Nghiên cứu lựa chọn điều kiện biểu hiện protein dung hợp sumo IL 11 trong chủng escherichia coli

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN
PROTEIN DUNG HỢP SUMO_IL-11
TRONG CHỦNG ESCHERICHIA COLI

Người hướng dẫn

: TS. LÊ THỊ THU HỒNG

Sinh viên thực hiện

: HOÀNG ANH HÀ

Lớp

: 12.03

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người
thân.
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị
Thu Hồng, phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam không chỉ là người tận tình hướng dẫn tôi
những kiến thức, mà còn dành nhiều thời gian, công sức chỉ bảo và tạo điều

kiện cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Nội dung của khóa luận này là
một phần nội dung của đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước “Nghiên cứu
sản xuất Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng trong
y học (điều trị)” do GS.TS. Trương Nam Hải làm chủ nhiệm.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô trong Khoa Công nghệ
sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Để thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn kịp thời và
giúp đỡ quý báu của toàn thể cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công
nghệ sinh học, đặc biệt là ThS. Dương Thu Hương, NCS. Nguyễn Thị Quý và
KS. Đặng Thị Ngọc Hà đã nhiệt tình hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong việc
học tập, thực hành kỹ thuật cũng như chỉnh sửa luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân, bạn
bè đã quan tâm, cổ vũ và động viên tôi rất nhiều trong quá trình học tập, hoàn
thành luận văn này.
Chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
HOÀNG ANH HÀ


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................. iii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... v
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1. Interleukin-11 ........................................................................................... 3
1.1.1 Giới thiệu chung ..................................................................................... 3
1.1.2 Đặc tính phân tử và cấu trúc của IL-11 ................................................ 4

1.1.3 Vai trò và ứng dụng của IL-11 ............................................................... 6
1.1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................... 7
1.2. Hệ biểu hiện E. coli .................................................................................. 8
1.2.1 Chủng biểu hiện E.coli ........................................................................... 9
1.2.2 Vector biểu hiện trong E. coli............................................................... 10
1.2.3.Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein tái tổ hợp ...... 12
1.2.3.1 Ảnh hưởng của yếu tố môi trường ...................................................... 13
1.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng ............................................... 13
1.2.3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường ........................................................... 14
1.2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng ....................................................... 14
1.2.3.5 Ảnh hưởng của thời điểm cảm ứng biểu hiện ..................................... 15
1.2.3.6 Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu biểu hiện ....................................... 16
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................... 17
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu .......................................................... 17
2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid ......................................................... 17
2.1.2 Hoá chất và enzyme .............................................................................. 17
2.1.3 Các môi trường và dung dịch ............................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 20
2.2.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E. coli tái tổ hợp bằng sốc nhiệt .. 20
2.2.2 Biểu hiện protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 trong hệ biểu hiện E. coli21
i


2.2.3. Khảo sát các điều kiện biểu hiện protein SUMO_IL-11 từ chủng E. coli
tái tổ hợp..........................................................................................................22
2.2.3.1 Khảo sát điều kiện môi trường ............................................................ 22
2.2.3.2 Khảo sát điều kiện nồng độ chất cảm ứng .......................................... 22
2.2.3.3 Khảo sát điều kiện nhiệt độ biểu hiện ................................................. 23
2.2.3.4 Khảo sát điều kiện pH môi trường ...................................................... 23
2.2.3.5 Khảo sát mật độ tế bào lúc cảm ứng ................................................... 23

2.2.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu ................................................................. 23
2.2.4 Phương pháp siêu âm phá tế bào E. coli tái tổ hợp.............................24
2.2.5 Điện di protein trên gel Polyacrylamide............................................... 24
2.2.6 Phương pháp lai Western blot .............................................................. 25
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27
3.1 Biểu hiện protein SUMO_IL-11 trong E. coli R2 ................................ 27
3.2.Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men biểu hiện
SUMO_IL-11 ................................................................................................. 30
3.2.1 Khảo sát thành phần môi trường lên men biểu hiện SUMO_IL-11 .. 30
3.2.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG................................................. 33
3.2.3 Khảo sát nhiệt độ đến sự biểu hiện SUMO_IL-11 .............................. 34
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ............................................. 37
3.2.5 Khảo thời điểm cảm ứng biểu hiện SUMO_IL-11 .............................. 39
3.2.6 Khảo sát thời gian thu mẫu lên men SUMO_IL-11 ............................ 41
3.3 So sánh hiệu quả biểu hiện SUMO_IL-11 trước và sau khi tối ưu các
điều kiện biểu hiện ........................................................................................ 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Axit deoxyribo nucleic

APS

Amonium persulphate

Amp

Ampicillin

Bp

Base pair

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

E. coli

Escherichia coli

TEMED

N, N, N', N' - tetramethyl ethylendiamine

dNTP

2' - deoxyribonucleoside - 5' triphosphate

IL-11

Interleukin-11

IPTG

Isopropyl 𝛽-D-1thiogalactopyranoside

kDa

Kilo Dalton

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
OD

Optical density

PBS

Phosphate buffer saline

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số chủng E. coli thường được sử dụng nhất để biểu hiện
protein ngoại lai và những đặc điểm chính của chúng [23] .............................. 9
Bảng 2.1: Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE..................................19
Bảng 3.1: Mật độ tế bào chủng E. coli biểu hiện SUMO_IL-11 ở các môi trường
khác nhau.........................................................................................................32
Bảng 3.2: Mật độ tế bào chủng E. coli biểu hiện SUMO_IL-11 ở các nồng độ
IPTG khác nhau .............................................................................................. 34
Bảng 3.3: Mật độ tế bào chủng E. coli biểu hiện SUMO_IL-11 ở các nhiệt độ
cảm ứng khác nhau ......................................................................................... 37
Bảng 3.4: Mật độ tế bào chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện SUMO_IL-11 ở

