên có khả
năng liên kết với phức sắt để tạo phức IPC rất tốt.
• Polymaltose có thể được hấp thu từ từ trong máu cung cấp năng lượng cho
cơ thể một cách đều đều, giữ ổn định đường trong máu trong thời gian dài.
• Được dùng để căn chỉnh kích thước màng, ổn định các tính chất của các sản
phẩm thực phẩm và nguyên liệu.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

• Độ tan giảm theo nồng độ dịch, polymaltose có khả năng hút ẩm rất cao và

độ nhớt trung bình. Chính vì vậy, polymaltose có khả năng duy trì độ ẩm
cao, giữ được độ ẩm phù hợp trong thực phẩm đặc biệt là các loại bánh tươi.
Khi bổ sung vào thực phẩm, đồ uống polymaltose là tác nhân gây kìm hãm
thành phần máu, vì nó thay thế một phần glucose nên hàm lượng glucose thấp. Ngoài
ra sẽ ngăn cản sự kết tinh của đường saccharose và bảo vệ cấu trúc của sản phẩm trong
thời gian bảo quản.
1.1.2. Ứng dụng của polymaltose
Polymaltose có khả năng giữ ẩm tốt và hạn chế kết tinh, làm giảm hiện tượng
thoái hóa bằng cách ức chế quá trình tái cấu trúc chuỗi amylose và amylopectin cùng sự
liên kết giữa tinh bột- gluten. Sản phẩm có thể ở dạng bột màu trắng hoặc dạng dung
dịch đậm đặc. Polymaltose được thừa nhận là một chất phụ gia cho thực phẩm và dược
phẩm an toàn cho người dùng trực tiếp. Polymaltose được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực chế biến thực phẩm và dược phẩm [6].
1.1.2.1. Ứng dụng trong dược phẩm
Polymaltose là một dạng polysaccharide mạch thẳng nên có khả năng liên kết
với phức sắt để tạo phức IPC rất tốt, tan trong nước, đáp ứng được các yêu cầu chữa các
bệnh có độc tính thấp, dễ kết hợp với máu và có độ ổn định cao. Phức sắt-polymaltose
đã được sử dụng làm thuốc chống thiếu máu cả ở dạng viên nén và dạng dung dịch,
được ghi nhận là hiệu quả trong việc tăng nồng độ hemoglobin trong máu [3,11].
Thiếu máu do sắt là hội chứng thiếu máu thường gặp nhất. Thiếu máu khiến cơ
thể mệt mỏi, giảm khả năng lao động, suy giảm khả năng phát triển thể chất và tư duy.
Người ta nhận thấy rằng hầu hết các trường hợp thiếu máu do thiếu sắt đều có thể điều
trị bằng cách bổ sung sắt hàng ngày dưới dạng thuốc hoặc thực phẩm giàu sắt. Nhiều
loại thuốc chứa sắt điều trị thiếu máu đã được sản xuất trên thế giới bao gồm cả sắt vô
cơ và sắt hữu cơ hóa trị II hoặc III. Tuy nhiên, với liều lượng cao, sắt tồn tại ở trạng thái
ion dễ gây các hiệu ứng phụ có hại như rối loạn đường ruột, ngộ độc sắt, biến màu men
răng,… Nhược điểm này có thể khắc phục bằng cách ổn định các nhân tố sắt oxi-

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

hidroxide (FeOOH) không ion kích thước nano bằng các tác nhân tạo phức tan trong
nước đó là phức sắt- polymaltose (IPC) [3,17,19,28].
Ngoài ra polymaltose còn được sử dụng làm tá dược đóng viên nén được sử bổ
sung vào các thực phẩm chức năng, thực phẩm ăn kiêng, thuốc bổ,… làm cho người
bệnh hấp thu tốt hơn, đối với người bệnh tiêu đường thì giúp cho đường máu ổn định
hơn [11].
1.1.2.2. Ứng dụng trong thực phẩm
Trong công nghiệp bánh kẹo, polymaltose được sử dụng trong sản xuất kẹo ngọt,
các món tráng miệng, kẹo mềm, bánh ngọt, bánh nướng, kem bơ,...[7,26].
Trong công nghiệp đồ uống, polymaltose được sử dụng làm chất độn tạo viên,
đặc biệt là đồ uống cho trẻ em, đồ uống và thức ăn nhanh dành riêng cho vận động viên
thể thao, làm kẹo gum mềm, làm chất trợ sấy, chất giữ hương yếu tố tạo hình [6,26].
Sản phẩm còn được sử dụng làm chất kết dính, kẹo gum, làm dịu hương, chất
tăng vị cho đồ uống, sử dụng thay thế glucose và saccharose, đưa vào thành phần bơ,
sữa bột, cà phê hòa tan,...[26,34].
1.2. TINH BỘT- NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT POLYMALTOSE
Nguồn nguyên liệu sản xuất polymaltose là tinh bột. Tinh bột chứa phần lớn
trong các nguyên liệu củ và hạt ngũ cốc. Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một
thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều
loài động vật khác. Các nguyên liệu khác nhau thì thành phần tinh bột trong đó cũng
khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm nguồn nguyên liệu tinh bột: trong sắn chiếm 95%,
khoai lang chiếm 81%, lúa, gạo, ngô chiếm 35-70%, khoai tây chiếm 18%,...[1].
1.2.1. Giới thiệu về tinh bột

