Nghiên cứu hoá học và hoạt tính chống ung thư của một số hợp chất benzopyran nguồn gốc thực vật

Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO VIệN KHOA HọC
Và CÔNG NGHệ VIệT NAM
Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên



NGUYễN HOàI NAM



nghiên cứu hóa học và hoạt tính chống
ung th của một số hợp chất benzopyran
nguồn gốc thực vật


Chuyên ngành : Hoá học các hợp chất thiên nhiên
Mã số : 62.44.27.02


Tóm tắt Luận án tiến sỹ hóa học







Hà nội-2009

Công trình đ ợc hoàn thành tại Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.


Ng ời h ớng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Châu Văn Minh
2. TS. L u Văn Chính



Phản biện 1: GS. TSKH Phan Tống Sơn
Tr ờng Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội
Phản biện 2: GS. TSKH Phạm Tr ơng Thị Thọ
Viện D ợc liệu- Bộ Y tế
Phản biện 3: GS. TS Phạm Xuân Sinh
Tr ờng Đại học D ợc Hà Nội



Luận án đ ợc bảo vệ tr ớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà n ớc họp tại: Phòng họp
A1-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18-Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy,
Thành phố Hà Nội
Vào hồi: 9
h
00 giờ ngày 22 tháng 07 năm 2009





Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Th viện Quốc gia
- Th viện Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện KH&CN Việt Nam
Danh mục công trình đã công bố của tác giả
liên quan đến luận án


1 Nguyen Hoai Nam, Nguyen Hai Dang, Phan Van Kiem, Luu Van Chinh, Phan
Thi Binh, La Dinh Moi, and Chau Van Minh (2007), Study on benzopyrans
and other isolated compounds from Mallotus apelta, Tạp chí Hóa học, Tập
45, Số đặc biệt, trang 111-121.
2 Nguyen Hoai Nam, Nguyen Huu Tung, Nguyen Xuan Nhiem, Chau Van
Minh, Phan Van Kiem (2007), Study on synthesis of some new derivatives of
malloapelta B isolated from Mallotus apelta, Tạp chí Hóa học, Tập 45, Số 2,
trang 250-254.
3 Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Huu Tung, Nguyen Hai
Dang, Phan Van Kiem, Chau Van Minh (2006), New cytotoxic benzopyrans
synthesized by michael type and nitration reactions from malloapelta B, Tuyển
tập các bài báo khoa học-Hội nghị Khoa học lần thứ 20-Đại học Bách khoa
Hà Nội, Nhà xuất bản Bách khoa Hà nội, trang 246-250.
4 Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Hoang Thanh Huong, Nguyen Hoai Nam,
Jung Joon Lee, Young Ho Kim (2005), Chemical Investigation and biological
studies of Mallotus apelta, III- New chromene derivative from Mallotus
apelta, Tạp chí Hóa học, Tập 43, Số 5, trang 652-656.
5 Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Nguyen Hoai Nam, Hoang Thanh Huong,
Jung Joon Lee and Young Ho Kim (2005), Chemical Investigation and
biological studies of Mallotus apelta, IV. Constituents with inhibitory activity
against NFAT and NF-kB activation from Mallotus apelta, Tạp chí Hóa học,
Tập 43, Số 6, trang 773-777.
6 Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Hoang Thanh Huong, Nguyen Hoai Nam,
Jung Joon Lee and Young Ho Kim (2004), Pentacyclic triterpenoids from

Mallotus apelta, Arch of Pharmacal Research, Vol.27(11), pp. 1109-1113.


1

I. Giới thiệu luận án
1. Đặt vấn đề
Trong nhiều năm gần đây, với sự hỗ trợ của các kỹ thuật tiên tiến, các thành phần có
hoạt tính trong thảo d ợc đã dần dần đ ợc phân lập, xác định cấu trúc, mô tả rõ đặc điểm
của hợp chất, đánh giá hoạt tính sinh học, nghiên cứu tiền lâm sàng và nghiên cứu lâm sàng.
Trong ch ơng trình nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiên
nhiên, các nhà khoa học của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã sàng lọc trên 500
cây thuốc, kết quả đã phân lập đ ợc rất nhiều hợp chất, trong đó có nhiều hợp chất thể hiện
hoạt tính sinh học quý báu. Trong số các hợp chất phân lập đ ợc có nhóm chất có kiểu
khung 2H-chromene đ ợc phân lập từ loài Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg thuộc chi
Mallotus ở Việt Nam, kết quả đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất có kiểu khung 2H-
chromene này cho thấy các hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý báu. Để góp
phần tạo cơ sở khoa học cho việc đ a những kết quả nghiên cứu này trở thành những h ớng
nghiên cứu khả quan trong nghiên cứu phát triển các hợp chất quý từ thiên nhiên thành các
d ợc phẩm hỗ trợ và điều trị các bệnh hiểm nghèo, chúng tôi đề ra nhiệm vụ của bản luận án
này là nghiên cứu hóa học và hoạt tính chống ung th của một số hợp chất benzopyran
nguồn gốc thực vật.
2. Các đối t ợng nghiên cứu của luận án
Đối t ợng nghiên cứu của luận án bao gồm hợp chất sạch malloapelta B có kiểu khung
benzopyran, có hoạt tính chống ung th và có hàm l ợng cao đ ợc phân lập từ lá loài
Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg và chế phẩm malloapelta B (MB) với thành phần chính
là hợp chất malloapelta B.
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Đã áp dụng mô hình nghiên cứu hóa học theo định h ớng hoạt tính kháng NF-kB
hoạt hóa và kết hợp các ph ơng pháp chiết, sắc ký phân lập và xác định cấu trúc đ ợc hoạt

chất malloapelta B (1-(5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl)-but-2-en-1-one) từ
lá cây Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính
kháng NF-kB hoạt hóa của hợp chất này, kết quả cho thấy hợp chất malloapelta B có khả
năng kháng NF-kB (IC
50
=0.54 mM) hoạt hóa và khả năng ức chế hai dòng tế bào ung th
ng ời là dòng tế bào ung th gan ng ời (Hep-G2, IC
50
=0,49 mg/ml) và dòng tế bào ung th
màng tim (RD, IC
50
=0,54 mg/ml).
3.2. Lần đầu tiên sử dụng thiết bị sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ để khảo sát sự
biến động của hợp chất malloapelta B trong lá loài Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg theo
mùa vụ. Kết quả khảo sát b ớc đầu cho thấy hàm l ợng malloapelta B cao nhất vào tháng 1
và thấp nhất vào tháng 9.

