Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch kháng sinh demethyl dihydrochalcomycin tạo ra từ steptomyces sp kctc0041bp ger mi

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ
TINH SẠCH KHÁNG SINH DEMETHYL
DIHYDROCHALCOMYCIN TẠO RA TỪ STEPTOMYCES
SP.KCTC0041BP/∆ GER MI

Giáo viên hướng dẫn:T.STẠ THỊ THU THỦY

Sinh viên:ĐỖ THỊ TRANG
Lớp: 1203–K19

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – TS.Tạ Thị Thu
Thủy – người đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ chúng em trong quá
trình thực hiện đề tài.
Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo ThS.Nguyễn Thành Chung
cùng toàn thể các thầy cô giáo Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Khoa
Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, cùng các anh chị kỹ thuật
viên - Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều
kiện tốt nhất để chúng em hoàn thành đề tài này.
Qua đây, chúng em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình,

người thân, cùng toàn thể các bạn Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động
viên và giúp đỡ chúng em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng,
nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên chúng em rất mong
nhận được những sự góp ý của quý thầy – cô cũng như các bạn trong lĩnh vực
nghiên cứu.

Chúng em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 23 tháng 02 năm 2016
Sinh viên
Đỗ Thị Trang


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1 Tổng quan về kháng sinh .............................................................................. 3
1.1.1 Lịch sử về kháng sinh ............................................................................... 3
1.1.2 Định nghĩa về kháng sinh ......................................................................... 3
1.1.3 Phân loại kháng sinh ................................................................................. 4
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh................................................................ 5
1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh ...................................................... 7
1.2 Xạ khuẩn ...................................................................................................... 8
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên .......................................................... 8
1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ....................................... 10
1.2.3 Chủng xạ khuẩn Steptomyces sp.KCTC 0041BP/∆ Ger MI ..................... 11
1.3 Kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin ................................................ 12
1.3.1 Cấu trúc của Demethyl dihydrochalcomycin ........................................... 13
1.3.2 Vai trò và hoạt tính sinh học .................................................................... 14
1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng về kháng sinh Demethyl

dihydrochalcomycin trong nước và trên thế giới. ............................................. 14
1.4 Mục tiêu và nội dung đề tài ........................................................................ 19
1.4.1 Mục tiêu .................................................................................................. 19
1.4.2 Nội dung................................................................................................. 19
PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 20
2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu ......................................................................... 22
2.1.1 Vật liệu ................................................................................................... 22
2. 1.2 Hóa chất ................................................................................................. 23
2.1.3 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................. 24
2.2. Các phương pháp nghiên cứu .................................................................... 25
2.2.1 Phương pháp vi sinh ............................................................................... 25
2.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh .......... 25
2.2.1.2 Phương pháp nuôi các chủng VSV kiểm định. .......................... 26
2.2.1.3 Phương pháp bảo quản giống ................................................. 27
2.2.2 Phương pháp hóa sinh ............................................................................ 27
2.2.2.1 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô .................................... 27


2. 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh .......................... 28
2.2.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC .......................................... 29
2.2.2.4 Phương pháp sắc ký Cột .......................................................... 31
PHẦN III: KẾT QUẢ .................................................................................... 34
3.1 Ảnh hưởng của các điều kiện lên men tổng hợp kháng sinh ....................... 34
3.1.1 Điều kiện nhiệt độ ................................................................................... 34
3.1.2 Điều kiện pH của dịch nuôi .................................................................... 34
3.1.3 Tỷ lệ giống thích hợp để sinh kháng sinh ................................................ 35
3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian ........................................................................ 36
3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thu nhận và tinh sạch kháng sinh. ..... 37
3.2.1 Hệ dung môi thích hợp để thu nhận kháng sinh thô ................................ 37
3.2.2 PH thích hợp để thu nhận kháng sinh thô................................................. 38

3.2.2 Hệ dung môi thích hợp để tinh sạch kháng sinh ...................................... 39
3.2.3 Tinh sạch kháng sinh bằng chạy cột sắc ký Silica gel ............................. 39
3.2.4 Phân tích kháng sinh sau chạy cột bằng bản mỏng TLC ......................... 41
3.2.5 Phân tích kháng sinh bằng phương pháp kháng khuẩn ............................ 43
3.2.6 Phân tích kháng sinh bằng phương pháp khối phổ LC-Mass.................... 43
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................ 49
4.1 Kết Luận .................................................................................................... 49
4.2 Đề xuất ....................................................................................................... 49
Tài liệu tiếng việt ............................................................................................ 50
Tài liệu tiếng anh:........................................................................................... 50
Trang web tham khảo: ................................................................................... 51