Tinh bột là polysaccharide chủ yếu trong các hạt, củ, thân cây và lá cây. Tinh
bột cũng có nhiều ở các loại củ như sắn, khoai tây, củ mài. Một lượng đáng kể tinh bột
cũng có trong các loại quả như chuối và nhiều loại rau. Tinh bột được thực vật tạo ra
trong tự nhiên trong các quả, củ như ngũ cốc do đó các loại lương thực này được coi là
nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất tinh bột. Hình dạng và thành phần hóa học của
tinh bột phụ thuộc vào giống cây, điều kiện trồng trọt,… Tinh bột không phải là một
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

chất riêng biệt, nó bao gồm hai cấu tử amylose và amylopectin. Hai chất này khác hẳn
nhau về tính chất lí học và hóa học. Dựa vào sự khác nhau đó có thể phân chia được hai
thành phần trên để điều chế dưới dạnh tinh khiết [1,2].
Tinh bột có trọng lượng phân tử cao gồm các đơn vị glucose được nối với nhau
nhờ liên kết α- glucoside, có công thức phân tử là (C6H10O5)n ở đây n có thể từ vài trăm
đến hơn một triệu. Tính chất của tinh bột được quyết định bởi tính chất của 2 phân tử
tạo nên tinh bột là amylose và amylopectin và tỉ lệ giữa chúng [9]. Amylose dễ hòa tan
trong nước ấm, tạo nên dịch có độ nhớt không cao còn amylopectin chỉ hòa tan khi đun
nóng và cho dịch có độ nhớt cao. Dịch amylose không bền, nhất là ở nhiệt độ thấp, nó
dễ dàng tạo nên dạng gel vô định hình, sau đó trở thành các gel tinh thể và các kết tủa
không thuận nghịch. Các phân tử amylopectin không có xu hướng kết tinh, chúng có
khả năng giữ nước lớn nên dịch thường không bị thoái hóa [6,33].
Tinh bột giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm do những tính chất
lí hóa của chúng, tinh bột thường được dùng làm chất tạo độ nhớt sánh cho các thực
phẩm dạng lỏng hoặc là các tác nhân làm bền keo hoặc nhũ tương, như các yếu tố kết

dính và làm đặc tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm, dược phẩm, công
nghiệp dệt, hóa dầu [6,18].

Hình 1.2. Cấu tạo của Amylose

Hình 1.3. Cấu tạo của Amylopectin

Hạt tinh bột khi được sử lý thủy nhiệt thì sẽ xảy ra hiện tượng hồ hóa và hòa tan.
Trước hết hạt tinh bột sẽ hấp thụ nước làm liên kết ở phân tử tinh bột yếu đi, lúc này
các phân tử tinh bột xê dịch, nhão ra và trương phồng lên. Độ nhớt của dung dịch tăng
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

mạnh đến một mức nào đó, hạt tinh bột vỡ ra, phân tử tinh bột bị thủy phân, hòa tan và
độ nhớt của dung dịch giảm dần, lúc này các phân tử tinh bột phân bố đồng đều trong
các khối nước tạo thành một hệ thống đồng thể (gọi là hồ tinh bột). Nhiệt độ hồ hóa
(nhiệt độ để chuyển hạt tinh bột từ trạng thái ban đầu có mức độ hydrat hóa khác nhau
thành dung dịch keo) phụ thuộc vào kích thước của hạt tinh bột, nguồn tinh bột, và
thành phần amylose/ amylopectin có trong tinh bột. Hồ tinh bột có tính chất nhớt dẻo.
Độ nhớt của tinh bột phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nồng độ tinh bột, đường kính của các
hạt phân tán, nhiệt độ, pH. Khi để nguội hồ tinh bột một thời gian dài, tinh bột bị thoái
hóa kèm theo tách nước và đặc cứng. Tính chất thủy nhiệt và sự hồ hóa của tinh bột là
một đặc tính được quan tâm đến nhiều trong các phản ứng enzyme [18,33].
1.2.2. Tinh bột sắn