các pH môi trường khác nhau ......................................................................... 38
Bảng 3.5: Mật độ tế bào thu được ở các thời điểm OD600 cảm ứng từ 0,4 – 4,0
......................................................................................................................... 40
Bảng 3.6: Mật độ tế bào ở các thời điểm thu mẫu khác nhau ........................ 42
Bảng 3.7: So sánh các điều kiện và kết quả biểu hiện trước và sau khi tối ưu
......................................................................................................................... 43

iv


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-11 ........................................ 5
Hình 1.2: Sơ đồ vector pE SUMOpro3 có chứa gen kháng Ampicllin .......... 12
Hình 3.1: Phân tích SDS-PAGE sự biểu hiện của SUMO_IL-11 trong E. coli
Rosetta 2..........................................................................................................28
Hình 3.2: Western blot phân tích sự biểu hiện SUMO_IL-11 trong E. coli
Rosetta 2.......................................................................................................... 28
Hình 3.3: Phân tích tính tan của protein SUMO_IL-11 được biểu hiện trong
chủng E. coli tái tổ hợp ................................................................................... 29
Hình 3.4: SDS-PAGE kiểm tra mức độ biểu hiện của SUMO_IL-11 ở các
môi trường khác nhau ..................................................................................... 31
Hình 3.5: Kiểm tra mức độ biểu hiện SUMO_IL-11 ở các nồng độ chất cảm
ứng IPTG khác nhau: a) các mẫu đưa về cùng một giá trị OD = 10; b) mẫu
điện di theo giá trị OD600 thực. ....................................................................... 33
Hình 3.6: Kiểm tra mức độ biểu hiện SUMO_IL-11 ở các nhiệt độ khác nhau
......................................................................................................................... 35
Hình 3.7: Kiểm tra protein ở pha tan, không tan ở các nhiệt độ khác nhau. .. 36
Hình 3.8: Kiểm tra mức độ biểu hiện của protein SUMO_IL-11 ở các pH môi
trường khác nhau ............................................................................................ 38
Hình 3.9: Kiểm tra biểu hiện protein SUMO_IL-11 được cảm ứng ở các mật

độ tế bào (OD600) khác nhau ........................................................................... 40
Hình 3.10: Điện di protein mẫu biểu hiện protein SUMO_IL-11 ở các thời
điểm từ 1 đến 8 giờ và qua đêm (20 giờ) ........................................................ 41
Hình 3.11: Kiểm tra biểu hiện protein SUMO_IL-11 với các điều kiện trước
và sau tối ưu .................................................................................................... 43

v


MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, ngành
công nghiệp sinh phẩm với các sản phẩm có nguồn gốc vi sinh vật sử dụng
trong lĩnh vực y dược ngày càng được chú trọng. Số lượng các loại protein tái
tổ hợp tạo ra cho mục đích dược phẩm đã có sự tăng trưởng vượt bậc, trong đó
cytokine tái tổ hợp là một dạng sinh phẩm quan trọng đối với hệ miễn dịch.
Interleukin-11 (IL-11) người có bản chất là protein được biết tới như một
cytokine tạo máu. Nó là yếu tố sinh tưởng đối với các tế bào nguồn của u tương
bào, tế bào tạo máu tạo máu tiềm năng, nguyên mẫu tiểu cầu, đại thực bào. Với
vai trò như vậy, yếu tố tăng trưởng này rất hữu ích trong việc hỗ trợ và điều trị
các bệnh về máu. Trong những năm gần đây, các bệnh về máu nói chung và
đặc biệt là các bệnh của hệ thống tạo máu có xu hướng gia tăng mạnh mẽ. Do
đó, việc nghiên cứu vai trò cũng như khả năng ứng dụng của các yếu tố này
trong hỗ trợ điều trị bệnh ngày càng được quan tâm.
IL-11 người tái tổ hợp (rhIL-11) là một trong số ít sản phẩm Interleukin
(IL) được cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ cấp phép cho sử
dụng để điều trị trên người. Tên thương mại được cấp phép cho loại rhIL-11 là
NEUMEGA của công ty Wyeth và được chỉ định cho mục đích cảm ứng sinh
tiểu cầu để bảo vệ bệnh nhân trước và sau khi hoá trị liệu. Sinh phẩm này được
cung cấp bởi một số hãng dược phẩm như Pfizer, Biocompare, Millipore... với
giá trung bình khoảng 200 - 300 USD/10µμg.

Hiện nay nước ta vẫn chưa sản xuất được IL-11. Các sản phẩm IL-11 đều
phải nhập khẩu với chi phí rất đắt đỏ, do đó khó khăn trong việc chi trả kinh
phí đối với nhiều đối tượng bệnh nhân. Vì vậy để chủ động nguồn nguyên liệu
trong nước và giảm giá thành sản phẩm IL-11, Viện Công nghệ sinh học đang
được nhà nước đầu tư cho chủ trì đề tài “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và
Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng trong y học (điều trị)”.
Trong các nghiên cứu trước, Phòng Kỹ thuật di truyền đã tạo được chủng
E. coli Rosetta 2 tái tổ hợp biểu hiện protein dung hợp SUMO_IL-11. Do đó,
1


để tạo điều kiện thuận lợi cho các bước nghiên cứu tiếp theo, phải khảo sát để
tìm ra điều kiện biểu hiện tối ưu protein dung hợp SUMO_IL-11 người tái tổ
hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất IL-11
tái tổ hợp trong hỗ trợ điều trị các bệnh về máu. Từ những lý do trên, tôi đã
được hướng dẫn thực hiện nội dung này cho khoá luận với tên đề tài tốt nghiệp
"Nghiên cứu lựa chọn điều kiện biểu hiện protein dung hợp SUMO_IL-11
trong chủng Escherichia coli".
Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2


PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Interleukin-11
1.1.1 Giới thiệu chung
Với bản chất là protein hoặc glycoprotein, Interleukin (IL) là một trong
bốn nhóm của cytokine (Interferron, IL, nhân tố hoại tử ung thư, nhân tố sinh
trưởng). Tính đến thời điểm hiện tại, số lượng IL được phát hiện lên tới hơn 37

loại [1]. Theo chức năng sinh học, IL được xác định là chất tác động giữa các
bạch cầu, hoạt hóa lympho bào. Nó có thể là sản phẩm của dòng tế bào T hỗ
trợ nhưng cũng có thể tiết ra bởi đại thực bào hay các tế bào khác trong hệ miễn
dịch. Các IL này có vai trò trung gian trong việc liên kết với các thụ thể đặc
hiệu để điều khiển quá trình hoạt động của tế bào, các quá trình phân chia của
tế bào và quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Mỗi nhóm IL
có vai trò khác nhau trong hệ thống miễn dịch và chúng có thể được tạo ra bởi
các loại tế bào khác nhau. Ví dụ, IL-1 tác dụng hoạt hóa tế bào T, giúp tăng
sinh và trưởng thành của tế bào B; IL-2 có tác dụng kích thích phát triển tế bào
T, đồng kích thích tế bào B phát triển và biệt hóa, tăng cường tế bào giết tự
nhiên NK (natural killer) và tế bào giết được kích hoạt bởi lymphokine LAK
(Lymphokine-activated killer); IL-3 kích thích sự biệt hóa của các tế bào gốc
tạo máu đa năng thành các tế bào tiền thân dòng tủy cũng như kích thích sự
phân chia của tất cả các tế bào thuộc dòng tủy; IL-4 có tác dụng tăng sinh và
biệt hóa lên nhiều loại tế bào T, B, đại thực bào, tế bào mast; IL-5 tác dụng hiệp
đồng với IL-4 để sản xuất kháng thể IgE, kích thích sự sinh trưởng và biệt hóa
của bạch cầu ái toan; IL-7 tăng cường sự tiết IL-2, kích thích tăng sinh của tế
bào B, IL-11 có tác dụng kích thích tủy xương tạo tiểu cầu, giúp cải thiện tình
trạng giảm tiểu cầu do quá trình hóa trị liệu [2][3].
Trong thực tế, hầu hết các loại IL đã phát hiện đều có thể được tạo ra được
theo con đường tái tổ hợp và chúng được sử dụng không chỉ trong việc điều trị
bệnh mà còn được sử dụng vào các mục đích chẩn đoán và nghiên cứu khác.

3


Ví dụ, cho mục đích điều trị lâm sàng, IL-2 tái tổ hợp sử dụng trong điều trị hắc
tố ác tính, ung thư biểu mô tế bào thận; IL-3 thúc đẩy sự phục hồi dòng bạch
cầu khi ghép tủy xương hoặc phục hồi dòng bạch cầu trong suy tủy xương thứ
phát do thuốc/hóa chất độc hại; IL-11 kích thích sự gia tăng của tiểu cầu trong

tủy xương, sử dụng cho bệnh nhân giảm tiểu cầu sau xạ trị, sau hóa trị liệu…
[4]. Hơn nữa, các loại IL còn có thể được dùng kết hợp để đạt hiệu quả điều trị
tốt nhất, ví dụ IL-2, IL-5, IL-7 trong điều trị bệnh nhân HIV, IL-4 và IL-13
trong điều trị bệnh ung thư [5][6]. Chính vì vậy, việc tạo ra các loại sinh phẩm
IL và phát triển các phương thức điều trị hữu hiệu dựa trên loại sản phẩm này
đã và đang là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn.
Với IL-11, định nghĩa ban đầu chỉ là một yếu tố hòa tan trong môi trường
với sự tham gia của chất cảm ứng IL-1α trên dòng tế bào đệm tủy xương, PU34, nó được cung cấp lâu dài cho quá trình nuôi cấy tế bào [7]. Hiện nay, IL-11
được biết tới là một cytokine tạo máu với vai trò là yếu tố sinh trưởng cho tế
bào nguồn của u tương bào (plasmacytomas), tế bào tạo máu tiềm năng, nguyên
mẫu tiểu cầu, đại thực bào, đồng thời ức chế chứng phát phì với tiền tế bào mỡ.
Chính vì vậy, IL-11 còn có tên gọi khác là yếu tố ức chế chứng phát phì (AGIF).
Nhiều nghiên cứu trên tế bào và trên các mô của các cơ quan đã chỉ ra IL-11
còn có hoạt tính bảo vệ và hồi phục màng nhày của hệ tiêu hóa; tác động như
là tác nhân điều biến miễn dịch hay tham gia vào các hoạt động trao đổi chất
trong xương [3]. Bên cạnh đó, IL-11 còn có tác dụng kích thích tạo tế bào hồng
cầu erythrocytopoiesis, tăng cường phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng
thể, cảm ứng sự tổng hợp protein giai đoạn cấp tính, ức chế hoạt động lipase
lipoprotein và biệt hóa các tế bào mỡ, và thúc đẩy sự phát triển tế bào thần kinh.
1.1.2 Đặc tính phân tử và cấu trúc của IL-11
Trong cơ
 thể người, gen hoàn chỉnh mã hóa cho IL-11 chiếm kích thước
khoảng 7 kb trong ADN của hệ gen, định vị trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể
số 19, tại vị trí 19q13.3-q13.4 [8]. Gen này chứa 5 vùng exon và 4 vùng intron.