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chú thích

Amp

Ampicillin

Apr

Apramycin

Bp

Base paire

C

Carbon

CKS

Chất kháng sinh

Cm

Chloramphenicol

DMI

Downstream MI

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxyribonucleotides

ORFs

Open reading frames

RNA

Ribonucleic Acid

Gr+

Gram dương

Gr-

Gram âm

HTKS

Hoạt tín kháng sinh

Kb

Kilobase

Neo

Neomycin

Neor

Gen kháng neomycin

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Ter

Tetramycin

TLC

Thin layer chromatography

IPTG

Isopropyl-thio-β-galactoside


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của kháng sinh……………………………………..5
Hình 1.2 Cấu trúc của Demethyl dihydrochalcomycin……………………...…14
Hình 1.3 Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn
thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin ……………………………….19
Hình 3.1 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ………………………………34
Hình 3.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống thích hợp thu nhận kháng sinh thô…35
Hình 3.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn (A ethylacetate; B:Chloroform; D: nbutanol)…………………………………………………………………………37
Hình 3.4a chloroform :methanol……………………………………………….39
Hình 3.4b ethylacetat:methanol………………………………………………...39
Hình 3.5 :Chạy sắc ký cột tỷ lệ dung môi chloroform:methanol khác nhau …..40
Hình 3.6 :Hình ảnh tách kháng sinh thu được sau khi chạy cột………………..41
Hình 3.7: Phân tích kháng sinh sau chạy cột bằng bản mỏng TLC …………....41

Hình 3.8: Mẫu thử hoạt tính kháng sinh các phân đoạn……………………......43
Hình 3.9a. Kháng sinh thô sau khi đã tinh sạch được phân tích bằng LC-Mass.43
Hình 3.9b kháng sinh thô sau khi đã tinh sạch được phân tích khối lượng phân tử
bằng phương pháp LC-Mass…………………………………………………...44


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp
dimethyl dihydrochalcomycin…………………………………………………16
Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài…………………………………...25
Bảng 3.1 Ảnh hưởng điều kiện pH của dịch nuôi………………………...……35
Bảng 3.2 :Khảo sát thời gian thích hợp cho sinh kháng sinh ……………..…..36
Bảng 3.3 :Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin với 3
loại dung môi…………………………………………………………………37
Bảng 3.4 :Khảo sát pH thích hợp sinh kháng sinh…………………………….38
Bảng 3.5 : Tỷ lệ dung môi Chloroform: Methanol để tinh sạch kháng sinh …..40
Bảng 3.6: Giá trị Rf phân đoạn có hoạt tính 3,4,5,6,7,8……………………….42
Bảng 3.7: Bảng so sánh giá trị Ovelay với bản TLC…………………………...42


Viện Đại Học Mở Hà Nội
LỜI MỞ ĐẦU
Bệnh nhiễm khuẩn đã là một trong những nỗi kinh hoàng đối với con
người. Những trận đại dịch đã từng làm thay đổi sức mạnh của cả một đoàn
quân thiện chiến, thậm chí dẫn đến sự diệt vong của một đế chế hùng mạng.
Chính điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phải tìm ra được một
chất có khả năng phòng chống và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1928,
Alexander Fleming phát hiện ra penicillin – chất kháng sinh (CKS) có nguồn
gốc từ nấm Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941- penicillin mới
chính thức được sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnh nhân nhiễm

trùng máu đầu tiên, cũng từ đó kỷ nguyên CKS bắt đầu. Đây là một trong những
thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ XX.
Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ
sinh học cũng được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế
giới. Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh,
vitamin và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như các lĩnh vực khác phục
vụ đời sống con người đang có những phát triển vượt bậc.
Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi
sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Trong số
hơn 10.000 CKS được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra, khoảng
8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp
trên 80% [1].
Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiện tượng
kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng. Việc sử dụng một
số chất đặc hiệu để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại hiệu quả
như mong muốn. Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng gia
tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm ra những CKS mới luôn thu hút sự quan tâm
của nhiều nhà khoa học.

