sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa của một số cây thuốc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA
CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC VIỆT NAM
S

K

C

0

0

3

9
0

5
4

9
3

MÃ SỐ: T2010 - 71

S KC 0 0 3 0 7 2

Tp. Hồ Chí Minh, 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA
CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC VIỆT NAM
Mã số: T2010- 71

Chủ nhiệm đề tài: Ths. PHAN THỊ ANH ĐÀO

HCM, 12/2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA
CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC VIỆT NAM
Mã số: T2010- 71

Chủ nhiệm đề tài: Phan Thị Anh Đào
Thành viên đề tài: Nguyễn Thị Bạch Lê

HCM, 12/2010


DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI
TT

Họ và tên

1

Phan Thị
Anh Đào

Đơn vị công tác và
lĩnh vực chuyên môn
Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa học&
Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM

2

Nguyễn Thị

Bạch Lê

Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa học&
Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM

Nội dung nghiên
cứu được giao
Chủ trì

Tham gia

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Tên đơn vị
ĐH Khoa học Tự nhiên TP.
HCM
ĐH Dược

Nội dung phối hợp nghiên
cứu
Ly trích các mẫu cao MeOH

Thử khả năng ức chế quá
trình peroxyd hóa lipid
(TBA test)

Họ tên người đại diện
đơn vị
Nguyễn Xuân Hải

Nguyễn Ngọc Tiên

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành gửi tới TS. Nguyễn Thị Thanh Mai (Khoa Hóa, ĐH Khoa học Tự
nhiên TP HC), đã dìu dắt, định hướng cho tôi trong nghiên cứu này.
Đề tài hoàn thành còn có sự đóng góp, hỗ trợ của các thầy cô trong khoa CN Hóa
Học & Thực Phẩm- ĐH Sư phạm kỹ thuật HCM, của các cô thuộc TT Sâm, ĐH Y
Dược TP HCM.
Xin chân thành cảm ơn!

Chủ nhiệm đề tài: Phan Thị Anh Đào


MỤC LỤC
Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài và đơn vị phối hợp chính
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục bảng biểu

1

Danh mục các chữ viết tắt

2

Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Việt và tiếng Anh

3

Mở đầu

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

8

1.1. Khái niệm về gốc tự do

8

1.1.1. Khái niệm

8

1.1.2. Sự hình thành gốc tự do

8

1.1.3. Độ bền gốc tự do

8

1.1.4. Hệ thống gốc tự do trong sinh học

9

1.1.5. Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể

9

1.1.6. Vai trò của gốc tự do trong cơ thể

13

1.2. Chất chống oxi hóa

17

1.2.1 Chất chống oxi hóa có bản chất enzym

17

1.2.2. Chất chống oxi hóa không có bản chất enzym

18

1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa

22

1.3.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

22

1.3.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế quá trình peroxyd hóa lpid (TBA test)

