luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (curcuma zedoaria roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

48
was suitable for cell growth of Zedoary in flask 250 mL. The cell
biomass was maximum with 10.44 g fresh weight (0.66 g dry weight)
after 14 culture days with inoculum size of 3 g.
3. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented
with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; agitation speed 150 rpm/min,
aeration rate 2,5 L/min was suitable to growth of Zedoary cells in 10 L
bioreactor. The cell biomass was maximum with 603 g fresh weight
(53.25 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 200 g.
4. The concentration of essential oil in cells reached maximum at
2.57% dry weight after 14 culture days, 1.6 times higher than that in
rhizome. The concentration of curcumin in cells reached maximum at
1.16% after 14 culture days, 2.7 times higher than that in rhizome.
There was a biotransformation of curcuminoid in cell culture. The
concentration of polysaccharide in cell was maximum at 6.55% dry
weight after 10 culture days, 1.4 time lower than that in rhizome.
There was accumulation of sesquiterpenes in cell culture. The
compositions of sesquiterpene distributed in suspension cells was less
than that in rhizome. There were 3-4 peaks of sesquiterpene distributed
similar to rhizome. There was a biotransformation of sesquiterpene in
cell culture.
5. Essential oil could inhibit growth of B. cereus ATCC 11778 (31
mm), S. aureus ATCC 6538 (22.33 mm) and E. coli ATCC 25922
(18.33 mm). Overall, the antibacterial ability of essential oil derived
from culture cell was high.
RECOMMENDATION
1. More studies to enhance the accumulation ability of
bioactive compounds in Zedoary cells.
2. More studies in composition as well as bioactivities of
curcumin, sesquiterpenes, polysaccharides produced from
Zedoary cells.

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Thực vật là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm
thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các
hợp chất tự nhiên dùng làm dược ph
ẩm, hóa chất nông nghiệp, hương
liệu Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp,
chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật
với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động
vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật
đ
ã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có
khoảng hơn 80.000 hợp chất đã đuợc công bố. Việc khai thác nguồn
dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng
mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều
hơn. Vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc
đang bị bi
ến mất nhanh chóng do sự biến động của điều kiện môi
trường và địa lý, cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Điều
này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến tiềm năng của kỹ thuật
nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế để cung cấp nguyên liệu
ổn định cho ngành công nghiệp sản xuất dược phẩm.
Nuôi cấy tế
bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những
năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một
phương thức hiệu quả trong sản xuất các hoạt chất sinh học hoặc các
chất chuyển hóa của chúng. Đến nay, người ta đã thành công trong sản
xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này
như anthraquinone, vincristine, berberin, diosgenin, taxol,

ginsenoside…. Nghệ đen là loài thảo dược quý, không
độc, có chứa
các chất như curcumin, terpenoid và tinh dầu. Curcumin của nghệ đen
có khả năng ức chế khối u; chống lại một số dạng ung thư ở chuột như
ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng;
curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp;
2
curcuminoid và sesquiterpen là những chất có khả năng ức chế sự hình
thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng
chống viêm nhiễm; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả
năng bảo vệ tế bào. Tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và
kháng đột biến rất cao. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức
chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180), ng
ăn ngừa
đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào. Trong tự
nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian
dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc
biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân
công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự
nhiên còn dễ mắc
các bệnh như thối củ và đốm lá. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên
liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hoạt tính sinh học quý
của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria
Roscoe) và khảo sát khả nă
ng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính
sinh học của chúng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy

thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định
khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong
tế bào cây nghệ đen nuôi cấy huyền phù.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro;
- Nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen;
- Khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tinh sinh học của tế bào;
- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu của tế bào.
4. Những đóng góp mới của luận án
- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây
47
(22.33 mm) and finally E. coli (18.33 mm). Meanwhile, essential oil
derived from rhizome can inhibit the growth of B. Cereus; E. coli; S.
aureus (16 mm; 17.67 mm and 14 mm) respectively.
Table 3.18. The antibacterial ability of essential oil in Zedoary cells
D-d (mm)
Bacteria
Control
Essential oil of
cells
Rhizome essential
oil
B. cereus ATCC 11778
0 22.33
b
16.00
a
E. coli ATCC 25922
0 18.33
b

17.67
a
S. aureus ATCC 6538
0 31.00
a
14.00
a


Figure 3.14. Antibacterial ability of essential oil. A: E. coli ATCC 25922. B:
B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: control. TN: essential
oil of rhizome. TB: essential oil of cells

CONCLUSION AND RECOMMENDATION
CONCLUSION

1. The basic MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.8%
agar; 0.5 mg/L BA and 0.5 mg/L 2,4-D was suitable to callus
induction from leaf-base of in vitro Zedoary. The yellow compact and
friable callus were most suitable for cell suspension culture.
2. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented
with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; shaking speed of 120 rpm/min
46

Figure 3.13. Distribution of sesquiterpene. A: Accumulation of sesquiterpene in rhizome;
B: kinetics of sesquiterpene accumulation in suspension cells from day 2 to 18
3.5. Antibacterial activity of essential oil in Zedoary cells
Results performed in table 3.18 indicated that, essential oil
extracted from both cells and rhizome can depress growth E. coli, S.
aureus and B. cereus. Overall, essential oil collected from suspension
cells could be antibacterial (Figure 3.14). The essential oil from
culture cells depressed most to S. aureus (31 mm), then to B. cereus
3
nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định
một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp
cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy
huyền phù trong bình tam giác và trong hệ lên men 10 lít.
- Đã khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học như:
tinh dầu, curcummin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế
bào
nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời
điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh
trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như
curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây
nghệ đen.
- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào cây
nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh d
ầu của tế bào có khả
năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học
mới, có tính hệ thống về nuôi cấy tế bào cây nghệ đen và khả năng tích

lũy một số hoạt chất sinh học của chúng; đồng thời là nguồ
n tài liệu
tham khảo hữu ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và
sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học để phát triển nuôi cấy tế
bào cây nghệ đen nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn
nguyên liệu ổn định để chi
ết tách thu hồi các hợp chất thứ cấp dùng
làm dược liệu, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 105 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành
các phần: Phần Mở đầu có 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 32
trang; Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 7
4
trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận, 36 trang; Phần Kết
luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án:
1 trang, Tài liệu tham khảo: 23 trang với 193 tài liệu tham khảo bằng
tiếng Việt và tiếng Anh; Luân án có 18 bảng số liệu và 16 hình.

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 17 tài liệu tiếng Việt và 189 tài liệu tiếng
Anh với các nội dung liên quan gồm: (1) Nuôi cấy tế bào thực vật; (2)
Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật nuôi cấy in
vitro; (3) Giới thiệu về cây nghệ đen.
Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực
vật hoàn chỉnh đượ
c công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh
lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra

phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Những thử nghiệm đầu tiên
trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược phẩm đã được tiến hành
trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer. Đến nay, một thế kỷ
sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấ
p đã được
sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật.
Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các
tế bào không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được
bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh
dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar. Nuôi cấy huyền phù tế bào
thường được khởi đầu bằng cách chuy
ển các khối callus vào nuôi cấy
trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc
xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập
được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy
huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy
nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất
chuyển hóa. Trong nuôi cấy huy
ền phù tế bào thực vật cần thiết phải
45
For examples, peak 1 (retention time 4.7 min) had absorption of 6.05
mAU in rhizome but got just 2.55 mAU in suspension cells,
meanwhile, peak 4 (retention time 7.5 min) in suspension cells had
absorption of 7.33 mAU and 2.23 mAU in rhizome. Some peaks
appeared in rhizome (5-8) were absent or trace (< 1 mAU) in
suspension cells. However, in suspension cells, some new peaks
appeared (not numbered) that had retention time about 6.8; 7.8; 8.2
and 9.2 min and the absorption of 1.38-4.10; 5.62-7.54; 1.70-8.41 and
1.06-8.38 mAU respectively. These resultd indicated that many
biotransformation of sesquiterpene were occuring in process of cell

culture, producing different sesquiterpene types compared with the
rhizome control.
Table 3.17. Comparision of eluted peak heights (mAU) for rhizome control and
suspension cells of Zedoary at different culture times
Compound number/retention time (min)
Culture
time
(day)
1/4.7 2/5.1 3/6.0 4/7.5 5/12.7 6/13.8 7/19.2 8/20.5 9/26.7
2 2.11 - 2.49 5.99 -
trace trace trace
-
4 1.93 - 2.23 5.76 -
trace trace trace
-
6 1.15 trace 2.81 3.17 -
trace
- - -
8 1.06 - 1.54 3.57 - - - - -
10 1.22 - 1.02 4.05 -
trace
trace - -
12 1.04 trace 2.14 3.29 -
trace
-
trace
-
14 2.55 1.59 - 7.33 -
trace
-

trace
-
16 1.58 - 3.82 4.04 -
trace
- - -
18 2.36 1.15 1.15 5.11 - trace - trace -
Rhizome