4


Một điểm khá đặc biệt là mặc dù IL-11 nằm trong họ của IL-6 nhưng
 trình

 tự
ADN của gen il-11 lại khó tìm thấy sự tương
 đồng ở cấp độ nucleotide [9]. Một
vài vùng nằm ở đầu 5’ của gen lại có trình tự nucleotide tương
 đồng đến 70%
khi so sánh với các gen mã hóa cho các cytokine khác như
 IL-­‐‑2,
 IL-3, IL-9 và
GM-CSF.
IL-11 là một phân tử protein có mức độ ổn định cao trước điều kiện nhiệt
độ mặc dù trong cấu trúc không tồn tại amino acid cystein nào. Dạng tiền IL11 bao gồm 199 amino acid. Đoạn peptide tín hiệu gồm 21 amino acid sẽ được
loại bỏ sau dịch mã để tạo nên dạng IL-11 có hoạt tính với 178 amino acid.
Mức độ tương
 đồng của IL-11 ở người với thỏ là 88%, với linh trưởng khác là
94%. Các vị trí amino acid 59 (methionine), 42 (lysine) và 99 (lysine) là các vị
trí cốt yếu để thụ thể có thể gắn kết với protein [10]. Cấu trúc không gian của
IL-11 được mô phỏng cũng gồm 4 chuỗi xoắn A, B, C, D (hình 1). Tuy nhiên,
không có vị trí nào của asparagine để hình thành cấu trúc glycosil hóa hay sự
biến đổi của chuỗi carbonhydrate. Hơn
 nữa, với thành phần amino acid gồm
proline (12%), leucine (23%) và các amino acid tích điện dương
 khác
 (14%)
 
làm
 điểm đẳng điện của protein có giá trị khác với các cytokine khác (pI =
11,7).

Hình  1.1:  Mô  phỏng  cấu  trúc  không  gian  của  IL-­11  

Trong cơ thể, IL-11 có thể được tiết ra bởi nhiều loại tế bào ở các mô khác
nhau. Về mức độ tiết cơ bản của IL-11 được phát hiện ở các tế bào như nguyên
5


bào sợi, tế bào biểu mô phổi, tế bào sụn, tế bào dịch khớp, tế bào sừng, tế bào
nội mô, nguyên bào xương, một số dòng tế bào ung thư và một số tế bào khác
[11].
1.1.3 Vai trò và ứng dụng của IL-11
Với IL-11, đã có nhiều nghiên cứu không chỉ áp dụng sản phẩm này vào
trong điều trị bệnh mà còn áp dụng vào trong nghiên cứu cơ
 bản để sáng tỏ các
cơ
 chế hay những con đường tác dụng của IL trong cơ
 thể. Những hướng nghiên
cứu ấy được tiến hành trên cả in vitro và in vivo. Trong in vitro, các nghiên cứu
đã chứng minh được rằng, sinh phẩm IL-11 có thể tác động lên nhiều dạng tế
bào khác nhau, bao gồm
 các
 tế bào tạo máu, tế bào gan, tế bào mỡ, đại thực
bào, tế bào biểu mô ruột, tế bào khối u, tế bào tạo xương
 và
 tế bào hủy xương.
 
IL-­‐‑11
 có
 thể tác động kích thích sản xuất các protein pha cấp gan như
 IL-­‐‑6
 mà
 

không
 ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp albumin [12]; IL-11 có thể làm giảm
bớt các sản phẩm trung gian tiền viêm do hoạt hóa lipopolysaccharide [13]; IL11 ức chế sự tổng hợp của IL-12 từ đại thực bào [14]; IL-11 làm giảm tốc độ
sinh trưởng của dòng tế bào biểu mô ruột IEC-6…. Trong nghiên cứu dược
phẩm in vivo, dạng cytokine tạo máu này đã được tiến hành tìm hiểu trên nhiều
mô hình hóa trị liệu hay mô hình ghép tủy xương
 nhằm xác định khả năng ứng
dụng như
 là
 một yếu tố kích thích tạo tiểu cầu. Các kết quả thu được khi thử
nghiệm trên chuột và khỉ đều cho kết quả khả quan về khả năng kích thích tạo
tiểu cầu của IL-11. Chính vì vậy, năm 1997, hãng Neumega đã được cơ
 quan
 
Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration FDA) cấp phép cho việc áp dụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt
tiểu cầu và giảm bớt nhu cầu về tiểu cầu trong quá trình truyền máu sau khi hóa
trị liệu ức chế tủy đối với những bệnh nhân bị u tủy ác tính - những người có
nguy cơ
 cao
 về sự thiếu hụt tiểu cầu [15]. Hơn
 nữa, những nghiên cứu gần đây
nhất còn xác nhận, IL-11 cũng có hiệu quả khi điều trị riêng rẽ hay hiệp đồng

6


với G-CSF trên bệnh nhân bị bệnh máu trắng và các bệnh ung thư
 liên
 quan
 

đến các tế bào máu [16][17][18].
Cùng liên quan đến hệ tế bào tạo máu của cơ
 thể, nhiều công trình nghiên
cứu còn cho rằng IL-3 và IL-11 còn có thể sử dụng phối hợp để tạo hiệu quả
tốt nhất trong điều trị. Nghiên cứu khi sử dụng đồng thời hai loại IL này trên
chuột đã chiếu xạ cho thấy, việc kết hợp điều trị bổ sung IL-3 với IL-11 làm
khả năng sống sót của chuột tăng lên 97% khi so với lô chuột đối chứng. Hơn
 
nữa bằng việc kiểm tra lượng bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu trong máu đã cho
thấy, việc sử dụng phối hợp hai loại IL-3 và IL-11 còn giúp tăng cường khả
năng hồi phục các loại tế bào trong máu [19]. Nghiên cứu khác còn xác định
rằng, IL-11 được sự hiệp đồng từ IL-3 có thể thúc đẩy trực tiếp quá trình phát
triển nguyên mẫu tiểu cầu từ tế bào nguồn ở giai đoạn sớm, trong điều kiện môi
trường nuôi cấy [20][21].
1.1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước
Ung thư đang là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở
nước ta hiện nay. Các bệnh về máu nói chung và đặc biệt là các bệnh của hệ
thống tạo máu ngày càng có xu hướng gia tăng mạnh mẽ. Nguyên nhân gia tăng
các bệnh về máu có thể do môi trường, hoá chất, các loại virus, các chất độc từ
thời chiến tranh, đặc biệt là chất độc da cam đang phát tán hậu quả. Điều đáng
lo ngại là bệnh thường được phát hiện hầu hết ở các bệnh nhân còn trẻ ở lứa
tuổi lao động và gây tỉ lệ tử vong cao. Có rất nhiều loại cytokine như IL-2, IL3, IL4, IL-7, IL-11 hiện đang được sử dụng trong điều trị ung thư bằng liệu
pháp miễn dịch ung thư biểu mô thân, ung thư da ác tính, ung thư máu.
Hiện nay, Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm có
nguồn gốc tái tổ hợp. Viện Công nghệ sinh học là một trong những đơn vị đi
đầu trong lĩnh vực này. Với kinh nghiệm nghiên cứu và sản xuất thành công
IL-2 từ trước, Viện Công nghệ sinh học đã tiếp tục nghiên cứu sản xuất IL-3 và
IL-11 dưới dạng tái tổ hợp. Bên cạnh đó, một số công ty như công ty vắc xin
và sinh phẩm số 1, công ty vắc xin và sinh phẩm Nha Trang (BioPharco), công
7

