PHÂN LẬP VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, KHỬ NITƠ, PHOTPHO VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
-----------------BÙI THẾ VINH

PHÂN LẬP VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, KHỬ
NITƠ, PHOTPHO VÀ ỨNG DỤNG TRONG
XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 62 - 42 - 40 - 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Năm 2012


2
Công trình được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP
PGS. TS. HÀ THANH TOÀN

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, ĐHCT.

28

1
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Bùi Thế Vinh, Phan Thanh Quốc, Cao Ngọc Điệp. 2010. Phân lập và
nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trong chất thải sữa và
ứng dụng trong xử lý nước thải. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A),
pp. 805 – 809.
2. Cao Ngọc Điệp, Khổng Thị Thu Vân, Bùi Thế Vinh. 2010. Phân lập và
nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P trong nước rỉ rác. Tạp chí Công
nghệ Sinh học, 8(3A), pp. 915-922.
3. Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập, nhận
diện vi khuẩn tích lũy polyphosphate từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất
thải sữa và ứng dụng trong xử lý nước thải. Tạp chí Khoa học, Trường
Đại học Cần Thơ, 18a, pp. 185-193.
4. Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập và
nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất
thải sữa và ứng dụng trong xử lý nước thải. Tạp chí Khoa học, Trường
Đại học Cần Thơ, 18a, pp. 194-200.
5. Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn, Cao Ngọc Điệp. 2011. Biological
treatment of dairy processing wastewater. The second Conference on
Food Science & Technology, Can Tho University, Viet Nam.

Đề tài cấp Trường

Thời gian

Ngày

Kết

thực hiện

nghiệm thu

quả

Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sản xuất
chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ,
photpho và ứng dụng trong xử lý nước
thải nhà máy sữa

01/04/2010 –
31/12/2010

30/12/2010

Tốt

Ngành sữa có vai trò rất quan trọng không chỉ đối với nền kinh tế mà
còn đối với đời sống của người dân bởi nó liên quan trực tiếp đến sức khỏe
và trí tuệ của thế hệ tương lai của đất nước. Theo Quyết định của Thủ
Tướng Chính Phủ số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008 về việc phê duyệt
Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 thì đến năm 2015 đạt 700 tấn

sữa và đến năm 2020 đạt trên 1.000 tấn sữa; và theo Quyết định của Bộ
Công Thương số 3399/QĐ-BCT ngày 28/06/2010 về việc Phê duyệt Quy
hoạch phát triển Ngành công nghiệp chế biến sữa Việt Nam đến năm 2020,
tầm nhìn đến năm 2025 thì cả nước sẽ sản xuất ra sản lượng sữa (quy ra sữa
tươi) 2,6 tỷ lít vào năm 2020 và 3,4 tỷ lít vào năm 2025. Ngành công nghiệp
sữa phát triển sẽ có nhiều nhà máy sữa được thành lập, sản xuất ra số lượng
lớn sản phẩm để đáp ứng nhu cầu cho xã hội, đồng thời cũng tạo ra một
lượng lớn chất thải và nước thải.
Trong các thành phần của nước thải nhà máy sữa, các thành phần chứa
nitơ, photpho được chú ý nhiều nhất bởi vì chúng ảnh hưởng đến quá trình
phát triển tảo ở các ao hồ. Tảo ở các ao hồ phát triển quá mức sẽ làm giảm
chất lượng nước, ảnh hưởng đến đời sống động vật, thực vật nước. Phương
pháp thực tiễn duy nhất và hiệu quả nhất để kiểm soát qúa trình phú dưỡng
hóa là tập trung kiểm soát hàm lượng nitơ và photpho trong nước. Do vậy,
cần phải loại bỏ nitơ, photpho đến mức tối thiểu trước khi đưa ra môi
trường.
Trong thực tế hiện nay, người ta sử dụng các phương pháp hóa lý và
sinh học để xử lý nước thải nhà máy sữa. Tuy nhiên, do sử dụng hóa chất có
khả năng gây ung thư như aluminum sunphat, polyacrylamid,…gây ra ô
nhiễm thứ cấp trong áp dụng thực tế; chi phí các thuốc thử cao và quá trình
loại bỏ COD hòa tan kém trong các quá trình xử lý hóa lý nên các quá trình
xử lý sinh học thường được ưu tiên.


2

27

Chính vì các lý do trên, đề tài luận án: “Phân lập vi khuẩn kết tụ sinh

với dòng LV1 có sục khí 6 giờ/ngày, trong thời gian 4 ngày. Nước thải sau

học, khử nitơ, photpho và ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy
sữa” được thực hiện nhằm tìm ra các dòng vi khuẩn bản địa có ích trong tự

xử lý đạt loại B (QCVN 24: 2009/BTNMT) ở quy mô khảo sát và 80 lít/mẻ.

nhiên, đặc biệt là các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn có
khả năng chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho (tích lũy polyphotphat [poyP]) trong chất thải từ trại nuôi bò sữa, nhà máy sữa và trạm thu mua sữa, để
ứng dụng vào trong xử lý nước thải nhà máy sữa, góp phần giải quyết vấn
đề ô nhiễm môi trường nước thực sự rất cần thiết trong tình hình hiện nay.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài được thực hiện nhằm mục đích tìm ra các dòng vi khuẩn bản địa
gồm vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi
khuẩn chuyển hóa photpho hiệu quả nhất từ chất thải lỏng và rắn của trại
chăn nuôi bò sữa ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, nhà máy sữa
Vinamilk Cần Thơ và trạm thu mua sữa ở thành phố Hồ Chí Minh để ứng
dụng vào trong xử lý nước thải sữa ở quy mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở
khoa học cho việc đề xuất một quy trình xử lý nước thải nhà máy sữa.
1.3 Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn
chuyển hóa nitơ, photpho từ các chất thải lỏng và rắn của trại chăn nuôi bò
sữa, trạm thu mua sữa bò tươi và nhà máy sữa.
2. Kiểm tra khả năng tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa
photpho của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa
nitơ, chuyển hóa photpho từ các dòng vi khuẩn phân lập được, từ đó chọn ra
một số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, một số dòng vi khuẩn
chuyển hóa nitơ và một số dòng vi khuẩn chuyển hóa photpho.
3. Định danh các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển
hóa nitơ, chuyển hóa photpho đã chọn bằng phương pháp sinh học phân tử.

4. Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhà máy sữa của các dòng vi
khuẩn tổng hợp kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho đã

5.2 Đề nghị
Tiếp tục thử nghiệm trên thể tích nước thải nhà máy sữa tổng hợp lớn
hơn.


26
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Từ 19 mẫu chất thải lỏng và rắn, phân lập được tổng số 36 dòng vi
khuẩn để tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và
tổng số 47 dòng vi khuẩn từ môi trường tối thiểu để tuyển chọn các vi
khuẩn chuyển hóa nitơ và phopho.
Qua quá trình tuyển chọn, chọn được hai dòng vi khuẩn (P11 và P14) có
khả năng tạo kết tụ sinh học với hiệu quả cao; hai dòng vi khuẩn chuyển
hóa nitơ (LV1 và TR3) có khả năng oxy hóa ammonnium và khử nitrat tốt ở
nồng độ 700 mM; hai dòng vi khuẩn (LV1 và LV8b) có khả năng tích lũy
photpho.
Kết quả định danh 05 dòng vi khuẩn cho thấy:
+ dòng P14 và dòng P11 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Enterobacter
aerogenes dòng CTSP30 16S rDNA (EU855208.1) là 99%.
+ dòng vi khuẩn LV1 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Arthrobacter
mysorens 16S rRNA dòng LMG 16219T (AJ639831.1), Arthrobacter
mysorens dòng DSM 12798 16S rRNA (NR 025613.1) là 99%.
+ dòng TR3 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Acinetobacter
calcoaceticus dòng PVAS6 16S rRNA (GU130530.1), Acinetobacter
calcoaceticus 16S rRNA, dòng MTCC:9488 (FM210755.1) là 99%.
+ dòng LV8b có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium

dòng NY-3 16S rRNA (EU918562.1), Bacillus megaterium dòng EI-6 16S
rRNA (FJ613535.1) là 99%.
Qua đánh giá khả năng tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho của
05 dòng vi khuẩn đã qua tuyển chọn và định danh trong nước thải nhà máy
sữa, hai dòng vi khuẩn P11 và LV1 được chọn để xử lý nước thải nhà máy
sữa nhân tạo. Qui trình xử lý (bên dưới) gồm các bước xử lý kết tụ sinh học
nước thải với dòng P11, sau đó xử lý nitơ, photpho còn lại trong nước thải

3
qua tuyển chọn và định danh. Từ đó, chọn ra trong mỗi loại vi khuẩn 01
dòng vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ, chuyển hóa nitơ và chuyển hóa
photpho ưu việt nhất.
5. Ứng dụng kết hợp các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi
khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn chuyển hóa photpho để xử lý nước thải
nhà máy sữa ở quy mô phòng thí nghiệm.
1.4 Những đóng góp của luận án này
- Cung cấp thông tin về một số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho bản địa có khả năng kết tụ các
chất rắn lơ lửng, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho trong nước thải nhà
máy sữa.
- Đã tuyển chọn được 02 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ sinh học cao
là P11 và P14 (Đồng hình với Enterobacter aerogenes dòng CTSP30); 03
dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ, photpho là LV1 (chuyển hóa
nitơ và photpho, đồng hình với Arthrobacter mysorens dòng LMG
16219T), TR3 (chuyển hóa nitơ, đồng hình với Acinetobacter calcoaceticus
dòng PVAS6), LV8b (chuyển hóa photpho, đồng hình với Bacillus
megaterium dòng NY-3). Trong đó, dòng P11 và LV1 có khả năng kết hợp
để xử lý nước thải nhà máy sữa.
- Xây dựng một quy trình xử lý nước thải nhà máy sữa mới bằng con
đường sinh học, trong đó có sử dụng kết hợp 01 dòng vi khuẩn tổng hợp

chất kết tụ sinh học (để loại bỏ một phần dưỡng chất trong nước thải ở công
đoạn tiền xử lý thay cho hóa chất có khả năng gây ô nhiễm thứ cấp) với 01
dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho (xử lý hiếu khí lượng nitơ,
photpho còn sót lại trong nước thải với thời gian sục khí 6 giờ/ngày – thời
gian sục khí ngắn so với các quy trình xử lý đang áp dụng tại Việt Nam 18 20 giờ/ngày).


4
- Đóng góp tư liệu cho giảng dạy và nghiên cứu vi sinh vật trong xử lý
nước thải bằng con đường sinh học.

25
sục khí 6 giờ/ngày có tỷ lệ loại bỏ các thành phần như N_tổng số, N_NH4+,
PO43- tăng, P_tổng số cao nhất.

1.5 Cấu trúc của luận án này
Luận án gồm các chương mở đầu, tổng quan tài liệu, phương tiện và
phương pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và đề nghị; các
công trình của tác giả có nội dung liên quan đến luận án; danh mục tài liệu

Trước xử lý

tham khảo và phần phụ chương. Toàn bộ nội dung của luận án được trình
bày trong 101 trang, 19 hình, 39 bảng và 95 tài liệu tham khảo. Phần lớn

(C)

(B)

(A)

(D)

Hình 4.2 Độ đục của mẫu nước thải trước và sau xử lý

nội dung của luận án đã được công bố trong các bài báo khoa học.