23

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị

24

2.1.1. Hóa chất

24

2.1.2. Dụng cụ

24

2.1.3. Thiết bị

24

2.2. Qui trình ly trích điều chế cao thô

25

2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu

25


2.2.2. Tiến hành ly trích

25

2.3. Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa

27

2.3.1. Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH

27

2.3.2. Phương pháp thử TBA

29

2.3.3. Xác định khả năng chống oxi hóa và giá trị IC50

31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

32

3.1. Kết quả

32

3.1.1. Hiệu suất ly trích cao thô

32

3.1.2. Kết quả thử hoạt tinh ức chế gốc tự do DPPH

33

3.1.3. Kết quả thử hoạt tính ức chế quá trình peroxyd hóa lipid

34

3.2. Thảo luận

35

3.2.1. Phương pháp thử DPPH

35

3.2.2. Phương pháp thử TBA

35

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

37

4.1. Kết luận

37

4.2. Kiến nghị

37

Tài liệu tham khảo


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Donald Armstrong. Oxidants and antioxidants, Ultrastructure and Molecular Biology
Protocols. Volume 196, (2002).
[2] Pramote Mahakunakorn. Study on the antioxidant and free radical – scavenging
activities of a traditional Kampo medicine, Choto – san, and its related constituents.
Luận án tiến sĩ (2003)
[3] Evgeny T. Denisov, Igor B. Afanas’ev. Oxidation and antioxidant in Organic
chemistry and Biology. Taylor and Francis (2005): 835-884.
[4] Leo M A Heunks, P N Richard Dekhuijzen. Respiratory muscle function and free
radicals from cell to COPD. Thorax (8/2000), 55: 704-716.
[5] Wulf Dröge. Free radicals in physiological control of cell function. Physical Review
(2002): 47-95.
[6] Resat Apak, Kubilay Güçlü, Mustafa Özyürek, Burcu Bektasog˘lu, and Mustafa
Bener, Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity Assay for Food antioxidants:
Vitamins, Polyphenolics, and Flavonoids in Food Extracts, Advanced protocols in
oxidative Stress 1, Methods in Molecular Biology, vol. 477, 2009
[7] Mensor L L, Menezes F S, Leitao G G, Reis A S, dos Santos T C, Coube C S and
Leitao S GS, Sreening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of
DPPH free radical method, 127- 130, Phytother. Res., Vol 15, 2001.
[8] Eva sodergren, Lipid Peroxidation in vivo, Tryck &Medier, Uppsala, Sweden, 2000.
[9] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 2009.
[10] Võ Văn Chi, Cây thuốc An Giang, Ủy ban Khoa Học Kỹ thuật An Giang, 1991.


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Hình 1.1. Các nguồn nội sinh tạo gốc tự do trong cơ thể

12

Bảng 1.1. Ảnh hưởng của sự stress oxy hóa lên các phân tử trong cơ thể

14

Hình 1.1. Quá trình peroxyd hóa lipid

15

Hình 1.2. Chức năng của ROS trong phản ứng miễn dịch của cơ thể

16

Hình 1.4. Những hợp chất chính thuộc họ Flavonoid

20

Hình 1.5. Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH

22

Hình 1.6. Phản ứng tạo phức giữa Malonyl dialdehyd (MDA) và acid

23

thiobarbituric (TBA)
Bảng 2.1. Danh mục 31 cây thuốc An Giang

26

Sơ đồ 2.1. Quá trình ly trích dược liệu tạo cao

27

Sơ đồ 2.2. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

29

Sơ đồ 2.3. Quy trình thử TBA trên não chuột

30

Bảng 3.1. Kết quả cao thô và hiệu suất ly trích

32

Bảng 3.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH• của chất đối chứng dương

33

Trolox ở nồng độ µM và nồng độ quy đổi µg/ml
Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên 31 mẫu dược liệu

33

Bảng 3.4. Kết quả thử TBA của chất chuẩn Trolox

34

Bảng 3.5. Kết quả thử TBA của hai mẫu cao Lá Liễu và Huyết Rồng

34

Hình 3.1. So sánh hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của Trolox và 21

35

mẫu có họat tính


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA

Deoxyribonucleic acid

DPPH

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

LH

Lipid chưa bão hòa

LOOH

Lipid hydroperoxide

MDA

Malonyldialdehyde

TBA

Thio barbituric acid

TCA

Trichloro acetic acid

ROS

Reactive oxygen species (các dạng hoạt động của oxygen)

AntH

Antioxidant (chất chống oxi hóa)

2


.

ĐH SPKT TP HCM
Đơn vị: Khoa CN HH & TP

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa của một số cây thuốc Việt Nam

- Mã số: T2010-71
- Chủ nhiệm: Phan Thị Anh Đào
- Cơ quan chủ trì: ĐH Sư phạm Kỹ thuật HCM
- Thời gian thực hiện: 8/2010-2/2011
2. Mục tiêu:
- Sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa của 31 cây thuốc An Gang bằng phương pháp ức chế
gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxyl hóa lipid.
- So sánh, đánh giá kết quả nghiên cứu để lựa chọn ra những cây thuốc hoạt tính mạnh
cho những nghiên cứu về sau
3. Tính mới và sáng tạo:
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam với mục đích sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa
của các cây thuốc sử dụng hai phương pháp pháp ức chế gốc tự do DPPH và ức chế quá
trình peroxyl hóa lipid.
4. Kết quả nghiên cứu:
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của 31 mẫu cao MeOH trích từ
31 cây thuốc An Giang bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH. 31 mẫu cao đều có
hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH tại các nồng độ 100 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml và 10
µg/ml. Trong đó, 21 mẫu có phần trăm ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 100 µg/ml, 10
mẫu có phần trăm ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 50 µg/ml và 5 mẫu có phần trăm ức
chế lớn hơn 50% tại nồng độ 25 µg/ml. Hai mẫu cao Lá Liễu và Huyết Rồng có hoạt
tính mạnh được thử tại các nồng độ 1, 2, 5 và 10 µg/ml. Giá trị IC50 lần lượt của hai mẫu
3


.

này là 5.21 µg/ml và 6.32 µg/ml. Hai mẫu này được đánh giá khả năng ức chế quá trình
peroxyd hóa lipid bằng phương pháp thử TBA tại các nồng độ mẫu từ 10− 2000 µg/ml.
Giá trị IC50 được tìm thấy theo thứ tự: Lá Liễu (73.37 µg/ml) > Huyết Rồng (158.69
µg/ml).