ty Nanogen đã sản xuất thành công một số dược phẩm có nguồn gốc protein tái
tổ hợp như interferon alpha 2a, interferon alpha 2b, interpheron gamma 1b,
reteplase, filgrastim, insulin,… dùng trong điều trị một số bệnh về tim mạch,
bệnh tiểu đường, viêm gan siêu vi, viêm gan C, một số bệnh ung thư.
1.2 Hệ biểu hiện E. coli
E. coli là một vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que với kích thước bộ gen
là 4,6 Mb [22]. E. coli được sử dụng phổ biến trong việc biểu hiện các protein
tái tổ hợp [23] do có nhiều ưu điểm như: thao tác đơn giản, có khả năng tăng
trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trong các môi trường cơ chất không đắt
tiền (cứ 20 – 30 phút lại nhân đôi một lần) và đặc biệt là chúng có khả năng thu
nhận rất nhiều các yếu tố di truyền vận động từ môi trường ngoài như plasmid,
phage… [24]. Các yếu tố di truyền này có thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong
E. coli. Hơn nữa, những đặc điểm di truyền và sinh lý của E. coli đã được nghiên
cứu khá đầy đủ và hiện nay có rất nhiều chủng chủ đã đột biến đang được
thương mại rộng rãi trên thị trường. Nhiều nghiên cứu cho thấy, hiệu suất tổng
hợp nhiều loại protein ngoại lai trong tế bào E. coli rất cao khi sử dụng các
plasmid phù hợp.
Bên cạnh những thuận lợi đã nêu trên, hệ biểu hiện E. coli cũng có những
hạn chế. E. coli không có khả năng sản xuất hiệu quả các loại protein có kích
thước quá lớn hoặc quá bé. Khả năng tạo và tiết protein ra ngoài tế bào cũng
rất hạn chế, E. coli có khả năng methyl hóa vào 1 số nucleotid trong hệ gen, do
đó gen ngoại lai cũng có thể bị methyl hóa gây ảnh hưởng đến quá trình biểu
hiện gen đó. E. coli không có khả năng sửa đổi sau khi dịch mã, do đó gây hạn
chế ở các protein được phosphoryl hóa, glycosyl hóa…hoặc kết hợp với lipid
để tạo lipoprotein [25]. Mặt khác, trong quá trình tiết, E. coli có khả năng tạo
thể vùi làm mất đi cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein. Trong nhiều trường
hợp protein có nguồn gốc từ tế bào nhân chuẩn được tổng hợp thông qua E. coli
thường không có hoạt tính sinh học hoặc có nhưng thiếu ổn định. Hơn nữa,

nhược điểm khi sử dụng hệ biểu hiện này đối với biểu hiện các protein trị liệu
8


là sự tích luỹ của thành phần lipopolysaccharide (LPS), được biết đến là nội
độc tố gây ra phản ứng phụ cho người và các động vật khi dùng.
1.2.1 Chủng biểu hiện E. coli
Hiện nay, có nhiều chủng E. coli đã được cải biến cho mục đích biểu hiện
gen và mỗi chủng có những ưu và nhược điểm khác nhau. Tuỳ theo đặc tính
protein muốn biểu hiện trong vector nào mà chọn chủng E. coli phù hợp với
từng mục đích sử dụng. Bảng 1.1 liệt kê một số chủng E. coli thường dùng để
biểu hiện protein ngoại lai.
Bảng  1.1:  Một  số  chủng  E.  coli  thường  được  sử  dụng  nhất  để  biểu  hiện  
protein  ngoại  lai  và  những  đặc  điểm  chính  của  chúng  [23]

Để biểu hiện protein ở mức độ cao, chủng E. coli BL21 (DE3) là chủng
biểu hiện phù hợp. Ưu điểm của chủng này là thiếu hụt hai enzyme lon và ompT
protease và tương thích với promoter T7 lacO [26]. Đối với các protein của tế
bào nhân chuẩn, điều rất quan trọng là sử dụng các chủng có nguồn gốc từ BL21
(DE3) mang thêm tRNA để khắc phục vấn đề mã hiếm. Những chủng này cung
cấp thêm các tRNA dưới sự kiểm soát của promoter của chính vật chủ.
Các chủng như BL21 CodonPlus-RIL, BL21 CodonPlus-RP, Rosetta và
những chủng khác được sử dụng để khắc phục trở ngại về mã hiếm tuy nhiên
thành công cũng chỉ ở mức độ hạn chế [23]. Các chủng này cung cấp tRNA cho
các codon như AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA. Như vậy chủng Rosetta
9


cung cấp những tRNA phổ biến mà đối với E. coli là những mã hiếm. Các gen
mã hóa cho tRNA này được điều khiển bởi các promoter nội tại. Chủng Rosetta