2

3.3. Lần đầu tiên xây dựng thành công quy trình phân lập malloapelta B từ lá loài
Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg ở qui mô 25kg lá khô/mẻ. áp dụng quy trình này đã
phân lập đ ợc 50,5 g malloapelta B làm nguyên liệu cho bán tổng hợp các dẫn xuất và
nguyên liệu cho các nghiên cứu về an toàn, hiệu lực của chế phẩm malloapelta B (MB).
3.4. Đã bán tổng hợp đ ợc 10 dẫn xuất mới từ malloapelta B, đó là:
ã 8-[1-oxo-3(R)-methoxy-butyl]-5,7- dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
(MalloB2);
ã 8-[1-oxo-3(R)-ethoxy-butyl]-5,7-dimethoxy-2,2- dimethyl -2H-1-benzopyran
(MA20A);
ã 8-[1-oxo-3(R)-propoxy-butyl]-5,7-dimethoxy-2,2- dimethyl -2H-1-benzopyran
(MA20C);

ã 8-[1-oxo-3(R)-isopropoxy-butyl]-5,7-dimethoxy- 2,2-dimethyl- 2H-1-benzopyran
(MA20D);
ã 8-(1-oxobut-2-en-1-yl)-5,7-dimethoxy-3- nitro -2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
(MA20B);
ã 1-(5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl)-butan-1-one (MalloB7);
ã 8-(1,5-dioxo-3(R)-methyl-4-acetylhexyl)-5,7- dimethoxy- 2,2-dimethyl-2H-1-
benzopyran (MA20TB);
ã 8-(1,5-dioxo-3(R/S)- methyl - 4-methoxycarbonylhexyl)-5,7-dimethoxy-2,2-
dimethyl-2H-1-benzopyran(MA20A5B);
ã 8-(1,5-dioxo-3(R/S)-methyl-4-ethoxycarbonylhexyl)- 5,7- dimethoxy-2,2-
dimethyl-2H-1-benzopyran (MA20A5A);
ã 8-(1-oxo- 3(R)-(imidazol-1-yl)butyl)-5,7- dimethoxy- 2,2-dimethyl- 2H-1-
benzopyran (MalloB11).
3.5. Lần đầu tiên tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của malloapelta B v
các dẫn xuất bán tổng hợp đ ợc trên hai dòng tế bào ung th ng ời (Hep-G2, RD). Kết quả
cho thấy hầu hết đều thể hiện hoạt tính diệt tế bào ung th . Malloapelta B thể hiện hoạt tính
mạnh nhất với các giá trị IC
50
t ơng ứng là 0,49 mg/ml và 0,54 mg/ml. Kết quả thử cho phép
sơ bộ kết luận nhóm cacbonyl a, b không no có thể có vai trò quan trọng cho sự xuất hiện
hoạt tính cao.
3. 6. Kết quả thử độc cấp, bán tr ờng diễn và tác dụng diệt tế bào ung th in vivo cho
thấy chế phẩm malloapelta B ở dạng tiêm có giá trị LD
50
= 43,00 6,58 mg/kg thể trọng. Với
mức liều nghiên cứu là 25 mg/kg, chế phẩm đ ợc coi là an toàn trên động vật thực nghiệm.
Chế phẩm có tác dụng hạn chế sự phát triển ung th thực nghiệm sacoma 180.

3

4. Bố cục của luận án:
Luận án gồm 140 trang với 36 bảng số liệu, 86 hình, 115 tài liệu tham khảo và 11 phụ
lục. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang), Ch ơng 1: Tổng quan tài liệu (30 trang), Ch ơng
2: Nguyên liệu và ph ơng pháp nghiên cứu (6 trang), Ch ơng 3: Thực nghiệm (14 trang),
Ch ơng 4: Kết quả và Thảo luận (71 trang), Kết luận (2 trang), Các công trình đã công bố (1
trang), Tài liệu tham khảo (13 trang), Danh mục các phụ lục (1 trang).
II. Nội dung của luận án
Mở đầu
Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.
Ch ơng 1: tổng quan tài liệu
Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong n ớc và quốc tế về các vấn đề:
ã Các nghiên cứu về các hợp chất có khung 2H-1-benzopyran (2H-chromene)
ã Hoạt tính sinh học của các hợp chất có khung 2H-1-benzopyran
ã Chi Mallotus và ứng dụng trong y học
Ch ơng 2: Nguyên vật liệu và Ph ơng pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu thực vật là lá cây bùm bụp (Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg) thu hái
tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Chế phẩm malloapelta B (MB) ở dạng tiêm với thành phần chính là
hợp chất malloapelta B do Bộ môn Công nghiệp d ợc, tr ờng Đại học D ợc bào chế. Các
dòng tế bào ung th của Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất thiên
nhiên. Chuột nhắt trắng dòng Swiss, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ Sinh dịch tễ
Trung ơng cung cấp. Dòng tế bào ung th Sarcoma 180 do phòng thí nghiệm thực nghiệm
Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp
2.2. Ph ơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Ph ơng pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất theo định h ớng hoạt tính sinh
học.
Phần này trình bày ph ơng pháp phân lập hợp chất theo định h ớng hoạt tính sinh học
và các ph ơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất bằng các ph ơng pháp vật lý và thiết bị
nghiên cứu hiện đại.
2.2.2. Ph ơng pháp bán tổng hợp các dẫn xuất.

Phần này trình bày các ph ơng pháp bán tổng hợp dẫn xuất theo cơ chế phản ứng
Maicơn với các tác nhân khác nhau, phản ứng khử hóa hợp chất có liên kết a, b không no và
phản ứng nitro hoá.

4

2.2.3. Ph ơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro
Phần này trình bày ph ơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự hoạt hóa NF-kB và đánh
giá hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung th ng ời là dòng Hep-G2 (Human
hepatocellular carcinoma-dòng tế bào ung th gan ng ời) và dòng RD (Rhabdosarcoma-
Ung th màng tim).
2.2.4. Ph ơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vivo
Phần này giới thiệu các ph ơng pháp nghiên cứu về độc tính cấp (LD
50
) theo quy định
của Bộ Y tế, ph ơng pháp cải tiến của Litchfield-Wilcoxon và ph ơng pháp nghiên cứu độc
tính bán tr ờng diễn trên động vật thực nghiệm theo Abrham W.B và Turner A. Ngoài ra,
trong phần này còn mô tả vắn tắt về ph ơng pháp nghiên cứu hiệu lực của chế phẩm, trong
đó trình bày tóm tắt các b ớc nghiên cứu tác dụng của chế phẩm trên mô hình ung th thực
nghiệm.
Ch ơng 3. Thực nghiệm
3.1. Phân lập hợp chất malloapelta B có hoạt tính ức chế NF-kB từ lá cây Mallotus
apelta (Lour.) Muell Arg
3.1.1. Phân lập hợp chất malloapelta B từ loài Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg
Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập hợp chất malloapelta B từ lá loài Mallotus
apelta (Lour.) Muell Arg theo định h ớng hoạt tính ức chế NF-kB hoạt hóa.

Hình 3.1. Sơ đồ chiết phân bố bột lá Mallotus apelta với các dung môi khác nhau
Các b ớc nghiên cứu sẽ thực hiện cho đến khi phân lập đ ợc hợp chất có hoạt tính ức
chế sự hoạt hóa của NF-kB (hình 3.2).
Bổ sung CHCl
3

MA1.2
Cặn CHCl
3

Bột lá khô M. apelta

- Chiết MeOH

MA1 Cặn MeOH
Bổ sung n ớc

n-Hexan: n ớc 1/1

CHCl
3
: n ớc 1/1
Dịch n ớc

Dịch n ớc

MA1.1
Cặn n-hexane
MA1.3
Dịch n ớc

5

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất MA8D từ lá cây Bùm bụp
3.1.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất malloapelta B
Phần này nêu ra các dữ kiện phổ cũng nh hằng số vật lý của chất phân lập đ ợc là
malloapelta B.
3.2. Khảo sát động thái tích lũy hoạt chất malloapelta B trong lá loài Mallotus apelta
(Lour.) Muell Arg theo mùa bằng ph ơng pháp HPLC-MS.
Trong phần này trình bày các b ớc thực nghiệm để xây dựng đ ờng chuẩn định l ợng
hàm l ợng hợp chất malloapelta B trong lá loài Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg và khảo
sát sự biến đổi hàm l ợng hợp chất malloapelta B trong lá loài Mallotus apelta bằng hệ sắc
ký lỏng cao áp kết nối khối phổ.
3.3. Xây dựng quy trình phân lập malloapelta B từ lá loài Mallotus apelta (Lour.)
Muell Arg qui mô 25 kg lá khô/mẻ.
Phần này trình bày các b ớc thực nghiệm để lựa chọn điều kiện phân lập nhóm chất
benzopyran có malloapelta B và các b ớc tối u để phân lập malloapelta B từ nhóm chất.

