Thiết kế vector đột biến gen DNRU trong chủng xạ khuẩn streptomyces peucetius

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

“THIẾT KẾ VECTOR ĐỘT BIẾN GEN DNRU
TRONG CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES
PEUCETIUS ”

Người hướng dẫn: TS.Tạ Thị Thu Thủy
Th.S Nguyễn Thành Chung
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Nhân Hậu
Lớp

:KS CNSH- 1202

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô công tác tại
khoa công nghệ sinh học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho
em được học tập trong môi trường khoa học và hoàn thiện nhất.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy, cô giáo - ThS
Nguyễn Thành Chung và TS. Tạ Thị Thu Thủy. Người đã dành rất nhiều thời
gian và tâm huyết định hướng nghiên cứu giúp đỡ em trong suốt quá trình
thực hiện bài khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo- Kỹ sư khoa
Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã nhiệt tình hướng dẫn
và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập cũng như hoàn thành đề tài của

mình.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình,
bạn bè, người thân và toàn thể các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Học
Phân Tử đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân em đã có nhiều cố
gắng tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em mong
nhận được sự góp ý của quý thầy – cô để bài khóa luận của em được đầy đủ
và hoàn chỉnh hơn
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Nhân Hậu


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..............................................1
PHẦN I. TỔNG QUAN .....................................3
1. Tổng quan về kháng sinh .................................3
1.1. Lịch sử hình thành chất kháng sinh .......................3
1.2 Định nghĩa về chất kháng sinh. .........................4
1.3. Phân loại kháng sinh .................................5
1.4. Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh ......................6
1.4.1 Ức chế chức năng của màng tế bào ......................7
1.4.2. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein....................7
1.4.3. Ức chế chế quá trình sinh tổng hợp nucleic acid .............7
1.2. Tổng quan về xạ khuẩn .................................8
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên. ......................8
1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ..............9
1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peuticeus ATCC27952 .............10

1.3Kháng sinh Doxorubicin. ...............................11
1.3.1. Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin. ...................11
1.3.2 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của Doxorubicin. .......12
1.3.2.1 Hoạt tính sinh học của Doxorubicin ....................12
1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của kháng sinh Doxorubicin. ............13
1.3.3.2 Thành tựu nghiên cứu. ............................14
1.4. Tổng quan về gen dnrU ...............................16
1.4.1. cấu trúc gen dnrU ................................16
1.4.2 Vai trò của gen dnrU ...............................17
1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu. .........................17
1.5.1. Mục tiêu của đề tài. ...............................17
Phần II ...............................................18
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ..................18
2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị ..............................18
2.1.1 Vật liệu .......................................18
2.1.2 Môi trường .....................................19
2.1.3 Hóa chất .......................................20
2.1.4 Thiết bị........................................24


2.2. Các phương pháp nghiên cứu. ...........................26
2.2.1. Thiết kế mồi. ...................................26
2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số của xạ khuẩn. ..........26
2.2.3. Phương pháp PCR. ...............................28
2.2.4 Phương pháp fusion PCR. ..........................30
2.2.5 Phương pháp điện di gel agarose. ......................31
2.2.6 Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose. ...............31
2.2.7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn. ..........32
2.2.8. Phương pháp chuyển gen bằng phương pháp sốc nhiệt. .......33
2.2.9 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn. .............34

2.2.10 Phương pháp nối DNA. ............................35
2.2.11. Phương pháp giải trình tự gen. .......................36
PHẦN III .............................................38
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................38
3.1Kết quả thiết kế mồi tạo vector đột biến gen dnrU ...............38
3.2 Tách dòng đoạn TU, SU và Neor ..........................39
3.2.1 Tách chiết DNA genome của chủng xạ khuẩn S.peucetius ......39
3.2.2 Tách đoạn Neor từ plasmid pFDNEO-S modified. ..........39
3.2.3 Tách dòng đoạn gene TU ...........................40
3.2.4 Tách dòng đoạn gen SU .............................41
3.3 Tạo đoạn fusion PCR nối 3 đoạn gen TU-Neor –SU .............42
3.4 Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn gen TU, Neor, SU..............43
3.5 ...... Kết quả ghép nối đoạn gen TU-Neor-SU vào vector PKC1139, biến nạp
vào tế bào E.coli JM109. ...............................44
3.5.1 Kết quả cắt TU-Neor –SU Vector pGEM T-TU-Neor-SU và....44
3.5.2 Tạo vector pKC 1139 TU-Neor-SU .....................45
Phần IV ..............................................48
Kết luận và đề xuất .......................................48
4.1 kết luận ..........................................48
4.2. Đề xuất ..........................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................49
Tài liệu tiếng việt: ......................................49
Tài liệu tiếng anh: ......................................49
Trang web tham khảo: ...................................50