5. Sản phẩm:
- Bảng kết quả phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của 31 mẫu cao trích từ 31 cây thuốc
- Bảng kết quả tử hoạt tính ức chế quá trình peroxyl hóa lipid của hai mẫu cao trích từ
cây Huyết Rồng và Lá Liễu
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:
- Lựa chọn được hai cây thuốc có hoạt tính mạnh cho các nghiên cứu cô lập chất vê sau.

Ngày

tháng

năm

Trưởng Đơn vị

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu)

(ký, họ và tên)

4


.

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
Project title: The Screening of antioxidant activity of Vietnamese medicinal plants
Code number: T2010- 71

Coordinator: Phan Thi Anh Dao
Implementing institution: University of Technical Education Ho Chi Minh City
Duration: from 08/2010 to 02/2011
2. Objective(s):
- Screening of antioxidant activity of 31 An Giang medicinal plants using different
antioxidant tests including DPPH free radical scavenging and lipid peroxidation
inhibition (TBA test).
- Evaluation of the results to choose plants which for further investigation on these
medicinal plant species to isolate active constituents and drug development.
3. Creativeness and innovativeness:
- This is first report in the Vietnamese about the screening of antioxidant activity of 31
An Giang medicinal plants using different antioxidant tests including DPPH free radical
scavenging and lipid peroxidation inhibition.
4. Research results:
- We carried out studying for antioxidant activity of 31 extracts prepared from 31
medicinal plants from An Giang province by the DPPH radical scavenging test. 31
extracts displayed activity at 100 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, and 10 µg/ml. Of the
extracts assayed, 21 extracts showed an inhibition rate greater than 50% at 100 µg/ml; 10
extracts had over 50% inhibition at 50 µg/ml; and 5 extracts showed greater than 50%
inhibition at 25 µg/ml. Stholobus parviflorus (Roxb.), Excoecaria cochinchinensis Lour showed
strong activity tested at smaller concentrations of 1, 2, 5, and 10 µg/ml. IC50 values of
these extracts were 5.21 µg/ml and 6.32 µg/ml, respectively. Two extracts which were
estimated lipid peroxidation inhibition by thiobarbituric acid assay displayed activity at
various concentrations from 10− 2000 µg/ml. The IC50 values were found to be in the
order: Excoecaria cochinchinensis (73.37 µg/ml) > Spatholobus parviflorus (158.69
µg/ml).
5. Products:

5

.

- The results about DPPH Inhibitory Activity of 31 extracts prepared from An Giang
Medicinal Plants.
- The result about Antioxidant activity of 2 extracts of E. cochinchinensis and S.
parviflorus using TBA assay.
6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:
- The results indicated 2 plants which for further investigation on these medicinal plant

species to isolate active constituents and drug development.

6


.

MỞ ĐẦU
Oxygen là một nguyên tố thiết yếu cho sự sống, tuy nhiên nó trở nên có hại khi tồn
tại dưới dạng các gốc tự do hay các dạng hoạt động của oxygen (ROS). Các gốc tự do
được tạo ra trong cơ thể để chống lại các loại virút và vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi ở
hàm lượng cao các gốc tự do này phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, ADN
và gây ra một số bệnh nghiêm trọng như ung thư, suy thận, rối loạn tim mạch… Do đó,
chất chống oxi hóa là sự lựa chọn hàng đầu trong việc ngăn chặn những thiệt hại do gốc tự
do gây ra. Những chất chống oxi hóa có nguổn gốc tổng hợp hóa học ra đời đã đem lại
những hiệu quả thiết thực trong y học. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra
những ảnh hưởng không tốt của chúng tới sức khỏe người bệnh và môi trường sống của
nhân loại. Do vậy, các nhà nghiên cứu mong muốn tìm các hợp chất chống oxi hóa mạnh
có nguồn gốc dược thảo thay cho các hóa chất tổng hợp. Việt Nam là nước có nguồn
dược thảo phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loại cây cỏ, trong đó có rất nhiều dược