Silica gel CC với tỷ lệ CHCl
3
: MeOH
100/1
Silica gel CC với hệ dung môi CHCl
3
: MeOH
tỷ lệ100/0 đến 0/100

Silica gel CC
n-hex. acetone 100/0-10/1
MA2A2

MA8D

Silica gel CC với tỷ lệ n-Hex. EtOAC 10/1
MA2A

MA2B

MA2C

MA2D MA2E
MA2A3

MA3A

MA3B

MA3C

MA3D

MA3E

MA3G
MA4A

MA4B

MA4C

MA4D

MA2A1

MA1.2: cặn CHCl
3


Tách chất và kết tinh


6

3.4. Nghiên cứu chuyển hóa một vài dẫn xuất từ hợp chất malloapelta B.
3.4.1. Quy trình chuyển hóa một vài dẫn xuất
Phần này trình bày các b ớc chuyển hóa các dẫn xuất từ hợp chất ban đầu là
malloapelta B. Trong đó:
ã Hợp chất MalloB7 đ ợc chuyển hóa từ chất đầu malloapelta B dựa trên cơ chế phản
ứng khử hóa hóa hợp chất có liên kết a, b không no bằng tác nhân NaBH
4
với cơ chế phản
ứng đ ợc trình bày nh sau:
R
OH
CH
3
Na
+NaB(OH)
4
O
R
CH

3
B
O
O
OO
R
R
H
3
C
R
CH
3
R
CH
3
Na
B
H
H
HH
R
O
CH
3
O
CH
3
CH
3

OCH
3
H
3
CO
R
O
CH
3
+
+4H
2
O
4
R=
1
2 3
4
Sản phẩm tạo thành

Hình 3.3. Cơ chế phản ứng khử nối đôi trên mạch nhánh của malloapelta B bằng NaBH
4

ã Hợp chất MA20B đ ợc hình thành qua phản ứng nitro hoá dựa trên phản ứng thế S
E
,
cơ chế của phản ứng này đ ợc mô tả nh sau:
Tác nhân electrophin (E+) phản ứng với malloapelta B là ion nitroni (
+
NO

2
). Sự có
mặt axit sunfuric sẽ làm tăng nồng độ tác nhân này.
B ớc 1: Cation nitroni tấn công vào liên kết P (C
3
=C
4
)
O
O
O
O
chậm
O
O
O:
O
N
+
:O:
:O:
N
+
:O:
:O:
-
H
+

B ớc 2: Tách proton khỏi cation
O
O
O:
O
N
+
:O:
:O:
-
H
+


:O:
H
H
nhanh
O
O
O:
O
N
+
:O:
:O:
-

+ H
3
O
+

Hình 3.4. Cơ chế phản ứng nitro hóa
ã Các hợp chất khác nh MalloB2, MA20A, MA20C, MA20D, MA20TB,
MA20A5B, MA20A5A và MalloB11 đ ợc chuyển hóa từ chất đầu malloapelta B dựa trên
phản ứng Maicơn theo cơ chế trình bày trên hình d ới đây:

7

R Hợp chất
-OCH
3
MalloB2
-OCH
2
CH
3
MA20A
-OCH
2
CH
2
CH
3
MA20C
-OCH(CH
3

)
2
MA20D
- CH(COCH
3
)
2
MA20TB
-CH(COCH
3
)COOCH
3

MA20A5B
CH(COCH
3
)COOC
2
H
5

MA20A5A
OH
3
CO
CH
3
CH
3
O

CH
3
OCH
3
RH + B
-
R
-
OH
3
CO
OCH
3
CH
3
CH
3
O
H
2
C
CH
3
R
OH
3
CO
OCH
3
CH

3
CH
3
O
H
C
CH
3
R
OH
3
CO
OCH
3
CH
3
CH
3
O
H
C
CH
3
R
R
-

+





B
H
BH
Nhanh
B
-
Enol
X
e
t
o
n

N
N

MalloB11
Hình 3.5. Cơ chế phản ứng bán tổng hợp các hợp chất theo phản ứng Maicơn
3.4.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất chuyển hóa.
Phần này nêu ra các dữ kiện phổ cũng nh hằng số vật lý của 10 dẫn xuất bán tổng hợp
đ ợc từ hợp chất malloapelta B.
3.5. Đánh giá hoạt tính chống ung th của các hợp chất
3.5.1. Đánh giá hoạt tính chống ung th in vitro
Phần này trình bày các thử nghiệm về hoạt tính kháng NF-kB hoạt hóa đối với hoạt
chất malloapelta B và hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào ung th ng ời (Hep-G2,
RD) của hoạt chất malloapelta B và các dẫn xuất.
3.5.2. Đánh giá hoạt tính chống ung th in vivo
Phần này trình bày nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán tr ờng diễn của chế phẩm
malloapelta B (MB). Ngoài ra, phần này còn trình bày thêm về nghiên cứu về hiệu lực chế
phẩm MB trên mô hình gây ung th thực nghiệm.
Ch ơng 4. kết quả và thảo luận
4.1. Xác định cấu trúc hóa học hợp chất malloapelta B có hoạt tính ức chế NF-kB
D ới đây trình bày ví dụ điển hình minh họa các b ớc xác định cấu trúc của hợp chất
(MA8D) phân lập từ lá loài Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg. Hợp chất MA8D tách đ ợc
d ới dạng tinh thể hình lập ph ơng có màu trắng theo sơ đồ trên hình 3.1, hình 3.2 mục
3.1.1, đ ợc ký hiệu là MA8D. Phổ khối l ợng bắn phá nguyên tử nhanh FAB-MS (positive)
cho píc ion m/z 311.0 [M+Na]
+
, m/z 289.0 [M+H]
+
(hình 4.1).


Hình 4.1. Phổ FAB-MS của MA8D
[M+Na]
+

[M+H]
+


8

Phổ
1
H-NMR (hình 4.2) xuất hiện tín hiệu của hai nhóm metyl metoxi điển hình d
H

3,84 (3H, s) và d
H
3,77 (3H,s), tín hiệu của hai nhóm metyl ở tr ờng cao chập nhau ở d
H

1,34 (6H, s). Bên cạnh đó còn có tín hiệu doublet của một nhóm metyl ở d
H
1,91 (3H, d, J =
6,5 Hz). Ngoài ra còn xuất hiện các tín hiệu của 5 proton nối đôi, trong đó một tín hiệu đơn
d
H
6,03 (1H, s), hai tín hiệu doublet của hai proton nằm ở vị trí octo với nhau d
H
5,45 (1H,
d, J = 10.5 Hz) và 6,58 (1H, d, J = 10,5 Hz), tín hiệu doublet 6,38 (1H, d, J = 17,0 Hz) của
proton có t ơng tác mạnh với proton cộng h ởng ở d
H
6,69 (1H, dd, J=17,0 Hz, 6,5 Hz).