6.05 2.59 2.15 2.23 6.23 1.46 3.59 1.29 1.19

44




Figure 3.12. HPLC results of curcumin in Zedoary suspension cells from days 2 to18
3.4.4. Sesquiterpenes
Study showed that the appearance of separated peaks in rhizome
was more than that in suspension cells (Figure 3.13). Overall, peaks
had retention time related to sesquiterpene compounds (numbered 1-9)
in the rhizome and in suspension cells had different absorption
spectrums (mAU), particularly peaks numbered 1 and 4 (Table 3.17).
5
quan tâm đến các yếu tố sau: Môi trường nuôi cấy như các chất điều
hòa sinh trưởng, nguồn carbon và các điều kiện nuôi cấy như: cỡ mẫu
nuôi cấy ban đầu, sự khuấy trộn, sục khí…Trình tự của một quá trình
nâng cấp điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến
bình tam giác nuôi cấy lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men
b
ằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó nâng cấp đến hệ lên men bằng thép

không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L. Hệ lên men là một hệ thống nuôi
cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện kiểm soát môi
trường để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào
và/hoặc hình thành sản phẩm.
Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và trong
thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản
sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; kháng nấm và vi
khuẩn; kháng virus Các hợp chất hóa học này còn được dùng nhiều
trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo
mùi, thuốc trừ sâu. Các hợp chất thứ cấp của thực v
ật có thể phân thành
ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen.
Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã
được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều
quốc gia. Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công
nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp.
Những thành tựu
đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để
sản xuất các hợp chất dùng để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản
xuất trên qui mô lớn các chất thuộc nhóm alkaloid, terpenoid, steroid,
saponin, phenol, flavonoid và các amino acid.
Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào
những năm 1970 và đến nay đã đạt được một số thành công. Một trong
những kết quả nuôi cấy tế bào thành công nh
ất đó là nuôi cấy tế bào
cây sâm Ngọc Linh. Ngoài ra còn có một số nghiên cứu nuôi cấy tế
bào các loài cây thuốc khác như cây thông đỏ, cà gai leo, rau má, dừa
6
cạn… Nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu
bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene;

curcuminoid. Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất
dẻo và một số chất có vị đắng khác. Cây nghệ đen đã được con người
dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nhiều nghiên
cứu cho thấy, các hợp chất như tinh dầu, curcumin, sesquiterpene của
nghệ đ
en có các hoạt tính sinh học quý như: kháng ung thư, bảo vệ
gan, kháng loét, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng nấm.
Có một số công trình nghiên cứu về nhân giống in vitro ở cây
nghệ đen chẳng hạn như tái sinh chồi từ callus nghệ đen; nhân giống in
vitro cây nghệ đen từ chồi. Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro
cây nghệ đen, một số kết quả bước đầu trong nuôi cấy callus và huyền
phù tế bào cây nghệ đen cũng
đã được công bố. Cho đến nay, công
trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào với khả năng tích lũy sinh khối cao
cũng như khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính học của tế bào
nghê đen nuôi cấy in vitro trong hệ lên men là rất hạn chế.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tương nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen. Nguyên liệu nghiên cứu là
các tế bào callus đượ
c tạo từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nuôi cấy callus
Bẹ lá của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường MS có
2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0 mg/L
BA để tạo callus.
2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù
2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào trong bình tam giác
Khoảng 2 g callus 2 tuần tuổi được chuyển vào bình tam giác 250

ml chứa 50 ml môi trường MS lỏng có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L
43
speak at 1.16% before gradually decreasing from day 16 to day 18
alongs to cell growth (Figure 3.9). Overall, concentration of curcumin
in culture cell with diferent culture time was higher than that in
rhizome (0.43%).
Bảng 3.16. Concentration of curcumin in Zedoary cells cultured in 10L bioreactor
Culture time
(day)
Retention time
(min)
Peak square
(mAU)

Curcumin
concentration (%)
2 2.09
1909 0.44
g
4 1.98
2226 0.52
e
6 2.05
2285 0.53
e
8 2.00
2442 0.56
e
10 1.97
4244 0.98

b
12 1.99
4448 1.03
b
14 2.07
5034 1.16
a
16 1.99
3631 0.84
c
18 2.07
2573 0.60
d
Rhizome 2.06
1868 0.43
g



Figure 3.10. HPLC result of standard curcumin Figure 3.11. HPLC result of rhizome


42
3.4.2. Total water soluble polysaccharide
Table 3.15 showed the concentration of total water soluble
polysaccharide (% dry quantity) from Zedoary cells at variety time. Overall,
concentration of polysaccharide increased from 2 to 10 and reached a peak at
6.55%, 1.4 time lower than that in Zedoary (9.46%) (p<0,05).
Table 3.15. Concentration of polysaccharide in Zedoary cells
Time (days)

Concentration of polysaccharide
(%)
2 1.73
e
4 2.23
d
6 3.53
cd
8 5.15
bc
10 6.55
a
12 5,76
b
14 4.53
c
16 2.01
d
18 1.60
e
Rhizome 9.46
g
3.4.3. Curcumin
Analysis results of HPLC were performed in Figure 3.10-3.12 and
Table 3.16. Standard curcumin has a retention time of 2.05 mins, one
another peak has a similar retention time was found in extractive
solution of rhizome (2.08 mins) and cells were cultured within
different time 2-18 days (1.97-2.09 mins). Besides, extractive solution
of natural Zedoary performed 2 other peaks. Of them, one peak had
retention time that was similar to the second peak of culture cell (1.79

min), the another peak had a retention time of 1.21 min. The extractive
solution of culture cell had the third peak with retention time of 1.6
minute. The disappearance of the third peak of 1.21 min (in extractive
solution of rhizome) in vitro cells can be due to biotransformation
happening in culture process.
Results in Table 3.16 showed that, the concentration of curcumin
(% dry weight) increased
gradually from day 2 to day 14, reached
7
2,4-D và 0,5 mg/L BA, nuôi ở tốc độ lắc 100 vòng/phút để thiết lập nuôi
cấy huyền phù tế bào. Môi trường MS lỏng bổ sung nguồn carbon khác
nhau (sucrose, glucose và fructose) và các chất ĐHST BA và 2,4-D ở
dạng riêng rẽ hoặc tổ hợp, nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá
khả năng sinh trưởng của tế bào.
2.2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù trong hệ lên men
100 g sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) thu từ nuôi cấy lắc trong bình
tam giác được đưa vào nuôi trong hệ
lên men 14 L chứa 10 L môi
trường MS lỏng có 3% sucrose, bổ sung 1,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L
BA; với các điều kiện khác nhau như cỡ mẫu: 100-250 g, tốc độ khuấy:
100-200 vòng/phút và tốc độ sục khí: 1,5-3,5 L/phút. Sinh khối tế bào
được thu 2 ngày một lần trong suốt 18 ngày để khảo sát khả năng sinh
trưởng của chúng.
2.2.3. Xác định sinh trưởng của tế bào
Sinh khối tươi của tế bào thu được bằng cách lọc chân không dịch
huyền phù tế bào, sau đó rửa bằng nướ
c cất để loại bỏ môi trường và
cân xác định khối lượng tươi.
Khối lượng khô của tế bào được xác định bằng cách sấy sinh khối
tươi trong tủ sấy ở 50

0
C cho đến khi khối lượng không đổi và cân.
2.2.4. Định lượng tinh dầu
Tách chiết và xác định hàm lượng tinh dầu theo phương pháp của
Manzan và cs 2003.
2.2.5. Định lượng curcumin
Tách chiết curcumin theo phương pháp của Paramapojn và
Gritsanapan (2009). Phân tích HPLC để xác định hàm lượng curcumin
được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng
chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34).
2.2.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số
Tách chiết polysaccharide theo phương pháp của Sun và cs
(2005). Xác định hàm lượng polysaccharide dựa vào đường chuẩn D-
8
glucose (4-20 mg/ml) theo Chaplin và cs 1994 và tính toán theo hệ số
chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 theo Li và cs 2007.
2.2.7. Xác định sesquiterpene
Tách chiết sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs 2004.
Phân tích HPLC để xác định sesquiterpene được thực hiện trên máy
Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình
ChromQuest (ver. 4.2.34).
2.2.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được xác định theo phương
pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) .
2.2.9. Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thự
c nghiệm được
tính trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p<0,05)
bằng chương trình SAS.

Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nuôi cấy callus nghệ đen
Kết quả tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro trên các môi
trường khác nhau sau 90 ngày nuôi cấy được ở bảng 3.1. Các môi
trường có bổ sung BA và 2,4-D đều kích thích tạo callus, trong khi đó
môi trường không bổ sung chất ĐTST lại không tạo callus. Môi trường
có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và
2,0 mg/L BA là thích h
ợp nhất (tỷ lệ tạo callus từ 40,1-46,01%), callus
có màu trắng, xốp và có khả năng sinh trưởng tốt (Hình 3.1A). Ở các
môi trường còn lại tỷ lệ tạo callus thấp (8,2-15,74%), callus có màu
trắng và mọng nước (Hình 3.1B).
41
Table 3.13. Effects of aeration rate on cell growth
Aeration rate
(L/min)
Fresh weight (g) Dry weight (g)
1.5 489.67
c
36.9
b
2.0 561.00
b
50.84
a
2.5 603.00
a
53.25
a

3.0 583.33
b
50.33
a
3.5 441.00
d
33.17
b

Figure 3.9. Growth of Zedoary cell in 10 L bioreactor
3.4. The accumulation of some bioactive compounds in
Zedoary cells
3.4.1. Essential oil
Concentration of essential oil derived from Zedoary cells cultured
in 10 L bioreactor was showed in table 3.14. Overall, concentration of
essential oil (% dry weight) of cells increased from 2 to 14 culture
days and reached a peak 2.57% (1,61% in natural Zedoary rhizomes).
Table 3.14. Concentration of essential oil in Zedoary cells
Time (days) Concentration of essential oil (%)
2 1.41
c
4 1.49
c
6 1.57
bc
8 1.98
c
10 2.32
b
12 2.42

b
14 2.57
a
16 1.68
bc
18 1.09
d
Rhizome 1.61
c
40
Table 3.11. Effects of inoculum size on cell growth
Inoculum size (g) Fresh weight (g) Dry weight (g)
100 241.67
c
22.28
d

150 358.33
bc
32.68
c

200 514.67
a
47.97
a

250 441.00
b
38.89

b

3.3.2.2. Agitation speed
This research showed that, the increase of agitation speed 100-150
rpm/min resulted in the increase of cell biomass as well as can got
peak 561 g fresh weight (50,84 g dry weight). However, at the higher
agitation speed (>150 rpm/min) cell growth decreased with 437 g fresh
weight (37,42 g dry weight) at 200 rpm/min (table 3.12).
Table 3.12. Effects of agitation speed on cell growth
Agitation speed
(rpm/min)
Fresh weight (g) Dry weight (g)
100 435.67
c
38.19
c
120 514.67
bc
47.97
b
150 561.00
a
50.84
a
180 547.33
b
50.03
a
200 437.00
c

37.42
c
3.3.2.3. Effects of aeration rate
Increasing aeration rate from 1.5 to 2.5 L/min resulted in a
increase of cell growth and reached a peak at 603 g fresh weight
(53.25 g dry weight). However, increasing aeration rate from 3 to 3.5
L/min, cell growth were decreased. With aeration rate of 3.5 L/min,
fresh weight of cell was 441 g fresh weight (33,17 g dry weight)
(Figure 3.9 và Table 3.13).
9
Bảng 3.1. Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
2,4-D
(mg/L)
BA
(mg/L)
% mẫu vật
tạo callus
Sinh trưởng
của callus
Hình thái callus
0,0 0,0 - - -
0,5 0,5 15,74
c
++ Trắng, mọng nước
1,0 1,0 46,01
a
++++ Trắng, xốp
2,0 2,0 40,10
b
++++ Trắng, xốp

3,0 3,0 10,20
d
+++ Trắng, mọng nước
4,0 4,0 8,20
cd
+ Trắng, mọng nước
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +:
sinh trưởng kém; - : không xuất hiện callus.





Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và xốp,
(B) callus trắng và mọng nước
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất KTST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus
2,4-D
(mg/L)
BA (mg/L)
Sinh trưởng
của callus
Hình thái callus
0,25 0,25 + Trắng và mọng nước
0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc
1,00 1,00 ++ Trắng và xốp
2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước
4,00 4,00 - Hóa nâu và chết
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +:
sinh trưởng kém; - : không sinh trưởng.

B
A
10






Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy
Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy
chuyển lên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L.
Kết quả cho thấy, các callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L
2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các
callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BA phát triển thành
dạng callus thứ cấp tốt nhất trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D
và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi trường còn lại không có tác dụng
kích thích sinh trưởng callus (callus sinh trưởng kém hoặc hóa nâu và
chết) sau 4 tuần cấy chuyển. Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn
và dễ
vỡ vụn (Hình 3.2) thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5
mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA tạo nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào
huyền phù.
3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác
3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu
Với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 4,12 g tươi
(0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì
sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41
g khô) và chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh

khố
i đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và
7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và
1,44. Mặc dù cỡ mẫu 2 g sau 14 ngày cũng có chỉ số sinh trưởng có
cao (2,0), nhưng chất lượng tế bào kém hơn (tế bào có màu vàng nhạt,
dịch huyền phù ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g (tế bào có màu
39
3.3. Cell suspension culture of Zedoary in bioreactor
3.3.1. Assessment of cell growth
Study showed that cell mass got maximum on the 14
th
with 241.67
g fresh weight (22.28 g dry weight), then decreased. The fresh cell
biomass was 132.67 g fresh weight (10.08 g dry weight) after 18 days
of culture.

Figure 3.7. Growth of Zedoary cells in 10 litter bioreactor

Figure 3.8. Fresh weight biomass (A) and dry weight biomass (B)
Based on observating the growth curve of Zedoary cell, we study effects
of some culture conditions on cell biomass accumulation after 14 days.
3.3.2. Effects of culture conditions
3.3.2.1. Inoculum size
Results showed that the inoculum size effected on cell growth.
Biomass increased when supplementing 100-200 g of cell and got pick
at 514.64 g fresh weight (47,97 g dry weight). However, when
increasing the inoculum size up to 250 g, cell growth was depressed
(441 g fresh weight and 38.89 g dry weight) (Table 3.11).
38
from 20-60 g/L, the cell biomass also increases and reaches a

maximum of 8.40 g fresh weight (0.62 g dry weight). However, when
the fructose up to 70 g/L, the cell growth slowed (7.65 g fresh weight
and 0.57 g dry weight).
Table 3.10. Effects of fructose on cell growth
Fructose (g/L) F
W
D
W
G
I

20 6.72
b
0.35
c
2.24
30 7.34
b
0.55
b
2.45
40 7.70
ab
0.57
b
2.57
50 7.72
ab
0.59
b

2.57
60 8.40
a
0.62
a
2.80
70 7.65
b
0.57
b
2.55
Cell culture of Zedoary on MS medium supplemented with 3%
sucrose, 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D, shaking speed 120
rpm/min. The maximum biomass was gotten after 14 days with 10.44
g fresh weight (Figure 3.4 and 3.5).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0
2
4
6
8
10
12
024681012141618
Dry cell weight (g)
Fresh cell weight (g)

Culture time (days)
Fresh cell weight
Dry cell weight

Figure 3.4. Growth of Zedoary cells in flask of 250 ml







Figure 3.5. Cell culture of Zedoary in flask of 250 ml

11
vàng đậm và tươi, dịch huyền phù đồng nhất). Vì thế, theo nhận định
của chúng tôi cỡ mẫu 3 g là thích hợp hơn cả.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên tích lũy sinh khối của tế bào nghệ đen
2 g 3 g 4 g 5 g
TN
F
W
D
W
G
I
F
W
D
W