liệu quý. công việc tìm kiếm cây thuốc có hoạt tính mạnh hết sức khó khăn và phức tạp.
Do đó, các nhà khoa học thường sử dụng những phương pháp sàng lọc hoạt tính chống
oxi hóa để định hướng trong nghiên cứu.
Phương pháp thử DPPH (in vivo) là một phương pháp đơn giản, nhanh chóng và
dễ dàng thực hiện với một máy đo UV- Vis. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp là đo
độ giảm hấp thu của DPPH trước và sau khi DPPH bị trung hòa bởi các chất có khả năng
chống oxi hóa. Phương pháp này được sử dụng phổ biến, đặc biệt là rất phù hợp cho quá
trình sàng lọc những cây thuốc có hoạt tính chống oxi hóa. Trong khi đó phương pháp
thử TBA (in vitro) là phương pháp ưu việt nhất để đánh giá quá trình ức chế quá trình
peroxyd hóa lipid trên não chuột. Phương pháp dựa trên phản ứng của MDA (1 sản phẩm
cuối cùng của quá trình peroxyd hóa lipid) với axit thiobarbituric (TBA) tạo ra sản phẩm
màu đỏ, có độ hấp thu quang cực đại tại 532 nm.
Hiện nay chưa có những báo cáo nào mang tính phổ quát về hoạt tính chống oxi
hóa của dược thảo, mà hầu hết là những kinh nghiệm dân gian và những nghiên cứu cho
từng đối tượng cây cỏ cụ thể. Đề tài này ra đời với mong muốn tạo bước đệm cho công
cuộc tìm kiếm, sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính chống oxi hóa mạnh, phục vụ các
nghiên cứu cô lập và xác định cấu trúc về sau.

7


.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

KHÁI NIỆM VỀ GỐC TỰ DO [1]

1.1.1. Khái niệm
Trong hóa học, gốc tự do được khái niệm là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc

phân tử có những electron không ghép cặp ở lớp ngoài cùng. Các electron này có năng
lượng cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng
oxy hóa – khử, phản ứng polymer hóa ….
Gốc tự do thường được chia làm 3 loại: gốc tự do trung tính, gốc tự do cation và gốc
tự do anion. Trong thực tế, gốc tự do trung tính tồn tại nhiều nhất.
Ví dụ:
• Gốc tự do trung tính: Cl●, HO●…
• Gốc tự do cation: xuất hiện phổ biến trong kỹ thuật khối phổ.
• Gốc tự do anion: O2●-, ONOO●- …
1.1.2. Sự hình thành gốc tự do[3]
Sự đứt nối đồng ly trong các nối cộng hóa trị là nguyên nhân chính thường dẫn đến sự
hình thành các gốc tự do, và quá trình này cần năng lượng. Gốc tự do nào cần nhiều năng
lượng để hình thành thì sẽ kém bền hơn so với gốc tự do cần ít năng lượng để hình thành.
Ví dụ, sự hình thành gốc H● từ H2 cần 435 kJ/mol và sự hình thành gốc Cl● từ Cl2 cần
243 kJ/mol, như vậy gốc Cl● sẽ bền hơn gốc H● .
Ngoài sự đứt nối đồng ly của các nối cộng hóa trị, gốc tự do còn được hình thành bởi
các phản ứng oxy hóa khử một điện tử. Phản ứng Fenton tạo gốc HO● từ H2O2 dưới sự
xúc tác của Fe2+ là một ví dụ điển hình của phản ứng oxy hóa khử một điện tử:
Fe2+

+

H2O2

Fe3+

+

HO●

+

HO-

(1)

1.1.3. Độ bền của gốc tự do
Gốc tự do có hoạt tính cao nên thời gian sống của chúng thường rất ngắn. Tuy nhiên
khi được hổ trợ bởi các yếu tố làm bền như hệ thống π liên hợp, gốc tự do sẽ trở nên bền
hơn và có thời gian sống lâu hơn. Điều này được giải thích qua hiệu ứng cộng hưởng xảy
ra trong hệ thống .
Ví dụ: Gốc tự do của α-tocopherol (vitamin E) là một gốc tự do bền do tồn tại hiệu
ứng cộng hưởng p-π trong cấu trúc phân tử của hợp chất.
8


.

O

O
C16H33

O

O
C16H33

C16H33

O

O

O
C16H33

O
1.1.4. Hệ thống gốc tự do trong sinh học
Các gốc tự do giữ một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh lý của con người, và
cũng là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh lý nguy hiểm. Phần lớn hệ thống gốc tự do
trong sinh học là các gốc có trung tâm là oxygen, thường được gọi là các dạng hoạt động
của oxygen (reactive oxygen species, ROS).
Oxygen được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống.
Oxygen tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng, cung cấp cho hoạt
động sống của con người. Tuy nhiên, khi tồn tại ở các dạng hoạt động và các dạng gốc tự
do như superoxyd (O2●-), hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●),
alkoxyl (RO●), … thì chúng trở nên có hại cho cơ thể. Các dạng oxygen hoạt động này có
năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như
protein, lipid, ADN , … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi
một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do
mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi
là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể. [1,2,3]
1.1.5. Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể
1.1.5.1.