(DE3) pLysS có các gen mã hóa cho tRNA trên plasmid mang gen T7
lysozyme.
Chủng vi khuẩn JM109 (DE3), có nguồn gốc từ JM109 được dùng để biểu
hiện ở mức độ cao các gen nối vào vector xuôi chiều từ T7 promoter và nó chứa
gen cảm ứng bởi IPTG để tổng hợp T7 RNA polymerase.
Chủng vi khuẩn SoluBL21 E. coli là chủng chủ BL21 được cải thiện đáng
kể tính hòa tan của protein biểu hiện ra trong hầu hết các trường hợp trong khi
chủng gốc BL21 (DE3) hầu như không tạo ra protein hòa tan nào ngay cả ở
hàm lượng thấp nhất.
Chủng vi khuẩn Origami 2 là chủng có nguồn gốc từ K-12 đã bị đột biến
ở gen thioredoxin reductase (trxB) và gen glutathione reductase (gor), làm tăng
đáng kể sự tạo thành cầu disulfide trong tế bào chất của E. coli. Chủng Origami
2 là chủng nhạy cảm với kanamycin. Để làm giảm khả năng hình thành cầu
disulfide giữa các phân tử, chủng chứa đột biến ở gen trxB và gor được khuyến
cáo chỉ dùng trong trường hợp biểu hiện protein đòi hỏi sự hình thành chính
xác cầu disulfide.
1.2.2 Vector biểu hiện trong E. coli
Có hai loại vector biểu hiện là vector phiên mã (transcription vector) và
vector biểu hiện dịch mã (translation vector). Vector phiên mã được sử dụng
khi ADN được tạo dòng có chứa một codon khởi đầu ATG và một vị trí gắn
ribosome của prokaryote (ribosome – binding site – RBS), còn trên vector dịch
mã có chứa một vị trí gắn của ribosome có ái lực cao và do đó ADN mục tiêu
không cần thiết phải mang trình tự này nữa. Điều này có ý nghĩa đặc biệt trong
trường hợp phần đầu của gen mục tiêu phải được loại bỏ để cải thiện tính tan
của protein mục tiêu. Một lưu ý nữa khi lựa chọn sử dụng vector biểu hiện phiên
mã hay dịch mã là nguồn gốc của ADN cần biểu hiện. Các gen mục tiêu từ sinh
vật nhân chuẩn thường được tạo dòng vào các vector dịch mã trong khi các gen
10

từ sinh vật nhân sơ lại thường được tạo dòng vào các vector phiên mã. Nguyên
nhân là do các gen sinh vật nhân sơ thường có một vị trí gắn của ribosome
tương thích với bộ máy dịch mã của tế bào chủ E. coli trong khi các gen có
nguồn gốc sinh vật nhân chuẩn thì không. Việc biểu hiện các gen sinh vật nhân
sơ có thể được cải thiện nhờ sử dụng các promoter và RBS được thiết kế.
Vai trò của vector biểu hiện là mang các gen ngoại lai mong muốn cho
phép thực hiện sự phiên mã và sự dịch mã các mARN của chúng trong E. coli.
Những vector này được dùng để biểu hiện các gen của sinh vật nhân chuẩn
trong E. coli hoặc tăng hiệu suất các sản phẩm của gen ở sinh vật nhân sơ [27].
Vector này cần phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau:
-  Trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế
bào vật chủ.
-  Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo
duy trì vector trong tế bào.
-  Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản
xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng.
-  Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome được bố trí
thích hợp và codon khởi đầu AUG.
-  Một vùng đa nối (polylinker) để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng
chính xác với promoter.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector peSUMOpro3 làm vector
biểu hiện. Vector có chiều dài 5761 bp (Hình 1.2) là vector được sử dụng chủ
yếu cho biểu hiện gen tái tổ hợp trong E. coli. Về cấu tạo, vector này bao gồm:
- Các trình tự mã hoá gen chỉ thị chọn lọc (Amp) để đảm bảo duy trì sự
tồn tại của vector trong tế bào vi khuẩn đồng thời giúp biểu hiện protein dung
hợp.
- Vùng đa nối (Multiple Cloning Site - MCS) có chứa điểm cắt của một
số enzyme hạn chế để thuận tiện cho việc đưa gen ngoại lai vào vector.

11

- Promoter T7 kiểm soát phiên mã để nhận biết tín hiệu khởi đầu phiên
mã, từ đó cho phép sản xuất 1 lượng lớn mARN từ các gen được nhân dòng
sau cảm ứng.

pE-SUMO Amp
5761 bp
T7 Promoter

 
Hình  1.2:  Sơ  đồ  vector  pE  SUMOpro3  có  chứa  gen  kháng  Ampicllin  

1.2.3 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein tái tổ hợp
Trên thực tế, hệ biểu hiện E. coli có một vài nhược điểm quan trọng: không
có quá trình cải biến sau dịch mã, các sản phẩm protein ngoại lai thường ở dạng
không hòa tan mà tích tụ trong tế bào ở dạng thể vùi, những protein ngoại lai
kích thước lớn trên 70 kDa thường khó biểu hiện trong E. coli. Hiện có rất nhiều
nỗ lực đang được thực hiện nhằm hạn chế những nhược điểm này. Những
nghiên cứu đó đặc biệt tập trung vào các khía cạnh điều kiện biểu hiện protein
và mức độ hòa tan của protein đích, lựa chọn môi trường sinh trưởng phù hợp
cho vi khuẩn chủ và thiết kế vector biểu hiện.
Đối với hệ biểu hiện vi khuẩn E. coli, môi trường nuôi cấy, nồng độ chất
cảm ứng IPTG, nhiệt độ lên men, oxi hòa tan, pH môi trường… là những yếu
tố tác động đáng kể đến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp. Vì vậy, trước khi
biểu hiện lượng lớn, cần tiến hành thăm dò những yếu tố thích hợp cho việc
nâng cao được năng suất sản phẩm protein đích.