Chữ viết tắt
Amp
Apr
Bp

C
CKS
Cm
DMSO
DNA
dNTPs
ORFs
RNA
Gr+
GrKb
Neo
Neor
PCR

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chú thích
Ampicillin
Apramycin
Base pair
Carbon
Chất kháng sinh
Chloramphenicol
Dimethyl sulfoxide
Deoxyribonucleic acid
Deoxyribonucleotides
Open reading frames
Ribonucleic Acid
Gram dương
Gram âm
Kilobase

Neomycin
Gen kháng neomycin
Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Ter

Tetramycin


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ........................................ 7
Hình 1.2 cấu trúc kháng sinh doxorubicin ...................................... 11
Hình 2.1: a) Cấu trúc pGEM – T vector; b) vector PKC1139 ..... 19
Hình 2.2 .Sơ đồ phản ứng Fusion PCR. .......................................... 30
Hình 2.3: Phản ứng cắt của enzyme giới hạn .................................. 35
Hình 2.4 quá trình nối DNA ............................................................ 35
Hình 2.5. Giải trình tự bằng đánh dấu huỳnh quang ....................... 37
Hình 3.1. Điện di AND genome ...................................................... 39
Hình 3.2 Kết quả tinh sạch đoạn gen Neor ...................................... 40
Hình 3.3.điện di PCR đoạn TU ....................................................... 41
Hình 3.4 điện di PCR đoạn gen SU ................................................. 41
Hình 3.5. Nối 3 đoạn gen TU-Neor-SU bằng fusion PCR .............. 42
Hình 3.6 Điện di đoạn gen TU-Neor-SU sau phản ứng fusion PCR
......................................................................................................... 43
Hình 3.7.Quá trình tạo vector tái tổ hợp pGEM T-TU-Neor-SU .... 43

Hình 3.8 Điện di quá trình tạo vector pGEM T-TU-Neor-SU ....... 44
Hình 3.9 Quá trình tạo vector đột biến gen dnrU ........................... 45
Hình 3.10 khuẩn lạc E.coli JM109 .................................................. 45
Hình 3.11 điện di plasmid PKC-TU-neor-SU ................................. 46
Hình 3.12 kết quả cắt kiểm tra PKC-TU-Neor-SU biến nạp trong
E.coli JM109 bằng BamHI .............................................................. 46



DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 thiết bị dùng trong quá trình thực hiện đề tài ................................. 24


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
MỞ ĐẦU
Kháng sinh là một nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ các
thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm
như dịch hạch, tả, thương hàn và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi
các vi khuẩn. Đặc biệt đối với các nước nghèo, các thuốc kháng sinh lại giữ
một vị trí rất quan trọng vì ở các nước này do điều kiện vệ sinh yếu kém và
mức sống còn thấp nên thường xảy ra các vụ dịch ỉa chảy, kiết lỵ, nhiễm
khuẩn hô hấp... Theo các số liệu thống kê mới nhất, thì các kháng sinh chiếm
khoảng 10% tổng số thuốc sử dụng trên toàn thế giới (tính trên cơ sở giá trị
tiền thuốc bằng đôla Mỹ).
Tuy nhiên trong báo hàng năm mới đây về nguy cơ toàn cầu của diễn
đàn kinh tế Thế giới (WEF) đã kết luận : nguy cơ lớn nhất đối với sức khỏe
con người xảy ra ở dạng vi khuẩn đề kháng kháng sinh. Đó chính là do việc
sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh xuất
hiện, phát triển và ngày càng lan rộng. Việc sử dụng một số chất đặc hiệu để
chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại hiệu quả như mong muốn. Số

lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng gia tăng.
Doxorubicin là một kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin gây độc tế bào
được phân lập từ môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius var. caecius.
Hiện nay được tổng hợp từ Daunorubicin. Doxorubicin kích ứng mạnh các
mô và có thể gây hoại tử mô, ví dụ trong trường hợp tiêm ra ngoài mạch máu.
Hoạt tính sinh học của doxorubicin là do doxorubicin gắn vào DNA làm
ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA. Doxorubicin gây
gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn
gián phân, nhưng thuốc cũng tác dụng trên các giai đoạn khác của chu kỳ phát
triển tế bào.
Doxorubicin có thể dùng đơn độc hoặc phối hợp với thuốc chống ung thư
khác. Sự kháng thuốc chéo xảy ra khi khối u kháng cả Doxorubicin và
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Daunorubicin. Doxorobicin là một kháng sinh có giá thành rất đắt và hiện nay
ở Việt Nam chưa sản xuất được. Trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh
doxorubicin gen dnrU mã hóa enzyme Daunorubicin -13 ketoredustase thực
hiện chuyển hóa DNR thành 13S-13-dihydrodaunorubicin khiến cho DNR
không chuyển hóa thành DXR. Vì vậy em thực hiện đề tài “ Thiết kế vector
đột biến gen dnrU trong Streptomyces peucetius” nhằm đột biến gen dnrU
để DNR không bị chuyển hóa thành (13s)-13 dihydrodaunnorubicin. Từ đó
DNR sẽ chuyển hóa thành DXR nhờ hoạt động của enzyme Daunorubicin
(-13) hydroxylase làm tăng sản lượng DXR .

NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHẦN I. TỔNG QUAN
1. Tổng quan về kháng sinh
1.1. Lịch sử hình thành chất kháng sinh
Từ lâu con người đã biết dùng nấm mốc (mold, milew) trên đậu phụ để
đắp chữa các vết thương nhỏ. Nhiều thế kỷ trước tại châu Âu, châu Mỹ, người
ta đã biết cách dùng bánh mỳ, ngô hay giày da cũ đã lên mốc để điều trị các
vết lở loét, lên mủ ở da. Theo quan điểm khoa học hiện nay thì mốc meo trên
đậu phụ hay trên bánh mỳ thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người
xưa chưa biết vi khuẩn là gì, lại càng không biết chất kháng sinh là gì.
Cho đến năm 1928 Nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleaming
phát hiện lần đầu tiên trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng bị nhiễm nấm và
xung quanh loại nấm này tụ cầu vàng không thể phát triển được. Nghiên cứu
hiện tượng lạ này, ông xác định được nấm đó là Penicillum Notaum có khả
năng tiết ra một chất có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus
Aureus, sau này được gọi là penixillin.
Năm 1929 ông đã đem phát hiện của mình về penicillin công bố và
khẳng định rằng chất penicillin có thể trở thành một thứ thuốc quan trọng
nhưng ông không có khả năng và kỹ thuật để chiết xuất. Trong 10 năm sau
đó, ông âm thầm làm các công việc khác trong khi vẫn tìm cách chiết tách
penicilin, còn báo cáo của ông về penicilin dần rơi vào quên lãng khi giới y
học lúc đó cho rằng nấm chỉ đem lại bệnh tật, chứ không thể chữa bệnh được.
Năm 1938, ông nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học
Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được
hợp tác với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicilin. Và
sự hợp tác đã mang lại thành công họ đã tách được penicillin từ nấm
penicillum và thử nghiệm trên chuột vào năm 1940.

Năm 1941, nhóm nghiên cứu đã chọn được loại nấm penicilin ưu việt
nhất là chủng Penicilin Chrysogenium, chế ra loại penicilin có hoạt tính cao
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
hơn cả triệu lần penicilin do Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928. Năm 1944
penicillin đã được sản xuất trên quy mô lớn ở Mỹ để phục vụ chữa trị các
bệnh nhiễm khuẩn cho thương binh trong chiến tranh thế giới thứ II. Sau đó
một số cũng sản xuất được penicillin G và penicillin V.
Năm 1944 penicillin đã được sản xuất trên quy mô lớn ở Mỹ để phục
vụ chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn cho thương binh trong chiến tranh thế giới
thứ II. Sau đó một số cũng sản xuất được penicillin G và penicillin V.
Năm 1945, Fleming được nhận giải thưởng Nobel về y học cùng với
Ernst Boris chain và Howard Walter Florey.Việc phát hiện ra penicillin là
một bước ngoặt lớn trong lịch sử y học thế giới. Làm tiền đề cho các nhà
khoa học khác tìm ra những loại kháng sinh mới như : Streptomycescin được
Waksman tìm ra vào năm 1944 bởi sự nuôi cấy nấm Streptomyces griseus.
Đến nay với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học và hóa dược con
người đã biết được hơn 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm
mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn, 150 kháng sinh được dùng trong y khoa và thú y.
1.2 Định nghĩa về chất kháng sinh.
Năm 1942 Tiến sĩ Selman A.Waksman đưa ra định nghĩa đầu tiên về
kháng sinh :“Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các
vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc
tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác".
Về sau, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, người ta có thể tổng
hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân

tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh
vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin).
Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi : “ Kháng sinh là tất cả các
hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả
năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây

NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật
và thực vật bằng con đường cung cấp chung”.
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml
dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị
kháng sinh. Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong
một thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật
kiểm định trong thời gian xác định . Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1
UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007).
1.3. Phân loại kháng sinh
Phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục cá thể do
việc tìm ra các chất kháng sinh ngày càng nhiều. Có thể phân loại kháng sinh
dựa trên phương diện như phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con
đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học. Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc
hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối
với các nhóm kháng sinh.
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính :
Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate gồm:
Các saccarit thuần nhất (Nojirmycin)

Các aminoglycoside (Streptomyces)
Các ortozomycin ( Everninomycin)
Các N-glycosid (Steptortycin)
Các photphopeptid (Vancomycin)
Các glycolipid (Moenomycin).
Nhóm 2: Các lactone macrolide.
Các kháng sinh macrolid (Erythromycin)
Các kháng sinh polyen (Nystatin)
Các anzamycin (Rifamicin)
Các macrotetrolid (Tetranactin)
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất
Các tetracylin (tetracylin)
Các antracyclin (Actinorodin)
Các naftoquinonm (Mitomycin)
Các benzoquinone (Mitomycin)
- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid
Các dẫn xuất axit amin (Cycloserin)
Các kháng sinh beta-lactam(Penicillin)
Các kháng sinh peptid (Bacitracin)
Các cromopeptid (Actinomycin)
Các peptid tạo kelat (Bleomycin)
- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
Các kháng sinh nucleozid polyoxin
- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

Kháng sinh polyete (Monenzim)
- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
Các dẫn chất alkan (Cytcloheximid)
Kháng sinh steroid (Fuzidic acid)
- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
Các dẫn chất benzene (Chloramphenicol)
Các chất nhân thơm ngưng tụ (Griseofulvin)
- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng
Các chất chứa photpho (Photphomycin).
1.4. Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh
Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh của mỗi CKS thường mang
những đặc điểm riêng, tùy vào thuộc vào bản chất của kháng sinh đó. Các tác
động thường gặp là rối loại cấu trúc thành tế bào , ức chế quá trình sinh tổng
hợp protein, rối loại quá trình tái bản DNA, rối loại chức năng điều tiết quá
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
trình vận chuyển chất qua màng tế bào chất, hoặc tương tác đăc hiệu với
những giai đoạn nhất định trong chuyển hóa và trao đổi chất.

Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của kháng sinh

1.4.1 Ức chế chức năng của màng tế bào
-

Thay đổi chức năng năng lượng, ảnh hưởng sự hô hấp tế bào:

gramicidin, sideromycin.
-

Kháng sinh gắn lên màng tế bào chất làm thay đổi cân bằng thẩm thấu

của màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng
sinh chống nấm nistatin.
1.4.2. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
Tetracyclin gắn vào tiểu phần 30S của ribosome ức chế gắn aminoacylARN vào vị trí mới làm cho quá trình dịch mã tổng hợp protein không chính
xác.
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi
polypeptide mới thành lập.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm
ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide.
1.4.3. Ức chế chế quá trình sinh tổng hợp nucleic acid
Mitomycin kết hơp với DNA ngăn cản 2 chuổi DNA tách rời ức chế sự
nhân đôi của DNA.
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã
tạo thành mRNA (RNA thông tin).
Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch
đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của
DNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác dụng

cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân purine
làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.[2]
1.2. Tổng quan về xạ khuẩn
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên.
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,
bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển
được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc khí hậu, thành phần đất, mức độ
canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 ÷ 45% tổng số vi sinh vật .Một trong những đặc tính
quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 ÷
70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới
80% là do xạ khuẩn sinh ra [1]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các
loại xạ khuẩn hiếm như: Miccromonospora actinomadurahiếm, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm, đã cung cấp nhiều CKS có giá trị đang dùng trong y học như
gentamycine, tobramycine, vancomycine, rovamycine. Nhiều xạ khuẩn có khả
năng sinh chất kháng sinh.

NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Ngoài ra, xạ khuẩn còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa
và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững trong đất như

cenlulose, tinh bột, chất mùn kitin, keratin…góp phần khép kín vòng tuần
hoàn vật chất trong tự nhiên. Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có
thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12);
một số axit hữu cơ như lactic acid, acetic acid; amino acid như glutamic acid,
methyonine, tryptophan, lysine. Một số khác có khả năng tạo thành các chất
kích thích sinh trưởng thực vật. Xạ khuẩn được dùng rộng rãi trong các ngành
công nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm lên men hoặc ứng dụng các men
do xạ khuẩn sinh ra nhiều như proteinase, amylase, cellulase, kitinase…
Tuy nhiên bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các
chất độc kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng cũng như sự phát
triển của hệ vi sinh vật có ích trong đất, một số khác lại là nguyên nhân gây ra
một số bệnh khó chữa ở người và gia súc. Hai nhóm xạ khuẩn quan trọng là
tác nhân gây bệnh ở người là Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao và
Corynebacterium diphtheria gây bệnh bạch hầu.
1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành CKS. Trên thế giới, trong số hơn 8000 CKS do vi sinh vật tổng
hợp hiện nay thì trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn.
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ vi sinh vật nói
chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác
dụng với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết các CKS có nguồn gốc từ xạ
khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng , kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và
phát triển của nhiều loài vi sinh vật khác nhau.
Ngày nay, người ta đã biết CKS là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của
vi sinh vật. Dù vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của CKS đối
với xạ khuẩn. Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS.
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 9

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là cơ chế giúp xạ khuẩn tồn tại
trong môi trường tự nhiên, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh môi trường
dinh dưỡng. Lại có giả thuyết cho rằng CKS chỉ là sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp của quá trình trao đổi chất của tế bào, được hình thành vào cuối pha lũy
thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng.
Có 3 con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn:
-

CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi
phản ứng enzym.

-

CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau.

-

CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa
sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có
cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS
phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng
hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme
và cofactor tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh.
1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peuticeus ATCC27952
Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500
loài, có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong ADN. Một phần rất lớn các chất

kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài
thuộc chi Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là Streptomycin,
erythromycin và tetracyclin
Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm
1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này
có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh.
Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 thuộc chi Streptomyces, là
chủng sản sinh ra kháng sinh doxorubicin. Khi sinh trưởng trên môi trường
NDYE ở nhiệt độ 280C sau 4-5 ngày thì bắt đầu xuất hiện khuẩn lạc.
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Về hình thái xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 tồn tại ở
dạng khuẩn ty. Khi nuôi trên môi trường đĩa thạch hoặc dịch lỏng thì dịch
nuôi có nâu đỏ, các tế bào tồn tại dưới dạng sợi mảnh, nhỏ nhưng liên kết với
nhau thành từng búi sợi. Mỗi sợi khuẩn ty bao gồm nhiều đốt nhỏ và mỗi đốt
nhỏ là một tế bào xạ khuẩn.
Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 có khả năng hấp thụ các
nguồn cacbohydrat khác nhau. Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong môi
trường có glucose, sacharose và maltose. Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn này sinh
trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất là trong
môi trường có maltose [17][18].
1.3 Kháng sinh Doxorubicin.
1.3.1. Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin.
Công thức phân tử: C27H29NO11 .
Tên khác: C-14 hydroxydaunorubicin .
Tên thương mại: Doxil, Adriamycin .

Tên khoa học: (8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methylt-etrahydro-2Hpyran-2-yloxy)-6,7,8,11-trihydroxy-8-2-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-7,8,9,10tetrahydrotetracene-5,12-dione.
Kích thước: 1.583 × 1.212 (4 KB)
Khối lượng phân tử: 543.526 đơn vị Cacbon
Nhiệt độ nóng chảy: 205oC
Tính tan: Tan trong MeOH, Cloroform, không tan trong nước và hexan.

Hình 1.2 cấu trúc kháng sinh doxorubicin

NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.3.2 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của Doxorubicin.
1.3.2.1 Hoạt tính sinh học của Doxorubicin
Doxorubicin tác động vào tế bào ung thư bằng cách tương tác với ADN,
ức chế sự tổng hợp axit nucleic (ARN - quá trình phiên mã) và sự phân chia
của tế bào ung thư [21] [22].
Các enzyme ADN Topoisomerase chính là các mục tiêu tác động của
DXR trong sự tiêu diệt tế bào ung thư. DXR thực hiện quá trình ức chế trực
tiếp lên sự hoạt động của các enzyme này, làm gián đoạn chức năng đồng thời
thay đổi chức năng tự nhiên của nó tạo ra sự đứt đoạn trong phân tử ADN
cuối cùng dẫn đến các tế bào ung thư bị chết
Enzyme ADN Topoisomarse
Lịch sử: Enzyme ADN Topoisomerase do James C. Wang là nhà sinh
học người Mỹ gốc Trung Quốc phát hiện ra và đề xuất cơ chế hoạt động của
chúng trong những năm 1970 [10].
Chức năng: Xúc tác và điều khiển quá trình tháo xoắn hoặc mở nút
bằng cách phá vỡ sự liên kết một đoạn ngắn trên phân tử ADN [23].