Nguồn nội sinh

Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý như quá trình hô hấp ở
tế bào, hoặc các quá trình bệnh lý như quá trình viêm nhiễm, hoặc bởi hệ thống enzym

thân oxy hóa (prooxydant enzymes), ion kim loại chuyển tiếp … trong cơ thể.
a) Quá trình hô hấp của tế bào[1,5]

9


.

Quá trình hô hấp ở tế bào là một chuỗi những phản ứng oxy hóa – khử và gốc tự do là
các sản phẩm trung gian được sinh ra trong quá trình này.
Ví dụ: Quá trình khử oxygen tạo nước trong quá trình hô hấp tạo các gốc tự do như O2●-,
HO● thông qua những phản ứng như sau:
+

−

O2 + 4 H + 4e → 2 H 2O
−

O2 + e → O2

g−

(2)

(3)

g−

+

−

H 2O2 → O2 + 2 H + e (4)
+

−

g

H 2O2 + H + e → OH + H 2O (5)
g

+

−

OH + H + e → H 2O (6)
Bên cạnh đó, phản ứng phụ giữa các gốc tự do trong quá trình hô hấp cũng sẽ hình
thành những gốc tự do mới, độc hại hơn. Một phản ứng phụ đáng chú ý là phản ứng
Haber – Weiss (phản ứng 7), xảy ra giữa gốc O2● và hydrogen peroxyd H2O2 tạo nên
gốc hydroxyl HO● và oxygen đơn bội (singlet oxygen):
O2●-

+

H 2O 2

1

O2

+

HO●

+ HO- (7)

Phản ứng 7 sẽ xảy ra nhanh hơn khi được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển tiếp
như sắt, đồng, cobalt …. Oxygen đơn bội và gốc hydroxyl hình thành là những gốc tự do
có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại. Chúng là nguyên nhân chính gây ra các quá
trình peroxyd hóa màng lipid.
b) Hội chứng viêm nhiễm [1]
Hội chứng viêm nhiễm là một phản ứng tự vệ của cơ thể sống nhằm chống lại sự tấn
công của các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể hoặc sinh ra
ngay trong cơ thể.
Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân
trung tính bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này enzym NADPH oxydase ở màng
bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do
superoxyd O2●-, từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm phân hủy các sinh vật lạ. Tuy nhiên,
một phần các gốc tự do sẽ thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm. Như
vậy trong các hội chứng viêm đã hình thành các gốc tự do dưới xúc tác của enzym
NADPH oxydase.
c) Các enzym prooxydant (prooxydant enzyms)

10


.

Một hệ thống enzym prooxydant trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như xanthine
oxydase (XO), NADPH oxydase, nitric oxyde synthase (NOS), myeloperoxydase (MPO),
… Gốc O2● và NO● là 2 gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzym
thân oxy hóa này.
* Xanthine oxydase (XO) là một enzym quan trọng trong quá trình thoái hóa của các
hợp chất purine. XO dùng O2 như một chất chuyển electron (electron transfer) trong quá
trình phản ứng và kết quả dẫn đến là hình thành gốc O2●-. Điều này được minh họa bằng
phản ứng 8 sau:
O

O
H
N

HN

+ H2O

N

N
H

O

+ 2O2

H
N

XO HN
O

O + 2O2 + 2H+
N
H

N
H

(8)

Sự tạo thành gốc O2●- bởi XO đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra các tổn thương
trong hiện tượng thiếu máu cục bộ (ischaemia injury).
* NOS là một enzym xúc tác sự oxy hóa L – arginine thành citrulline và tạo gốc nitric
oxyde (NO). NOS tồn tại ở 3 dạng: nNOS (neuronal NOS), eNOS (endothelial NOS),
iNOS (inducible NOS) và dùng NADPH làm chất chuyển electron trong quá trình phản
ứng. Nếu trong phản ứng có tồn tại gốc O2●- thì gốc O2●- dễ dàng phản ứng với gốc NO
tạo peroxynitrit (ONOO─), một hợp chất độc đối với ADN.
* Enzym myeloperoxydase được tạo ra do sự hoạt hóa bởi bạch cầu trung tính, sử
dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl─ tạo HOCl, một hợp chất không phải là gốc tự do nhưng có
khả năng oxy hóa mạnh (reactive nonradical species), gây nguy hại cho các mô cơ trong
quá trình viêm.
d)Các ion kim loại chuyển tiếp [1]
Phản ứng giữa một ion kim loại chuyển tiếp và một hợp chất peroxyd cũng góp phần
sản sinh gốc tự do trong cơ thể. Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● dưới xúc tác ion
sắt là một ví dụ điển hình (phản ứng 9 và 10)
Fe2+

+

H2O2

HO- + HO●

Fe3+

+

H2O2

H+

+

Fe3+

+ HOO● + Fe2+

(9)
(10)

Phản ứng 9 và 10 được gọi là phản ứng Fenton. Ngoài sắt, các ion kim loại chuyển tiếp
khác như đồng, cobalt cũng có thể tham gia quá trình này.
11


.