Hình 4.2. Phổ
1
H-NMR của MA8D
Phổ hồng ngoại (hình 4.3) IR n
max
KBr
, cm
-1
: 1650 (C=O), 1115 (C-O-C), 1580
(C=C);

Hình 4.3. Phổ IR của MA8D

Hình 4.4. Phổ
13
C-NMR của hợp chất MA8D
Phổ
13
C-NMR v DEPT (hình 4.4 và hình 4.5) xuất hiện 17 tín hiệu cacbon, bao gồm 7 C
bậc bốn, 5 CH, 3 nhóm metyl và hai nhóm metoxi. Trên phổ khẳng định sự tồn tại của hai
nhóm metoxi (d
C
55,5 và 55,8), hai nhóm metyl bậc bốn (d
C
27,5 và 27,7), một nhóm metyl

9

nối với nối đôi (d

C
18,1), một nhóm cacbonyl (d
C
194,2), C bậc 4 nối trực tiếp với nguyên tử
ôxy rất điển hình (d
C
76,5).

Hình 4.5. Phổ DEPT của hợp chất MA8D
Các phân tích trên cho thấy, nếu trong phân tử MA8D chỉ có các nguyên tố C, H, O thì
công thức phân tử có dạng C
17
H
20
O
4
ứng với m/z=311 [M+Na]
+

hoặc m/z=289 [M+H]
+
.
Công thức phân tử của MA8D đ ợc xác định chính xác là C
17
H
20
O
4
thông qua phổ khối
l ợng phân giải cao. Phổ khối l ợng phân giải cao thời gian bay (HR TOF-MS) xuất hiện píc

ion phân tử [M+H]
+
tại m/z: 289,1478 và kết quả phân tích nguyên tố là 289,1440 cho thức
C
17
H
21
O
4
[M+H]
+

(hình 4.6)

Hình 4.6. Phổ phân giải cao HR TOF-MS và kết quả phân tích nguyên tố của MA8D.
Bảng 4.1. Số liệu phổ
1
H,
13
C-NMR và HMBC của MA8D và số liệu tham khảo
C
#
d
C
(c)


d
C
(a,c)

d
H
(b,c)
(J, Hz) HMBC (HC)
2 76,8

76,5
3 126,7

126,6 5,45 (1H, d, 10,5) C-2, C-10, C-11, C-12
4 116,3

116,2 6,58 (1H, d, 10,5) C-2, C-5, C-9, C-10
5 156,7

156,3
6 87,8

87,7 6,03 (1H, s) C-5, C-7, C-8, C-10
7 157,8

158,1
8 113,6

111,4

10
9 151,9

151,7
10 104,2

104,1
11 27,6

27,7 1,34 (3H, s) C-2, C-3
12 27,6

27,5 1,34 (3H, s) C-2, C-3
1 201,1

194,2/194.3*


2 32,6

134,8/134,3*

6,38 (1H, d, 17,0) C-1, C-4, C-8
3 - 144,8/144,6*

6,69 (1H, dd, 17,0, 6,5) C-1, C-4
4 - 18,1/18,1* 1,91 (3H, d, 6,5) C-2, C-3
5-OCH
3
55,8

55,8 3,77 ( 3H, s) C-5
7-OCH

3
56,1

55,5 3,84 ( 3H, s) C-7

#
d
C
của alloevodionol methyl ether [Phytochemistry, 1997, 45, 1049]; * phần nhánh của hợp chất vertinone
trong tài liệu [Phytochemistry, 1988, 27, 3683];
a)
150 MHz;
b)
600 MHz;
c)
Đo trong CDCl
3

Việc ghép chính xác độ dịch chuyển hóa học của C và H theo phổ HMQC (hình 4.7)
cho thấy hợp chất MA8D có những vị trí khá giống với hợp chất alloevodionol methyl ether
và 5,7-dihydroxy-2,2-dimethyl-8-vinyl-2H-1-benzopyran [Phytochemistry, 1997, 45, 1049].
Khi so sánh giá trị về độ dịch chuyển hóa học thì giá trị của MA8D giống với alloevodionol
methyl ether hơn so với giá trị của 5,7 - dihydroxy-2,2-dimethyl-8-vinyl-2H-1-benzopyran
(kết quả so sánh trên bảng 4.1). Nếu giả thuyết hợp chất MA8D có phần mạch nhánh ở vị trí
t ơng tự nh mạch nhánh hợp chất alloevodionol methyl ether thì rõ ràng giá trị phổ của hợp
chất MA8D cho thấy hợp chất này nhiều hơn hợp chất alloevodionol methyl ether hai
nguyên tử cacbon và giá trị sai khác giữa hai hợp chất này thể hiện ở phần mạch nhánh từ vị
trí C-1 đến C-4. Tiến hành phân tích các giá trị hằng số t ơng tác trên phổ
1
H-NMR, cũng

nh kết quả phổ hai chiều HOMOCOSY (hình 4.7).

Hình 4.7. Phổ hai chiều HOMOCOSY của MA8D

11
Kết quả phân tích cho thấy t ơng tác của H-3 và H-4; H-2, H-3 và H-4; H-6 không
có t ơng tác với proton nào chứng tỏ vị trí C-6 chỉ có một proton đơn. Mặt khác, khi so sánh
giá trị phổ của vị trí C-1 đến C-4 của MA8D với giá trị phổ của phần nhánh trong hợp chất
1-(2,4,6-trimethoxyphenyl)-2-buten-1-one (vertinone) [Phytochemistry, 1988, 27, 3683] thấy
hoàn toàn phù hợp. Kết hợp với thông tin trên phổ HMQC (hình 4.8) cho thấy sự tồn tại của
một nhánh propen C
3
H
5
, vòng 2H-chromene có các proton H-3 và H-4 nằm ở vị trí octo với
nhau, còn H-6 thuộc vào vòng thơm bị thế cả 5 vị trí. Để khẳng định chính xác các vị trí
nhóm thế, cũng nh toàn bộ các vị trí C trong phân tử, chúng tôi đã tiến hành phân tích các
giá trị trên phổ HMBC. Trên phổ HMBC (hình 4.10), các t ơng tác HMBC (hình 4.9) giữa
H-4 (d
H
1,91) với các C-3 (d
C
144,8), C-2 (d
C
134,8); cũng nh t ơng tác của proton H-3
(d
H
6,69) với C-4 (18,1), C-2 (134,8) và với C-1 (194,2) càng khẳng định thêm sự tồn tại
của một mạch nhánh propen nối trực tiếp với cacbon cacbonyl. Các vị trí C-5, C-6, C-7, C-8
và C-10 đ ợc xác định từ t ơng tác HMBC của H-6 (6,03) với C-10 (104,1), C-5 (156,3), C-

7 (158,1) và C-8 (111,7) cũng nh t ơng tác của H-4 (6,58) với C-10 (104,1), C-9 (151,9) và
C-5 (156,5).