Hình (A) : Trước xử lý
Hình (B): Sục khí 2 giờ/ngày, xử lý 4 ngày
Hình (C): Sục khí 4 giờ/ngày, xử lý 4 ngày
Hình (D): Sục khí 6 giờ/ngày, xử lý 4 ngày

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trong chương này chúng tôi trình bày các kiến thức nền tảng về vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn khử nitơ, vi khuẩn khử
photpho cũng như quá trình trình tạo kết tụ sinh học, khử nitơ, photpho
trong nước thải. Bên cạnh đó, chúng tôi đã điểm qua một số công trình
nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về ứng dụng một số hệ thống thiết
bị phản ứng sinh học trong xử lý nước thải nhà máy sữa.

Qua kết quả trên, chọn qui trình xử lý có sục khí 6 giờ/ngày để thực hiện
xử lý nước thải với thể tích 80 lít. Kết quả sau 4 ngày xử lý (Bảng 4.4) cho
thấy tỷ lệ loại bỏ COD, TSS, N_tổng số, NH4+, PO43-, P_tổng số lần lượt là
79,67%; 55,82%; 58,13%; 76,00%; 83,07%; 82,55%. Nước thải sau xử lý
đạt loại B.
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và

CHƯƠNG 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nguyên liệu
Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn: 19 mẫu chất thải rắn và lỏng (vi khuẩn

tổng hợp chất kết tụ sinh học – 6 mẫu; vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho 13 mẫu chất thải) thu nhận từ trại chăn nuôi bò sữa tại các tỉnh, thành ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long, trạm thu mua sữa bò tươi tại TP. Hồ Chí Minh
và nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.21. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH4+, PO4 3- và P_tổng số của nước thải nhà
máy sữa tổng hợp [80 lít] sau 4 ngày xử lý, thời gian sục khí 6 giờ/ngày
Thời

gian

(giờ/ngày)
Trước xử lý

sục

khí

Chỉ tiêu
COD

TSS

N_tổng

NH4+

PO43-

P_tổng

(mgO2/l)

(mg/l)

số (mg/l)

(mg/l)

(mg/l)

số (mg/l)
6,82

482,00

36,72

43,49

25,00

13,47

Sau xử lý

98,00

16,23

18,21

6,00

2,28

1,19

Tỷ lệ giảm (%)

79,67

55,82

58,13

76,00

83,07

82,55


24

5
- Địa điểm thí nghiệm: tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật và Sinh học
Phân tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại
Học Cần Thơ.

- Thời gian thực hiện đề tài: 01/03/2009 đến 30/06/2011.

Đối chứng

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ
Đĩa petri, tủ cấy vi sinh vật, máy chạy PCR,..

Sau xử lý

Hình 4.1 Hình ảnh nước thải sau xử lý 2 ngày, sục khí 2 giờ/ngày

Khi kéo dài thời gian xử lý từ 2 ngày lên 4 ngày (so sánh kết quả trên
Bảng 4.2 và Bảng 4.3), tỷ lệ loại bỏ COD, TSS, N_tổng số và P_tổng số
tăng lên (COD từ 73,71% tăng lên 83,54%; TSS từ 52,19% tăng lên
90,16%; N_tổng số từ 42,51% tăng lên 51,57%; P_tổng số từ 31,91% tăng
lên 82,40%). Nước thải đầu ra đều đạt loại B ở tất cả các nghiệm thức có
sục khí 2 giờ/ngày, 4 giờ/ngày và 6 giờ/ngày. Sau khi tăng thời gian xử lý
lên 4 ngày, nước thải đầu ra trong hơn (không màu) (Hình 4.1 và Hình 4.2).
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và
photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH4 +, PO43- và P_tổng số của nước thải nhà
máy sữa tổng hợp sau 4 ngày xử lý, thời gian sục khí 2, 4, 6 giờ/ngày
Thời

gian

sục

khí

(giờ/ngày)

Trước xử lý
2

Sau xử lý
Tỷ lệ giảm (%)
Trước xử lý

4

3.2.4 Phân lập vi khuẩn
Tiến hành phân lập các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trên
môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharid
và môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein; phân
lập các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho trên môi trường tối thiểu.
Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sau khi phân lập được
nuôi trong 50 ml môi trường lỏng (môi trường cho vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học polysaccharid hay protein ứng với từng dòng vi khuẩn). Vi
khuẩn tạo ra chất kết tụ sinh học được trữ lạnh và sử dụng trực tiếp cho các

COD

TSS

N_tổng

N_NH4+

PO43-

P_tổng

(mgO2 /l)

(mg/l)

số (mg/l)

(mg/l)

(mg/l)

số (mg/l)

thí nghiệm sau không qua quá trình ly tâm loại bỏ tế bào vi khuẩn.

6,76

3.2.5 Tuyển chọn vi khuẩn
3.2.5.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học: Đánh giá khả năng kết tụ
sinh học với dung dịch Kaolin thông qua tỷ lệ kết tụ.

480,00
79,00 a

36,56
4,50

43,40
c

21,02 a

22,01

11,23

4,96 a

8,34 a

1,19 a

83,54

90,16

51,57

77,46

25,73

82,40

480,00

36,56

43,40

22,01

11,23

6,76

Sau xử lý

70,00 a

Tỷ lệ giảm (%)

85,42

81,81

51,57

81,24

480,00

Trước xử lý
6

Chỉ tiêu

3.2.3 Hóa chất
Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn, chạy PCR,..

6,50 b

21,02 a

4,13 a

36,56

43,40

22,01

Sau xử lý

77,00 a

7,50 a

19,61 b

3,86

Tỷ lệ giảm (%)

83,96

79,49

54,82

82,46

6,82 b
39,27
11,23

b

6,31
43,81

Lấy 90 ml dung dich Kaolin (5 g/l, Kaolin có độ mịn tốt < 4 µm), bổ
sung 10 ml dung dịch 1% CaCl2 trong bình tam giác 250 ml, chỉnh pH 7,0;