12

1.2.3.1 Ảnh hưởng của yếu tố môi trường
Trong quá trình biểu hiện sản phẩm protein ngoại lai, điều kiện môi trường
thích hợp để nâng cao sinh khối tế bào và sản lượng riêng của protein tái tổ hợp
là điều rất quan trọng. Luria broth (LB) là môi trường tiêu chuẩn cho sự biểu
hiện protein. Dung dịch này bao gồm bactotrypton cung cấp các peptide,
peptone và các axit amin thiết yếu, cao nấm men (yeast extract) cung cấp các
vitamin và nguyên tố vi lượng, và muối natri clorua bổ sung các ion natri để
duy trì sự cân bằng thẩm thấu [28]. Terrific broth (TB) là môi trường giàu dinh
dưỡng với hàm lượng peptone, yeast extract và nguồn carbon cao, có khả năng
tăng hàm lượng và khả năng hòa tan của protein. M9, hay môi trường tối thiểu
(minimal medium), chứa các chất dinh dưỡng tối thiểu cần thiết cho các loài vi
khuẩn sinh trưởng.
1.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng
Khi trong môi trường không có chất cảm ứng, gen lacI nằm trên hệ gen vi
khuẩn được phiên mã sinh tổng hợp protein LacI. LacI là chất ức chế, chúng có
ái lực cao với lac operon và bám chặt vào operator làm cho lac promoter điều
khiển phiên mã gen T7 RNA polymerase trong hệ gen chủng chủ và T7 promoter
điều khiển phiên mã gen ngoại lai trên plasmid không hoạt động. Khi được cảm
ứng với IPTG, IPTG bám vào LacI làm cho LacI không còn ái lực với lac
operator nữa và rời khỏi phức hợp với operator trên ADN hệ gen chủng chủ và
plasmid. Khi ấy, lac promoter hoạt động, khởi động sinh tổng hợp T7 RNA
polymerase và chính T7 RNA này bám vào vị trí T7 promoter để khởi đầu quá
trình sinh tổng hợp protein ngoại lai.
Chất cảm ứng IPTG được sử dụng như một yếu tố trung hòa chất ức chế.
Vì vậy, lượng chất cảm ứng bổ sung vào môi trường không cần quá nhiều mà
chỉ cần đủ để trung hòa chất ức chế. Ngoài ra, việc sử dụng IPTG cũng cần có
giới hạn, bởi IPTG sẽ gây độc cho tế bào. Nồng độ IPTG trong môi trường cao
sẽ ức chế vi khuẩn sinh trưởng. Bên cạnh đó, IPTG có giá thành đắt nên việc

13


xác định nồng độ IPTG thích hợp cho quá trình biểu hiện gen ngoại lai là công
việc cần thiết, có ý nghĩa thiết thực cho quá trình sản xuất ở quy mô lớn sau
này [25].
1.2.3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường
Nồng độ ion H+ trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến hoạt
động của vi khuẩn. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ
tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như
chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt ở một pH nhất
định. Việc duy trì pH môi trường rất quan trọng đối với các tế bào chứa gen
kháng ampicillin biểu hiện ở mật độ cao bởi sự phân hủy của ampicillin khiến
pH môi trường giảm, trở nên axit trong quá trình nuôi cấy, bất lợi cho sự sinh
trưởng của vi khuẩn. Ngoài ra, một môi trường có pH thấp cũng có thể gây ảnh
hưởng đến các tế bào vi khuẩn, kết quả là xảy ra sự đào thải plasmid ở mật độ
tế bào cao [29]. Nâng pH môi trường ngay từ ban đầu sẽ giúp kiểm soát pH môi
trường trong suốt quá trình nuôi cấy ở mật độ tế bào cao do môi trường có khả
năng đệm lớn hơn [30].
1.2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng
Nhiệt độ nuôi cấy luôn là một yếu tố quan trọng hàng đầu ảnh hưởng đến
hiệu suất và chất lượng protein. Nhiệt độ càng cao, lượng mRNA càng dễ bị
phá hủy [31]. Đồng thời tính ổn định của plasmid trong tế bào cũng phụ thuộc
vào nhiệt độ. Nhiệt độ càng cao thì khả năng đào thải plasmid càng lớn [32].
Thông thường, ở 37℃, tế bào E. coli sinh trưởng tốt nhất, đồng thời quá
trình sinh tổng hợp protein của chủng diễn ra mạnh mẽ. Vì vậy, khi biểu hiện
một số gen có mã bộ ba tương đồng với mã bộ ba trong E. coli, chủng chủ sẽ
tổng hợp ồ ạt một lượng rất lớn protein ngoại lai. Song song với việc tổng hợp
mạnh protein, các protease cũng được tổng hợp với lượng lớn. Vì thế, những
protein ngoại lai nhạy cảm với quá trình thủy phân sẽ bị protease phân cắt nhanh

chóng.
14


Khi quan sát điều kiện nhiệt độ trong quá trình sinh trưởng và tổng hợp
protein ngoại lai của chủng biểu hiện E. coli, người ta đã phát hiện rằng nhiệt
độ tối ưu cho sinh trưởng của E. coli 37℃ không phải là điều kiện tối ưu tạo
sản phẩm. Khi sinh trưởng với tốc độ cao, các bản sao plasmid trong tế bào
thường giảm, kéo theo sự giảm chất lượng của sản phẩm tạo ra trong quá trình
biểu hiện. Bởi vậy, nhiều thực nghiệm đã cho thấy rằng, với chủng E. coli, điều
kiện tối ưu cho sự biểu hiện tạo sản phẩm protein có chất lượng tốt thường là
nhiệt độ 28-30℃.
Hạ thấp nhiệt độ biểu hiện có thể cải thiện độ hòa tan của protein tái tổ
hợp biểu hiện [33][34]. Ở nhiệt độ thấp, thời gian sinh trưởng và tổng hợp
protein của vi khuẩn chậm lại giúp cho protein cuộn xoắn đúng cấu trúc nên
giảm sự kết tập protein mặc dù điều này không phải luôn xảy ra [28]. Hơn nữa,
hầu hết các protease hoạt động kém tích cực ở nhiệt độ thấp, do đó làm giảm
nhiệt độ biểu hiện dẫn đến làm giảm sự phân hủy các protein nhạy cảm với quá
trình phân cắt bởi protease nội bào [35]. Vì vậy, khi biểu hiện protein ngoại lai
trong chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp cần phải lựa chọn nhiệt độ thích hợp để
thu nhận được tối đa lượng protein tái tổ hợp có hoạt tính sinh học.
1.2.3.5 Ảnh hưởng của thời điểm cảm ứng biểu hiện
Nhiều tác giả đã chứng minh giai đoạn sinh trưởng của tế bào mà tại đó
protein được cảm ứng biểu hiện có ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp và khả năng
hoạt động của protein. Đối với biểu hiện các loại protein tái tổ hợp khác nhau
trên E. coli thì thời điểm thích hợp để cảm ứng là khác nhau [36]. Khi nghiên
cứu biểu hiện beta-defensin-4 của người nhận thấy protein tái tổ hợp được sản
xuất mạnh khi cảm ứng ở OD600 từ 0,8 - 1 [37], cystein protease từ
Porphyromonas gingivalis là OD600 bằng 0,6 [38]. Vi khuẩn E. coli điển hình
thường được cảm ứng khi mật độ tế bào OD600 từ 0,4 - 0,6. Tuy nhiên tuỳ từng