Hình 4.8. Phổ hai chiều HMQC của MA8D
O
H
3
CO
H
3
CO
O
1
H-
1
H COSY
HMBC

Hình 4.9. Các t ơng tác trên phổ HOMOCOSY và HMBC của MA8D

12
Các t ơng tác HMBC (hình 4.9) giữa các proton của cả hai nhóm metyl bậc bốn (d
H

1,36) với C-2 (d
C
76,5) và C-3 (126,6) mà không có t ơng tác với C-9, cũng nh các giá trị
cộng h ởng dịch chuyển về tr ờng thấp của C-2 và C-9 chứng tỏ chúng đều đ ợc nối với
nguyên tử oxy. Vị trí của nhánh bên propenyl và hai nhóm metoxy dễ dàng đ ợc xác định
thông qua t ơng tác HMBC mạnh của H-2 (d

H
6,38) với C-8 (111,4), t ơng tác của các
proton metyl (3,86) với C-7 (158,1) và C-5 ( 156,3). Ngoài ra giá trị độ dịch chuyển hoá học
cụ thể của C-7 và C-5 còn đ ợc chứng tỏ bằng t ơng tác HMBC của H-4 với C-5 mà không
có t ơng tác với C-7.

Hình 4.10. Phổ hai chiều HMBC của MA8D
Từ kết quả phổ khối l ợng FAB MS, HR-TOF-MS, phổ 1D, 2D-NMR nêu trên hợp
chất MA8D đ ợc xác định là 1-(5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-8-yl)-but-2-en-
1-one (hình 4.11). Đây là một chất mới lần đầu tiên đ ợc phân lập từ thiên nhiên và đã đ ợc
nhóm nghiên cứu đặt tên là malloapelta B.
OH
3
CO
OCH
3
O
2
3
45
6
7
8
9
10
11
12
1'
2'
3'

4'

Hình 4.11. Cấu trúc hoá học của hợp chất MA8D (malloapelta B)
Kết quả thử nghiệm hoạt tính NF-kB của hợp chất 1-(5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-
chromen-8-yl)-but-2-en-1-one (MA8D) đ ợc trình bày trên bảng 4.2 và bảng 4.3.

13
Bảng 4.2. Hoạt tính ức chế quá trình hoạt hoá NF-kB
% c ch
Nng
parthenolide malloapelta B
30 104,92 102,82
10 100,94 102,91
3 66,83 94,97
1 29,93 62,41
0,3 9,32 29,04
Bảng 4.3. Giá trị IC
50
của malloapelta B (1-(5,7-dimetoxy-2,2-dimetyl-2H-cromen-8-yl)-
but-2-en-1-on) so với đối chứng
Ký hiệu mẫu
IC
50
(mg/ml)
SD
Parthenolide 6.66 0.06
MA8D 0.54 0,05
Ghi chú: SD=standard diviation
Kết quả trên bảng 4.2, 4.3 cho thấy hợp chất 1-(5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-
chromen-8-yl)-but-2-en-1-one ức chế rất mạnh quá trình hoạt hoá NF-kB với giá trị IC

50
=
0,54 0,05 mM, giá trị IC
50
này thấp hơn rất nhiều so với của chất đối chứng Parthenolide
(IC
50
= 6,660,06 mM). Nhiều tác giả đã cho rằng liên kết a, b không no trên cấu trúc phân
tử có nhiều ảnh đến sự hoạt hóa NF-kB [J.Nutritional Biochem., 16, 500-506, 2005]. Trong
khi đó trên cấu trúc hợp chất malloapelta B có hiệu ứng liên hợp của nối đôi của mạch nhánh
với nhóm cacbonyl giữ vai trò liên kết a, b không no trên cấu trúc phân tử. L u Văn Chính
và cộng sự (Arch. Pharm. Res., 29(10), 840-844, 2006) đã tiến hành các nghiên cứu về vài
trò của liên kết a, b không no trên cấu trúc của malloapelta B với sự ức chế sự hoạt hóa NF-
kB. Kết quả đánh giá b ớc đầu cho thấy vài trò của liên kết a, b không no trên cấu trúc
malloapelta B có ảnh h ởng đến sự hoạt hóa NF-kB.
4.2. Kết quả khảo sát động thái tích lũy hoạt chất malloapelta B trong lá loài Mallotus
apelta (Lour.) Muell.Arg theo mùa bằng HPLC-MS
Trong phần này các b ớc xây dựng đ ờng chuẩn và các b ớc phân tích mẫu đ ợc mô
tả chi tiết (hình 4.12 và hình 4.13)

Hình 4.12. Sắc ký đồ của mẫu
malloapelta B
y = 17246x - 85.844
R
2
= 0.9991
0.00
5000.00
10000.00
15000.00

20000.00
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentration
Hình 4.13. Đồ thị đ ờng chuẩn
malloapelta B

14
Đ ờng chuẩn xây dựng đ ợc với hàm tính toán y=17246x-85.844 (y là diện tích píc và
x là hàm l ợng malloapelta B) với giá trị R
2
=0.999 là hoàn tòan có thể áp dụng để định
l ợng hàm l ợng malloapelta B trong các mẫu thô Mallotus apelta thu thập theo các thời
điểm trong năm (bảng 4.3)
Kết quả khảo sát hàm l ợng của hợp chất malloapelta B trong 17 mẫu lá Mallotus
apelta thu thập theo các thời điểm trong năm, kết quả đ ợc ghi trong bảng 4.3
Bảng 4.3. Thời gian lấy mẫu và % hàm l ợng malloapelta B trong mẫu thô
% malloapelta B trong mẫu thô
Stt

Ký hiệu
Thời gian
lấy
Địa điểm

Lần
1
Lần 2

Lần
3

Trung
bình
Độ lệch
chuẩn
1 TD121206

12/12/2006

Tam đảo

0.192 0.191

0.196

0.1930

2.6.10
-3

2 TD210107

21/01/2007

Tam đảo

0.213 0.211

0.213

0.2123

1.1.10
-3

3 TD160207

16/02/2007

Tam đảo

0.173 0.179

0.175

0.1757

3.0.10
-3

4 TD120307

12/03/2007

Tam đảo

0.144 0.142

0.146

0.1440

2.0.10
-3

5 TD200407

20/4/2007 Tam đảo

0.147 0.143

0.149

0.1463

3.0.10
-3

6 TD220507

22/5/2007 Tam đảo

0.133 0.134

0.136

0.1343

1.5.10
-3

7 TD160607

16/6/2007 Tam đảo

0.137 0.132

0.136

0.1350

2.6.10
-3

8 TD180707

18/7/2007 Tam đảo

0.104 0.106

0.104

0.1047

1.1.10
-3

9 TD190807

19/8/2007 Tam đảo

0.097 0.092

0.094

0.0943

2.5.10
-3

10

TD200907

20/9/2007 Tam đảo

0.087 0.082

0.081

0.0833

3.2.10
-3

11

TD171007

17/10/2007

Tam đảo

0.108 0.102

0.101

0.1037

3.7.10
-3

12

TD211107

21/11/2007

Tam đảo

0.177 0.173

0.176

0.1753

2.0.10
-3

13

TD231207

23/12/2007

Tam đảo

0.198 0.191

0.198

0.1957

4.0.10
-3

14

TD270107

27/01/2008

Tam đảo

0.202 0.206

0.208

0.2053

3.0.10

-3

15

TD250208

25/02/2008

Tam đảo

0.178 0.171

0.175

0.1747

3.5.10
-3

16

TD140308

14/03/2008

Tam đảo

0.145 0.146

0.142

0.1443

2.0.10
-3

17

TD210408

21/04/2008

Tam đảo

0.141 0.143

0.149

0.1443

4.1.10
-3

Nh vậy, kết quả khảo sát sự biến đổi hàm l ợng của malloapelta B theo mùa vụ thu
hoạch cho thấy hàm l ợng malloapelta B có nhiều nhất vào những tháng đầu năm khi mùa
xuân tới (hình 4.14). Qua việc khảo sát trên các mẫu lá Mallotus apelta việc lấy mẫu để
phục vụ phân lập l ợng lớn nên tập trung vào đầu tháng 01 hàng năm.