1
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Demethyl dihydrochalcomycin là kháng sinh thuộc nhóm macrolide 16C, được
sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp. Nhiều nhà khoa học đã và
đang quan tâm nghiên cứu về loại kháng sinh này bởi nhiều ưu điểm vượt trội
của nó như ít độc, dung nạp tốt, thải trừ nhanh, đặc biệt có hoạt tính kháng

khuẩn rất mạnh và chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc.Demethyl
dihydrochalcomycin là dẫn xuất của kháng sinh dihydrochalcomycin của chủng
xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆Ger MI, có tác dụng ức chế và tiêu
diệt vi khuẩn Gr- (Gram âm) và Gr+ (Gram dương) bằng cách liên kết vào tiểu
phần 50S của ribosome, ngăn cản quá trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn.

Vì vậy chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài:” Nghiên cứu xây dựng quy
trìnhtách chiết và tinh sạch kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin tạo ra từ
Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆GerMI.

2
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về kháng sinh
1.1.1 Lịch sử về kháng sinh
Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi
nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào
hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn.Hiện tượng kì lạ này đã được
Fleming nghiên cứu, phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là
Penicillium notatum – một chủng tạo penicillin.
Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại
học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được
hợp tác với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicillin và họ
đã thử nghiệm thành công penicillin trên chuột vào 1940.
Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm Penicillium ưu việt nhất là

chủng Penicillum chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt tính cao hơn cả
triệu lần penicillin do Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928.
Năm 1945, Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng với Ernst
Boris Chain và Howard Walter Florey
Một số kháng sinh khác : sulfornamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra
vào năm 1932 và streptomycin được Selman Waksman và Albert Schat tìm ra
vào năm 1934.Sau này đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, công nghệ
sinh học và hóa dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại
kháng sinh mới.Ngày nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh
khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn, 100 loại được dùng
trong Y khoa và Thú y.
1.1.2 Định nghĩa về kháng sinh
Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng
trong lâm sàng (1941). Khi đó người ta đã định nghĩa:" Kháng sinh là những sản
phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có

3
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật
khác", theo Waksman1942.
Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán
tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất
có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất
diệt được tế bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được
thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng

hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu
diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng
yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung”[1].
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml
dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị
kháng sinh. Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một
thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm
định trong thời gian xác định [3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI
penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007).
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CKS
do việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều. Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên
cứu các CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng
trong công tác chữa bệnh.
Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác
dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa
học. Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất,
đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh.
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [1]:
- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate
- Nhóm 2: Các lactone macrolide
- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất
4
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid

- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính
xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi
chất làm ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.

Hình 1.1.Cơ chế tác dụng của kháng sinh [19]

Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều
trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng khác
nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên
màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp DNA, tác dụng lên quá

5
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp và cuối cùng là tác
dụng lên sự trao đổi chất trung gian [2].
Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn
- Các β-Lactam ngăn cản sự tổng hợp các mucopeptide, làm rối loạn quá
trình nhân lên của vi khuẩn. Khi có mặt kháng sinh, vi khuẩn có thể vẫn tiếp tục

nhân lên với vách không hoàn chỉnh hoặc không có vách nhưng chúng dễ bị tiêu
diệt bởi thực bào, nhân tố lý hóa học.
- Xycloserin tác động bằng cách ngăn cản tập hợp các tetra và pentapeptide
do ức chế enzym tổng hợp D-alanin.
- Bacitracin: thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương của
vi khuẩn.
Ức chế chức năng của màng tế bào
- Thay đổi chức năng năng lượng, ảnh hưởng sự hô hấp tế bào: gramicidin,
sideromycin.
- Kháng sinh gắn lên màng tế bào chất làm thay đổi cân bằng thẩm thấu của
màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh
chống nấm nistatin.
Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
- Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome,
ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường,can thiệp tiếp cận tRNA làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.
- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế
enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi
polypeptide mới thành lập.
- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome
làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide.
Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid
- Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao
mã tạo thành mRNA (RNA thông tin).
6
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai
mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của
DNA.
- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid.
- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân
purine làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.
Ức chế quá trình trao đổi chất folate
Folic acid là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ
đó tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn. Sulfamid và
trimethoprim có cấu trúc hoá học tương tự p-aminobenzoic acid (PABA) và
folic acid. Khi sử dụng, sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất
để tổng hợp folic acid, sẽ gây thiếu purine, nucleic acid. Trimethoprim ức chế
dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành
tetrahydrofolate (dạng hoạt động của folic acid), làm cho sự hoạt động của tế
bào bị rối loạn.
1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh
Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu
CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin, tiroxidin
do Rene Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện
năm 1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952…Cùng với việc phát
hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được
hoàn thiện [20].
Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc
phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng.
CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác
nhau trên thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh
chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông

7
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát triển được hàng loạt các
CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.
Năm 1999 một chất kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn
chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột,
ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là
kháng sinh loposomal HA – 92, được tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL –
312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt
các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách
chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột.
CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và
Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung
thư [3].
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp.
C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng
methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [10].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ
của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt
được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm
những chủng vi sinh vật sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều
phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gây đột biến định
hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các
chủng có hoạt tính kháng sinh cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại

kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [4], [11].