G
I
F
W
D
W
G
I
F
W
D
W
G
I

2 2,22
c
0,18
d
1,11 3,14
d
0,28
c
1,05 4,07
c
0,32
b
1,02 5,20
d
0,39

c
1,04
4 2,52
c
0,24
c
1,26 3,52
c
0,32
c
1,17 4,34
c
0,35
b
1,09 5,32
d
0,42
c
1,06
6 3,00
b
0,24
c
1,50 4,00
c
0,35
b
1,33 4,94
c
0,37

b
1,24 5,61
c
0,44
c
1,12
8 3,30
b
0,30
b
1,65 4,53
b
0,38
b
1,51 5,65
b
0,40
b
1,41 6,09
c
0,47
b
1,22
10 3,50
b
0,33
b
1,75 4,92
b
0,40

a
1,64 6,04
a
0,42
b
1,51 7,02
b
0,48
b
1,40
12 3,70
a
0,35
b
1,85 5,15
b
0,40
a
1,72 6,15
a
0,44
a
1,54 7,22
a
0,51
a
1,44
14 4,00
a
0,35

b
2,00 5,61
a
0,41
a
1,87 6,12
a
0,46
a
1,53 5,68
c
0,41
c
1,14
16 4,12
a
0,37
a
2,06 5,21
b
0,37
b
1,74 5,20
b
0,35
b
1,30 5,00
d
0,32
cd

1,00
18 4,01
a
0.23
c
2,01 4,67
b
0,29
c
1,56 4,56
c
0,27
c
1,14 4,12
e
0,22
d
0,82
TN: thời gian nuôi cấy (ngày); F
W
: khối lượng tươi (g); D
W
: khối lượng khô (g), G
I
:
chỉ số sinh trưởng
3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. Nhìn chung, tốc độ
lắc cũng đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào. Ở tốc độ lắc 80-120
vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần lên và đạt cực đại là 5,91 g tươi

(0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và dịch huyền phù tế bào có màu
vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơ
n 150-180 vòng/phút,
tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế mạnh ở 180 vòng/phút,
sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào
chuyển sang màu nâu nâu sau 14 ngày nuôi cấy.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh sinh trưởng tế bào
Tốc độ lắc (vòng/phút) F
W
D
W
G
I

80 5,00
ab
0,34
c
1,67
100 5,61
b
0,41
b
1,87
120 5,91
a
0,44
a
1,97
150 5,60

b
0,42
b
1,87
180 4,75
ab
0,35
c
1,58
3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ BA 0,25 và 0,5 mg/L có
hiệu quả tương đương (p<0,05), khối lượng tươi của tế bào từ 2,06-
2,08 g (0,45-0,46 g khô) và chỉ số sinh trưởng xấp xỉ 2,1 là cao nhất.
12
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh sinh trưởng tế bào
BA (mg/L) F
W
D
W
G
I

0,25 6,17
a
0,45
a
2,06
0,5 6,25
a

0,46
a
2,08
1,0 5,76
b
0,42
ab
1,92
1,5 5,92
b
0,37
b
1,97
2,0 5,41
bc
0,35
b
1,80
2,5 4,55
bc
0,32
b
1,52
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D
Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ
sung 2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở
bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có
ảnh hưởng lớn nhất, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô)
và chỉ số sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh sinh trưởng tế bào

2,4 D (mg/L) F
W
D
W
G
I

0,25 5,10
c
0,42
b
1,70
0,5 5,77
b
0,43
b
1,92
1,0 6,02
b
0,45
b
2,01
1,5 6,75
a
0,52
a
2,25
2,0 6,04
b
0,46

b
2,01
2,5 5,35
c
0,36
c
1,78
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA
Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA và
2,4-D nồng độ từ 0,25-2,5 mg/L. Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy được
trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh sinh trưởng tế bào
2,4 D (mg/L) BA (mg/L) F
W
D
W
G
I

0,5 0,25 5,82
b
0,43
b
1,94
0,5 0,5 5,91
b
0,44
b
1,97
0,5 1,0 5,32

c
0,40
c
1,77
0,5 1,5 5,00
c
0,39
c
1,67
0,5 2,0 4,45
cd
0,38
c
1,48
0,5 2,5 4,00
d
0,35
c
1,33
0,25 0,5 5,12
c
0,39
c
1,71
0,5 0,5 5,91
b
0,44
b
1,97
1,0 0,5 6,20

b
0,46
b
2,07
1,5 0,5 7,22
a
0,55
a
2,41
2,0 0,5 6,03
b
0,43
b
2,01
2,5 0,5 6,01
b
0,42
b
2,00
37
culture were showed in figure 3.8.
Table 3.8. Effects of sucrose on cell growth
Sucrose (g/L) F
W
D
W
G
I
20 7.22
c

0.55
b
2.41
30 10.44
a
0.66
a
3.48
40 8.85
b
0.64
a
2.95
50 8.80
b
0.65
a
2.93
60 8.75
b
0.70
a
2.92
70 6.75
c
0.60
b
2.25
Results showed that, cell growth were slowly at low concentration
of 20 g/L sucrose (7,22 g of fresh weight and 0.55 g dry weight). The

medium contained 30 g/L sucrose, cell growth increase dramatically
(10.44 g fresh weight and 0.66 g dry weight) with growth index of
3.48, the suspension solution was bright yellow and rather
homogenous. At the sucrose concentration of 40-70 g/L, cell growth
decreased, especially at 70 g/L (6.75 g fresh weight and 0.6 g dry
weight).
3.2.4.2. Effects of glucose
Results indicated that cell biomass was rather low when culturing
cells on medium contain 20-30 g/L glucose. At the glucose of 40-60
g/L cell biomass got maximum (7.32 g fresh weight and 0.59 g dry
weight), with growth index of 2.44. At the glucose of 70 g/L, the cell
growth was depressed.
Table 3.9. Effects of glucose on cell growth
Glucose (g/L) F
W
D
W
G
I

20 3.15
cd
0.22
c
1.05

30 6.05
c
0.42
bc

2.02

40 7.12
a
0.53
b
2.37

50 7.20
a
0.55
b
2.40

60 7.32
a
0.59
a
2.44

70 6.65
b
0.53
b
2.22
3.2.4.3. Effects of fructose
The study results showed that fructose has significant influence
than glucose. When fructose concentrations in the medium increasing
36
mg/L was most effect, fresh weight of cell got 6.75 g (0.52 g dry

weight) and growth index was 2.25, higher than other medium.
Table 3.6. Effects of 2,4-D on cell growth
2.4 D (mg/L) F
W
D
W
G
I

0.25 5.10
c
0.42
b
1.70
0.5 5.77
b
0.43
b
1.92
1.0 6.02
b
0.45
b
2.01
1.5 6.75
a
0.52
a
2.25
2.0 6.04

b
0.46
b
2.01
2.5 5.35
c
0.36
c
1.78
3.2.3.3. Effects of 2,4-D and BA
The cells of Zedoary were cultured on the medium supplemented
with BA and 2,4-D (0.25-2.5 mg/L). Results after 14 days of culture
were showed in table 3.7.
Table 3.7. Effects of 2,4-D and BA on cell growth
2.4 D
(mg/L)
BA
(mg/L)
F
W
D
W


G
I

0.5 0.25 5.82
b
0.43

b
1.94
0.5 0.5 5.91
b
0.44
b
1.97
0.5 1.0 5.32
c
0.40
c
1.77
0.5 1.5 5.00
c
0.39
c
1.67
0.5 2.0 4.45
cd
0.38
c
1.48
0.5 2.5 4.00
d
0.35
c
1.33
0.25 0.5 5.12
c
0.39

c
1.71
0.5 0.5 5.91
b
0.44
b
1.97
1.0 0.5 6.20
b
0.46
b
2.07
1.5 0.5 7.22
a
0.55
a
2.41
2.0 0.5 6.03
b
0.43
b
2.01
2.5 0.5 6.01
b
0.42
b
2.00
Overall, the medium that supplemented both 2,4-D and BA showed
better result, compared to the medium supplemented only one of them.
The cell weight and growth index got maximum on the environment

containing 2,4-D 1.5 mg/L and BA 0.5 mg/L, with 7.22 g fresh weight
(0.55 g dry weight) and 2.41 respectively.
3.2.4. Effects of carbon sources
3.2.4.1. Effects of sucrose
Effects of
sucrose on the growth of Zedoary cells after 14 days of
13
Nhìn chung, môi trường có bổ sung đồng thời 2,4-D và BA cho kết
quả tốt hơn các môi trường bổ sung riêng rẽ hai chất này. Khối lượng tế
bào và chỉ số sinh trưởng đạt cao nhất trong môi trường có 2,4-D 1,5
mg/L và BA 0,5 mg/L, tương ứng là 7,22 g tươi (0,55 g khô) và 2,41.
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose
Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau
14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng tế bào
Sucrose (g/L) F
W
D
W
G
I
20 7,22
c
0,55
b
2,41
30 10,44
a
0,66

a
3,48
40 8,85
b
0,64
a
2,95
50 8,80
b
0,65
a
2,93
60 8,75
b
0,70
a
2,92
70 6,75
c
0,60
b
2,25
Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ sucrose thấp (20 g/L) tế
bào sinh trưởng chậm, chỉ đạt 7,22 g khối lượng tươi (0,55 g khô).
Sinh trưởng của tế bào đã tăng mạnh đạt 10,44 g khối lượng tươi (0,66
g khô) với chỉ số sinh trưởng là 3,48 trong môi trường có 30 g/L
sucrose, dịch huyền phù có màu vàng tươi và khá đồng nhất. Ở nồng
độ sucrose từ 40-70 g/L, sinh trưởng của tế bào giảm, đặc biệt là ở 70
g/L (chỉ
đạt 6,75 g tươi/0,60 g khô).