1.2.2.1. Cấu tạo và tính chất của tinh bột sắn
Tinh bột sắn có màu sáng trắng, có độ pH từ 4,5 đến 6,5. Hạt tinh bột sắn có
kích thước 5- 40 µm, chủ yếu là hình tròn, có bề mặt nhẵn. Hàm lượng amylopectin
trong tinh bột sắn tương đối cao, chiếm 78- 80%, amylose chiếm 12%. Tinh bột sắn có
độ nở, khả năng hồ hóa và độ hòa tan cao. Khoảng nhiệt độ hồ hóa của tinh bột sắn là
58- 70%, độ nhớt dung dịch bột tăng nhanh và có độ chính xác cao so với tinh bột từ
các nguồn khác. Ngoài ra hồ tinh bột có xu hướng thoái hóa thấp và độ bền gel cao,
đây là tính chất quan trọng giúp tinh bột có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. Xứ lí
hóa học và vật lí (gia nhiệt, tăng áp suất hơi), pH của môi trường và sự có mặt của các
chất như protein, chất béo, chất có hoạt tính bề mặt đều có ảnh hưởng đến độ nhớt của
tinh bột sắn [4,6].
Về mặt cảm quan tinh bột sắn là các hạt rất mịn, màu trắng. Để đảm bảo tốt,
người ta giữ ẩm của tinh bột trong khoảng 12- 14% nhằm ngăn ngừa sự phát triển của
vi sinh vật [33].
1.2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn
Theo tổ chức Nông lương thế giới (FAO), sản lượng sắn của thế giới năm 2015
ước đạt 288,9 triệu tấn, tăng nhẹ 0,2% so với năm 2014. Châu Phi vẫn là khu vực sản

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

xuất sắn lớn nhất thế giới với hơn 56% tổng sản lượng đạt 162,5 triệu tấn, tiếp theo là
khu vực châu Á với 32,2% đạt gần 93 triệu tấn [37];
Tại khu vực châu Á, Việt Nam là nước đứng thứ 3 sau Thái Lan và Indonesia

dẫn đầu về sản lượng sắn trong năm 2015 ước đạt 10,67 triệu tấn. Theo thống kê của
bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong quý I năm 2015 tổng sản lượng sắn
xuất khẩu và các sản phẩm từ sắn đạt 1,37 triệu tấn, với giá trị 420 triệu USD, tăng
24% về lượng và tăng 22,7% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Tính đến ngày
15/8/2015 diện tích trồng sắn cả nước đạt hơn 473 nghìn ha, tăng 0,8% so với cùng kỳ
năm 2014. Sắn được trồng nhiều nhất ở Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung,
nhưng năng suất cao nhất vẫn là ở vùng Đông Nam Bộ. Thị trường tiêu thụ sắn và tinh
bột sắn chủ yếu là Trung Quốc (chiếm trên 85% tổng kim ngạch xuất khẩu) [37,38,42].
Theo số liệu của hiệp hội sắn Việt Nam, cả nước có 100 nhà máy sản xuất tinh
bột sắn với quy mô công nhiệp, trong đó có 7 nhà máy chế biến cồn từ tinh bột sắn. So
với 5 năm trước đây, con số này tăng gấp đôi về số lượng nhà máy và gấp 3 lần về
công suất. Cơ cấu sử dụng sắn hàng năm được chia thành 3 nhóm chính gồm: 37% cho
sản xuất tinh bột, 33% cho xuất khẩu và 30% cho sản xuất thức ăn chăn nuôi. Sắn được
xem là cây dễ trồng, ít kén đất, vốn đầu tư ít, phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác
nhau và điều kiện kinh tế nông hộ. Hiện nay, cây sắn đang được chuyển đổi từ cây
lương thực, thực phẩm sang cây công nghiệp hàng hóa có lợi thế cạnh tranh cao. Vì
vậy tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền và được sử dụng trong nhiều
ngành công nghiệp như: thực phẩm, dược phẩm, dệt, giấy,…[39,40].
1.3. ENZYM SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT POLYMALTOSE
Quá trình thủy phân tinh bột để sản xuất polymaltose gồm hai giai đoạn.
Giai đoạn 1 là giai đoạn dịch hóa tinh bột làm giảm độ nhớt của tinh bột và làm
cho tinh bột tan hoàn toàn giúp cho quá trình đường hóa tốt.
Giai đoạn 2 là giai đoạn đường hóa tạo polymaltose mạch thẳng tức là trong giai
đoạn đường hóa chỉ tiến hành thủy phân liên kết α-1,6 glucoside [9,26,27].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