15
0

0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
TD121206
TD210107
TD160207
TD120307
TD200407
TD220507
TD160607
TD180707
TD190807
TD200907
TD171007
TD211107
TD231207
TD270107
TD250208
TD140308
TD210408
Thời gian
% malloapeltaB

Hình 4.14. Đồ thị biểu diễn sự dao động hàm l ợng malloapelta B theo mùa
4.3. Quy trình phân lập l ợng lớn hợp chất malloapelta B qui mô 25kg lá khô/mẻ
Quy trình phân lập malloapelta B qui mô 25kg lá khô/mẻ đ ợc xây dựng từ việc nghiên
cứu ổn định thời điểm thu nguyên liệu, tối u các b ớc phân lập nhóm chất benzopyran có
chứa malloapelta B và tối u các b ớc để phân lập malloapelta B từ nhóm chất. Sơ đồ quy

trình phần lập malloapelta B qui mô 25kg lá khô/mẻ đ ợc trình bày trên hình 4.15.
















Hình 4.15. Quy trình phân lập malloapelta B qui mô 25kg/mẻ
áp dụng qui trình trên với qui mô 25 kg lá khô/mẻ (thời gian là 10 ngày tính từ thời
gian làm khô nguyên liệu và tạo dịch chiết) và đã thu đ ợc 50,5 g sản phẩm (hiệu suất đạt
trên 0,2 %).
MeOH (x 3 lần), 50
o
C, 6 giờ

Bột lá khô
Mallotus apelta

Dịch cô MeOH (A)

Chiết CHCl
3
: n ớc (1:1), cất loại dung môi
Thêm CHCl
3
để hoà
tan dịch cô (tỷ lệ 1/2)
Thêm Silicagen (tỷ lệ 1/3)
Sắc ký cột (100 mm, 500mm) dung
môi : Hexan, CHCl
3

Cất loại dung môi
Kết tinh trong etanol.
Dịch cô CHCl
3
(B)

Hỗn hợp (Silicagen/B)
Phân đoạn 100% CHCl
3

Dịch cô (D)
malloapelta B
(0.2%)


16
4.4. Xác định cấu trúc hóa học các dẫn xuất bán tổng hợp đ ợc từ malloapelta B
Phần này trình bày chi tiết cách xác định cấu trúc hóa học của các dẫn xuất bán tổng

hợp đ ợc từ hợp chất malloapelta B. D ới đây trình bày ví dụ minh họa các b ớc xác định
cấu trúc của hợp chất (MalloB7) là hợp chất bán tổng hợp từ hợp chất MA8D.
Phản ứng khử hoá malloapelta B bằng tác nhân NaBH
4
, trong đó NaBH
4
là tác nhân khử
chọn lọc cho C=O. Tuy vậy, trong tr ờng hợp này do các hiệu ứng cảm ứng và liên hợp nên
phản ứng lại xảy ra theo cơ chế cộng 1,4 (Đối với các xeton không no có các kiểu cộng 1,2;
3,4 và 1,4) mà không cộng 1,2. Theo nh cơ chế phản ứng (hình 3.3) thì các hydrua trong
NaBH
4
bị thay thế bởi cơ chất malloapelta B, phức hidrua kim loại này dễ dàng bị thủy phân
thành muối natri của axít boric và giải phóng ra các enol, các enol này không bền sẽ chuyển
vị thành dạng xeton bền vững hơn. Sản phẩm phản ứng tạo thành cho sản phẩm là hợp chất
MalloB7 kết tinh d ới dạng tinh thể hình kim có màu trắng. Kết quả xác định cấu trúc của
hợp chất MalloB7 bằng các ph ơng pháp vật lý sau sẽ làm sáng tỏ cơ chế phẩn ứng nêu trên.
Trên phổ
1
H-NMR (hình 4.16) xuất hiện tín hiệu của hai nhóm metyl metoxi điển hình d
H

3,83 (3H, s) và d
H
3,70 (3H,s), tín hiệu của hai nhóm metyl ở tr ờng cao chập nhau ở d
H

1,39 (6H, s). Bên cạnh đó, ở vùng tr ờng yếu còn có tín hiệu triplet của một nhóm metyl ở
d
H

0,95 (3H, t, 6,5). Ngoài ra còn xuất hiện các tín hiệu của 3 proton, trong đó một tín hiệu
đơn d
H
6,02 (1H, s), hai tín hiệu doublet của hai proton nằm ở vị trí octo với nhau d
H
5,44
(1H, d, J = 10.5 Hz) và 6,56 (1H, d, J = 10,5 Hz), tín hiệu multi tại 2,72 (2H, m) của proton
có t ơng tác mạnh với proton cộng h ởng ở d
H
1,70 (2H, m).

Hình 4.16. Phổ
1
H-NMR của MalloB7
Phổ
13
C-NMR (hình 4.17) xuất hiện 17 tín hiệu cacbon, bao gồm 7 C bậc bốn, 3 CH,
2CH
2
, 3 nhóm metyl và hai nhóm metoxi. Trên phổ khẳng định sự tồn tại của hai nhóm
metoxi (d
C
55,6 và 55,9), hai nhóm metyl bậc bốn (d
C
27,7), một nhóm metyl (d
C
18,1), một
nhóm cacbonyl (d
C
204,2), C bậc 4 nối trực tiếp với nguyên tử ôxy rất điển hình (d

C
76,7).
Việc so sánh độ dịch chuyển hóa học của C và H của MalloB7 với độ dịch chuyển hóa học

17
của hợp chất MA8D có những vị trí khá t ơng đ ơng. Nếu giả thuyết về cơ chế phản ứng
nêu trên là đúng thì hợp chất MalloB7 sẽ có phần khung giống nh MA8D, phần khác nhau
sẽ là phần mạch nhánh.