Phân loại: Dựa vào số lượng sợi cắt trong một đợt hoạt động phân loại
enzyme ADN Topoismerase làm hai loại là loại I và loại II.
- Enzyme ADN Topoisomerase loại I
Enzyme ADN Topoisomerase loại I có cấu trúc như là một monomer gồm
bốn tiểu phần riêng biệt. Các thành phần chính gắn với nhau bằng đầu Cacbon
và đầu Nito. Hai đầu này gắn với các rãnh lớn và nhỏ tương ứng. Là enzyme
nuclease đặc biệt có vai trò trong quá trình bẻ gãy liên kết photphodiester giữa
các bazơ trên một mạch đơn tạo ra vết đứt giải phóng hai đầu và dạng sợi tự
do. Các đầu tự do này sẽ quay để giúp cho quá trình mở xoắn sợi ADN giúp
cho quá trình sao chép, tái bản. Do phân tử ADN có cấu trúc xoắn kép nên
trong quá trình nhân đôi tại chạc sao chép được mở ra và chạc này chuyển
động theo sợi khuôn sẽ khiến sợi này xoắn lại rất chắc. Enzyme ADN
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Topoisomerase I đóng vai trò mở xoắn để khắc phục sự xoắn cho quá trình
sao chép, sau đó liên kết photphodiester lại được phục hồi và enzyme tách
khỏi ADN.
- Enzyme ADN Topoisomerase loại II
Enzyme ADN Topoisomerase loại II có khả năng cắt đứt cả hai mạch trên sợi
ADN và sau đó xúc tác cho quá trình phục hồi gắn lại hai sợi ADN. Vì vậy
mà enzyme này vừa có chức năng tháo gỡ siêu xoắn trong quá trình tái bản
ADN vừa có chức năng tạo ra trạng thái siêu xoắn trở lại của sợi ADN bằng
cách đảo mạch hai sợi xoắn kép hoặc gắn hai đầu xoắn của sợi xoắn kép sau
đó lồng vào với nhau để tạo siêu xoắn và co ngắn sợi AND.
1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của kháng sinh Doxorubicin.
Trong tế bào ung thư, enzyme ADN Topoisomarase được sinh tổng hợp và

biểu hiện với tốc độ rất cao. Sau đó, enzyme này xúc tác cho quá trình sao
chép ADN hay quá trình phân chia tế bào ung thư diễn ra rất nhanh chóng.
Kết quả là số lượng tế bào ung thư sẽ được nhân lên với một số lượng lớn. Do
đó, enyme ADN Topoisomarase là mục tiêu của rất nhiều loại thuốc kháng
sinh chống và điều trị ung thư trong đó có cả kháng sinh DXR.
Khi xảy ra sự tương tác với tế bào ung thư, DXR sẽ gây ức chế quá trình sinh
tổng hợp ADN hay quá trình phân chia tế bào ung thư bằng cách phân tử
DXR hình thành mối tương tác xen kẽ giữa các cặp bazơ trong chuỗi ADN ở
trạng thái xoắn kép từ đó ức chế hoạt tính của enzyme ADN Topoisomarse II
dẫn đến ức chế quá trình tháo xoắn và mở xoắn của ADN. Ngoài ra, DXR còn
giúp cho quá trình cố định lại phức hệ Topoisomarase II với ADN và sau khi
tháo xoắn kép cho quá trình sinh tổng hợp phân tử ADN đó không có khả
năng đóng xoắn lại hay ghép lại mạch bởi cầu nối photphodieste.
Các nghiên cứu về kháng sinh Doxorubicin
Kháng sinh DXR và những chế phẩm của nó đã được áp dụng thử nghiệm
lâm sàng vào những năm của thập niên 1960. Qua các nghiên cứu thực tiễn đã
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
chỉ ra rằng kháng sinh này có khả năng ức chế sự hoạt động của tế bào. Hiện
nay DXR đã được nhiều công ty dược lớn trên thế giới nghiên cứu sản xuất và
bào chế thành nhiều dạng thuốc lưu hành trên thị trường với một số tên gọi
khác như Adriamycin CS, Adrim, Doxorubicin hidrocloride....
DXR được dùng để điều trị về các bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu,
và khối u hệ lympho gồm các bệnh như :Điều trị ung thư vú, u xương ác tính
(sarcom xương) và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác
tính cả 2 dạng: Hodgin và không Hodgin, ung thư biểu mô tuyến giáp