1,21 a
81,10
6,76

c

0,84

b

87,57

sau đó thêm 0,1 ml (0,1%) dung dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học, mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn sản

Và trong cùng thời gian xử lý 4 ngày, khi tăng số giờ sục khí trong ngày

xuất chất kết tụ sinh học. Khuấy hỗn hợp trên trong 30 giây ở 60 vòng/ phút
bằng máy lắc. Sau đó, để yên hỗn hợp trong 5 phút, lấy phần trong cách mặt

từ 2 giờ/ngày lên 4 giờ/ngày, 6 giờ/ngày, tỷ lệ loại bỏ N_tổng số, N_NH4+,
PO43- tăng, P_tổng số tăng cùng với thời gian sục khí, trong đó nghiệm thức

nước 2 ÷ 3 cm đo OD ở độ dài sóng 550 nm. Xác định tỷ lệ kết tụ theo công
thức: Tỷ lệ kết tụ (%) = ((OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng) x 100

Các trung bình trong cùng một cột có cùng chữ theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức α = 0,01.


6
Chọn các dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ cao nhất để thực hiện thí nghiệm
tiếp theo.
3.2.5.2 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Đem các dòng vi khuẩn phân lập được từ môi trường tối thiểu (trong các
ống trữ giống) cấy ria trên môi trường tối thiểu có bổ sung lần lượt

23
xuống đáy) đem xử lý nitơ, photpho còn lại trong nước thải với dòng vi
khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho (LV1) trong thời gian 2 ngày, có sục khí
2 giờ/ngày.
Kết quả (Bảng 4.2) cho thấy sau khi xử lý với dòng P11, hàm lượng
COD, TSS, N_tổng số, P_tổng số, N_NH4 +, PO43- trong phần trong phía

ammonium (N_NH4 +), nitrit (N_NO2-) và nitrat (N_NO3-) ở dạng hợp chất
(NH4Cl, NaNO2, NaNO3) qua các nồng độ tăng dần (100, 200, 300, 400,

trên đã giảm đi một phần so với ban đầu. Lấy phần nước trong phía trên để
xử lý tiếp tục với dòng LV1 trong 2 ngày, hàm lượng COD, TSS, N_tổng

500, 600 và 700 mM) nhằm kiểm tra khả năng oxi hóa ammonium và khử
nitrat, khử nitrit của các dòng vi khuẩn trên. Chọn các dòng vi khuẩn có khả

số, N_NH4 +, PO4 3-, P_tổng số trong nước thải còn lần lượt là 127 mg O2/l;
17,45 mg/l; 24,98 mg/l; 3,15 mg/l; 2,14 mg/l; 4,63 mg/l. Nước thải sau xử

năng oxi hóa N_NH4+ và khử N_NO3 - ở cao nhất để thực hiện thí nghiệm
tiếp theo.

lý có màu nâu đỏ nhạt (Hình 4.1), chứng tỏ sinh khối vi khuẩn còn lơ lửng
trong nước thải sau xử lý. Vì thế cần nghiên cứu các biện pháp bổ sung để
nước thải đầu ra đạt loại B theo mục tiêu đề ra.

3.2.5.3 Vi khuẩn chuyển hóa photpho
Đem các dòng vi khuẩn phân lập được từ môi trường tối thiểu (trong các
ống trữ giống) cấy ria trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa
photpho có bổ sung 2% agar, chọn những dòng có khả năng phát triển trên
môi trường này. Để kiểm tra nhanh khả năng hình thành poly-P của các
dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa
photpho, các dòng vi khuẩn này được cấy trên môi trường lân khó tan với
chất chỉ thị pH (Bromothymol blue 0,5%), quan sát trong 2 đợt, mỗi đợt 2
ngày, lặp lại 2 lần (không phát triển hoặc phát triển nhưng không hòa tan
lân (không tạo vòng halo) trên môi trường lân khó tan). Đồng thời, các dòng
vi khuẩn này được nuôi trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa
photpho (lỏng) trong 15 ngày trên máy lắc xoay vòng (150 vòng/phút) để
kiểm tra sự hình thành poly-P của các dòng vi khuẩn. Sau đó, đo hàm lượng
poly-P trong dung dịch vi khuẩn tại phòng thí nghiệm Chuyên sâu, trường

Đại học Cần Thơ. Chọn 02 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P (01
dòng có poly-P cao nhất và 01 dòng có poly-P thấp nhất) để thực hiện thí
nghiệm tiếp theo.

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và
photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH4+, PO4 3- và P_tổng số của nước thải nhà
máy sữa tổng hợp sau 2 ngày, sục khí 2 giờ/ngày
Chỉ tiêu
Kết quả sau 2 ngày xử lý

COD

TSS

N_tổng số

N_NH4+

PO43

(mgO2/l)

(mg/l)

(mg/l)

(mg/l)

(mg/l)

P_tổng
số
(mg/l)

Trước xử lý

483,00

36,50

43,45

22,72

11,89

Sau xử lý kết tụ (P11)

286,00

16,50

36,43

21,86

2,11

5,95

Tỷ lệ giảm (%)

40,80

54,79

16,16

3,80

82,25

12,50

Sau xử lý nitơ, photpho(LV1)

127,00

17,45

24,98

3,15

2,14

4,63

Tỷ lệ giảm chung (%)

73,71

52,19

42,51

86,14

82,00

31,91

6,80

Chính vì các lý do trên, tiến hành xử lý nước thải theo qui trình trên
nhưng kéo dài thới gian xử lý ở công đoạn xử lý nitơ và photpho từ 2 ngày
lên 4 ngày và tăng thời gian sục khí từ 2 giờ/ngày lên 4 giờ/ngày, 6
giờ/ngày, sau đó đánh giá hiệu quả xử lý của các dòng vi.


