Luận án tiến sĩ sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI
-----------------

NGÔ THANH XUÂN

NGHIÊN CỨU TẠO PHYTASE TÁI TỔ HỢP
TỪ Aspergillus niger XP TRONG Pichia pastoris
VÀ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

Chuyên ngành:

Vi sinh học

Mã số:

62.42.40.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Mai Thi Hằng
2. PGS.TS. Vũ Nguyên Thành

Hà Nội - 2011


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi.
Các kết quả công bố trong luận án là trung thực, chính xác và tôi xin chịu
trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án.

Hà Nội, Ngày 11 tháng 11 năm 2011

NCS. Ngô Thanh Xuân


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Mai Thị Hằng người thầy đã dìu dắt tôi những bước đi đầu tiên trong con
đường nghiên cứu khoa học, người đã luôn động viên chia sẻ và tạo những
điều kiện tốt nhất về thời gian và kinh phí để tôi tiến hành những nghiên cứu
trong luận án.
PGS. Vũ Nguyên Thành người truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh
nghiệm quí báu trong lĩnh vực sinh học phân tử, người luôn chỉ bảo tận tình
theo dõi sát tiến độ và có những đóng góp mới mẻ, sâu sắc về lĩnh vực nghiên
cứu. Đồng thời thầy cũng tạo điều kiện tốt nhất về thời gian và cơ sở vật chất
khi tôi thực hiện những nghiên cứu tại Viện Công nghiệp Thực phẩm.
GS. Nguyễn Thành Đạt, PGS. Vương Trọng Hào những người thầy đầu tiên
định hướng, truyền đạt kiến thức cho tôi về lĩnh vực Vi sinh vật từ khi còn là
sinh viên, đồng thời các thầy tham gia góp ý cho tôi từ xây dựng đề cương đến
quá trình thực hiện luận án.
TS. Dương Minh Lam, TS. Phan Duệ Thanh, Ths. Tống Thị Mơ, Ths. Trần
Hữu Phong, Ths. Đào T Hải Lý, CN. Phạm T Hồng Hoa, CN. Phạm Thị Vân
(Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh – ĐHSP Hà Nội) về những
hỗ trợ kỹ thuật, điều kiện thực nghiệm cũng như đã giúp đỡ tôi hoàn thiện các

seminar khoa học ở Bộ môn.
NCS. Lê Thùy Mai, CN. Trần T. Thanh Tâm, Ths. Nguyễn Hương Giang, Ths.
Đinh T. Mỹ Hằng, Ths.Nguyễn Thanh Thủy, Ths. Dương Anh Tuấn, CN. Đào
Anh Hải những người bạn đồng nghiệp tại Bộ môn Vi sinh – Viện Công
nghiệp Thực phẩm luôn chia sẻ động viên tôi, giúp đỡ và hỗ trợ kỹ thuật cũng
như chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm nghiên cứu.
Ban Giám Hiệu và các đồng nghiệp Trường Cao đẳng Cộng đồng Lào Cai đã
tạo mọi điều kiện về mặt thời gian, luôn động viên khích lệ tôi trong quá trình
học tập.
Ban lãnh đạo Viện Công nghiệp Thực phẩm, Trung Tâm Bảo tồn giống vật
nuôi - Viện Chăn nuôi Quốc Gia, Khoa Y Sinh- Viện Pháp Y Quốc Gia về
những giúp đỡ và hợp tác trong nghiên cứu.


iii
Ban Giám Hiệu, Phòng quản lý Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học
Trường ĐHSP Hà Nội đã động viên và tạo những điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cơ quan Hợp tác Phát triển Quốc tế Thuỵ Điển (SIDA) đã hỗ trợ kinh phí cho
tôi trong suốt quá trình học tập.
Gia đình luôn yêu thương, ủng hộ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn
thành luận án.
Hà Nội, Ngày 11 tháng 11 năm 2011
NGHIÊN CỨU SINH

Ngô Thanh Xuân


iv

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Diễn giải

AOX

Alcohol oxidase

BMM

Buffered minimal methanol (Môi trường tối thiểu chứa methanol)

bp

base pair (cặp bazơ)

BSA

Bovine serum albumin (albumin huuyết thanh bò)

cDNA

Copy DNA

CNTP

Viện Công nghiệp Thực phẩm

CS

Cộng sự

ĐHSP

Đại học Sư Phạm

EDTA

Ethylene diamine tetra acetate

FTU

Phytase unit (đơn vị phytase)

HIV

Human immunodeficiency virus
(vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người)

ITS

Internal transcribed spacer

IU

International unit (đơn vị quốc tế)

kb

Kilo base

kDa

Kilo dalton

LB

Luria - Betani

MW

Molecular weight (trọng lượng phân tử)

NMR

Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

NRRL

Northern regional research laboratory (hiện là National center for
agricultural utilization research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp
Hoa Kỳ)

OD

Optical density (mật độ quang)

P

Phốt pho

PCR

Polymerase chain reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)

PDA

Potato dextrose agar

Phosphate

Phốt phát

Pvc

Phốt pho vô cơ


v
Kí hiệu

Diễn giải

SDS- PAGE

Sodium dodecyl sulphat polyacrylamide gel electrophoresis

TAE

Tris acetic acid EDTA

TCA

Trichloroacetic acid

TE

Tris EDTA

TTTĂ

Tiêu tốn thức ăn

YPD

Yeast peptone dextrose


vi

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục đích của đề tài ............................................................................................... 2
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 2
4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 3
5. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................ 3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. Axit phytic ........................................................................................................... 4