1.2 Xạ khuẩn
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn,
thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được.Sự
8
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và
thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm
xạ khuẩn, chiếm 9 ÷ 45% tổng số vi sinh vật [12].
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng
sinh CKS.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có
tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [1]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các
loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora actinomadura, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium…Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm
đã cung cấp nhiều CKS có giá trị đang dùng trong y học như gentamycine,
tobramycine, vancomycine, rovamycine.Nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh chất
kháng sinh.
Ngoài ra, xạ khuẩn còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và
phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững trong đất như cenlulose,

tinh bột, chất mùn kitin, keratin…góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên.Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất
hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12); một số axit hữu cơ như
lactic acid, acetic acid; amino acid như glutamic acid, methionine, tryptophan,
lysine.Một số khác có khả năng tạo thành các chất kích thích sinh trưởng thực
vật.
Xạ khuẩn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men, chế
tạo các sản phẩm lên men hoặc ứng dụng các men do xạ khuẩn sinh ra nhiều như
proteinase, amylase, cellulase, kitinase…
Tuy nhiên bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra
các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng cũng như sự phát
triển của hệ vi sinh vật có ích trong đất, một số khác lại là nguyên nhân gây ra
một số bệnh khó chữa ở người và gia súc [10]. Hai nhóm xạ khuẩn quan trọng
9
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
là tác nhân gây bệnh ở người là Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao và
Corynebacterium diphtheria gây bệnh bạch hầu.
1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành
CKS.Trên thế giới, trong số hơn 8000 CKS do vi sinh vật tổng hợp hiện nay thì
trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [1].
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ vi sinh vật nói
chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc.Mỗi CKS chỉ có tác dụng
với một nhóm VSV nhất định.Hầu hết các CKS có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều
có phổ kháng khuẩn rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của

nhiều loài vi sinh vật kác nhau.
Ngày nay, người ta đã biết CKS là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của vi
sinh vật.Dù vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của CKS đối với
xạ khuẩn.Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số
tác giả cho rằng sự hình thành CKS là cơ chế giúp xạ khuẩn tồn tại trong môi
trường tự nhiên, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh môi trường dinh dưỡng.
Lại có giả thuyết cho rằng CKS chỉ là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của quá
trình trao đổi chất của tế bào, được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha
cân bằng của chu kỳ sinh trưởng [3], [8], [9].
Có 3 con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn [1]:
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi
phản ứng enzym.
- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau.
- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa
sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS
có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS
phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng

10
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và
cofactor tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh [9], [13].
1.2.3 Chủng xạ khuẩn Steptomyces sp.KCTC 0041BP/∆ Ger MI
Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500

loài, có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong DNA. Một phần rất lớn các chất kháng
sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài thuộc chi
Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin
và tetracyclin [11].
Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên
năm 1943 [30]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện
chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh.
Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆GerMI thuộc chi
Streptomyces, là chủng sản sinh ra kháng sinhDemethyl dihydrochalcomycin.
Khi sinh trưởng trên môi trường ISP2 cho khuẩn lạc không lớn, có kích thước từ
1-5 mm. Khuẩn lạc rắn chắc và đâm sâu vào trong bề mặt cơ chất, bề mặt khuẩn
lạc thường được bao phủ bởi một lớp các khuẩn ty khí sinh dạng nhung dày.
Đặc điểm nổi bật của loài xạ khuẩn này là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không hình thành vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào
tử). Hệ sợi mảnh, đường kính sợi dao động trong khoảng từ 0,2-2 µm.
Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆ Ger MI sinh sản vô tính
bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử.
Cuống sinh bào tử có hình thẳng hoặc lượn sóng. Bào tử được hình thành trên
cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ
khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm.
Bề mặt bào tử trơn nhẵn. Màng bào tử có nếp nhăn trên môi trường ISP2.
Khi nuôi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆ Ger MI trên
môi trường lỏng dịch nuôi có màu đen và có mùi đặc trưng của đất do chủng
được phân lập từ đất.