22
Qua kết quả thí nghiệm trên cho thấy khả năng xử lý PO43- (tích lũy
poly-P) trong nước thải nhân tạo của các dòng vi khuẩn tốt nhất trong điều
kiện có sục khí 2 giờ/ngày, đặc biệt là dòng vi khuẩn LV1 và thời gian xử lý
2 ngày có khả năng loại bỏ photpho hòa tan trong nước thải.

7
3.2.6 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp phân tích trình tự 16S
rDNA
Được thực hiện qua các giai đoạn gồm ly trích DNA của vi khuẩn, thực

ii. Kết quả xử lý photpho của các dòng vi khuẩn trong nước thải nhà

hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, điện di sản phẩm
PCR trên agrose gel, nhận diện vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự

máy sữa tổng hợp
Sử dụng hai dòng vi khuẩn LV1, LV8b để xử lý photpho trong nước thải

đoạn DNA có sử dụng chương trình BLASTn để so sánh trình tự đoạn DNA
của dòng vi khuẩn với trình tự DNA của các loài vi khuẩn có trong ngân

nhà máy sữa tổng hợp có bổ sung 9 ÷ 11 mg/l ở điều kiện xử lý có sục khí 2
giờ/ngày. Đồng thời cũng tiến hành bố trí các nghiệm thức kết hợp hai dòng

hàng dữ liệu NCBI.

vi khuẩn LV1+LV8b, Đối chứng để xử lý photpho trong nước thải nhà máy
sữa tổng hợp. Sau 2 ngày xử lý, hàm lượng PO4 3- trong nước thải đều giảm
xuống so với ban đầu 11,96 mg/l ở tất cả các nghiệm thức. Trong đó, ở
nghiệm thức bổ sung vi khuẩn LV1 giảm xuống nhiều nhất (3,96 mg/l), sau

3.2.7 Đánh giá khả năng tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho
của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ,

đó đến các nghiệm thức bổ sung LV1+LV8 (4,02 mg/l), LV8b (4,11 mg/l).
Trong khi đó nghiệm thức đối chứng còn ở mức cao (9,62 mg/l). Tỷ lệ loại
bỏ photpho tổng số ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn LV1, LV8b,
LV1+LV8b lần lượt là 26,34%, 23,81%, 24,26%, trong khi đó nghiệm thức

3.2.7.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
i. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu quả kết tụ
* pH ban đầu của môi trường: Nhằm xác định giá trị pH thích hợp để
vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được chọn ở thí nghiệm trước cho

đối chứng chỉ đạt 7,30%.
Dòng vi khuẩn LV1 được chọn để xử lý nước thải trong điều kiện có sục

hiệu quả kết tụ cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (pH với các mức 4,0; 5,0; 6,0;

khí 2 giờ/ngày cho thí nghiệm tiếp theo.

7,0; 8,0 9,0), được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp
lại. Tổng số nghiệm thức : 6 x 3 = 18.

4.5 Kết quả ứng dụng kết hợp các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

chuyển hóa photpho đã qua tuyển chọn và định danh trong nước thải
nhà máy sữa

Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu quả kết tụ như sau:
- Lấy 6 bình tam giác 250 ml, cho vào mỗi bình gồm: 90 ml dung dịch

sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho vào trong xử lý nước thải nhà máy
sữa tổng hợp
Ứng dụng kết hợp dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (dòng
P11) và dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho (dòng LV1) vào trong

Kaolin (5 g/l) + 10 ml (1 g/l) dung dịch CaCl2.

- Điều chỉnh pH của 6 bình ở các giá trị pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 9,0

xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp. Nước thải nhà máy sữa tổng hợp
được chỉnh về pH 9,0; bổ sung dung dịch muối CaCl2 (1%) và 0,1% dung

bằng dung dịch HCl hay NaOH.
- Cho vào mỗi bình 0,1 ml (0,1 %) dung dịch vi khuẩn (mật số lớn hơn

dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (P11), sau đó khuấy đều trong 1
phút và để yên 30 phút. Lấy phần nước trong bên trên [3 lít] (bỏ phần lắng

hoặc bằng 109 CFU/ml). Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không
chủng vi khuẩn.


8

21
Trong điều kiện xử lý không có sục khí, hàm lượng PO4 3- trong nước

- Lắc bằng máy lắc ở 60 vòng/phút trong 30 giây.
- Để yên 5 phút.
- Lấy phần trong cách mặt nước 2 ÷ 3 cm đem đo OD550nm.

thải giảm dần theo thời gian xử lý ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung vi
khuẩn. So sánh quá trình xử lý trong điều kiện có sục khí và không có sục

- Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức ở mục 3.2.2.1.
* Các muối kim loại (ion kim loại) bổ sung vào môi trường: Nhằm

khí cho thấy hàm lượng PO43- giảm nhiều hơn trong điều kiện xử lý có sục
khí ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn.

xác định muối kim loại bổ sung vào môi trường để vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học được chọn ở thí nghiệm trước cho hiệu quả cao nhất.

Đo hàm lượng poly-P trong nước thải nhân tạo sau 3 ngày xử lý, sục khí
2 giờ/ngày, kết quả cho thấy cả hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b đều có khả

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (Muối kim loại bổ sung gồm
KCl, NaCl, CaCl2, MgSO4, MnSO4 , FeCl3), được bố trí theo thể thức hoàn

năng tích lũy lượng poly-P cao trong môi trường, 3 nghiệm thức có chủng
vi khuẩn vào nước thải có hàm lượng poly-P gần tương đương nhau và cao

toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Tổng số nghiệm thức : 6 x 3 = 18.
Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu quả kết tụ như sau:
- Lấy 6 bình tam giác loại 250 ml, cho vào mỗi bình gồm: 90 ml Kaolin
(5 g/l) + 10 ml dung dịch 1 % từng loại muối trên.

hơn nhiều so với nghiệm thức đối chứng (LV1 – 26,75 mg/l; LV8b – 26,31
mg/l; LV1 + LV8b – 25,56 mg/l; Đối chứng – 7,87 mg/l).