1.1.1. Cấu trúc hóa học của axit phytic ....................................................................... 4
1.1.2. Chức năng sinh lý của axit phytic ..................................................................... 5
1.1.3. Phân bố và thành phần của axit phytic ............................................................. 5
1.1.4. Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic .................................................... 6
1.2. Enzyme phân giải phytate (phytase) ................................................................ 6
1.2.1. Cấu trúc phytase ................................................................................................ 8
1.2.1.1. Histidine Acid Phosphatase (HAP) ...................................................................................8
1.2.1.2. β-Propeller Phytase (BPP)............................................................................................... 10
1.2.1.3. Cysteine Phosphatase (CP) ............................................................................................. 11
1.2.1.4. Purple Acid Phosphatase (PAP) ..................................................................................... 12
1.2.2. Nguồn phytase ................................................................................................. 13
1.2.2.1. Phytase từ vi sinh vật ....................................................................................................... 13
1.2.2.2. Phytase từ thực vật ........................................................................................................... 15
1.2.2.3. Phytase từ động vật .......................................................................................................... 15
1.2.3. Đặc điểm phytase ............................................................................................ 15
1.2.3.1. Đặc điểm phân tử ............................................................................................................. 15
1.2.3.2. Đặc tính nhiệt độ và pH ................................................................................................... 16
1.2.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính phytase ....................................................... 17
1.2.4. Ứng dụng của phytase ..................................................................................... 18
1.2.4.1. Trong chăn nuôi ............................................................................................................... 18
1.2.4.2. Trong công nghệ thực phẩm ........................................................................................... 22


vii
1.2.4.3. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate.................................................. 22
1.2.4.4. Trong công nghiệp giấy................................................................................................... 23
1.2.4.5. Trong cải tạo đất ............................................................................................................... 23
1.3. Nghiên cứu chuyển gen mã hóa phytase ........................................................ 24
1.3.1. Gen mã hóa phytase ........................................................................................ 24
1.3.2. Một số thành tựu chuyển gen mã hóa phytase ................................................ 25

1.3.2.1. Thực vật chuyển gen........................................................................................................ 25
1.3.2.2. Động vật chuyển gen ....................................................................................................... 26
1.3.2.3. Vi sinh vật chuyển gen .................................................................................................... 27
1.4. Hệ biểu hiện ...................................................................................................... 29
1.4.1. Các hệ biểu hiện phổ biến ............................................................................... 29
1.4.2. Đặc điểm của hệ biểu hiện P. pastoris ............................................................ 30
1.5. Cấu trúc vector biểu hiện ở P. pastoris........................................................... 31
1.6. Tình hình sử dụng và nghiên cứu phytase ở Việt Nam ................................ 32
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 34
2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 34
2.1.1. Hóa chất .......................................................................................................... 34
2.1.2. Plasmid và mồi PCR ....................................................................................... 34
2.1.3. Vi sinh vật ....................................................................................................... 35
2.1.4. Thiết bị ............................................................................................................ 35
2.1.5. Môi trường và dung dịch đệm ......................................................................... 35
2.1.5.1. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................................ 35
2.1.5.2. Môi trường biểu hiện ....................................................................................................... 37
2.1.5.3. Dung dịch đệm ................................................................................................................. 37
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 37
2.2.1. Các phương pháp vi sinh ................................................................................. 37
2.2.1.1. Định loại Aspergillus bằng phương pháp truyền thống ............................................... 37
2.2.1.2. Định loại Aspergillus bằng phân tích 28S rRNA.......................................................... 38
2.2.1.3. Lên men rắn thu phytase ................................................................................................. 39


viii
2.2.2. Các phương pháp hoá sinh .............................................................................. 39
2.2.2.1. Xác định hoạt tính phytase .............................................................................................. 39
2.2.2.2. Xác định protein tổng số.................................................................................................. 41
2.2.2.3. Tinh sạch phytase ............................................................................................................. 43

2.2.2.4. Điện di SDS - PAGE ....................................................................................................... 44
2.2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme ...................................... 45
2.2.2.6. Nghiên cứu hai pha tiêu hóa trong ống nghiệm ............................................................ 46
2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử ................................................................. 46
2.2.3.1. Tách chiết DNA genome của Aspergillus và Pichia.................................................... 46
2.2.3.2. Tách chiết plasmid ........................................................................................................... 47
2.2.3.3. Phương pháp PCR ........................................................................................................... 47
2.2.3.4. Tinh sạch DNA ................................................................................................................ 48
2.2.3.5. Xác định trình tự gen ....................................................................................................... 48
2.2.3.6. Ghép nối plasmid ............................................................................................................. 48
2.2.3.7. Biến nạp DNA vào E. coli bằng sốc nhiệt ..................................................................... 48
2.2.3.8. Biến nạp DNA vào P. pastoris bằng phương pháp xung điện .................................... 49
2.2.3.9. Tuyển chọn dòng mang gen biến nạp ............................................................................ 50
2.2.3.10. Định lượng số copy bằng realtime-PCR ..................................................................... 50
2.2.4. Các phương pháp thử nghiệm ứng dụng phytase ............................................ 52
2.2.4.1. Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm phytase thô từ A. niger XP trên gà Lương
Phượng nuôi thịt............................................................................................................................. 52
2.2.4.2. Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm phytase tái tổ hợp từ A. niger XP trên lợn giai
đoạn 10 - 50 kg............................................................................................................................... 54
2.2.4.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vật nuôi thí nghiệm.............................................. 55
2.2.4.4. Xác định tiêu tốn và chi phí thức ăn ............................................................................... 56
2.2.4.5 Tỷ lệ nuôi sống .................................................................................................................. 56
2.2.4.6 Đánh giá năng suất thịt ở gà nuôi .................................................................................... 56
2.2.4.7. Xác định hàm lượng nước trong thịt gà ......................................................................... 57
2.2.4.8. Phân tích hàm lượng phytate trong phân ....................................................................... 58
2.2.4.9 Tính toán và xử lý số liệu ................................................................................................. 58