8

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

1.3.1. Quá trình dịch hóa tinh bột bằng enzym α- amylase
Để tạo ra tinh bột tan có DE thích hợp cho quá trình đường hóa tạo polymaltose
trước hết phải tiến hành quá trình dịch hóa tinh bột bằng enzym α- amylase.
1.3.1.1. Giới thiệu enzym α- amylase và nguồn sinh tổng hợp
α- amylase là enzym nội bào (endo- 1,4 α- D glucan glucohydrolase) thủy phân
liên kết α-1,4 glucoside của phân tử amylose một cách ngẫu nhiên. Đó cũng là endoenzym phân cắt bên trong mạch tinh bột. Các α- amylase được phân loại theo tính chất
và hoạt động của nó. α- amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo ra dextrin được xếp vào
loại “dịch hóa” [1,2,4,10,22].
Nguồn sinh tổng hợp
Enzym α- amylase có thể nhận được từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau như vi
khuẩn, nấm mốc, nấm men. Tuy nhiên α- amylase từ vi khuẩn vẫn được sử dụng nhiều
nhất do một số đặc điểm ưu việt như có hoạt tính và nhiệt độ tối ưu cao hơn so với các
α- amylase thu được từ nấm mốc, nấm men [15].
Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đóng vai trò quan trọng nhất trong việc
sản xuất α-amylase trong công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương
pháp nuôi cấy chìm. Hiện nay có nhiều phương pháp nghiên cứu sản xuất α- amylase
bền nhiệt từ B. licheniformis, trong đó phương pháp nuối cấy bề mặt cho hiệu suất kinh
tế cao [5,16,31].
Nấm mốc thuộc chi Aspergillus rất phổ biến trong sản xuất enzyme ngoại bào.
Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme có thể tăng lên nhiều nhờ điều kiện nuôi cấy và thành
phần môi trường. Phương pháp sử dụng trong nuôi cấy enzyme α- amylase từ nấm mốc
là phương pháp nuôi cấy bề mặt, sử dụng chủng Asp. oryzae trong thiết bị với dòng khí
phun từ dưới lên có tác dụng đảo trộn các hạt trong môi trường, giúp tăng tốc độ truyền
nhiệt và truyền khối, tăng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme. Các điều kiện trao đổi oxy,
đặc biệt là áp suất oxy hòa tan là những yếu tố quan trọng trong sản xuất α- amylase
[13,35].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Xạ khuẩn và nấm men thuộc chi Endomycopsis cũng có khả năng tổng hợp αamylase, tuy nhiên hoạt lực α- amylase của chúng không cao [32,34].
1.3.1.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym α- amylase.
Enzyme α- amylase thủy phân tinh bột bằng cách phân cắt ngẫu nhiên tại các
liên kết α-1,4 glucoside. Khi thực hiện quá trình thủy phân, α- amylase phân cắt
amylose thành maltose, maltotriose, oligosaccharide. Giai đoạn tiếp theo là quá trình
thủy phân thành các dextrin phân tử lượng thấp, nhưng quá trình này xảy ra chậm, đặc
biệt là các maltotriose vì cơ chất này không thích hợp với các α- amylase. Nếu chịu tác
dụng lâu dài thì α- amylase có thể chuyển phần lớn các chất trên thành maltose và
glucose [1].
Khi thủy phân amylopectin, giai đoạn đầu dẫn tới sự hình thành các dextrin giới
hạn, có nhánh, và trọng lượng phân tử thấp là maltose và glucose. Giai đoạn sau, thủy
phân maltotriose diễn ra với tốc độ rất chậm. Sản phẩm cuối cùng ngoài maltose và
glucose còn có các dextrin phân tử lượng thấp và isomaltose. Thủy phân tinh bột bằng
α- amylase dịch hóa có mức độ polyme không vượt quá 30-40% và tạo thành chủ yếu là
dextrin và một ít đường.
Tinh bột