gen biểu hiện và chủng chủ mà có thể cảm ứng ở mật độ tế bào khác nhau.

15


1.2.3.6 Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu biểu hiện
Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, môi trường nuôi cấy đầy đủ chất dinh
dưỡng, vi sinh vật phát triển nhanh chóng đồng thời sinh khối được tích luỹ
nhiều. Các vi sinh vật sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng
sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn.
Tế bào bắt đầu sinh tổng hợp protein mục tiêu ngay sau khi promoter T7lac
được cảm ứng bởi IPTG nên mức độ tích luỹ sản phẩm theo lý thuyết sẽ tăng
dần theo thời gian và cực đại ở một thời điểm nào đó. Khi thời gian lên men
kéo dài, nguồn dinh dưỡng cạn dần, các tế bào chết có thể sản sinh ra các sản
phẩm phụ không mong muốn và các protease phân giải protein vừa tổng hợp
này ảnh hưởng đến lượng sản phẩm tạo thành, chi phí lên men tốn kém hơn.

16


PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid
- Chủng E. coli Rosetta 2 của hãng Novagen (E. coli R2) được sử dụng
làm chủng biểu hiện gen.
- pESUMO_IL-11 là vector biểu hiện pESUMOpro3 của hãng
LifeSensors mang gen il11 đã được thiết kế bởi Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện
Công nghệ sinh học dùng để biểu hiện protein dung hợp SUMO_IL-11.
2.1.2 Hoá chất và enzyme
Các hoá chất thông dụng như Ampicillin, IPTG, 2-Mercaptonethanol,

Acetic acid, Isoamyl alcohol, BactorTMagar, BactorTM pepton, BactorTM Yeast
Extract, BactorTM trypton, NaCl, Ammonium Persulfate (APS), Skimmed milk,
Methanol, SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamid, Glucose, Glycerol đạt tiêu chuẩn
phân tích có xuất xứ từ các hãng Merck và Sigma.
2.1.3 Các môi trường và dung dịch
* Các môi trường và dung dịch sử dụng trong biến nạp plasmid vào E.
coli và lên men protein tái tổ hợp
- Môi trường Luria Bertani (LB) lỏng: Cao nấm men (0,5%); Bacto trypton
(1%; NaCl (1%).
- Môi trường LB-Amp lỏng: Môi trường LB lỏng bổ sung ampicillin đến
nồng độ cuối cùng là 100 µμg/ml.
- Môi trường LB đặc: Môi trường LB lỏng có bổ sung thêm 1,5% agar.
- Môi trường chọn lọc LB-Amp đặc: Môi trường LB đặc bổ sung
ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100µμg/ml.
- Môi trường 10X M9 (1 lít): Na2HPO4 (60 g), KH2PO4 (30 g), NaCl (5
g), NH4Cl (10 g), bổ sung dH2O đến 1 lít.
- Môi trường M9 1X (1 lít): 10X M9 (100ml), 20% glucose (10 ml),
MgSO4 1M (1 ml), CaCl2 1M (0,1 ml), bổ sung dH2O đến 1 lít.

17


- Môi trường M9 + 1% glucose.
- Môi trường M9 + 1% glycerol.
- Môi trường M9 + 0,5% yeast extract.
- Môi trường M9 + 1% glucose + 0,5% yeast extract.
- Môi trường M9 + 1% glycerol + 0,5% yeast extract.
- Môi trường TB: 1,2% pepton, 2,4% yeast extract, 72 mM K2HPO4, 17
mM KH2PO4, 0,4% glycerol.
- Môi trường SB: 3,2% pepton, 2% yeast extract, 0,5% NaCl.

Các môi trường trên được khử trùng ở 121℃, 1 atm trong 20 phút rồi để
nguội trước khi sử dụng. Ampicillin được bổ sung khi nhiệt độ môi trường dưới
50℃ để không bị mất hoạt tính.
* Các dung dịch sử dụng trong điện di protein:
- Đệm xử lý mẫu trước khi điện di (Sample buffer 6X): Tris 0,36 M
(pH=8), Glycerol (60%), SDS (12%), Bromophenol blue (0,06%), 2mecaptoethanol 3/10 (v/v).
- Đệm chạy điện di (Running buffer): Tris base 25 mM, Glycine 192 mM,
SDS 0,1%.
- Hoá chất đổ gel polyacrylamid-SDS
+ Bis-acrylamide 30%: Cân 29,2 g acrylamid và 0,8 g Bis-acrylamide hoà
tan trong 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4℃.
+ Đệm Tris pH=8,8: Tris 1,5M, SDS 0,2% và dùng HCl để chỉnh pH đến
8,8.
+ Đệm Tris pH=6,8: Tris 0,5M, SDS 0,2% và dùng HCl để chỉnh pH đến
6,8.
+ APS 10%: cân 0,1g Amonium persulphate hoà tan vào 1ml nước.
+ TEMED: Sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ các công ty.
+ SDS 10%.

18