ix
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 59

3.1. Tuyển chọn, phân loại và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng nấm mốc
thu phytase ............................................................................................................... 59
3.1.1. Tuyển chọn chủng nấm mốc sinh phytase ...................................................... 59
3.1.2. Định loại chủng nấm mốc đen XP ................................................................ 59
3.1.2.1. Định loại bằng hình thái .......................................................................................... 59
3.1.2.2. Định loại bằng phân tích 28S rRNA .............................................................................. 61
3.1.3. Lên men bề mặt thu phytase............................................................................ 62
3.2. Tinh sạch và đánh giá đặc tính của phytase .................................................. 63
3.2.1. Tinh sạch phytase ............................................................................................ 63
3.2.2. Một số đặc tính hóa lý của phytase ................................................................. 66
3.2.2.1. Đặc tính pH ....................................................................................................................... 66
3.2.2.2. Đặc tính nhiệt độ .............................................................................................................. 67
3.2.3. Thử nghiệm khả năng phân giải cơ chất ở hai pha tiêu hoá in vitro ............... 68
3.3. Tính đa dạng nguồn gen mã hoá phytase (phyA) từ A. niger ....................... 69
3.3.1. Tách DNA genome của Aspergillus................................................................ 70
3.3.2. Nhân dòng phyA từ A. niger ............................................................................ 70
3.3.3. Giải và phân tích trình tự các gen phyA .......................................................... 71
3.4. Biểu hiện gen phyA trong Pichia pastoris ....................................................... 77
3.4.1. Thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và C-myc-epitope ... 77
3.4.1.1.Thiết kế mồi ....................................................................................................................... 77
3.4.1.2. Nhân dòng gen ................................................................................................................. 78
3.4.1.3. Gắn phyA vào vector pPICZA ..................................................................................... 78
3.4.1.4. Kiểm tra sự có mặt của phyA có trong E. coli bằng PCR colony ............................... 79
3.4.1.5. Tách chiết plasmid ........................................................................................................... 80
3.4.1.6 Kiểm tra trình tự của thiết kế mới tại các vị trí liên kết ................................................. 81
3.4.2. Chuyển plasmid biểu hiện pPICZA/phyA vào P. pastoris ........................... 82
3.4.2.1. Mở vòng pPICZA/phyA ............................................................................................... 82
3.4.2.2. Biến nạp plasmid biểu hiện pPICZA/phyA vào P. pastoris..................................... 83

x
3.4.2.3. Tuyển chọn dòng tế bào P. pastoris biến nạp dương tính............................................ 83
3.4.3. Biểu hiện phyA trên P. pastoris ...................................................................... 84
3.4.4. Tuyển chọn chủng biến nạp có hoạt tính phytase cao..................................... 85
3.5. Tuyển chọn và xác định số copy trong dòng biến nạp mang đa gen ........... 86
3.5.1. Tuyển chọn dòng tế bào .................................................................................. 87
3.5.2. Định lượng số copy của 3 thể biến nạp P. pastoris bằng realtime-PCR......... 89
3.5.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu phục vụ định lượng copy ........................................................... 89
3.5.2.2. Xác định tính đặc hiệu của cặp mồi thiết kế .................................................................. 89
3.5.2.3. Xác định mối tương quan giữa gen chỉ thị và gen đích................................................ 90
3.5.2.5. Xác định số copy ở các chủng P. pastoris biến nạp mang đa gen .............................. 92
3.6. Một số đặc tính hóa lý của phytase tái tổ hợp .................................................... 94
3.6.1. Đặc tính pH của phytase tái tổ hợp ................................................................. 95
3.6.2. Đặc tính nhiệt độ của phytase tái tổ hợp ......................................................... 95
3.6.3. Xác định các thông số động học của phytase.................................................. 96
3.6.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại ..................................................................... 98
3.6.5. Nghiên cứu tính mẫn cảm với enzyme thủy phân protein trong đường tiêu hóa
động vật ..................................................................................................................... 99
3.6.5.1. Ảnh hưởng của hệ enzyme trong dạ dày ....................................................................... 99
3.6.5.2. Ảnh hưởng của hệ enzyme trong ruột non .................................................................. 100
3.6.6. Nghiên cứu tiêu hóa hai pha in vitro ............................................................. 101
3.7. Xác định điều kiện lên men và thu hồi phytase tái tổ hợp ......................... 102
3.7.1. Ảnh hưởng của nồng độ methanol ................................................................ 102
3.7.2. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến khả năng biểu hiện phytase .... 103
3.7.3. Nghiên cứu thu hồi phytase ở qui mô phòng thí nghiệm .............................. 106
3.7.3.1. Nghiên cứu qui trình tinh chế phytase từ môi trường nuôi cấy ................................. 106
3.7.3.2. Nghiên cứu qui trình tạo chế phẩm enzyme dạng bột................................................ 107
3.7.3.3. Nghiên cứu tính bền nhiệt của chế phẩm dạng bột..................................................... 107
3.8. Thử nghiệm phytase trên vật nuôi ................................................................ 108
3.8.1. Ảnh hưởng của chế phẩm phytase thô từ A. niger XP trên gà Lương Phượng

nuôi thịt ................................................................................................................... 108