α- amylase, H2O

α- dextrin+ glucose+maltose

Cơ chế tác dụng của α- amylase lên phân tử tinh bột là thủy phân không định vị
các liên kết α-1,4 glucoside trong các polysaccharid, kết quả là dịch tinh bột loãng ra và
có độ nhớt giảm. Quá trình thủy phân tinh bột bằng enzyme được thực hiện qua một
loạt các sản phẩm trung gian có phân tử lượng khác nhau gọi là dextrin. Lúc đầu thu
được các dextrin có phân tử lượng lớn, khác biệt so với tinh bột về cấu trúc cũng như
tính chất tác dụng với oide. Sau đó các dextrin thu được có phân tử lượng ngày càng
thấp dần và tính chất tác dụng với iode cũng thay đổi. Sản phẩm cuối cùng là glucose
và maltose [6,20,25,30].
1.3.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới enzym α- amylase [5,9]
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đối với enzyme được thể hiện qua phương trình
Michaelis-Menten:
V
Trong đó:
V: vận tốc của phản ứng
Vmax: vận tốc cực đại của phản ứng
[S]: nồng độ cơ chất
Km: hằng số Michaelis, thể hiện ái lực giữa enzyme và cơ chất
Như vậy nồng độ cơ chất thấp, V phụ thuộc tuyến tính vào [S]. Ở nồng độ cơ

chất lớn, vận tốc phản ứng đạt cực đại và không phụ thuộc [S]. Nếu nồng độ cơ chất
bằng Km thì vận tốc phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại. Tuy nhiên cũng như một
số enzyme khác, α- amylase bị ức chế trong trường hợp thừa cơ chất [10].
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Đối với enzyme nói chung, trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ
thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme:
V= k. [E]

với [E] là nồng độ enzyme

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm.
Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của α- amylase
Mỗi α- amylase phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận mà có pH thích hợp và đặc
trưng riêng. Thường gặp là các α- amylase có pH hoạt động khoảng 5.0-7.0, một số loại
có pH hoạt động khá cao pH= 7.5-10, các enzyme này thường gặp ở các chủng ưa
kiềm, thuộc nhóm enzyme kiềm tính. Enzyme hoạt động ở vùng pH thấp, thuộc nhóm
enzyme axit. Một số α- amylase có vùng pH hoạt động khá rộng, tối ưu ở pH= 6.0-7.0,
nhưng ở vùng pH axit thấp và axit cao chúng vẫn giữ được tới 70-80% hoạt tính [32].
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của α- amylase
Enzyme α- amylase có nguồn gốc khác nhau thì hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khác
nhau. Phần lớn α- amylase của động vật và một số loại vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu
nằm trong khoảng 40-500C. Một số loại enzyme ưa lạnh còn lại chủ yếu là các loại
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

enzyme có nhiệt độ tối ưu cao hay còn gọi là enzyme chịu nhiệt. Nhiệt độ tối ưu của
enzyme chịu nhiệt thường lớn hơn 650C. Maininh và Campell đã xác định được nhiệt
độ tối ưu của các enzyme có nguồn gốc khác nhau như: B. stearothermophilus: 55700C, B. subtilus 600C, B. licheliformis: 90-1050C.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm lên hoạt động của α- amylase(inhibitor)
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme α- amylase có cơ chế tác động hoàn
toàn khác với cơ chế hoạt động của một số chất bất hoạt enzyme. Các chất kìm hãm
hoạt động của enzyme hoạt động theo cơ chế cạnh tranh và không cạnh tranh với cơ
chất. Khi giải phóng khỏi chất kìm hãm enzyme lại hoạt động trở lại. Nghiên cứa cơ
chế hoạt động của chất kìm hãm là một biện pháp hữu hiệu để nghiên cứu hoạt động
của enzyme, xác định vị trí tâm gắn cơ chất, tâm hoạt động trên các cấu trúc bậc ba của
α- amylase. Các chất kìm hãm của α- amylase chia làm hai loại:
Chất kìm hãm có cấu trúc tương tự cơ chất
Chất kìm hãm có bản chất protein
Nhiều chất kìm hãm có bản chất protein chỉ tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật.
Các chất này có tính chất đặc biệt là kìm hãm hoạt động của α- amylase động vật và
một số chủng Streptomyces, nhưng lại không kìm hãm hoạt động của α- amylase thực
vật và hầu hết các loại vi sinh vật khác. Tất cả các chất kìm hãm này đều có vùng đặc
trưng chứa trình tự Trp-Arg-Tyr.
Ảnh hưởng của Ca2+ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của α- amylase
Phần lớn α- amylase có hoạt tính và độ bền nhiệt phụ thuộc vào Ca2+ nhưng ở mức
độ khác nhau. Ở một số α- amylase cả hoạt tính và độ bền nhiệt đều phụ thuộc vào Ca2+.
Một số khác chỉ làm tăng độ bền nhiệt mà không ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme α- amylase. Ở nhiệt độ thấp Ca2+ hoàn toàn có thể thay thế bằng các ion kim loại
hóa trị II thuộc nhóm kiềm thổ, ở nhiệt độ cao thì không thể thay thế. Chỉ có một số ít αamylase mà Ca2+ không ảnh hưởng tới hoạt tính cũng như độ bền nhiệt của enzyme.
EDTA là chất khử Ca2+ nên làm giảm hoạt lực của α- amylase. Ca2+ làm giảm hoạt tính
của α- amylase mạnh nhất (gần 80%) ở nồng độ 5mM. Vì vậy ion Ca2+ giữ vai trò quan
trọng trong việc duy trì cấu trúc cũng như hoạt động của enzyme α- amylase [8].
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