Các lipid hydroperoxyd (LOOH) tinh khiết bền vững ở nhiệt độ sinh lý, nhưng khi có

mặt những phức hợp kim loại chuyển tiếp, đặc biệt là muối sắt, thì sự phân hủy của
LOOH sẽ gia tăng.
* Các nguồn nội sinh dẫn đến sự hình thành gốc tự do trong cơ thể người được tóm tắt
trong hình 1.1.

Hình 3.1. Các nguồn nội sinh tạo gốc tự do trong cơ thể

1.1.5.2.

Nguồn ngoại sinh:

Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các yếu
tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc, ozon …
a) Sự bức xạ
Thành phần chủ yếu của cơ thể là nước, do đó các bức xạ có năng lượng cao (tia X,
tia UV…) khi chiếu vào cơ thể sẽ phân hủy các phân tử nước thành các gốc tự do, có khả
năng phản ứng rất mạnh. Phản ứng như sau:
H2O

HO●

H2O

HO●

+
+

H+

+ e-aq

H●

24 % (11)
2%

(12)

Hiệu suất sinh gốc HO● là 26 %, và sinh điện tử hydrat hóa e-aq là 24 %. Nếu trong
nước có oxygen thì sẽ xảy ra phản ứng sau (phản ứng 13 và 14):
12


.

O2 + e-aq

O2●-

(13)

H●

HOO● (gốc hydroperoxyd)

(14)

+ O2

Như vậy, dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như HO●, O2●-, HOO● được hình
thành trong cơ thể. Điều này có thể giải thích vì sao sự lão hóa của da người sẽ tăng lên
tại những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do các bức xạ mặt trời, tia cực tím đã
làm sản sinh những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxyd hóa lipid ở các tế
bào da.
Bức xạ cũng có thể khơi mào những phản ứng gốc trong tế bào, chẳng hạn như sự tự
oxy hóa các lipid. Đồng thời, các phân tử ADN cũng là mục tiêu bị nguy hại bởi các bức
xạ vì các gốc tự do sản sinh từ sự phân giải nước sẽ tấn công các baz của ADN.
b) Khói thuốc lá
Khói thuốc chứa một lượng lớn những hợp chất như aldehyd, expoxyd, peroxyd và
những gốc oxy hóa như nitric oxyd, gốc peroxyl, gốc với trung tâm carbon hiện diện
trong pha khí. Có khoảng 1015 gốc tự do và 500 ppm NO trong một làn hơi thuốc. Chúng
có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công túi phổi.
Bên cạnh đó, khói thuốc còn chứa các gốc bền trong nhựa thuốc. Sự vi xuất huyết là
nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt ở được tìm thấy ở mô phổi của những người hút
thuốc. Sắt trong thể này dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton, sinh gốc HO● độc hại .
c) Ozon
Ozon là một trong những tác nhân độc hại tạo ra gốc tự do và sự ảnh hưởng của nó
trên cơ thể sống biểu hiện chủ yếu qua các tổn thương ở phổi và máu. Ozon có thể phản
ứng trực tiếp với các hợp chất bất bão hòa như các acid béo trong lipid hoặc có thể tự
phân hủy sinh ra O2, từ đó gia tăng khả năng hình thành các gốc tự do trong cơ thể .
1.1.6. Vai trò của gốc tự do trong cơ thể
1.1.6.1.

Tác dụng có hại của gốc tự do

Sự hiện diện của gốc tự do trong hệ thống sinh học được phát hiện cách đây hơn 50
năm. Vào thời điểm đó, nhiều nhà khoa học đã đưa ra bằng chứng về những tác hại của
gốc tự do đối với sức khỏe con người. Năm 1956, Denham Harman đã mô tả hệ thống
gốc tự do như một chiếc hộp chứa đựng những tác nhân nguy hại (“box of evils”), gây

nên quá trình biến đổi gen, bệnh ung thư và hơn hết là quá trình lão hóa của con người .