xi
3.8.1.1. Ảnh hưởng của các chế phẩm enzyme lên sự tăng khối lượng ở gà ........................ 109
3.8.1.2. Ảnh hưởng của chế phẩm enzyme lên hiệu quả sử dụng thức ăn............................. 109
3.8.1.3. Ảnh hưởng của chế phẩm lên chất lượng thịt và các nội quan của gà...................... 110
3.8.2. Ảnh hưởng của chế phẩm phytase tái tổ hợp từ A. niger XP trên lợn giai đoạn
10 - 50 kg................................................................................................................. 114
3.8.2.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme đến hệ số chuyển hóa thức ăn..... 115
3.8.2.2. Ảnh hưởng của phytase lên lượng P thải qua phân .................................................... 116
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 118
CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ......................................... 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 122
PHỤ LỤC


xii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại về cấu trúc của enzyme thủy phân phytate ..............................13
Bảng 1.2. Sử dụng phytase trong chăn nuôi [118] ...................................................19
Bảng 1.3. Biểu hiện phytase trong một số thực vật chuyển gen [118] .....................25
Bảng 1.4. Tách dòng và biểu hiện phytase ở vi sinh vật [118] ................................27
Bảng 1.5. Đặc điểm của vector biểu hiện pPICZA [72] ........................................31
Bảng 2.1 . Các cặp mồi sử dụng ...............................................................................34
Bảng 2.2. Tương quan giữa hàm lượng Pvc và OD700 nm.........................................40
Bảng 2.3. Tương quan giữa hàm lượng BSA và OD595 nm ....................................42
Bảng 2.4. Chuẩn bị gel tách 10,5% và gel cô 5% acryamide ...................................44
Bảng 2.5. Đặc điểm của mồi cho gen MET2 và Ble .................................................51

Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm tác dụng của chế phẩm phytase thô trên gà Lương
Phượng nuôi thịt ........................................................................................................53
Bảng 2.7. Thành phần enzyme ở các chế phẩm sử dụng trong thí nghiệm ..............53
Bảng 2.8. Khẩu phần cơ sở cho gà Lương Phuợng sau 4 tuần tuổi..........................54
Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................54
Bảng 2.10. Khẩu phần thức ăn cơ sở đầy đủ P giai đoạn 1 (10-20 kg) ....................55
Bảng 2.11. Khẩu phần thức ăn cơ sở đầy đủ P giai đoạn 2 (20-50 kg) ....................55
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng nấm mốc XP trên các môi trường ............60
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh phytase trong lên
men bề mặt ................................................................................................................63
Bảng 3.3. Các bước tinh sạch phytase từ A. niger ....................................................66
Bảng 3.4. Hai pha tiêu hoá in vitro ...........................................................................69
Bảng 3.5. Danh sách các chủng sử dụng trong nhân dòng phyA ..............................70
Bảng 3.6. Độ tương đồng (%) trình tự DNA và số lượng nucleotide khác biệt của
các gen phyA tách dòng .............................................................................................74
Bảng 3.7. Độ tương đồng (%) trình tự protein và số lượng axit amin khác biệt của
các PhyA tách dòng ...................................................................................................74
Bảng 3.8. Hoạt tính phytase của các thể biến nạp KM71H và X33 .........................86
Bảng 3.9. So sánh họat tính phytase giữa các thể biến nạp A và B..........................88
Bảng 3.10. Các chủng xác định số lượng copy ........................................................89
Bảng 3.11. Tổng hợp kết quả Ct với mẫu chuẩn P. pastoris A6 ..............................91


xiii
Bảng 3.12. Xác định số copy cho từng thể biến nạp ................................................93
Bảng 3.13. Các thông số động học của phytase tái tổ hợp .......................................98
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính phytase tái tổ hợp ................98
Bảng 3.15. Biểu hiện phytase trên các môi trường và thời gian khác nhau ...........104
Bảng 3.16. Tinh sạch phytase tái tổ hợp bằng phương pháp lọc luân hồi ..............106
Bảng 3.17. Hiệu suất thu làm khô chế phẩm bằng đông khô .................................107

Bảng 3.18. Khả năng bền nhiệt của chế phẩm phytase ..........................................108
Bảng 3.19. Ảnh hưởng chế phẩm phytase thô từ chủng A. niger XP đến sinh trưởng
và hiệu quả sử dụng thức ăn của gà Lương Phượng nuôi thịt.................................112
Bảng 3.20. Kết quả mổ khảo sát chất lượng thịt của gà thí nghiệm ở 12 tuần tuổi113
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của việc bổ sung enzyme đến khả năng sinh trưởng và hiệu
quả chuyển hóa thức ăn ...........................................................................................115
Bảng 3.22. Kết quả phân tích lượng P thải qua phân .............................................117


xiv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử (a) và cấu trúc không gian (b) của axit phytic ................4
Hình 1.2. Phản ứng xúc tác của phytase .....................................................................7
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Histidine acid phosphatase (a), β-propeller phytase
(b) và cysteine Phosphatase (c) ..................................................................................9
Hình 2.1. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc .......................................................41
Hình 2.2. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein ................................................43
Hình 3.1. Cây phả hệ xây dựng dựa trên trình tự ITS của chủng XP và các loài liên quan ....62
Hình 3.2. Sắc kí đồ loại muối bằng Sephadex G25-fine ..........................................64
Hình 3.3. Sắc kí đồ trao đổi ion ................................................................................64
Hình 3.4. Sắc kí đồ lọc gel bằng Superdex 200 .......................................................65
Hình 3.5. Điện di đồ SDS- PAGE các sản phẩm quá trình tinh sạch phytase ........65
Hình 3.6. pH tối ưu (a) và độ bền pH (b) của phytase từ A. niger XP .....................67
Hình 3.7. Nhiệt độ tối ưu (a) và độ bền nhiệt (b) của phytase từ A. niger XP .........68
Hình 3.8. Nhân dòng gen phyA bằng PCR ...............................................................70
Hình 3.9. Trình tự axit amin và sự khác biệt giữa 09 gen tách dòng .......................73
Hình 3.10. Độ tương đồng trình tự gen mã hóa phytase của các chủng nghiên cứu
và những chủng trong GenBank ...............................................................................75
Hình 3.11. Sản phẩm PCR ........................................................................................78