3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose
Kết quả cho thấy, tế bào có sinh khối tương đối thấp khi được
nuôi trong môi trường có 20-30 g/L glucose. Ở nồng độ glucose từ 40-
60 g/L sinh khối tăng lên và đạt cực đại là 7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ
số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng dộ 70 g/L đã ức chế sinh
trưởng của tế bào.
14
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng tế bào
Glucose (g/L) F
W
D
W
G
I

20 3,15
cd
0,22
c
1,05

30 6,05
c
0,42
bc
2,02

40 7,12
a
0,53

b
2,37

50 7,20
a
0,55
b
2,40

60 7,32
a
0,59
a
2,44

70 6,65
b
0,53
b
2,22
3.2.4.3. Ảnh hưởng của fructose
Kết quả nghiên cứu cho thấy, fructose có ảnh hưởng đáng kể hơn
glucose. Khi tăng nồng độ fructose trong môi trường từ 20-60 g/L,
sinh khối tế bào tăng theo và đạt cực đại là 8,40 g tươi (0,62 g khô).
Tuy nhiên, khi bổ sung fructose lên đến 70 g/L thì sinh trưởng của tế
bào chậm lại và chỉ còn 7,65 g tươi (0,57 g khô).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng tế bào
Fructose (g/L) F
W
D

W
G
I

20 6,72
b
0,35
c
2,24
30 7.34
b
0,55
b
2,45
40 7,70
ab
0,57
b
2,57
50 7,72
ab
0,59
b
2,57
60 8,40
a
0,62
a
2,80
70 7,65

b
0,57
b
2,55
Chúng tôi cũng đã thành công khi nuôi cấy tế bào nghệ đen trong
môi trường MS có 3% sucrose, 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, tốc
độ lắc 120 vòng/phút. Sinh khối cực đại thu được chỉ sau 14 ngày là
10,44 g tươi (Hình 3.4 và 3.5).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Khối lượng khô tế bào (g)
Khối lượng tươi tế bào (g)
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Khối lượng tươi tế bào
Khối lượng khô tế bào

Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml
35
3.2.2. Effects of shaking speed

The results were showed in table 3.4. Overall, the shaking speed
also affected on biomass. At the speed of 80-120 rpm/min, biomass
increases and got the maximum of 5.91 g fresh weight (0.44 g dry
weight), growth index was 1.97 and the solution of cell suspension
was bright yellow, homogenous. When the speed increased to 150-180
rpm/min, cell growth was slower, depressed especially at 180
rpm/min, the best biomass was 4.75 g fresh weight (0.35 g dry weight),
solution of cell suspension become brown after 14 days of culture.

Table 3.4. Effects of shaking speed on cell growth
Shaking speed
(
rpm/min)
F
W
D
W
G
I

80 5.00
ab
0.34
c
1.67
100 5.61
b
0.41
b
1.87

120 5.91
a
0.44
a
1.97
150 5.60
b
0.42
b
1.87
180 4.75
ab
0.35
c
1.58
3.2.3. Effects of hormones
3.2.3.1. Effects of BA
The results indicated that, concentration BA 0.25 and 0.5 mg/L
showed similar effects (p<0,05), fresh weight of cell 2.06-2.08 g
(0.45-0.46 g dry weight) and growth index got highest at 2.1.
Table 3.5. Effects of BA on cell growth
BA (mg/L) F
W
D
W
G
I

0.25 6.17
a

0.45
a
2.06
0.5 6.25
a
0.46
a
2.08
1.0 5.76
b
0.42
ab
1.92
1.5 5.92
b
0.37
b
1.97
2.0 5.41
bc
0.35
b
1.80
2.5 4.55
bc
0.32
b
1.52
3.2.3.2. Effects of 2,4-D
The growth ability of the Zedoary cells on the culture medium

supplemented with 2,4-D (0.25-2.5 mg/L) after 14 days of culture was
expressed on table 3.6. The result showe that, concentration 2,4-D 1.5
34
calluses that were light yellow, compact and friable (Figure 3.2) were
collected from MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D and
0.5 mg/L BA and then become materials of suspension cell culture.
3.2. Suspension cell culture in flasks
3.2.1. Effects of inoculum size
With inoculum size of 2 g, cell biomass was maximum after 16
days with 4.12 g fresh weight (0.37 g dry weight) and the growth
index was 2.06. With inoculum size of 3 g, cell biomass was
maximum after 14 days with 5.61 g fresh weight (0.41 g dry weight)
and the growth index was 1.87. When increasing the inoculum size up
to 4-5 g, cell biomass get maximum after 12 days, with 6.12 g fresh
(0.46 g dry weight) and 7.22 g fresh weight (0.51 g dry weight)
respectively but the growth index were low, at 1.54 and 1.44.
Although inoculum size of 2 g after 14 days got a rather high growth
index (2.0), the cell quality was worse (cells were light yellow,
suspension was less homogenous), compared to inoculum size of 3 g
(cells were bold and bright yellow, homogenous suspension). Thus,
the inoculum size of 3g was the best.
Table 3.3. Effect of inoculum size on biomass accumulation of Zedoary cells
2 g 3 g 4 g 5 g
TN
F
W
D
W
G
I

F
W
D
W
G
I
F
W
D
W
G
I
F
W
D
W
G
I

2 2.22
c
0.18
d
1.11 3.14
d
0.28
c
1.05 4.07
c
0.32

b
1.02 5.20
d
0.39
c
1.04
4 2.52
c
0.24
c
1.26 3.52
c
0.32
c
1.17 4.34
c
0.35
b
1.09 5.32
d
0.42
c
1.06
6 3.00
b
0.24
c
1.50 4.00
c
0.35

b
1.33 4.94
c
0.37
b
1.24 5.61
c
0.44
c
1.12
8 3.30
b
0.30
b
1.65 4.53
b
0.38
b
1.51 5.65
b
0.40
b
1.41 6.09
c
0.47
b
1.22
10 3.50
b
0.33

b
1.75 4.92
b
0.40
a
1.64 6.04
a
0.42
b
1.51 7.02
b
0.48
b
1.40
12 3.70
a
0.35
b
1.85 5.15
b
0.40
a
1.72 6.15
a
0.44
a
1.54 7.22
a
0.51
a

1.44
14 4.00
a
0.35
b
2.00 5.61
a
0.41
a
1.87 6.12
a
0.46
a
1.53 5.68
c
0.41
c
1.14
16 4.12
a
0.37
a
2.06 5.21
b
0.37
b
1.74 5.20
b
0.35
b

1.30 5.00
d
0.32
cd
1.00
18 4.01
a
0.23
c
2.01 4.67
b
0.29
c
1.56 4.56
c
0.27
c
1.14 4.12
e
0.22
d
0.82
TN: culture time (day); F
W
: fresh weight (g); D
W
: dry weight (g), G
I
: Growth index
15

Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác đặt trên máy lắc
3.3. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men
3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sinh khối tế bào đạt cực đại ở ngày
thứ 14 với 241,67 g tươi (22,28 g khô), sau đó bắt đầu giảm dần. Sinh
khối tươi tế bào chỉ còn lại 132,67 g (10,08 g khô) sau 18 ngày nuôi.
0
5
10
15
20
25
0
50
100
150
200
250
300
024681012141618
Khối lượng khô tế bào (g)
Khối lượng tươi tế bào (g)
Thời gian nuôi cấy(ngày)
Khối lượng tươi tế bào
Khối lượng khô tế bào

Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 lít

Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen
Dựa trên kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ
đen, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi
cấy đến sự tích lũy sinh khối tế bào sau 14 ngày.
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
3.3.2.1. Cỡ mẫu
Kết quả của chúng tôi cho thấy, lượng mẫu đã ảnh hưởng thật sự
16
lên sự sinh trưởng của tế bào. Sinh khối tăng lên khi đưa vào môi trường
từ 100-200 g tế bào và đạt cực đại là 514,64 g tươi (47,97 g khô). Tuy
nhiên, khi tăng lượng mẫu lên 250 g thì sinh trưởng của tế bào bị ức chế
do tăng mật độ, vì thế chỉ đạt 441 g tươi (38,89 g khô) (Bảng 3.11).
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
Cỡ mẫu (g) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
100 241,67
c
22,28
d