1.3.1.4. Giới thiệu một số enzym dịch hóa.
-

Enzyme Termamyl
Termamyl 120L là chế phẩm enzyme dạng lỏng của hãng Novo- Đan Mạch, chịu

nhiệt cao và pH trung tính. Chế phẩm này được sản xuất từ

vi sinh vật Bacillus

licheniformis. Termamyl là enzyme ở dạng endo- amylase có tác dụng thủy phân các liên
kết α-1,4 glucoside. Cơ chế tinh bột dưới tác dụng của Termamyl sẽ tạo thành các dextrin
và các oligosaccharide tan trong nước. Termamyl hoạt động ở nhiệt độ tối ưu từ 90-1000C,
pH 5-6. Nếu bảo quản Termamyl ở 50C thì hoạt tính có thể duy trì tối thiểu 1 năm [23].
-

Enzyme Liquozyme Supra (Novozyme- Đan Mạch)
Liquozyme Supra là một hỗn hợp dạng lỏng của các enzyme α- amylase bền

nhiệt được sử dụng dịch hóa tinh bột. Chế phẩm enzyme được sản xuất từ chủng tái tổ
hợp Bacillus licheniformis. Hoạt lực của enzyme đạt 135KNU/g, hoạt động ở nhiệt độ
tối ưu từ 105-1100C, pH 5.1-5.6, liều lượng khuyến cáo được sử dụng là 0.25-0.65
kg/tấn tinh bột [21].

-

Enzyme Amylex® HT [14,23]
Amylex® HT là tên thương mại của enzyme thuộc nhóm α- amylase dạng lỏng

màu nâu và chịu nhiệt. Amylex® HT có xuất xứ từ Mỹ, được sản xuất bằng quy tình
công nghệ cao và tự động hóa. Amylex® HT là enzyme đạt tiêu chuẩn thực phẩm làm
giảm nhanh độ nhớt của dịch tinh bột và sinh ra một lượng lớn các dextrin phân tử thấp.
Công dụng: Amylex® HT sử dụng trong công nghệ tinh bột để dịch hóa tinh bột
tạo ra các dextrin có phân tử thấp. Do khả năng chịu nhiệt, khoảng pH hoạt động rộng
4.0 -7.0 và nhu cầu canxi thấp nên Amylex® HT có thể dịch hóa tinh bột ở nhiệt độ cao
khoảng 80- 900C mà không cần bổ sung thêm ion canxi.
Đặc điểm: Amylex® HT là dung dịch có màu nâu. Enzyme có mùi nhẹ đặc trưng
của sản phẩm lên men. Enzyme tan trong nước, bị mất hoạt tính ở pH< 4.0 và pH> 7.0,
enzyme bị ức chế hoạt động ở nhiệt độ trên 950C, mất hoạt tính hoàn toàn khi nhiệt độ
vượt quá 100 0C trong thời gian nhất định.
Liều lượng: Liều lượng sử dụng tùy thuộc vào bản chất và tỷ lệ chất khô trong
cơ chất, chỉ số DE của dịch dextrose cuối, nhiệt độ và pH dịch hóa, thời gian dịch hóa
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

(thông thường là 30-120 phút). Liều lượng enzyme khuyến cáo: Tỷ lệ sử dụng không
vượt quá 0,5 kg Amylex® HT/ tấn tinh bột khô.
1.3.2. Quá trình đường hóa tinh bột bằng enzym pullulanase