Hình 3.12. Điện di đồ DNA sau khi cắt bằng EcoRI và XbaI và tinh sạch bằng kit ....79
Hình 3.13. Kết quả điện di PCR colony từ 15 khuẩn lạc .........................................80
Hình 3.14. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp .....................................................80
Hình 3.15. Sơ đồ hoạt động của cặp mồi chéo .........................................................81
Hình 3.16. Kiểm tra sự có mặt phyA bằng cặp mồi chéo .........................................81
Hình 3.17. So sánh độ tương đồng của đoạn gen pPICZA-phyA tại vị trí ghép nối
EcoRI (a) tại vị trí ghép nối XbaI (b) với phyA (Z16414) ở phía tương ứng ............82
Hình 3.18. Cắt plasmid tái tổ hợp bằng PmeI .........................................................83
Hình 3.19. Kiểm tra sự có mặt phyA trong P. pastoris bằng cặp mồi chéo .............84
Hình 3.20. Hoạt tính phytase trên đĩa 96 giếng từ chủng P. pastoris KM71H (a) và
từ chủng P. pastoris X33 (b) .....................................................................................85
Hình 3.21. Khả năng sinh trưởng trên nồng độ kháng sinh cao ...............................87
Hình 3.22. So sánh khả năng kháng zeocin giữa các thể biến nạp A và B ..............88
Hình 3.23. Biểu đồ đường tan chảy (a) và điểm tan chảy (b) của sản phẩm PCR ...90
Hình 3.24. Biểu đồ realtime-PCR mẫu chuẩn với cặp mồi Ble (a) và MET2 (b) ....91
Hình 3.25. Mối tương quan tuyến tính giữa độ pha loãng mẫu chuẩn với Ct của các
cặp mồi MET2 và Ble ...............................................................................................92


xv
Hình 3.26. Biểu đồ realtime-PCR của P. pastoris A3 (a), P. pastoris A7 (b),
P. pastoris B3 (c) ......................................................................................................93
Hình 3.27. Điện di đồ SDS-PAGE và zymogram của phytase tái tổ hợp ................94
Hình 3.28. pH tối ưu (a) và độ bền pH (b) của phytase tái tổ hợp ...........................95
Hình 3.29. Nhiệt độ tối ưu (a) và độ bền nhiệt (b) của phytase tái tổ hợp ...............96
Hình 3.30. Sự biến thiên vận tốc phản ứng của phytase phụ thuộc vào nồng độ
Na- phytate và pNPP .................................................................................................97
Hình 3.31. Sự phụ thuộc giữa 1/V và 1/[S] của với Na-phytate (a) và pNPP (b) ....97
Hình 3.32. Tác động của pepsin lên phytase tái tổ hợp ..........................................100
Hình 3.33. Tác động của pancreatin lên phytase tái tổ hợp ...................................101

Hình 3.34. Hai pha tiêu hóa in vitro .......................................................................102
Hình 3.35. Ảnh hưởng của nồng độ methanol lên khả năng sinh phytase .............103
Hình 3.36. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng biểu hiện phytase ...................105


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Diện tích ngũ cốc, cây họ đậu và cây cho hạt lấy dầu chiếm hơn 90% tổng
diện tích cây trồng của thế giới. Những thực vật này là nguồn dinh dưỡng quan
trọng cho con người và động vật. Một trong những hợp chất dự trữ nguồn phosphate
chủ yếu là axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate), chiếm hơn 80% tổng số
phốt pho (P) có trong những thực vật này [121]. Trong thực vật axit phytic liên kết
chặt chẽ với những nguyên tố khoáng như: Ca, Mg, Fe và Zn, các axit amin, các
protein và ức chế các enzyme tiêu hóa [104]. Vì thế, axit phytic là một yếu tố kháng
dinh dưỡng trong thức ăn và thực phẩm có nguồn gốc từ những thực vật trên. Do đó,
việc dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần thức ăn là rất
cần thiết.
Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ
vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra. Nhưng những động
vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong
đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt enzyme quan trọng này. Bởi vậy, người ta
thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pvc) vào trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ
thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình thường. Tuy nhiên, bổ
sung Pvc không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà còn
gây ô nhiễm môi trường, do P dư thừa thải qua phân động vật. Đồng thời làm tăng
chi phí khẩu phần thức ăn. Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pvc
là thêm phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có
trong thức ăn, giải phóng Pvc dễ hấp thụ cho vật nuôi.

Bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi động vật không những mang lại hiệu
quả về mặt dinh dưỡng và kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường [139]. Ngoài
ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn được sử dụng cho thực phẩm ở
người, trong điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm,
ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo đất trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản
xuất phytase đã và đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học [78].