150 358,33
bc
32,68
c

200 514,67
a
47,97

a

250 441,00
b
38,89
b

3.3.2.2. Tốc độ khuấy
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi tăng tốc độ khuấy từ 100-
150 vòng/phút thì sinh khối tế bào cũng tăng theo và cực đại đạt là 561
g tươi (50,84 g khô). Tuy nhiên, khi khuấy trộn trên 150 vòng/phút thì
sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và chỉ đạt được 437 g tươi (37,42 g
khô) ở 200 vòng/phút (Bảng 3.12).
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào
Tốc độ khuấy (vòng/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
100 435,67
c
38,19
c
120 514,67
bc
47,97
b
150 561,00
a
50,84
a
180 547,33
b
50,03

a
200 437,00
c
37,42
c
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí
Ở tốc độ 1,5-2,5 L/phút, sinh trưởng của tế bào tăng dần và đạt
cực đại với 603 g tươi (53,25 g khô). Nếu tốc độ sục khí tiếp tục tăng
lên từ 3-3,5 L/phút thì sinh trưởng của tế bào sẽ giảm. Ở tốc độ sục khí
3,5 L/phút, khối lượng tươi của tế bào chỉ đạt 441 g (33,17 g khô)
(Hình 3.9 và Bảng 3.13).
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào
Tốc độ sục khí (l/phút)
Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
1,5 489,67
c
36,9
b
2,0 561,00
b
50,84
a
2,5 603,00
a
53,25
a
3,0 583,33
b
50,33
a

3,5 441,00
d
33,17
b
33





Figure 3.1. Callus induction culture of Zedoary. (A) White and soft callus, (B) White
and viscous callus
Table 3.2. Effect of hormone on growth and morphogenesis of callus
2,4-D
(mg/L)
BA
(mg/L)
Callus growth
Callus morphogenesis
0.25 0.25 + White and viscous
0.50 0.50 ++++ Light yellow, compact and friable
1.00 1.00 +++ White and soft
2.00 2.00 ++ White and viscous
4.00 4.00 - Brown and dead
++++: high growth of callus; +++: medium growth of callus; ++: low growth of
callus; +: weak growth; - : no growth.

Figure 3.2. The yellow, compact and friable callus after 14 days of culture
Primary callus that were white, soft and high growth were
subcultured to MS medium supplemented with 2,4-D and BA (0.25 –
4.0 mg/L). The results showed that callus growed on the medium
contained 2.0 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L BA become brown and dead
after subculture. Callus growing on the medium supplemented with 1.0
mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L BA become the best secondary callus on the
medium containing 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA (Table 3.2). The
other medium did not stimulate callus growth (callus was weak growth
or becoming brown and dead) after 4 weeks of subculture. Secondary
B
A
32
method of agar plate diffusion as Lehrer et al. (1991) .
2.2.9. Statistics
Every experiment was repeated 3 times. The collected data were
calculated average ± standard error and analysed Ducan’s test (p<0,05)
by SAS programme.

Chapter 3
RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Callus culture
Results in inducting callus derived from leaf-base of in vitro
Zedoary on variety medium after 90 days of culture were summaried
in table 3.1. The medium added BA and 2,4-D showed stimulation in
inducting callus, meanwhile, free-hormones medium showed no
inducted callus. The medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D and
1.0 mg/L BA or 2.0 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L BA seemed most

suitable (rate of callus induction as 40.1-46.01%), callus was white,
soft and good growth (Figure 3.1A). On other medium, the rate was
low (8.2-15.74%), callus was white and viscous (Figure 3.1B).
Table 3.1. Callus induction and morphogenesis of Zedoary leaf-base
explants
2,4-D
(mg/L)
BA
(mg/L)
% explants
produced
callus
Callus
induction
Callus
morphogenesis
0.0 0.0 - - -
0.5 0.5 15.74
c
++ White, viscous
1.0 1.0 46.01
a
++++ White, soft
2.0 2.0 40.10
b
++++ White, soft
3.0 3.0 10.20
d
+++ White, viscous
4.0 4.0 8.20

cd
+ White, viscous
++++: high production of callus; +++: medium production of callus; ++: low
production of callus; +: induction; - : no induction.

17
0
10
20
30
40
50
60
0
100
200
300
400
500
600
700
024681012141618
Khối lượng khô tế bào (g)
Khối lượng tươi tế bào (g)
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Khối lượng tươi tế bào
Khối lượng khô tế bào

Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L
3.4. Khảo sát sự tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học

trong tế bào nghệ đen
3.4.1. Hàm lượng tinh dầu
Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi trong hệ lên men 10
l được trình bày ở bảng 3.14. Nhìn chung, hàm lượng tinh dầu (% khối
lượng khô) của tế bào tăng dần từ 2-14 ngày nuôi cấy và đạt giá trị cực
đại là 2,57% cao hơn của củ nghệ đen tự nhiên (1,61%) khoảng 1,6 lần
(p<0,05).
Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào nghệ đen
Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng tinh dầu (%)
2 1,41
c
4 1,49
c
6 1,57
bc
8 1,98
c
10 2,32
b
12 2,42
b
14 2,57
a
16 1,68
bc
18 1,09
d
MTN (củ nghệ đen 1 năm tuổi) 1,61
c
18

3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số
Bảng 3.15 trình bày hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước
tổng số (% khối lượng khô) trong tế bào nghệ đen tại các thời điểm
nuôi cấy khác nhau. Nhìn chung, hàm lượng polysaccharide tăng từ 2-
10 và đạt cực đại là 6,55% thấp hơn khoảng 1,4 lần so với củ nghệ đen
(9,46%) (p<0,05).
Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide trong tế bào nghệ đen
Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng polysaccharide (%)
2
1,73
e
4
2,23
d
6
3,53
cd
8
5,15
bc
10
6,55
a
12
5,76
b
14
4,53
c
16

2,01
d
18
1,60
e
MTN
9,46
g
3.4.3. Hàm lượng curcumin
Kết quả phân tích HPLC được trình bày ở các hình 3.10-3.12 và
bảng 3.16. Curcumin chuẩn có thời gian lưu là 2,05 phút, một peak có
thời gian lưu tương đương cũng được tìm thấy ở dịch chiết của củ
nghệ đen tự nhiên (2,08 phút) và tế bào nuôi cấy ở các thời gian khác
nhau từ 2-18 ngày (1,97-2,09 phút). Bên cạnh đó, dịch chiết của củ
nghệ đen tự nhiên còn có thêm 2 peak khác, một peak có thời gian lưu
như peak thứ hai ở tế bào nuôi cấ
y (1,79 phút), peak còn lại có thời
gian lưu là 1,21 phút. Dịch chiết tế bào nuôi cấy có một peak thứ ba rất
nhỏ với thời gian lưu khoảng 1,6 phút. Sự biến mất của peak thứ ba
1,21 phút (ở dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên) trong tế bào in vitro có
thể là do sự chuyển hóa sinh học đã xảy ra trong quá trình nuôi cấy.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.16 cho thấy,, hàm lượng curcumin
(theo % khối lượng khô) tăng dầ
n từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 14, đạt
31
stored liquid of MS environment including 3% sucrose, added 1.5 mg/L
2,4-D and 0.5 mg/L BA, sample amount of 100-250 g, agitation speed
of 100-200 rpm/min, aeration rate of 1.5-3.5 L/min. The cell mass was
collected every two days during 18 days to study their growth ability.
2.2.3. Determination of the cell growth

The fresh cell mass was collected by vacuum-filtering the cell
suspension before being rinsed with distilled water to remove
remaining environment solution and scaled to determine their fresh
mass. The dried amount of cells was indiated by drying the fresh mass
in dry cabinet at 50
0
C untill getting constant weight then being scaled.
2.2.4. Quantification of essential oil
Extracting and determining the amount of the essential oil using
method of Manzan et al 2003.
2.2.5. Quantification of curcumin
Extracting curcumin as the method of Paramapojn and
Gritsanapan (2009). Analysis of HPLC to determine the quantity of
curcumin was conducted by using Spectra System (Thermo Electron,
America) ultilized programme ChromQuest (ver. 4.2.34).
2.2.6. Quantification of the total water soluble polysaccharide
Polysaccharide extracted by using method of Sun et al (2005).
Determination of polysaccharide concentration was based on standard curve
D-glucose (4-20 mg/ml) as Chaplin et al. (1994) and calculated via the
coefficient of converting into polysaccharide of 3.168 as Li et al. (2007).
2.2.7. Determination of sesquiterpenes
Extracting sesquiterpene based on the method of Jang et al.
(2004). Analysis HPLC to determine sesquiterpene was conducted on
Spectra System (Thermo Electron, America) ultilized programme
ChromQuest (ver. 4.2.34).
2.2.8. Determination of the antibacterial activity of essential oil
The antibacterial activity of essential oil was identified via
30
anticancer, protecting brave, antiulcerated, anti-inflammatory,
antibacterian and antifungus.