13


.

a) Sự stress oxy hóa [2,3]
Stress oxy hóa (oxydative stress) là kết quả của sự hình thành gốc tự do vượt quá mức
kiểm soát của các hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể. Điều này xảy ra khi các chất
kháng oxy hóa có nồng độ quá thấp không đủ để kháng lại các gốc tự do trước khi nó
bùng nổ .
Sự stress oxy hóa mang lại nhiều nguy hại cho con người khi các gốc tự do bùng phát
và tấn công các phân tử sống như lipid, protein, ADN. Nếu sự stress oxy hóa diễn ra
mãnh liệt có thể gây chết tế bào. Ảnh hưởng của sự stress oxy hóa được tóm tắt trong
bảng sau (bảng 1.1):
Bảng 1.1: Ảnh hưởng của sự stress oxy hóa lên các phân tử trong cơ thể
Mục tiêu gốc tự do tác kích
Amino acid không no,
chứa các nhóm thiol
Nucleic acid
Carbohydrate
Lipid không no
Chất dẫn truyền thần kinh
Protein
ADN

Hậu quả
Biến chất protein, tạo các liên kết chéo
Ức chế enzym

Thay đổi tính thấm của tế bào và các cơ quan
Gây đột biến gen
Thay đổi vòng tuần hoàn của tế bào
Thay đổi các receptor trên bề mặt tế bào
Oxy hóa cholesterol và acid béo
Tạo liên kết chéo trong lipid
Thay đổi tính thấm của tế bào
Làm giảm hoạt tính cũng như khả năng của chất dẫn truyền
thần kinh, bao gồm serotonin và epinephrine
Phân chia các dây peptide, biến đổi tính chất protein
Đột biến gen, biến đổi các baz, ảnh hưởng đến quá trình sao
chép và sửa chữa gen.

b) Quá trình lão hóa
Các sinh vật đa bào thường chịu ảnh hưởng của một quá trình biến đổi theo thời gian
liên quan đến sự thoái hóa của các bộ phận chức năng sinh học. Quá trình này được gọi là
quá trình lão hóa hay chúng ta thường gọi là già hóa. Năm 1956, Harman đã đưa ra lý
thuyết về sự lão hóa qua bài viết “Theory of Aging”. Ông cho rằng quá trình lão hóa là
kết quả của những phản ứng độc hại của gốc tự do với các phân tử sinh học, gây rối loạn
các bộ phận và từ đó dẫn đến mất chức năng.

14


.

Sự rối loạn và đột biến xảy ra chủ yếu trong gen là nguyên nhân chính dẫn đến sự lão
hóa. Sự rối loạn này do các gốc tự do, đặc biệt là superoxyd và hydroxyl, phản ứng với
các phân tử duy truyền. Ngoài ra, gốc tự do có thể phản ứng với collagen, một protein
chính trong các mô liên kết, trong gân, xương, sụn, da, làm lão hóa các bộ phận này. Các

vết nhăn xuất hiện trên da do collagen bị hư hại là dấu hiệu chính cho sự lão hóa.
Sự gia tăng nồng độ các chất kháng oxy hóa nội sinh, đặc biệt là enzym SOD sẽ kéo
dài tuổi thọ ở loài khỉ nâu (rhesus macaques). Đây là một trong những bằng chứng chứng
minh sự liên quan giữa gốc tự do và sự lão hóa vì các chất kháng oxy hóa có thể dập tắt
các gốc tự do, kéo dài quá trình sống.
c) Quá trình peroxyd hóa lipid (lipid peroxydation )[2]
Các tế bào được bao bọc bởi một lớp màng lipid kép. Do trong cấu trúc lipid chứa
nhiều các acid béo không no nên gốc tự do rất dễ dàng xúc tiến phản ứng với các acid
béo này, quá trình được gọi là quá trình peroxyde hóa lipid.
Trong quá trình peroxyd hóa lipid, gốc hydroxyl sẽ lấy một nguyên tử hydrogen trong
nhóm methyl của lipid (LH), hình thành gốc tự do lipid (L●). Gốc tự do lipid sẽ tiếp tục
phản ứng với oxygen trong cơ thể tạo gốc lipid peroxyl (LOO●). Gốc LOO● sẽ hình thành
hợp chất lipid hydroperoxyd (LOOH) bằng cách lấy một nguyên tử hydrogen từ một acid
béo không no kế cận. Quá trình được mô tả trong hình 1.2.
Các gốc tự do lipid có thể phản ứng với nhau, gây xáo trộn cấu trúc màng tế bào. Quá
trình peroxyd hóa lipid làm thay đổi độ nhớt, tính thấm của màng tế bào và chức năng
của các kênh ion trên màng. Điều này sẽ gây nguy hiểm cho các thành phần bên trong tế
bào.