2
Với tầm quan trọng trong ứng dụng cho ngành chăn nuôi, phytase hiện đang
được thử nghiệm và sử dụng ở Việt Nam. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
đã đưa phytase vào danh mục thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu theo Quyết định
số 88/2008/QĐ-BNN ngày 22/8/2008. Chính vì vậy, những nghiên cứu về sản xuất
phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập khẩu đang được nhiều nhà khoa học
trong nước quan tâm [1], [4], [11]. Trong số các phytase thương mại hiện nay,
phytase từ Aspergillus niger được quan tâm nhiều nhất vì có ưu điểm như: khả năng
hoạt động ở pH axit; hoạt tính cao; chống chịu được tác động của các proteinase
trong hệ tiêu hóa của vật nuôi. Do vậy, việc phát hiện nguồn gen mã hóa phytase từ
A. niger từ Việt Nam và ứng dụng công nghệ gen để sản xuất phytase tái tổ hợp là
một hướng đi đúng đắn, hướng tới sản xuất thay thế phytase nhập khẩu trong tương
lai.
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, tôi đã thực hiện đề tài:
"Nghiên cứu tạo phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong Pichia pastoris
và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi ". Đây là một phần trong dự án: “Nghiên
cứu sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp để sản xuất enzyme vi sinh vật cho chăn
nuôi gia súc gia cầm ở Việt Nam” được tổ chức SIDA/SAREC Thụy Điển tài trợ
và đề tài: "Khai thác và phát triển nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm"
do Viện CNTP chủ trì.
2. Mục đích của đề tài
Tuyển chọn chủng A. niger có khả năng sinh phytase ngoại bào trên các phế

phụ phẩm nông nghiệp với các đặc tính phù hợp cho chăn nuôi. Nghiên cứu dùng
công nghệ gen tạo chủng sinh phytase tái tổ hợp năng suất cao.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Phytase và gen mã hóa phytase từ các chủng nấm
mốc trong bộ sưu tập giống của Bộ môn Công nghệ sinh học - Vi sinh (ĐHSP Hà
Nội) và Bộ môn Vi sinh (Viện CNTP).
- Phạm vi nghiên cứu: Tuyển chọn, nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và
phân loại chủng nấm sợi sinh phytase, tách dòng và biểu hiện phytase, xây dựng quy
trình thu nhận phytase và ứng dụng thử nghiệm trên gà, lợn. Các nghiên cứu được tiến


3
hành tại: Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh (ĐHSP Hà Nội); Bộ môn Vi sinh (Viện
CNTP) và Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi (Viện chăn nuôi Quốc gia).
4. Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn, định loại chủng nấm sợi có khả năng sinh phytase trên bã sắn phế
thải với đặc tính phù hợp cho chăn nuôi.
- Nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen mã hóa phytase (phyA) từ A. niger. Tách
dòng và biểu hiện gen mã hóa phytase (phyA) có nguồn gốc từ A. niger trong Pichia
pastoris. Tuyển chọn và xác định số copy của dòng tế bào biến nạp mang đa gen có hoạt
tính cao.
- Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng tái tổ hợp, nghiên cứu đặc tính phytase
tái tổ hợp, xây dựng các bước thu hồi và tạo chế phẩm phytase.
- Đánh giá hiệu quả tác động của phytase từ chủng tự nhiên và phytase tái tổ hợp
trên vật nuôi ở điều kiện thức ăn và chăn nuôi tại Việt Nam.
5. Những đóng góp mới của luận án
- Đây là luận án đầu tiên nghiên cứu toàn diện về một chủng A. niger phân
lập từ Việt Nam có khả năng sinh phytase axit có tiềm năng ứng dụng cao trong
chăn nuôi (từ khâu tuyển chọn và định loại đến loài, nghiên cứu các đặc điểm của
phytase đáp ứng các nhu cầu cho chăn nuôi, nâng cao năng suất chủng sản xuất

bằng kỹ thuật ADN tái tổ hợp).
- Nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam thành công trong việc nhân dòng, biểu
hiên gen phyA từ A. niger trong P. pastoris và thiết lập được quy trình sản xuất chế
phẩm phytase tái tổ hợp.
- Bổ sung vào GenBank 07 trình tự gen mã hóa phytase từ các chủng A.
niger, làm đa dạng gen phyA.
- Xây dựng phương pháp và xác định số copy trong các thể biến nạp P. pastoris
mang đa gen bằng kỹ thuật realtime - PCR.
- Bước đầu thử nghiệm tác động của phytase tự nhiên và phytase tái tổ hợp
trên vật nuôi với kết quả tốt, mở ra tiềm năng ứng dụng của enzyme này cho chăn
nuôi sạch ở Việt Nam.


4

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Axit phytic
Axit phytic là dạng dự trữ P chủ yếu ở ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt có
chứa dầu. Trong thực vật, axit phytic có chức năng sinh lý quan trọng, nó cũng ảnh
hưởng tới đặc điểm dinh dưỡng và đặc tính của thức ăn, thực phẩm có nguồn gốc từ
những thực vật trên. Công thức hóa học của axit phytic là: C6H18O24P6, khối lượng
phân tử là: 659,86 (đvC), tên khoa học là: myo-inositol 1,2,3,4,5,6 - hexakis
dihydrogen phosphate [74]. Trong thực vật axit phytic không tồn tại tự do mà tồn tại
dưới dạng muối phytate của các kim loại Mg, K, Ca (muối K-Mg phytate có trong
gạo; muối Ca-K-Mg phytate có trong đậu tương), cũng như tham gia liên kết với
các protein (hình 1.1a).