- Điều chỉnh pH tối ưu theo kết quả trên.
- Cho vào mỗi bình 0,1 ml (0,1 %) dung dịch vi khuẩn (mật số lớn hơn

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn và sục khí đến hàm lượng PO43- (mg/l) trong nước thải nhân tạo
theo thời gian
Sục Khí

- Lấy phần trong cách mặt nước 2 ÷ 3 cm đem đo OD550nm.
- Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức ở mục 3.2.2.1.

Trung bình
Vi khuẩn

Ngày 0

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

LV1

9,82

7,57

2,67

1,10

5,29 a

LV8b

9,39

6,50

4,19

3,42

5,88

LV1+LV8b

9,49

5,60

3,58

2,37

5,26 a

Đối chứng

11,90

11,14

11,58

10,66

11,32

10,15

7,70

5,51

4,39

LV1

10,76

7,91

5,28

4,88

7,21

LV8b

10,39

7,95

5,30

5,81

7,36

LV1+LV8b

10,19

7,56

5,04

5,41

7,05

Đối chứng

11,90

11,11

11,58

10,65

11,31

10,81

8,63

6,80

6,69

10,48 d

8,17 c

6,15 b

5,54 a

Trung bình thời
gian (có sục)

b
e

Không

* Tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sử dụng : Nhằm
xác định tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được chọn ở thí
nghiệm trước cho hiệu quả kết tụ cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (Tỷ lệ giống vi khuẩn ở các

Trung bình thời

nồng độ 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 %), được bố trí theo thể thức hoàn

toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Tổng số nghiệm thức : 6 x 3 = 18.

Trung bình chung
Thời gian

Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu quả kết tụ như sau:

Thời gian

Có

hoặc bằng 109 CFU/ml). Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không
chủng vi khuẩn.
- Lắc bằng máy lắc ở 60 vòng/phút trong 30 giây.
- Để yên 5 phút.

Vi khuẩn

gian (không sục)

cd
d
c
e

Các trung bình trong cùng một hàng hoặc trong cùng một cột có cùng chữ theo sau thì khác biệt
không ý nghĩa ở mức α = 0,01.
CV = 2,87%, LSD0.01 –Thời gian = 0,17; LSD0.01 –Vi khuẩn (có và không sục khí) = 0,24

20
N_NH4+ ban đầu lên 30, 40 mg/l, tăng thời gian xử lý lên 3 ngày thì hàm
+

lượng N_NH4 trong nước thải giảm xuống mức 10 mg/l.

9
- Lấy 6 bình tam giác loại 250 ml, cho vào mỗi cốc gồm: 90 ml dung

ii. Kết quả xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp của hai dòng vi

dịch Kaolin (5 g/l) + 10 ml dung dịch 1 % CaCl2.
- Điều chỉnh pH và muối kim loại tối ưu theo kết quả trên.

khuẩn LV1 và TR3
Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp với nồng độ

- Cho dung dịch vi khuẩn vào mỗi bình lần lượt với các tỷ lệ giống vi
khuẩn khác nhau, tỉ lệ 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1% (mật số lớn hơn

N_NH4+ ban đầu 20 ÷ 25 mg/l của hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ LV1
và TR3. Kết quả cho thấy, ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn LV1,

hoặc bằng 109 CFU/ml). Mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn.
- Lắc 60 vòng/phút trong 30 giây.

TR3, LV1 + TR3 có khả năng làm giảm nồng độ N_NH4+ đáng kể. Sau 2
ngày xử lý, hàm lượng N_NH4+ trong nước thải ở các nghiệm thức bổ sung

- Để yên 5 phút.

- Lấy phần trong cách mặt nước 2 ÷ 3 cm đem đo OD550nm.

vi khuẩn LV1, TR3, LV1+TR3 chỉ còn dưới 3 mg/l (loại A), riêng nghiệm
thức đối chứng vẫn còn ở mức cao (16,9 mg/). Tỷ lệ loại bỏ COD của hai
dòng vi khuẩn LV1 và TR3 là 27,63% cao hơn khi kết hợp cả hai dòng vi
khuẩn LV1+TR3 (11,80%) và thấp hơn mẫu đối chứng (34,21%). Trong khi

- Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức ở mục 3.2.2.1.
* Nguồn cacbon, nitơ và muối khoáng vô cơ bổ sung vào dịch nuôi vi
khuẩn: Nhằm chọn ra môi trường có bổ sung nguồn cacbon, nitơ và muối
khoáng vô cơ dùng để nuôi vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được

đó, tỷ lệ loại bỏ NO3- của dòng vi khuẩn LV1, TR3 và LV1+TR3 rất cao
(>99%), đặc biệt là dòng LV1 (không phát hiện), chứng tỏ hai dòng vi

chọn ở thí nghiệm trước cho hiệu quả kết tụ cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (Các loại môi trường nuôi vi

khuẩn này có khả năng khử nitrat rất tốt. Tỷ lệ loại bỏ N_tổng số ở nghiệm
thức bổ sung vi khuẩn LV1 cao nhất (42,03%) so với các nghiệm thức còn

khuẩn), được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
Tổng số 48 nghiệm thức: 3 nghiệm thức cacbon x 4 nghiệm thức nitơ x 4

lại.

nghiệm thức muối khoáng vô cơ = 48.
Thực hiện: Qui trình nuôi vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và

Dòng vi khuẩn LV1 được chọn để để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.