1.3.2.1 Giới thiệu enzym pullulanase và nguồn sinh tổng hợp
Enzyme pullulanase là enzyme đường hóa cắt mạch nhánh, theo danh pháp quốc
tế enzyme pullulanase gọi là pullulan 6-glucanohydrolase (EC. 3.2.1.41). Enzyme
pullulanase là enzyme thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong phân tử amylopectin, αdextrin, glycopen, pullulan, tuy nhiên nó không có tác dụng đối với amylase và các
oligosaccharide mạch thẳng [34].
Nguồn sinh tổng hợp
Enzyme pullulanase có trong thực vật như đậu Hà lan, cây yến mạch, malt
gạo,… nhưng nguồn sản xuất dồi dào và phong phú nhất là các chủng vi sinh vật.
Pullulanase lần đầu tiên được tìm thấy từ Klebsiella pneumoniae, sau này người ta phát
hiện thấy pullulanase được sinh tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật rất đa dạng như
Encherichia intermedia, Streptococcus mitis, Bacillus acidopullulyticus, Streptomyces
flavochromogenas, Oryza sativa, Bacillus macrans, Bacillus pomyxa, Aerobacter
aerogenes,…[34]
Pullulanase thu từ K. pneumoniae được dùng trong nghiên cứu cấu trúc của tinh
bột và glycogen, thủy phân cấu trúc phân nhánh α-1,6 glucoside. Trong sản xuất các
loại đường glucose, maltose từ tinh bột trên quy mô công nghiệp người ta ứng dụng
pullulanase từ K. pneumoniae và B. acidopullulyticus để tăng hiệu suất chuyển hóa. Ví
dụ trong công nghệ sản xuất maltose nếu kết hợp pullulanase với α- amylase và βamylase thì hiệu suất chuyển hóa tăng 97% [9].
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật DNA tái tổ hợp người ta
đã tách gen mã hóa pullulanse từ chủng Desulfurococcus mucosus DSM2162 ghép vào
chủng B. subtilis JA803 để sinh tổng hợp enzyme pullulanase [15].
Enzyme từ các chủng vi sinh vật khác nhau có những đặc tính kỹ thuật giống và
khác nhau. Bảng dưới đây cho thấy một số đặc tính kỹ thuật của enzyme pullulanase từ
2 chủng K. pneumoniae và B. acidopullulyticus. Hiện nay 2 chủng này được sử dụng để
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

sinh tổng hợp enzyme trên quy mô công nghiệp của 2 hãng nổi tiếng thế giới đó là
Amano (Nhật Bản) và Novozyme (Đan Mạch).
Bảng 1.1. Một số tính chất của enzyme pullulanase [34]
Pullulanase

K. pneumonia

B. acidopullulyticus

Nội bào

Ngoại bào

Chủng 11647

Chủng 11777

sinh

sinh

(Ngoại bào sinh

(Ngoại bào

enzyme

enzyme

enzyme)

sinh enzyme)

90.000

66.000

100.000

90.000

7.000(1)

7.200(1)

100(2)

50(2)

pH tối ưu

6.0

6.6

5.2

5.5

Khoảng pH ổn định

5.5-12

5.0-11.5

4-9

4- 9

Khả năng chịu nhiệt

400C

45-550C

550C

550C

Điểm đẳng điện (pI)

3.8-4.46

3.7-4.3

5.0

4.9

Kiểu hoạt động

Endo

Endo

Endo

Endo

Trọng lượng phân tử
(Dalton)
Hoạt lực/ mg protein
(UI/mg)

(1) Sử dụng cơ chất pullulanase

(2) Sử dụng cơ chất là amylopectin

Phần lớn pullulanase đều có trọng lượng phân tử tương đối gần nhau khoảng
90.000- 100.000 Da, nhưng pullulanase của B. polymyxa có trọng lượng phân tử chỉ
48.000 Da [27]. Trọng lượng phân tử xác định được bằng điện di gel từ 2 chủng K.
pneumoniae và B. acidopullulyticus là 66.000- 90.000 Da [35].
Pullulanase có nguồn gốc khác nhau thì hoạt động ở các nhiệt độ tối ưu và pH
khác nhau. Enzyme pullulanase của chủng Baccillus. Sp. 202-1 là 550C, chủng
Streptococcus mitis là 300C. Pullulanase từ chủng B. acidopullulyticus hoạt động ở pH
thích hợp nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 550C, tuy nhiên nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh
tổng hợp enzyme từ chủng này là 350C [22]. pH tối ưu cho hoạt động của pullulanase từ

K. pneumoniae là 6.0- 7.0 và enzyme duy trì được 80% hoạt lực khi pH 5- 10, nhiệt độ
tối ưu là 550C và nhiệt độ enzyme ổn định 40-550C [23,26].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