(a)

(b)

Chú thích: Những hình tròn thể hiện các nhóm phốt
phát. Nguyên tử các bon được đánh số từ 1-6

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử (a) và cấu trúc không gian (b) của axit phytic
1.1.1. Cấu trúc hóa học của axit phytic
Cấu trúc của axit phytic được đã được mô tả bằng phương pháp phân tích tia
X [23] và phương pháp 31P-NMR [76]. Johnson và Tate (1969) đã đề xuất rằng
nhóm phốt phát ở vị trí số 2 là vị trí trục, còn những nhóm phốt phát còn lại có vị trí
xích đạo (quay xung quanh trục). Ngược lại, Blank và CS (1971) lại cho rằng những
nhóm phốt phát ở vị trí 1-, 3-, 4-, 5-, và 6- mới là vị trí trục, còn nhóm phốt phát ở
vị trí số 2 là vị trí xích đạo. Sau này, những kết quả nghiên cứu của Costello và CS


5
(1976) đã ủng hộ quan điểm về cấu tạo axit phytic của Johnson và Tate (1969). Cấu
tạo không gian phù hợp nhất của axit phytic được mô tả qua hình 1.1b.
1.1.2. Chức năng sinh lý của axit phytic
Một số vai trò sinh lý của axit phytic trong hạt cây trồng và hạt ngũ cốc đã
được đề xuất. Bao gồm những chức năng:
(1) Nguồn dự trữ P.
(2) Nguồn dự trữ năng lượng.
(3) Nguồn các ion dương (cation).
(4) Nguồn cung cấp myo-inositol (chất tiền thân của thành tế bào).
(5) Khởi xướng trạng thái ngủ cho hạt.
Hơn nữa, có thể axit phytic có một vài chức năng khác trong hạt cây trồng mà
vẫn chưa được biết đến [121]. Vai trò của axit phytic như là một chất chống oxy hóa
tự nhiên trong giai đoạn nghỉ của hạt đã được Graf và CS (1987) nghiên cứu [55].
Axit phytic cũng được thử nghiệm làm tác nhân chống ung thư biểu mô ruột kết
và ung thư biểu mô vú ở động vật. Sự có mặt của axit phytic trong ruột kết có thể chống
lại sự phát triển của ung thư biểu mô ruột kết [45]. Những nghiên cứu cuối thập niên 80

và đầu thập niên 90 đã xác minh vai trò các dẫn xuất của inositol phosphate trong việc
vận chuyển vật chất vào trong tế bào. Đặc biệt là vai trò về tín hiệu truyền tính trạng và
điều hòa chức năng tế bào của inositol triphosphate đang thu hút được sự chú ý của nhiều
nhà nghiên cứu [162].
1.1.3. Phân bố và thành phần của axit phytic
Axit phytic có mặt ở trong các phần khác nhau của hạt ngũ cốc và hạt cây họ
đậu, nó được tổng hợp ở hạt trong quá trình chín của quả. Quá trình này xảy ra đồng
thời với sự tổng hợp các hợp chất dự trữ khác như tinh bột và lipid. Trong ngũ cốc
và cây họ đậu, axit phytic được tổng hợp trong hạt Aleurone và tinh thể hình cầu
[121]. Nội nhũ của lúa mỳ và hạt gạo hầu như không có phytate, mà nó lại nằm tập
trung trong mầm và trong lớp vỏ Aleurone của tế bào hạt gạo. Ferguson và Bollard
(1976) đã tìm thấy rằng 99% phytate ở hạt đậu Hà Lan khô có trong lá mầm và 1%


6
trong phôi mầm [47]. Lượng phytate cao nhất trong số ngũ cốc được tìm thấy ở ngô
(0,83 – 2,22%). Theo Reddy và CS (1989) trong các cây họ đậu, hàm lượng phytate
cao nhất đạt 5,92 – 9,15% ở cây đậu dolique [121].
1.1.4. Hiệu ứng kháng dinh dƣỡng của axit phytic
Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dưỡng rất mạnh [104]. Hiệu ứng này
biểu hiện rõ ràng khi chúng ta quan sát cấu trúc phân tử đặc biệt của nó (Hình 1.1a).
Axit phytic liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và các nguyên tố kim loại như
Ca2+, Mg2+, Zn2+. Chính những liên kết này tạo thành phức hợp không hòa tan
trong đường tiêu hóa, dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ khoáng của động vật [40],
[121].
Kẽm là một nguyên tố vi lượng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hưởng
lớn nhất bởi axit phytic. Rimbach và Pallauf (1992) đã chỉ ra rằng khi axit phytic
được bổ sung vào thức ăn đã làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và giảm
khối lượng của chuột [122]. Axit phytic còn tương tác với protein trong dải pH rộng
để tạo thành phức hợp phytate – protein. Ở pH thấp, axit phytic liên kết chặt chẽ với

những protein thực vật khi điểm đẳng điện của những protein này dao động trong
khoảng pH 4,0 – 5,0. Trong khoảng pH 6,0 - 8,0, axit phytic và phần lớn protein
thực vật tích điện âm. Tuy vậy, trong điều kiện này, sự tạo thành phức hợp giữa axit
phytic và protein vẫn khá phổ biến [30]. Liên kết giữa protein thực vật với axit
phytic làm giảm độ hòa tan, giảm khả năng bị phân cắt của protein và do vậy làm
giảm giá trị dinh dưỡng của chúng. Hơn nữa, khi liên kết với muối khoáng, protein,
axit phytic vẫn tiếp tục tương tác với các enzyme tiêu hoá như trypsin, pepsin, αamylase và β-galactosidase, làm giảm hoạt tính của những enzyme này [43], [71],
[140].
1.2. Enzyme phân giải phytate (phytase)
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc tác phản ứng
thủy phân myo-inositol hexakisphosphate (axit phytic) thành những gốc phosphate


7
đơn vô cơ và những dẫn xuất đơn giản hơn của myo-inositol phosphate. Trong một
vài trường hợp phản ứng có thể giải phóng myo-inositol tự do (Hình 1.2).