4.4.3 Khả năng chuyển hóa photpho của hai dòng vi khuẩn LV1 và
LV8b

kiểm tra hiệu quả kết tụ như sau:
- Tiến hành pha môi trường với sự phối hợp ba nguồn cacbon, nitơ và

i. Khả năng chuyển hóa photpho trong nước thải nhân tạo của hai dòng
vi khuẩn LV1 và LV8b
Kết quả (Bảng 4.1) cho thấy: Trong điều kiện xử lý có sục khí 2
giờ/ngày, chỉ cần 2 ngày xử lý, hàm lượng PO43- trong nước thải ở nghiệm

muối khoáng vô cơ được 48 nghiệm thức khác nhau.
- Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm loại 10 ml ở nhiệt độ phòng (270C),

thức có bổ sung vi khuẩn LV1 giảm xuống còn 2,67 mg/l. Và sau 3 ngày xử
lý, hàm lượng PO43- trong nước thải ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung vi

quả kết tụ sinh học với dung dịch Kaolin bằng cách đo OD550nm, sau đó tính
tỷ lệ kết tụ theo công thức ở mục 3.2.2.1.

khuẩn đều giảm xuống nhiều so với nghiệm thức đối chứng (10, 65 mg/l).

ii. So sánh khả năng kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học: Phối hợp các điều kiện tìm được ở các thí nghiệm 3.2.5.1-i để tối

lắc trên máy lắc 150 vòng/phút.
- Sau 3 ngày (mật số lớn hơn hoặc bằng 109 tế bào/ml), kiểm tra hiệu


10

19

ưu khả năng tạo kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

P11 (9,05 log10CFU/ml), chứng tỏ dòng P14 có tốc độ tăng trưởng và phát

được chọn, từ đó so sánh hiệu quả kết tụ của các dòng vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm các

triển cao hơn dòng P11. Tỷ lệ kết tụ của hai dòng vi khuẩn P11 và P14 lần
lượt là 95,62% và 95,94% (tỷ lệ kết tụ của dòng P14 cao hơn dòng P11

nghiệm thức là các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được chọn
ở thí nghiệm trước, 3 lần lặp lại.

không đáng kể). Như vậy, xét về mật số vi khuẩn thì dòng P14 không cho
hiệu quả kết tụ cao bằng dòng P11.

Qui trình thực hiện: Nuôi các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học được chọn trong 100 ml môi trường lỏng có nguồn cacbon, nitơ và

iii. Kết quả xử lý nước thải nhà máy sữa của hai dòng vi khuẩn P11 và
P14
Mặc dù đã sử dụng các thông số tối ưu của hai dòng vi khuẩn P11 và
P14 để xử lý nước thải nhà máy sữa nhưng cho kết quả không tốt. Qua kiểm

khoáng vô cơ được chọn ở phần trên, lắc trên máy lắc 150 vòng/phút, ở
nhiệt độ phòng (270C), nuôi trong 3 ngày. Xác định mật số vi khuẩn bằng
phương pháp đếm sống nhỏ giọt để so sánh mật số của các dòng vi khuẩn.

Sau đó kiểm tra khả năng kết tụ với dung dịch Kaolin ở các điều kiện pH,
liều lượng, ion kim loại bổ sung đã xác định ở các thí nghiệm ở phần trên.
iii. Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhà máy sữa của các dòng vi

tra cho thấy, pH của nước thải là yếu tố ảnh hưởng nhiều đến khả năng kết
tụ của vi khuẩn. Tiến hành thí nghiệm có điều chỉnh lại các giá trị pH ban
đầu từ 5,0 đến 9,0. Kết quả cho thấy hai dòng vi khuẩn P11 và P14 có hoạt
tính kết tụ thấp nhất ở pH = 7,0 (P11 - 20,75% và P14 - 21,32%) và cao

khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm các

nhất ở pH = 9,0 (P11 -56,79% và P14 - 45,28%).
Sử dụng các thông số tối ưu cho 2 dòng vi khuẩn P11 và P14 vào trong

nghiệm thức theo các dòng vi khuẩn với 3 lần lặp lại.
Qui trình thực hiện :

quá trình xử lý nước thải sữa. Kết quả cho thấy dòng P11 làm giảm COD và
TSS lần lượt là 44,44% và 58,98%. Dòng P14 làm giảm COD và TSS lần

- Cho vào cốc loại 1 lít: 475 ml nước thải nhà máy sữa và 25 ml dung
dịch muối kim loại (1%) từ kết quả của thí nghiệm trước.

lượt là 33,33% và 28,07%. Như vậy, dòng P11 cho hiệu quả cao hơn dòng
P14 mặc dù mật số của dòng vi khuẩn P11 thấp hơn dòng P14 đến 3,9 lần.

- Điều chỉnh pH tối ưu, bổ sung dung dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học theo kết quả của các thí nghiệm trước.

Dòng P11 được chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.

- Lắc 200 vòng/phút trong 1 phút, lắc tiếp 60 vòng/phút trong 5 phút.
Sau đó để yên 30 phút. Lấy phần trong đo chỉ tiêu TSS (Tổng số chất rắn lơ

i. Kết quả xử lý N_NH4+ trong nước thải nhà máy sữa tổng hợp của hai
dòng vi khuẩn LV1 và TR3
Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích đánh giá khả năng xử lý
N_NH4+ trong nước thải nhà máy sữa tổng hợp ở các nồng độ ban đầu 20,

lửng) và COD (Nhu cầu oxi hóa học).
3.2.7.2 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Vì việc thu nhận nước thải nhà máy sữa để thí nghiệm (thực hiện nhiều
lần, số lượng lớn) gặp nhiều khó khăn (vì lý do an ninh, chính trị, sản xuất
kinh doanh,..của doanh nghiệp); và để cho quá trình nghiên cứu thành công
khả năng xử lý nước thải nhà máy sữa của các dòng vi khuẩn được chọn,