Hình 1.4: Quá trình peroxyde hóa lipid
15


.

Quá trình peroxyd hóa cũng có thể được xúc tiến bởi oxygen đơn bội. Lipid
hydroperoxyd bị phân hủy thành rất nhiều sản phẩm aldehyd. Trong đó, hợp chất
malonyldialdehyd (MDA) là sản phẩm aldehyd phổ biến nhất và nó được xem là dấu hiệu
của quá trình peroxyd hóa lipid.
1.1.6.2.

Tác dụng có lợi của gốc tự do [5]

Ở nồng độ cao, gốc tự do rất nguy hiểm và có hại cho các phân tử sống trong cơ thể.
Tuy nhiên khi tồn tại ở nồng độ trung bình, gốc tự do lại rất có lợi và cần thiết cho các
hoạt động của cơ thể sống.
a) Vai trò của gốc tự do trong quá trình trao đổi chất và trong chuỗi hô hấp tế bào
Hầu hết tất cả các dạng sống đều cần đến gốc tự do cho các quá trình diễn ra trong cơ
thể ở mức vi mô. Trong tế bào của sinh vật sống, hàng triệu các phản ứng hóa học diễn ra
mỗi giây nhằm tạo năng lượng cung cấp cho hoạt động sống và tạo nên những chất cần
thiết để xây dựng cơ thể. Rất nhiều phản ứng trong số đó đòi hỏi sự di chuyển của các
điện tử từ phân tử này sang phân tử khác, đặc biệt trong chuỗi hô hấp của bào. Các gốc
tự do luôn đóng vai trò trung gian quan trọng cho sự dịch chuyển điện tử này.
b) Vai trò của gốc tự do trong hệ thống miễn dịch
Cơ thể chúng ta rất dễ bị các sinh vật lạ hoặc vi khuẩn từ môi trường bên ngoài xâm
nhập vào, do đó một hệ thống miễn dịch nhằm bảo vệ cơ thể khỏi các vi sinh vật là điều
cần thiết. Điều này được thực hiện chính bởi các bạch cầu hay còn gọi là tế bào Tlympho (T-Lymphocyte). Gốc tự do, phần lớn là ROS được tạo ra bởi sự hoạt hóa của
các đại thực bào (macrophage) góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có hại
.

Hình 1.5: Chức năng của ROS trong phản ứng miễn dịch của cơ thể
16


.

Bên cạnh tác dụng giúp tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do còn góp phần quét dọn
những tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi và phát
triển. Đồng thời, gốc tự do còn góp phần tiêu diệt những tế bào bất thường như tế bào
ung thư.

Ngoài hai vai trò trên, gốc tự do còn tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác cho cơ
thể như đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh (NO), hoặc làm nhiệm vụ là cell
signalling và cần thiết cho việc hình thành một số hormon như thyroxyne .
1.2.

CHẤT CHỐNG OXI HÓA

Sự tồn tại của các gốc tự do và các dạng oxygen hoạt động gây nên tác hại lớn cho cơ
thể. Để chống lại các tác hại này, cơ thể chúng ta được trang bị một hệ thống hiệu quả
bao gồm các chất kháng oxi hóa.
Chất kháng oxi hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác
dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Chất kháng oxi hóa có
thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động tạo ra những gốc tự do mới kém hoạt
động hơn, từ đó có thể ngăn cản các chuỗi phản ứng dây chuyền được khơi mào bởi gốc
tự do (xem phản ứng 1.15 và 1.16)
HO●

+

AntH

H2O

+

Ant●

AntH

ROOH +

Ant●

(1.15)
ROO●

+

(1.16)
Chất kháng oxi hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp
trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzym xúc tác cho các quá trình sinh ra gốc tự do
nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể. Ví dụ như allopurinol là một chất
kháng oxi hóa ức chế enzym xanthine oxidase, một enzym xúc tác cho sự hình thành gốc
superoxide trong hiện tượng thiếu máu cục bộ.
Có nhiều cách phân loại các chất kháng oxi hóa như dựa trên nguồn gốc, một trong
những cách đó là dựa trên bản chất enzym hoặc không enzym của chất kháng oxi hóa
1.2.1.

Chất kháng oxi hóa có bản chất enzym

Đây là hệ thống kháng oxi hóa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào và giữ một vai trò
quan trọng trong việc duy trì sự sống. Tế bào sống luôn bị tổn hại bởi các gốc tự do sinh
17