There have been some studies in in vitro multiplication of the
curcuma such as regenerating buds from callus of Zedoary. Overmore,
some initial results in culturing callus and cell suspension of the
curcuma have been published already. Up to now, there have been no
any studies of cell culture of the Zedoary in fermentation system as
well as no any assessment in their ability in accumulating bioactive
compounds.

Chapter 2
RESEARCH OBJECTIVE AND METHODS
2.1. Research objective
The objective was C. zedoaria Roscoe. The materials were callus
from leaf-base of in vitro Zedoary.
2.2. Methods
2.2.1. Callus culture
Leaf-base of in vitro Curcuma zedoaria Roscoe were cultured on
the MS medium supplemented with sucrose 2% and agar 0.8%; 0.5-4.0
mg/L 2,4-D; and 0.5-4.0 mg/L BA.
2.2.2. Cell suspension culture
2.2.2.1. Culturing cells in flask
2 g callus of two weeks age were transfered into flasks of 250ml
containing 50 mL of MS liquid medium supplemented with 2% sucrose,
0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA, cultured on the shaking machine with
speed of 500 rpm/min. The liquid MS medium added variety of carbon
resources and hormones like BA and 2,4-D cultured on the shaking
machine with speed of 500 rpm/min to evaluate the ability of cells growth.
2.2.2.2. Cell suspension culture in bioreactor
100 g of cell mass was transfered to fermentation system of 10 L
19
cực đại là 1,16%, sau đó giảm từ ngày 16-18 cùng với sinh trưởng của

tế bào (Hình 3.9). Nhìn chung, hàm lượng curcumin trong tế bào ở các
thời gian nuôi cấy khác nhau đều cao hơn trong củ nghệ đen tự nhiên
(0,43%), lúc cao nhất gấp khoảng 2,7 lần.
Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên
men 10 lít
Thời gian nuôi
cấy (ngày)
Thời gian
lưu (phút)
Diện tích peak
(mAU)
2
Hàm lượng
curcumin (%)
2 2,09
1909 0,44
g
4 1,98
2226 0,52
e
6 2,05
2285 0,53
e
8 2,00
2442 0,56
e
10 1,97
4244 0,98
b
12 1,99

4448 1,03
b
14 2,07
5034 1,16
a
16 1,99
3631 0,84
c
18 2,07
2573 0,60
d
MTN 2,06
1868 0,43
g


Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin
chuẩn (0,5 mg/ml)

Hình 3.11. Phổ HPLC của dịch chiết củ
nghệ đen tự nhiên


20





Hình 3.12. Phổ HPLC của dịch chiết tế

bào nghệ đen sau 2-18 ngày nuôi cấy

3.4.4. Xác định sesquiterpene
Kết quả cho thấy, sự hiện diện của các peak phân tách trong củ
nghệ tự nhiên nhiều hơn trong tế bào huyền phù (Hình 3.13). Nhìn
chung, các peak có thời gian lưu liên quan với các hợp chất
sesquiterpene (được đánh số từ 1-9) trong củ nghệ và tế bào huyền phù
có chiều cao phổ hấp thụ (mAU) khác nhau, đặc biệt là peak số 1 và 4
29
bottles, jars to flasks of 1 litter in shaking culture, after that, glass
fermentation system of 1-10 litter, and then unrested steel bioreactor of
30-150 L and final up to 1000 L. Bioreactor is a automatic culture
system with main aim of improving the ability of controlling optimal
condition for cell growth or for producing products.
Some collected evidences from reality over recent decades
indicated that secondary substance possed basic functions such as
protecting from herbivores, antibacterial, antivirus. Such substances
were also applied in pharmacy, agriculture chemicals, staining
chemical, perfurme – created substances, insecticide. Secondary
substances come from plant can be devided into 3 groups: terpene,
phenol and nitrogen compounds. Studies in the ability of biosynthetic of
cultured cells were conducted by botanist and microbiologist in many
nations. Most of applications of plant cell culture in biotechnology are
focused on producing secondary substance. Some archievements in the
field of plant cell culture to produce substances applied in treatment
indicated the future of producing with a large – scale substances of
class of alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid and
amino acids.
In Vietnam. The technology of plant cell has been culture
developed from 1970s and already got some suscesses up to now. One

of most successful archivements is culturing ginseng Ngoc Linh.
Besides, there were some other cell culture of others medicinal plants
like Taxus Wallichiana zucc, Solanum hainanense, Centella asiatica,
vinca rosea Zedoary possess essential oil including sesquiterpene
and monosesquiterpene; curcuminoid. Moreover, the plant also stores
starch, plastic and some other bitterness compounds. Zedoary has been
utilized in some remedies of oriental medicine for treatment. Many
studies indicated that compounds like essential oil, curcumin,
sesquiterpene… of Zedoary possess precious bioactivities such as
28
and discussion, 36 pages; Conclusion and recommendation, 2 pages;
Publcation related to the thesis: 1 page. References: 23 pages
(including 193 English and Vietnamese references); 18 table of data
and 16 figures

Chapter 1
OVERVIEW
17 Vietnamese references and 189 English references were
refered, related to: (1) Plant cell culture; (2) Accumulation of
secondary metabolites in in vitro plant cell culture; (3) Introduction of
C. zedoaria Rocoe.
The first experience of plant tissue was published in 1902 by
Haberlandt-the German plant Physiologist, known as the man invented
method of plant cell culture. First experiments in single cell culture for
pharmaceutical production in 1950s in Charles Pfizer company. Up to
now, 1 century since Haberlandt research, many sub – substances were
produced via plant cell culture.
Plant cell culture started from appearance of unsplitting cells that
called callus. Callus culture was based on tissue culture taken from
plants on the essential culture environment including agar. The cell

suspension culture started by transferring callus mass to liquid culture
using stirring machine, spin or whirl filter membrane. The callus
cultured were fragile, so it is possible to establish the cell suspension
liquid with highest level of dispersion. Culturing the cell suspension in
liquid environment provided a unique system for detail studies about
growth and production transformef substances.
In this culture process, some elements should be in high interst
such as: culture environment including hormones, carbon resource,
culture conditions such as size of original samples, agitation, aeration
rate. The order of a improved process started from culturing cell in
21
(Bảng 3.17). Chẳng hạn, peak số 1 (thời gian lưu 4,7 phút) co độ hấp thụ
là 6,05 mAU trong củ nghệ nhưng chỉ đạt 2,55 mAU trong tế bào huyền
phù, ngược lại peak số 4 (thời gian lưu 7,5 phút) ở tế bào huyền phù có
độ hấp thụ là 7,33 mAU còn củ nghệ
là 2,23 mAU. Một số peak hiện
diện trong củ nghệ (5-8) thì không có hoặc chỉ có ở dạng vết (< 1 mAU)
trong tế bào huyền phù. Tuy nhiên, ở tế bào huyền phù lại xuất hiện
những peak mới (không đánh số) với các thời gian lưu xấp xỉ 6,8; 7,8;
8,2 và 9,2 min tương ứng với độ hấp thụ 1,38-4,10; 5,62-7,54; 1,70-8,41
và 1,06-8,38 mAU. Kết quả này cho thấy, trong quá trình nuôi cấy tế
bào đã xuất hiện sự chuyển hóa sinh học của các sesquiterpene, tạo ra
những hợp chất sesquiterpene khác so với củ nghệ.
Bảng 3.17. Chiều cao của của phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào
nuôi cấy ở hệ lên en 10 L và củ nghệ tự nhiên
Hợp chất sesquiterpene (số)/thời gian lưu (phút)
TN
1/4,7 2/5,1 3/6,0 4/7,5 5/12,7 6/13,8 7/19,2 8/20,5 9/26,7
2 2,11 - 2,49 5,99 - vết vết vết -
4 1,93 - 2,23 5,76 - vết vết vết -