Hình 1.2. Phản ứng xúc tác của phytase
Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại
phytase thành hai dạng là:
Dạng 1: kí hiệu (EC 3.1.3.8)
Tên đề xuất: 3-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 3 phosphohydrolase
T ên khác: phytase; phytate-3-phosphatase
Dạng 2: kí hiệu (EC 3.1.3.26)
Tên đề xuất: 6-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 6 phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase
Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tấn

công, 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphate ở vị trí thứ 3; đây là
dạng phytase điển hình của vi sinh vật và 6-phytase (EC 3.1.3.26) tấn công đầu tiên
vào nhóm phosphate số 6; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật [159].


8
1.2.1. Cấu trúc phytase
Hiện nay, người ta chia phytase ra 4 nhóm như sau: (1) Histidine Acid
Phosphatase (HAP), (2) β-Propellar Phytase (BPP), (3) Cysteine Phosphatase (CP)
và (4) Purple Phosphatase Acid (PAP). Các nhóm này khác nhau về cấu trúc phân
tử và cơ chế xúc tác, cho phép chúng sử dụng axit phytic làm nguồn cơ chất trong
các môi trường khác nhau.
1.2.1.1. Histidine Acid Phosphatase (HAP)
Tất cả các enzyme của nhóm HAP thường có chung một cơ chế xúc tác và
vị trí hoạt động. Trình tự axit amin cấu thành vị trí hoạt động ở tận cùng đầu N là
RHGXRXP và đầu C là HD [162]. Khi trình tự axit amin được cuộn gập đúng, các
vị trí đó cấu thành với nhau để tạo thành vị trí xúc tác của nhóm phosphatase này.
Những trình tự xa nhau kết hợp lại hình thành một trung tâm xúc tác duy nhất, đây
là nơi bắt đầu hai bước phản ứng thủy phân liên kết phosphomonoester [151].
HAP là một nhóm axit phosphatase lớn có khả năng thủy phân nhiều loại cơ
chất khác nhau. Vì vậy, không phải tất cả các enzyme thuộc nhóm HAP đều có thể
phân giải muối phytate. Cơ chất phytate thường tích điện âm. Do đó, vị trí hoạt
động của HAP ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn chủ yếu tích điện
dương, ở pH axít giúp tăng cường hiệu quả thủy phân phytate. Oh và CS (2004) chỉ
ra rằng nhóm Histidine Acid Phytase (HAPhy) trong HAP là có hiệu quả thủy phân
phytate nhất [100]. HAPhy được biết đến ở cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn,
HAPhy đặc trưng nhất ở sinh vật nhân sơ là phytase của E. coli [59]. Mô hình cấu
trúc phân tử 3-D của phân tử này đã được xác định [166]. Ở sinh vật nhân chuẩn,
HAPhy có trong một số chủng nấm mốc và ngô [97]. Trong đó phytases của
A. niger (hình 1.3a) và A. fumigatus được nghiên cứu rộng rãi nhất.

Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính và duy trì cấu trúc của HAPhy là
sự glycosyl hóa. Quá trình này, giúp ổn định và hỗ trợ cho quá trình cuộn gập của
các enzyme được chính xác. Tất cả phytase ngoại bào có nguồn gốc từ nấm được
biết đến nay đều có sự glycosyl hóa đặc trưng. A. niger NRRL 3135 PhyA có tới 10


9
vị trí N được glycosyl hóa [166]. Một thành phần quan trọng cấu thành HAPhy là
cầu disulfide đóng vai trò trong việc duy trì cấu trúc 3 chiều cho phép phytase hoạt
động xúc tác tốt [96]. Có tất cả trên mười cysteine có mặt trong PhyA của A. niger
và A. fumigatus tham gia vào sự hình thành của các cầu disulfide. Tám cysteine
trong phytase E. coli tham gia vào các liên kết disulfide. Tuy nhiên, hoạt tính của
các phytase này được tăng cường đáng kể khi vị trí liên kết đặc hiệu với cơ chất bị
đột biến mất một cầu disulfide [166]. Điều đó gợi ý cho chúng ta rằng việc loại bỏ
cầu disulfide cho phép tăng cường tính linh hoạt vị trí gắn cơ chất nhờ đó nâng cao
hiệu quả xúc tác của enzyme.

(a)
(b)
(c)
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Histidine acid phosphatase (a), β-propeller
phytase (b) và cysteine Phosphatase (c)
Đặc điểm về cấu trúc và cơ chế xúc tác [163] đóng vai trò quan trọng đối
với khả năng tương tác với các cơ chất khác nhau của enzyme. Kostrewa và CS
(1999) chỉ ra một số axit amin tạo nên một vị trí gắn cơ chất đặc hiệu (SSS) của
phân tử PhyA từ A. niger, nó phân bố xung quanh vị trí hoạt động của enzyme.
Trong SSS của phytase từ A. niger NRRL 3135 có hai axit amin tính axit và 4 nhóm
axit amin tính bazơ: E228, D262, K91, K94, K300 và K301 [85], [97]. Ở pH 2,5
bốn axit amin tính bazơ; K91, K94, K300 và K301 trong SSS A. niger đều tích điện
dương và sẽ thu hút các phân tử phytate. Ngoài ra, điện tích của SSS vẫn liên kết

với cơ chất phytate khi pH được nâng lên 5,0.