11
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
Chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP/ ∆ Ger MI có thể sinh trưởng
trong dải nhiệt độ 25 ÷ 32°C, thích hợp nhất ở 28 ÷ 30°C.
Độ pH thích hợp cho sự phát triển của chủng là khoảng 6 ÷ 9. Ở pH thấp
hơn 6 hoặc cao hơn 9 thì chủng phát triển kém hoặc không phát triển. Chủng
Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆ Ger MI hình thành sắc tố melanin trên môi
trường thạch tyrosine [7]. Có khả năng đồng hóa tốt với một số loại đường như
cellobiose, D- glucose, D- mannose, maltose…
Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆ Ger MI sinh kháng sinh có
khả năng ức chế vi khuẩn Gr+ và vi khuẩn Gr- . Tuy nhiên, kháng sinh này có
khả năng ức chế cao hơn đối với vi khuẩn Gr+. Điều này được giải thích bởi vi
khuẩn Gr- có lớp thành tế bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr+, vì vậy
chúng ít chịu ảnh hưởng bởi kháng sinh hơn. Trong các vi khuẩn Gr+ được
nghiên cứu, khả năng ức chế vi sinh vật của xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC
0041BP/∆ Ger MI lên vi khuẩn Bacillus cereus là lớn nhất (D = 21,33 mm), tiếp
theo là vi khuẩn Bacillus subtilis (D = 19,50 mm) .

1.3Kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin
Macrolide là kháng sinh được sử dụng để chống nhiều vi khuẩn là cầu
khuẩn Gr+ hiếu khí và kị khí, tác dụng tốt với vi khuẩn nội bào ( Mycoplasma,
Rickettsia, Chlamydia), điều trị nhiễm trùng gây ra bởi Haemophilus influenzae,
nhiễm trùng đường hô hấp và nhiễm trùng mô mềm … Kháng sinh macrolide là
sản phẩm tự nhiên chiết xuất từ xạ khuẩn Streptomyces, có phổ kháng khuẩn
rộng hơn so với kháng sinh penicillin, có khả năng thâm sâu vào ổ mủ nên là
một chọn lựa tốt cho phòng ngừa nhiễm khuẩn hô hấp, có tác dụng hiệp lực với
polypeptide, sulfamid.Nhóm macrolide có độc tính rất thấp, thường chỉ sốt, nôn
mửa, dị ứng da.
Kháng sinh macrolide cấu tạo gồm một vòng lacton lớn (có từ 12-16 nguyên tử
C) gắn với các phân tử đường bằng các liên kết glycosid.Dựa vào số nguyên tử

C trong vòng lacton, kháng sinh macrolide được chia thành 3 nhóm: macrolide
12C, 14C và 16C. Trong đó, kháng sinh nhóm macrolide 16C có vai trò quan
12
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
trọng nhất với nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với macrolide l2C và 14C vì
kháng sinh nhóm này chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. [12]
Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng sinh thuộc nhóm macrolide có
khả năng ức chế cạnh tranh trung tâm hoạt động của enzyme petidyltransferase
của tế bào vi khuẩn như carbomycin, spiramycin, chalcomycin....nhưng duy nhất
chỉ có kháng sinh macrolide l6C có thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động
của enzyme peptidyltransferase và từ đó bất hoạt quá trình tổng hợp protein của
vi khuẩn.
Với nhiều ưu điểm như vậy kháng sinh nhóm macrolide 16C là nhóm
kháng sinh đang được nỗ lực nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế
giới với mục tiêu chính là: tạo ra các kháng sinh không bị ảnh hưởng bởi cơ chế
kháng thuốc của vi khuẩn và từ đó nghiên cứu và phát triển nhóm kháng sinh
polyketide synthase (PKS) thế hệ mới.
1.3.1 Cấu trúc của Demethyldihydrochalcomycin
Demethyl dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là
sản phẩm dẫn xuất của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP/ ∆ Ger
MI, được tách chiết lần đầu tiên và xác định cấu trúc năm 1996.