Hình 4.17. Phổ
13
C-NMR của MalloB7
Trên số liệu so sánh (bảng 4.4) thì rõ ràng giá trị phổ trên mạch nhánh của hai hợp
chất này sai khác thể hiện ở phần mạch nhánh từ vị trí C-1 đến C-4. Kết quả trên cho thấy
nối đôi trên mạch nhánh của MA8D đã đ ợc khử hoá bằng sự mất đi của các tín hiệu của nối
đôi và thay vào đó là tín hiệu của mạch cacbon no. Mặt khác, căn cứ vào cơ chế phản ứng thì
sản phẩm tạo thành là hợp chất MalloB7 sẽ có công thức phân tử là C
17
H
22
O
4
(M=290). Kết
quả phân tích phổ ESI-MS cho thấy sự xuất hiện của tín hiệu m/z: 291 [M+H]
+
(hình 4.18).
.
Hình 4.18. Phổ khối l ợng ESI-MS của hợp chất MalloB7
Ngoài ra khi tham khảo giá trị phổ của vị trí C-1 đến C-4 của malloB7 với giá trị
phổ của phần nhánh của hợp chất aspidinol B [Phytochemistry, 1998, 48, 931-939] thấy

hoàn toàn t ơng đ ơng (bảng 4.4).
Bảng 4.4. Kết quả so sánh dữ kiện phổ NMR của MalloB7 với malloapelta B và tài liệu
MalloB7
C

#
d
C

d
C
a,c
d
H
b,c

(J, Hz)
2 76,5 76,7 -
3 127,1 126,6 5,44 (1H, d, 10,5)
4 116,7 116,4 6,56 (1H, d, 10,5)
5 156,5 156,5 -
6 88,0 87,8 6,02 (1H, s)

18
7 158,1 156,5 -
8 111,7 113,6 -
9 151,9 151,5 -
10 104,2 104,1 -
2-Me
2

27,7 27,7 1,39 (6H, s)
1 194,2 204,2 /204,6* -
2 134,8 46,9/46,3 * 2,72 (m)
3 144,8 17,6/ 18,5* 1,70 (2H, m)
4 18,1 13,9/14,1* 0,95 (t, 6,5)
5-OCH
3
55,9 55,8 3,83 (3H, s)
7-OCH
3
55,6 55,7 3,70 (3H, s)
#
d
C
của malloapelta B; * phần nhánh của aspidinol B [Phytochemistry, 1998, 48, 931-939].
a)
150 MHz;
b)
500 MHz;
c)
Đo trong CDCl
3

O
CH
3
CH
3
OCH
3

H
3
CO
O
C
H
3

Hình 4.19. Cấu trúc hoá học của hợp chất MalloB7
Kết hợp các dữ kiện cho phép xác định hợp chất MalloB7 là 1-(5,7-dimethoxy-2,2-
dimethyl-2H-chromen-8-yl)-butan-1-one (hình 4.19). Đây là một chất mới lần đầu tiên đ ợc
bán tổng hợp từ nguyên liệu đầu là malloapelta B, đ ợc chúng tôi gọi tên là malloapelta B7.
Hợp chất tạo thành cũng hoàn toàn phù hợp với cơ chế về sản phẩm tạo thành của phản ứng
trong cơ chế phản ứng trên hình 3.3.
Các hợp chất khác đ ợc xác định cấu trúc t ơng tự nh trên, bảng tổng hợp cấu trúc các
hợp chất phân lập và bán tổng hợp đ ợc trong khuôn khổ luận án trình bày d ới đây:
O
H
3
CO
OCH
3
O
2
3
45
6
7
8
9

10
11
12
1'
2
'
3'
4'

MA8D (malloapelta B)
1-(5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-
8-yl)-but-2-en-1-one
O
CH
3
CH
3
OCH
3
H
3
CO
O
H
3
C
2
3
45
6

7
8
9
10
1'
2' 3'
4
'
OCH
3

MalloB2 (Chất mới)
8-[1-oxo-3(R)-methoxy-butyl]-5,7-
dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran

19
O
CH
3
CH
3
OCH
3
H
3
CO
O
H
3
C

2
3
45
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
OCH
2
CH
3
5'
6'

MA20A (ChÊt míi)
8-[1’-oxo-3’(R)-ethoxy-butyl]-5,7-dimethoxy-
2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
O
CH
3
CH
3
OCH
3
H

3
CO
O
H
3
C
2
3
45
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
OCH
2
CH
2
CH
3
5'
6' 7'

MA20C (ChÊt míi)
8-[1’-oxo-3’(R)-propoxy-butyl]-5,7-
dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran.

O
CH
3
CH
3
OCH
3
H
3
CO
O
H
3
C
2
3
45
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
O-CH
5'
C
H

3
CH
3

MA20D(ChÊt míi)
8-[1’-oxo-3’(R)-isopropoxy-butyl]-5,7-
dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
O
CH
3
CH
3
OCH
3
H
3
CO
O
CH
3
2
3
45
6
7
8
9
10
1'
2'

3'
4'
NO2

MA20B (ChÊt míi)
8-(1’-oxobut-2’-en-1’-yl)-5,7-dimethoxy-3-
nitro-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
O
CH
3
CH
3
OCH
3
H
3
CO
O
C
H
3

MalloaB7 (ChÊt míi)
1-(5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-
8-yl)-butan-1-one
O
CH
3
CH
3

OCH
3
H
3
CO
O
H
3
C
2
3
45
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
7'
CH
3
CH
3
O
O
4'
5'
6'

8'
9'

MA20TB (ChÊt míi)
8-(1’,5’-dioxo-3’(R)-methyl-4’-acetylhexyl)-
5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran

O
CH
3
CH
3
OCH
3
H
3
CO
O
H
3
C
2
3
45
6
7
8
9
10
1'

2'
3'
7'
OCH
3
CH
3
O
O
4'
5'
6'
8'
9'

MA20A5B (ChÊt míi)
8-(1’,5’-dioxo-3’(R/S)-methyl-4’-
methoxycarbonylhexyl)-5,7-dimethoxy-2,2-
dimethyl-2H-1-benzopyran
O
CH
3
CH
3
OCH
3
H
3
CO
O

H
3
C OCH
2
CH
3
CH
3
O
O
2
3
45
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
7'
4'
5'
6'
8'
9'
10'

MA20A5A (ChÊt míi)

8-(1’,5’-dioxo-3’(R/S)-methyl-4’-
ethoxycarbonylhexyl)-5,7-dimethoxy-2,2-
dimethyl-2H-1-benzopyran

20
O
CH
3
CH
3
H
3
CO
OCH
3
O
NH
3
C
N
2
3
45
6
7
8
9
10
1'
2'

3'
4'
5'
6'
7'
11
12

MalloB11 (Chất mới)
8-(1-oxo-3(R)-(imidazole-1-yl)butyl)-5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
4.4. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung th các hợp chất
4.4.1. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung th in vitro của malloapelta B và các dẫn xuất
Trong luận án này, chúng tôi đã thực hiện các nghiên cứu trên hợp chất malloapelta B,
với tác động vào liên kết a, b không no trên cấu trúc phân tử của malloapelta B để khảo sát
ảnh h ởng của sự thay đổi vị trí này đến hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất. Kết quả đánh
giá hoạt tính đ ợc trình bày trên bảng 4.5.
Bảng 4.5. Phần trăm tế bào còn sống sót và giá trị IC
50
của các mẫu trong thử nghiệm
Phần trăm tế bào sống sót (%)

Giá trị IC
50
(mg/ml)
STT
Ký hiệu
mẫu
Hep-G2 RD Hep-G2 RD
i DMSO
100,00,0 100,00,0