15


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

1.3.2.2. Cơ chế thủy phân tinh bột của enzym pullulanase
Pullulanase có tác dụng thủy phân liên kết α-1,6 glucoside của phân tử
amylopectin, các oligosaccharide mạch nhánh nên có giá trị DE tăng theo thời gian
phản ứng. Khả năng thủy phân của pullulanase từ chủng Streptococcus mitis trên cơ
chất amylopectin và glycogen là 50% và 30%. Pullulanase không thủy phân các liên kết
α-1,6 glucoside trong isopanose, isomaltose và một số mạch nhánh ngắn [9,12].
Pullulanase kết hợp với enzyme α- amylase trong thủy phân tinh bột để sản xuất
ra một loạt các maltooligosaccharide khác nhau như: maltose, maltotriose,
maltotetraose, maltopentaose,…. và làm tăng đường khử theo thời gian thủy phân.
1.3.2.3. Giới thiệu một số chế phẩm enzym pullulanase
-

Enzyme Promozyme D2
Promozyme D2 là tên thương mại của ezyme Pullulanase thủy phân liên kết α-

1,6 glucoside của amylopectin trong phân tử tinh bột. Promozyme D2 được sản xuất từ
chủng Bacillus subitis đột biến của hãng Novo- Đan Mạch, hoạt lực enzyme 1350
PNU/g. Chế phẩm dạng lỏng, có màu vàng, hoạt động ở nhiệt độ 45- 650C, pH= 5-7, tỷ

lệ sử dụng từ 0.1- 0.5%( so với tinh bột). Bảo quản ở nhiệt độ từ 0-250C, bị bất hoạt ở
800C trong 40 phút và 850C trong 5 phút [29].
-

Enzyme pullulanase “Amano” 3
Enzyme pullulanase “Amano” 3 là chế phẩm sản xuất từ chủng Klebsiella

pneumoniae của hãng Amano- Nhật Bản. Chế phẩm dạng lỏng, có màu vàng sáng, hoạt
động tốt ở 40- 650C, pH= 5.5- 7.5, có thể duy trì được hoạt lực ở 0- 50C trong 6 tháng.
Enzyme mất hoạt tính ở 800C trong 40 phút và 850C trong 5 phút [42].
-

Enzyme Kleistase PL
Enzyme Kleistase PL là chế phẩm được sản xuất từ chủng Pullulanibacillus

naganoensis của hãng Amano- Nhật Bản. Chế phẩm dạng lỏng, có màu vàng, hoạt động
ở nhiệt độ tối ưu 50- 650C, pH=5-6, hoạt lực 405 PNU/g, được bảo quản ở 50C, bị bất
hoạt ở 80- 850C [42].

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngô Thị Trang_1203_CNTP

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT

2.1.1. Nguyên liệu
* Tinh bột sắn (Việt Nam) có chất lượng như sau:
- Hàm lượng tinh bột:

85%

- Độ ẩm: 12-14%
* Enzyme:
- Chế phẩm enzyme dịch hóa: Chế phẩm enzyme dịch hóa: Amylex®HT (Mỹ),
Termamyl (Novozyme-Đan Mạch), Liquozyme Supra (Novozyme-Đan Mạch)
- Chế phẩm enzyme đường hóa: Promozyme D2 (Novozyme-Đan Mạch),
Pullulanase “Amano” 3 (Amanozyme-Nhật Bản), Kleistase PL (Amanozyme - Nhật
Bản).
- Than hoạt tính (Nhật)
2.1.2. Hóa chất
CuSO4.5H2O, KNaC4H4O6, NaOH, HCl, KOH, K3Fe(CN)6, nước cất, glucose,
Acetonitril (CAN), chỉ thị xanh metylen,…
2.1.3. Thiết bị
Thiết bị phòng thí nghiệm: Chiết quang kế, Brome kế - Germany, máy đo pH
Thermor Orion – Model 410 (China), máy đo độ nhớt Viscosimetre capillaire
(Germany), máy đo độ ẩm Precisa HA60 (Switzerland), máy sắc kí lỏng cao áp HPLC,
nồi ổn định nhiệt (Germany) và các thiết bị thí nghiệm thông thường.
2.2 PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Phương pháp phân tích
2.2.1.1. Xác định nồng độ chất khô bằng chiết quang kế
Chiết quang kế là một dụng cụ quang học dựa trên sự khúc xạ khác nhau trong
môi trường có nồng độ chất tan khác nhau. Dịch đem đo cần trong suốt, ở 200C để đảm
bảo độ chính xác.
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

17