Hình 1.2 Cấu trúc của Demethyldihydrochalcomycin [19]

Về cấu trúc, kháng sinh Demethyldihydrochalcomycin cấu tạo gồm nhân

lactone nối với 2 gốc đường là mycinose và chalcose thông qua liên kết O-

13
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
glucosid tại vị trí C5 và C20 bị đột biến mất nhóm methyl ở vị trí C số 3 tại gốc
đường chalcose[19]
1.3.2 Vai trò và hoạt tính sinh học
Qua

nghiên

cứu

thử

nghiệm

lâm

sàng,kháng

sinhDemethyl

dihydrochalcomycin đã biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế
và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr- và Gr+. Chủng xạ khuẩn tạo ra

Demethyldihydrochalcomycin đã được phân lập, đồng thời cấu trúc hóa học của
chúng cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này
được xác định là chất dẫn xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định
trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác [13], [14]. Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng
của dimethyl dihydrochalcomycin chưa được nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ
nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh học củaDemethyl
dihydrochalcomycin hoàn toàn tương tự như hoạt tính của kháng sinh
chalcomycin và mycinamycin [9].
Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định cơ chế hoạt động
của kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân
macrocyclic lacton của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần
lớn của ribosome vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polypeptide ra khỏi tâm hoạt
động của enzyme peptidyltransferase. Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế
sinh tổng hợp protein của vi khuẩn [8], [15].
1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng về kháng sinh Demethyl
dihydrochalcomycin trong nước và trên thế giới.
Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng hợp Demethyl
dihydrochalcomycin
Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc dihydrochalcomycin, kháng sinh này
được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR –
Nuclear Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS
loại I. Nhóm nghiên cứu đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen

14
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội

tham gia vào con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. KCTC 0041BP/∆ Ger MI.
Bảng 1.1Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp
dihydrochalcomycin

Tên

Số amino
acid

Ger1
Ger2
Ger3
Ger4
GerA
GerB
GerMIG
erN
GerR
GerPI
GerPII
GerG
GerD
GerE
GerF
GerMII
GerPIII
GerH
GerKI
GerMIII

GerTI
GerR
GerS1

608
684
331
308
334
381
271
485
823
401
407
274
323
295
196
255
420
73
326
403
418
280
439

GerS2
GerS3

GerS4
GerS5
GerY
GerTII
GerK2
Ger29

1976
3734
1618
1357
404
425
248
580

Dự đoán chức năng trong nhóm gen sinh tổng hợp

Transferase protein
Hypothetical protein
Hypothetical protein
Conserved hypothetical protein
Oxidoreductase
3,4-dehydratase like protein
O-methyltransferase
NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase
Beta glucosidase
Cytochrome P450 hydroxylase
Cytochrome P450 hydroxylase
Type II thioesterase

dTDP-glucose 4,6- dehydratase
Alpha-D-glucose-1-phosphate thymidyltransferase
NDP-hexose 3-epimerase
3-O-methyltransferase
Cytochrome P450
Ferredoxin
dTDP-hexose 4-ketoreductase
2-O-methyltransferase
Glycosyltransferase
rRNA methyltransferase
PKS[LM(KSQ,AT,ACP)M1(KS,AT,KR,ACP),
M2(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS [M3(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS[M4(KS,AT,KR*,ACP),M5(KS,AT,DH,ER,KR,
ACP)]
PKS [M6(KS,AT,KR,ACP)]
PKS [M7(KS,AT,ACP), TEI]
NDP-hexose-3,4-isomerase
Glycosyltransferase
Post-PKS reductase
Putative transcriptional regulator
15

Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5kb đã được

xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thông tin di truyền, mã hóa cho các
gen tham gia con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin. Đồng thời các gen
này cũng được dự đoán cấu trúc.[16]
Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường Dchalcose và D-mycinose
Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử D-chalcose và D-mycinose đã
được xác định và giải trình tự từ pGERI-5 cosmid. So sánh độ tương đồng về
trình tự các chuỗi amino acid của các gen trong cosmid với trình tự amino acid
của các gen đã biết trên ngân hàng gen thế giới GenBank. Các gen tham gia sinh
tổng hợp 2 gốc đường khử này đã được dự đoán cấu trúc, từ đó dự đoán được
con đường sinh tổng hợp gốc đường này.
Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc
đường trung gian cho quá trình tổng hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose,
được tổng hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme
GerD có chức năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDPglucose 4,6-dehydartase.
- Quá trình sinh tổng hợp đường D-chalcose bắt đầu từ gốc đường trung
gian 4-keto-6-deoxyglucose với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomerase
(GerY) để tạo đồng phân, tiếp theo là phản ứng loại nhóm OH bởi 3,4dehydratase (GerB) và phản ứng khử của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để
tạo ra 3-keto-4,6-dideoxyglucose. Sản phẩm tại vị trí 3-keto sẽ được chuyển
thành 3'-OH