6 1,15 vết 2,81 3,17 - vết - - -
8 1,06 - 1,54 3,57 - - - - -
10 1,22 - 1,02 4,05 - vết vết - -
12 1,04 vết 2,14 3,29 - vết - vết -
14 2,55 1,59 - 7,33 - vết - vết -
16 1,58 - 3,82 4,04 - vết - - -
18 2,36 1,15 1,15 5,11 - vết - vết -
MTN

6,05 2,59 2,15 2,23 6,23 1,46 3,59 1,29 1,19



22





Hình 3.13. Phổ HPLC về sự phân bố sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế
bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít từ 2-18 ngày
3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen
Kết quả trình bày ở bảng 3.18 cho thấy, tinh dầu tách chiết từ tế
bào và củ nghệ đen tự nhiên đều có khả năng ức chế sinh trưởng của
cả 3 loài vi khuẩn E. coli, S. aureus và B. cereus. Nhìn chung, tinh dầu
27
4. Thesis contributions
- Successful selection of cell line (compact and friable) from the
leaf-base explants of in vitro Zedoary to culture suspension, along with
systematical identification of

suitable conditions and culture
medium for the quick and stable growth of cells of C. zedoaria
Roscoe
that were from suspension culture in flasks and 10 litter
bioreactor.
- Study the accumulation of some bioactive substances such as:
essential oil, curcummin, sesquiterpene and polysaccharide in cells of
Curcuma zedoaria Roscoe.
- Studied the antibacterial ability of the essential oil extracted
from the in vitro cultured zedoary cells and already found that the
essential oil was able to depress growth of some pathogenic
microorganisms.
5. Science meaning and reality
5.1. Science meaning
The thesis results can provide some new science data
systematically on cell culture of Zedoary and on their accumulation
ability of some bioactive compounds. Moreover, the results can be a
useful reference for other researches and teaching in cell culture and
producing high valuable bioactive substances.
5.2. Reality meaning
The study results also could be a science base to develop the
process of cell culture for Zedoary in order to quickly produce biomass
and provide a stable material resource for extracting and collecting
some secondary metabolites used for medicine.
6. The thesis structure
The thesis concluded 105 pages (including references), involved:
Introduction: 4 pages: Chapter 1: Overview, 32 pages; Chapter 2:
Research objects, contents and methods, 7 pages; Chapter 3: Results
26
sesquiterpen are capable of inhibiting the formation of TNF-α of activated

macrophages, which has therefore the anti-inflammatory effects. Besides,
curcumin is also an antioxidant that is capable of cells protection.
Essential oil has the high capacity of antimicrobial and mutation
resistance. In addition, its polysaccharide effectively inhibited the growth
of sarcoma (sarcoma 180), preventing chromosome mutation, as well as
has macrophages stimulating activity.
In the nature, Zedoary is propagated by rhizome. The growth of
bulb takes place in a long time, leading to the less multiplier
coefficient and lower yield. On top of that, it especially depends
greatly on the conditions of weather, seasons, labor costs and
production materials. On the other hand, the natural Zedoary is also
susceptible to diseases such as root rot and leaf spot. It is, therefore,
very difficult to have a stable and abundant raw materials for the
production of a large number of precious activities used in
pharmaceutical preparations.
In the light of the above facts, we do the thesis of “Study on cell
culture of Zedoary (Curcuma Zedoaria Roscoe) and investigate the
accumulation of some bioactive compounds”.
2. Research purposes
Study to propose suitable culture conditions and medium for
quick production of cell biomass, simultaneously for identification
of the ability in accumulating some bioactive compounds in cells of
Curcuma zedoaria Roscoe that were from suspension culture.
3. Research contents
- Callus induction from in vitro leaf-base explants of Zedoary;
-
Suspension culture of Zedoary cells;
- Study the accumulation of some bioactive compounds in in
vitro Zedoary cells;
- Investigate of antibacterial activity of essential oil in

in vitro
Zedoary cells.
23
thu được từ tế bào nghệ đen có khả năng kháng khuẩn cao nhất thể
hiện qua đường kính vòng ức chế (Hình 3.14). Tinh dầu tế bào nuôi
cấy ức chế mạnh nhất đối với S. aureus (đường kính vô khuẩn 31
mm), sau đó đến B. cereus (22,33 mm) và kém nhất đối với E. coli
(18,33 mm). Trong khi đó, khả năng ức chế sinh trưởng của tinh dầu
củ nghệ đen tự nhiên đối vớ
i B. cereus và E. coli là tương đương nhau
(16 mm và 17,67 mm), kém nhất là đối với S. aureus chỉ đạt 14 mm.
Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen
Đường kính vòng vô khuẩn D-d (mm)
Vi khuẩn
Đối chứng Tinh dầu tế bào Tinh dầu củ nghệ
B. cereus ATCC 11778 0 22,33
b
16,00
a
E. coli ATCC 25922 0 18,33
b
17,67
a
S. aureus ATCC 6538 0 31,00
a
14,00
a

Đối chứng: không có tinh dầu nghệ đen

Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen. A: E. coli ATCC 25922.
B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: đối chứng. TN: tinh dầu củ
nghệ đen tự nhiên. TB: tinh dầu của tế bào nghệ đen
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN

1. Môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung
thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L thích hợp cho nuôi cấy callus từ
bẹ lá cây nghệ đen in vitro. Callus được tạo thành có màu có màu
vàng, rắn và rời rạc được dùng làm nguyên liệu để thiết lập nuôi cấy tế
bào huyền phù.
2. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5
mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút thích hợp cho sinh
24
trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml. Sinh khối đạt cực
đại là 10,44 g tươi (0,66 g) sau 14 ngày khi nuôi cấy với cỡ mẫu là 3 g.
3. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5
mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí
2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên
men 10 L. Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô) sau 14
ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g.
4. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt cao nhất là 2,57% khố
i
lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh dầu ở củ
nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế bào đạt
cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin
ở củ nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Đã có chuyển hóa sinh học
curcuminoid trong nuôi cấy tế bào. Hàm lượng polysaccharide trong tế
bào cao nhất là 6,55% khối lượng khô sau 10 ngày nuôi cấy, thấp hơn
ở củ nghệ tự nhiên khoảng 1,4 lần. Có sự

tích lũy các hợp chất
sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy. Thành phần sesquiterpene hiện
diện trong tế bào huyền phù ít hơn so với củ nghệ 1 năm tuổi. Trong tế
bào có 3-4 peak của sesquiterpene giống như tế bào củ nghệ. Đã có
chuyển hoá sinh học sesquiterpene trong nuôi cấy tế bào.
5. Tinh dầu tế bào cây nghệ đen có khả năng ức chế mạnh sinh
trưởng của 3 chủng vi khuẩn B. cereus ATCC 11778 (đường kính vô
khuẩn 31 mm), S. aureus ATCC 6538 (22,33 mm) và E. coli
ATCC
25922 (18,33 mm). Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của tinh dầu
thu hồi từ tế bào nuôi cấy khá cao.
ĐỀ NGHỊ
1. Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất có hoạt
tính sinh học trong tế bào nghệ đen.
2. Nghiên cứu thành phần và hoạt tính của curcuminoid,
sesquiterpenes, polysaccharides được sản xuất từ tế bào nghệ đen.

25
INTRODUCTION
1. The necessity of the thesis
Plants are the source of carbohydrate, protein and food fat.
Furthermore, they are also a diversified source of natural compounds
used in pharmaceuticals, agrochemicals and flavors These products
are known as secondary metabolites, which are also considered as the
product of the chemical reactions of the plants with the environment or
its chemical protections against microorganisms and animals.
The studies on the plant - originated sub compounds have
developed from the late 50s of the 20
th
century. To date, there are

about more than 80,000 compounds published. The exploitation of
natural resources of medicinal plants is becoming an important issue
globally as they are more increasingly commercialized. The question
is now that the natural habitats of medicinal plants are rapidly
disappearing due to fluctuations in environmental conditions and
geography, as well as the indiscriminate exploitation of human beings.
That is the reason why scientists must take into account the potential
of plant tissue culture technique as an alternative to a stable supply of
raw materials for the pharmaceutical industry.
Plant tissue culture has been researched since the 1950s. Many
studies showed that it is an effective method in producing bioactive
substances or their metabolites. Based on the method, a wide variety of
valuable compounds has been produced successfully, such as
anthraquinone, vincristine, berberine, diosgenin, taxol, ginsenoside,
and so on.
Zedoary is a non-toxic herb, containing the substances such as
curcumin, terpenoids and essential oils. Curcumin is capable of inhibiting
tumors, which helps to against some forms of cancer in mice, such as
colon cancer, stomach cancer, breast cancer and ovarian cancer. It has
also the effects of anti-clotting and hypotension. Both curcuminoid and