- -
ii Elipticine
1,650,07 1,050,09
0,004 0,002
1 MA8D
1,030,4 0,00,06
0,49 0,54
2 MalloB2
6,370,3 3,450,4
1,23 0,75
3 MA20A
25,90,4 22,331,1
2,81 1,78
4 MA20C
31,160,9 24,860,6
3,01 2,34
5 MA20D
35,801,5 28,751,2
4,22 3,75
6 MA20B
2,300,0 3,450,1
0,87 0,62
7 MalloB7 3,030,3 9,71,4 1,65 1,88
8 MA20TB
0,30,02 1,240,07
1,8 1,64
9 MA20A5A
31,41,5 81,71,2
4,22
>5

10 MA20A5B
93,050,8 94,22,2 >5 >5
11 MalloB11
73,050,8 84,22,2 >5 >5
Ghi chú: Hep-G2 (Human epidemoid carcinoma - ung th gan ng ời); RD (Rhabdosarcoma-Ung
th màng tim ng ời)

21
Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hợp chất malloapelta B có hoạt
tính kháng hai dòng tế bào ung th ng ời là Hep-G2 (IC
50
=0.49 mg/ml), RD (IC
50
= 0.54
mg/ml). Về mặt cấu trúc thì hợp chất malloapelta B khác so với các hợp chất công bố trong
[Arch.Pharm. Res., 28(10), 1131-1134] ở vị trí C-8, về mặt hoạt tính thì hợp chất
malloapelta B thể hiện hoạt tính tốt hơn các hợp chất công bố trong [Arch.Pharm. Res.,
28(10), 1131-1134]. Các hợp chất MalloB2, MA20A, MA20C, MA20D, MA20B, MalloB7
và MA20TB đều thể hiện hoạt tính độc tế bào với hai dòng tế bào ung th gan ng ời và ung
th màng tim ng ời (bảng 4.5). Tuy nhiên các sản phẩm của các quá trình tổng hợp nêu trên
đều cho hoạt tính thấp hơn so với chất đầu. Khi chú ý đến kết quả hoạt tính độc tế bào của
hợp chất 8-(1-oxobut-2-en-1-yl)-5,7-dimethoxy-3- nitro -2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
(MA20B) với các giá trị t ơng ứng là Hep-G2(IC
50
= 0,87 mg/ml) và RD (IC
50
=0,62 mg/ml),
trong đó nối đôi liên hợp với nhóm cacbonyl vẫn đ ợc giữ nguyên thì hoạt tính của nó gần
nh malloapelta B.
So sánh hoạt tính độc tế bào của các hợp chất mà sự liên hợp của nối đôi với nhóm

cabonyl không còn thì thấy hoạt tính bị giảm dần khi nhóm thế đính vào vị trí C-3 có kích
th ớc càng lớn. Điều này có thể thấy rõ hơn đối với dãy các hợp chất có số thứ tự từ 2-5
(bảng 4.5). Hợp chất MA20A5A chỉ có hoạt tính kháng một dòng tế bào ung th gan Hep-
G2 (IC
50
= 4,22 mg/ml), hợp chất MA20A5B không thể hiện hoạt tính với cả hai dòng tế bào
ung th thử nghiệm. Nh vậy có thể hiệu ứng liên hợp của nối đôi của mạch nhánh với nhóm
cacbonyl giữ vai trò quyết định đến hoạt tính của dãy các hợp chất benzopyran nêu trên.
4.4.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung th in vivo của chế phẩm malloapelta B
ã Kết quả nghiên cứu nghiên cứu độc tính cấp, bán tr ờng diễn của chế phẩm
malloapelta B nh sau:
Bảng 4.6. Độc tính cấp của chế phẩm malloapelta B theo đ ờng tiêm
k x
i
(mg/kg)

m
i
n - m
i
m
i
n - m
i

m
i
(n-m
i
) z

i
m
i
.z
i

1 10 0 10 0/10 - -
2 20 1 9 1/9 9 11 11
3 30 3 7 3/7 21 9 27
4 40 4 6 4/6 24 7 28
5 50 6 4 6/4 24 5 30
6 60 8 2 8/2 16 1 16
7 70 - 0 -
S=7

S=22


S=94

S=112

22
Kết quả áp dụng ph ơng pháp xử lý số liệu tại mục 2.2.6 cho thấy giá trị LD
50
=
43,00 6,58 mg/kg trọng l ợng cơ thể của chuột nhắt trắng theo đ ờng tiêm (36,42 từ
49,58).
Với mức liều nghiên cứu là 25 mg/kg dùng cho chuột uống tr ờng diễn và tiến hành
so sánh các tỷ số giữa trọng l ợng của các tạng quan trọng nhất trong quá trình chuyển hóa

và thải thuốc là gan, lách và thận. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa nhóm chứng
và nhóm thuốc nghiên cứu. Khi tiến hành so sánh số l ợng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và
định l ợng hemoglobin trên chuột nhắt trắng khi đ ợc tiêm dài ngày chế phẩm MB. Kết quả
thu đ ợc cho thấy với mức liều đã sử dụng, MB không làm ảnh h ởng đến số l ợng tế bào
máu ngoại vi, ch a ảnh h ởng đến chức năng tạo máu của động vật thí nghiệm. Xét nghiệm
các giá trị của hoạt độ enzym SGOT và SGPT nhằm đánh giá tác động của MB mức liều 25
mg/kg trọng l ợng cơ thể đ ợc sử dụng đã cho thấy hoạt độ này ở hai nhóm chứng và thử,
giá trị tr ớc và sau khi dùng MB rất ít biến đổi. Điều đó chứng tỏ: với mức liều đã sử dụng,
MB ch a gây ảnh h ởng gì bất lợi cho chức năng gan. Hoàn toàn t ơng tự, chức năng của
thận đ ợc đánh giá qua chỉ tiêu định l ợng creatinin cũng cho thấy MB không gây độc cho
thận. Kết hợp với các nghiên cứu về ảnh h ởng của MB đến các thông số mô bệnh học khi
dùng tr ờng diễn có thể thấy chế phẩm đ ợc coi là an toàn trên động vật thực nghiệm.
ã Kết quả nghiên cứu hiệu lực chế phẩm
Dòng tế bào ung th sarcoma 180 là dòng tế bào chuẩn đã đ ợc rất nhiều viện nghiên
cứu ung th trên thế giới sử dụng. Lý do: tế bào này có thể sống trong dịch ổ bụng và mô
liên kết. Khi tiến hành thử nghiệm chế phẩm MB trên mô hình u báng (ascitic tumor) và mô
hình u cơ đùi (solid tumor) với dòng tế bào này dùng theo đ ờng tiêm vào phúc mạc và vào
cơ đùi chuột nhắt trắng nói trên để nghiên cứu ung th thực nghiệm và nghiên cứu tác dụng
kéo dài thời gian sống thêm của chuột nhắt trắng. Kết quả nghiên cứu cho thấy:
+ MB có tác dụng ức chế tế bào ung th thực nghiệm
Bảng 4.7. Kết quả tác dụng của MB với các mức liều đã sử dụng để nghiên cứu đến sinh
khối, tỷ số phát triển, tỷ số ức chế u báng sarcoma 180 ở chuột nhắt trắng
Số thứ
tự
Lô thí nghiệm
Số l ợng chuột
thí nghiệm
Sinh khối
(ml)
Phát triển

(%)
ức chế
(%)
1 Đối chứng 11
5,44 1,08
100,0 00,0
2 MB
1
(1/20 LD
50
) 10
4,54 1,23
83,5 16,5
3 MB
2
(1/15 LD
50
) 9
4,19 1,28
77,0 23,0