nhờ enzyme 3-ketoreductase (GerKII) tạo dTDP-4,6-

dideoxyglucose. Tiếp đó, gốc đường này được chuyển đến nối với nhân
macrolide tại vị trí C5 nhờ hoạt tính xúc tác của chalcosylglycosyltransferase
(GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí C3 nhờ hoạt động của
enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường D-chalcose.
- Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh
tylosin vì vậy con đường sinh tổng hợp đã được chứng minh trong các nghiên
16
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
cứu về kháng sinh này [15]. Phản ứng sinh tổng hợp được bắt đầu từ dTDP-4keto-6-deoxyglucose để tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác của hai enzyme 3epimerase (GerF) và 4-ketoreductase (GerKI). Tiếp theo là phản ứng gắn gốc
đường allose vào nhân macrolacton tại vị trí C20 nhờ hoạt tính xúc tác của
glycosyltransferase (GerTI).Cuối cùng hai enzyme 2-O-methyltransferase
(GerMIII) và 3-O-methyltransferase (GerMII) xúc tác phản ứng methyl hóa
nhóm OH tại vị trí C2, C3 tạo gốc đường D-mycinose.
Bước cuối cùng hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin với
hoạt động của enzyme hydroxylase (GerPI) xúc tác gắn nhóm OH vào vị trí C8,
và enzyme epoxidase (GerPII) với hoạt tính tạo vòng lacton tại vị trí C12-C13 của
vòng dihydromacrolacton.[19]

Hình 1.3 Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn thành
cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin [19]

Sinh tổng hợp dTDP-6-deoxy-β-D-allose, chứng minh hoạt tính của
dTDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI).
Trong nghiên cứu này nhóm đã chứng minh hoạt tính và vai trò của gen
GerKI trong sinh tổng hợp D-mycinose.GerKI mã hóa cho enzyme 417
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp


Viện Đại Học Mở Hà Nội
ketoreductase, tham gia phản ứng xúc tác chuyển gốc đường 4-keto-6deoxyglucose thành 6-deoxy-D-allose. Cùng với kết quả này sản phẩm được tạo
thành đó là dTDP-6-deoxy-D-allose đã được xác định cấu trúc bằng phân tích

NMR và HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao). Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa
khoa học rất quan trọng bởi vì đây là đường khử hoàn toàn mới lần đầu tiên
được tổng hợp nhờ phản ứng enzyme invitro và nhờ đó đã tìm ra phương pháp
sinh tổng hợp một gốc đường quan trọng.[19]
Chứng minh hoạt tính của gen glycosyltransferases GerTI và GerTII bằng
phương pháp gây đột biến gen
Theo kết quả nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerTI và GerTII
đã được sáng tỏ bằng phương pháp đột biến gen để tạo chủng đột biến không có
chứa GerTI và GerTII. Chức năng của gen này là mã hóa cho sinh tổng hợp
enzyme glycosyltransferase. Các enzyme này tham gia vận chuyển và gắn gốc
đường mycinose và chalcose vào nhân macrolacton. Phân tích đánh giá sản
phẩm trung gian từ chủng đột biến, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được
bước cuối cùng của quá trình hình thành kháng sinh và thu được hợp chất có
hoạt tính sinh học mới.[19]
Nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường
khử dTDP-6-deoxy-D-allose
Kết quả nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3)đã chứng minh hoạt tính của gen GerF mã hóa cho enzyme dTDP-4keto-6-deoxyglucose 3-epimerase, xúc tác tạo đồng phân quang học chuyển vị
trí -OH ở vị trí C3 của đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, tham gia vào
chuyển hóa đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose thành đường dTDP-6-deoxyD-allose trong quá trình sinh tổng hợp đường khử D-mycinose trong cấu trúc
kháng sinh dihydrochalcomycin. Kết quả enzyme GerF được biểu hiện thành
công trên E. coli BL21 (DE3) có khối lượng phân tử là 38kDa, đồng thời xác
định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen GerF và enzyme này được sinh
ra ở dạng tan là ở 26oC, trong 8h, nồng độ IPTG 10mmol.[5]
18
Đỗ Thị Trang-CNSH 1203

Khóa luận tốt nghiệp