(carcinom tuyến giáp).
Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang,
ung thư tinh hoàn. Khối u đặc biệt của trẻ em như: Sarcom cơ vân
(Rhabdomyosarcom), u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp, ung
thư cổ tử cung, ung thư âm đạo, ung thư đầu cổ, ung thư dạ dày. Thuốc có tác
dụng tốt trên một số ung thư hiếm gặp như: đau tủy xương, u màng hoạt dịch,
u quái và u nguyên bào võng mạc.
1.3.3.2 Thành tựu nghiên cứu.
Hiện nay với nền khoa học hiện đại nghiên cứu tạo ra thuốc chống ung
thư đã áp dụng các phương pháp sinh tổng hợp, hóa tổng hợp hoặc kết hợp
bán tổng hợp tạo ra thư viện dự trữ, tổ hợp lại các hợp chất có hoạt tính chống
ung thư. Kết hợp với việc áp dụng công nghệ enzyme, kết hợp các enzyme để
sinh tổng hợp kháng sinh tạo ra nhiều dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao hơn,
tạo ra thế hệ kháng sinh lai, kháng sinh thế hệ mới bằng phương pháp invitro
và invivo. Áp dụng các công cụ và các phương pháp nghiên cứu hiện đại như
sinh học phân tử, nghiên cứu cấu trúc gene, nghiên cứu tối ưu hóa trong quá
trình lên men sản xuất kháng sinh trên quy mô công nghiệp...
Nghiên cứu nhằm nâng cao năng xuất tổng hợp Doxorubicin bằng các phương
pháp hiện đại. Theo nghiên cứu của Sailesh Malla và các cộng sự năm 2010,
DXR là nhóm kháng sinh rất độc nên số lượng sinh ra trong tế bào rất ít nếu
NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
được tổng hợp theo con đường tự nhiên. Vì vậy quá trình tổng hợp DXR được
điều hòa rất nghiêm ngặt bởi cơ chế điều hòa của nhóm gen dnrV, dnrI, afsR
và metK1-sp từ Streptomyces peucetius ATCC27952. Với nghiên cứu này
nhóm gen điều hòa được chuyển vào vector có chứa promotor mạnh ( ermE*),

sau đó chuyển vào tế bào vật chủ để tạo ra chủng tái tổ hợp đã tăng khả năng
sinh tổng hợp Doxorubicin cao hơn gấp 3-4,3 lần so với tế bào ban đầu.
Trong nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh DXR có chứa gen vận
chuyển

(glycosyltranferase - dnrS/dnrQ) gắn nhóm đường vào gốc

rhonohodine D. Khi hai gen này được chuyển vào vector có chứa promoter
mạnh (ermE*) đồng thời chuyển nhóm gen sinh tổng hợp đường khử trong
vector này. Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp này hay chủng tái tổ hợp đã
có khả năng tăng tổng hợp mạnh DXR hơn. Theo số liệu đã được công bố và
phân tích thì lượng DXR được tạo ra cao gấp 5,6 lần so với lượng kháng sinh
được tạo ra từ chủng tự nhiên.
Nghiên cứu tạo thế hệ kháng sinh mới từ DXR.
Nhóm Miyamoto Y (Nhật Bản năm 2000) đã tạo ra kháng sinh lai thế hệ mới
thuộc nhóm anthracyline bằng phương pháp tạo chủng Streptomyces
Violaceus tái tổ hợp. Gene dnrK mã hóa cho carminomycin 4-Ometyltransferase. Chủng thuộc nhóm gen sinh tổng hợp DXR được chuyển
vào chủng xạ khuẩn Streptomyces Violaceus. Chủng này đã tạo ra kháng sinh
anthracyline mới là dẫn xuất của DNR và DXR (4-O-methylepelmycin D).
Cho tới năm 1991 đã có tới 553 dẫn xuất đang trong giai đoạn thử nghiệm
lâm sàng tại NCI . Theo thống kê của Viện Nghiên Cứu Ung Thư của Mỹ
(National Cancer Institute - NCI), đã có hơn 2000 dẫn xuất, các hợp chất sinh
học thuộc nhóm anthracyline có cấu trúc đồng dạng với kháng sinh trên được
tạo ra.
Các nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện trong lên men sinh tổng hợp DXR

NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 15

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Các nghiên cứu của Hutchinson và cộng sự đã chỉ ra rằng Streptomyces
Peucetius tổng hợp và tiết DXR ngoại bào ra môi trường nuôi cấy bằng
phương pháp lên men chìm đạt hiệu quả cao khi sử dụng nguồn dinh dưỡng
với tỷ lệ thích hợp. Tỷ lệ này đã được tối ưu hóa với (gram/lit) nguồn Cacbon
là Glucose (60), Sacarose (1000), bột malt (20), nguồn Nito với Cao nấm men
(8), nguồn khoáng: NaCl (2), MOPS (15), MgSO4 (0,1), FeSO4.7H2O (0,01),
ZnSO4.7H2O (0,01). Với nhiệt độ thích hợp là 28-30oC và thời gian lên men
là 4-5 ngày. Với điều kiện trên hiệu xuất thu được là 1,5 miligram/lit dịch lên
men thực hiện với chủng tự nhiên.
Theo nghiên cứu của nhóm Sohng (2009), áp dụng phương pháp tái tổ hợp về
di truyền, công nghệ chuyển gene và nghiên cứu vai trò của các gene có khả
năng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh để tạo ra chủng tái tổ hợp
và kết hợp với các điều kiện lên men tối ưu đã được công bố bởi nhóm
Hutchinson như nguồn Cacbon, nguồn khoáng, nguồn Nito, chế độ lên men
như PH, tốc độ lắc, thời gian nuôi cấy đã giúp tăng hiệu xuất tổng hợp kháng
sinh lên tới 11,5mg/lít.
1.4. Tổng quan về gen dnrU
1.4.1. cấu trúc gen dnrU
Tên gọi dnrU: daunorubicin C-13 ketoreductase có kích thước 863 bp
TCAGTGCGCGGTGTCGCCGACGGCGGCCGCGCCGGCCTCCCAGAGCTTCGCCGCGAGGCCGG
CGTCGGCGGTCGGGCCGCTCACCGGGGACAGCCGCCGGTCGCTGTAGTAGCCGCCCGTGG
TCAACTCCTCGGCCGGCGCGGACGCCAGCCACACGAGGGTGTCGGCGCCCTTCGCCGCGG
AGCGCAGGAAGGGGTTGAACCGGAAGTAGGACGAGGCGACCGTGCCCCGTCCGATGCGGG
TGCGGACCTCACCGGGGTGATAGCTGACCGCCAGCACGTCCGGCCAGCGCCTGGCGGCCT
CCGCCGCGGTCATGATGTTGGCCTGTTTGGACGTGCCGTACGCCTGGCCGGCGCTGTAGC
GGTGACGGTCGCCGTTGAGGTCGTCCGGGTCGATCCGGCCCTGGGTGTACGCGTCGGACG
AGGTGAGGATCAGCCGCCCGCCCGCGAGCCGCTCCCGCAGCAGCCGTGCCAGCAGGAAGC
CTGCGAGGTGATTGACCTGGATGGTGGCCTCGAACCCGTCCTGGGTCGTGGTGCGCGACC

AGAACATGCCGCCGGCGTTGCTGGCCATGACATCGATGCGCGGGTACCGGTCCCGCAGCC
GCTCCCCCAGGTCGCGTACCTGGCGCAGCTCGGCGAAGTCCGCGCGGAAGGCGTCCGGGG
CCGGGCCGGCGGTCCGGGCCACCTCGTTCGTGACGGTCCGCAGACGCTCGGGGTCCCGGC
CGACGAGCACGACGCGGGCCCCCTGGCGGGCGACCGCGAGGGCCGCCGCCCGGCCGATGC
CGGACGTGGCCCCGGTGACCAGCACCGTCCGGCCCGACAGGCCGCCGCGTGGTGTCCCGT
GGTGCGGGGTGGAGGCCGTCAT

NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.4.2 Vai trò của gen dnrU
dnrU trong Daunorubixin mã hóa enzyme Daunorubicin -13
ketoredustase thực hiện chuyển hóa DNR thành 13S-13-dihydrodaunorubicin
khiến cho Daunorubicin không chuyển hóa thành Doxorubicin và làm giảm
khả năng sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces peuticeus.
1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu.
1.5.1. Mục tiêu của đề tài.
Mục tiêu: tạo vector đột biến để gây đột biến gene dnrU nhằm tăng
cường quá trình chuyển hóa Daunorubicin thành Doxorubicin, nâng cao khả
năng sinh tổng hợp doxorubicin trong Streptomyces peucetius.
1.5.2. Nội dung thực hiện.
1/ Tách dòng đoạn TU là đoạn tương đồng với đoạn AND phía trước của gene
dnrU từ DNA genome xạ khuẩn Streptomyces peucetius
2/ Tách dòng đoạn SU là đoạn tương đồng với DNA phía sau gene dnrU
3/ Nhân đoạn gen TU-Neor-SU và giải trình tự
.4/ Thiết kế vector đột biến pKC.dnrU

NGUYỄN NHÂN HẬU-1202

Page 17