4.4.2 Khả năng chuyển hóa nitơ của hai dòng vi khuẩn LV1 và TR3

30 và 40 mg/l. Kết quả cho thấy khả năng xử lý N_NH4+ trong nước thải
nhà máy sữa tổng hợp ở nồng độ ban đầu 20 mg/l của hai dòng vi khuẩn
LV1 và TR3 là rất tốt, nồng độ N_NH4+ ban đầu 20 mg/l giảm xuống dưới
5 mg/l (đạt loại A, QCVN 24: 2009/TNMT) sau 2 ngày. Khi tăng nồng độ


18

11

Kết quả kiểm tra cho thấy dòng vi khuẩn P11có tỷ lệ kết tụ cao nhất ở

cho nên thật sự cần thiết có một loại nước thải nhà máy sữa có những tính

pH 4,0 (95,61%), và dòng vi khuẩn P14 cho tỷ lệ kết tụ cao nhất ở pH 6,0
(95,63%). Như vậy, giá trị pH được chọn lần lượt 4,0 (P11) và 6,0 (P14).

chất ổn định. Chính vì lý do đó, loại nước thải nhà máy sữa tổng hợp (thành
phần trình bày trong Bảng 3.1 – có thành phần gần giống với nước thải thật)

• Ảnh hưởng của các muối kim loại bổ sung vào môi trường đến khả
năng kết tụ
Kết quả cho thấy khi bổ sung muối CaCl2 vào dung dịch, cả hai dòng vi
khuẩn P11 và P14 cho tỷ lệ kết tụ cao nhất (P11 - 96,03% và P14 -

được tạo ra dựa trên các tài liệu như của Environment protection Authority
State Government of Victoria (1997), Gutiérrez và ctv (2005) và đặc tính

95,27%). Như vậy, chọn muối CaCl2 làm chất bổ sung vào dung dịch để hỗ
trợ quá trình kết tụ cho 2 dòng vi khuẩn trong các thí nghiệm tiếp theo.

trở về sau.
Nhân nuôi các dòng dòng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm 3.2.2.2 trong

• Ảnh hưởng của tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
đến hiệu quả kết tụ sinh học
Cả hai dòng vi khuẩn này cho hiệu quả kết tụ cao nhất ở tỷ lệ giống vi
khuẩn là 0,1% (P11- 95,70%; P14 – 95,12%). Vậy, chọn tỷ lệ giống vi

môi trường BM/NO3- đã khử trùng trong bình tam giác 250 ml đặt trên máy
lắc (tốc độ 150 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng (25 ÷ 270C). Sau 24 ÷ 36 giờ,

mật số vi khuẩn trong mỗi bình đạt lớn hơn hoặc bằng 109 tế bào/ml được
sử dụng cho các thí nghiệm.

khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sử dụng đối với hai dòng vi khuẩn P11
và P14 là 0,1% để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.1 Thành phần nước thải nhà máy sữa tổng hợp (tính cho 1 lít nước thải)

• Ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ và khoáng vô cơ lên sự phát
triển của vi khuẩn
Khi nuôi hai dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P11 và P11
trong môi trường có nguồn cacbon là glucose; nguồn nitơ là một trong các
chất glutamat, yeast, ure và nguồn khoáng vô cơ là K2HPO4 (0,5%) +
KH2PO4 (0,2%) cho tỷ lệ kết tụ cao nhất (P11 – 95,60%; P14 - 96,12%).
Như vậy, nguồn cacbon, nitơ và khoáng vô cơ thích hợp để nuôi hai dòng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P11 và P14 cho tỷ lệ kết tụ sinh học cao
là glucose, glutamate và K2HPO4 + KH2PO4.
ii. Kết quả so sánh hiệu quả kết tụ sinh học của 2 dòng vi khuẩn P11 và
P14
Phối hợp các điều kiện tối ưu cho sự kết tụ của hai dòng vi khuẩn P11 và
P14 và kiểm tra hiệu quả kết tụ với dung dịch Kaolin. Kết quả cho thấy mật
số vi khuẩn của dòng P14 (9,58 log10CFU/ml) cao gấp 3,19 lần so với dòng

của nước thải nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ. Sử dụng nước thải nhà máy
sữa tổng hợp để thực hiện các loạt thí nghiệm từ nội dung nghiên cứu này

Hóa chất

Số lượng

Sữa tươi 100% vinamilk có đường

2,5 g/l

NaNO3

0,11 g/l

Nước cất

997,39 ml

Ghi chú: Kết quả phân tích các chỉ tiêu (chất rắn lơ lửng, COD, nitơ tổng số, photpho tổng số, NH4+,
PO43-, NO3-, pH) trong nước thải tổng hợp thể hiện ở phần Kết quả và Thảo luận

i. Đánh giá khả năng xử lý N_NH4 + trong nước thải nhà máy sữa tổng
hợp
Mục đích: Khảo sát khả năng xử lý N_NH4+ trong nước thải nhà máy
sữa tổng hợp với nồng độ ban đầu 20, 30 và 40 mg/l của các dòng vi khuẩn
chuyển hóa nitơ được chọn ở thí nghiệm 3.2.2.2.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 2 nhân tố (vi khuẩn, thời gian) được bố trí
hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp và đo nồng độ N_NH4 +
trong nước thải, sau đó bổ sung NH4Cl để đạt nồng độ khoảng 20, 30, 40
mg/l. Sau khi đo pH, lấy mẫu đếm mật số, tiến hành cho nước thải vào các
chai PET [500 ml] với thể tích 400 ml/chai. Chủng 5% dịch vi khuẩn vào


12

17

các chai PET chứa nước thải, lắc đều và để trong điều kiện tự nhiên của

Các dòng vi khuẩn phân lập được tiếp tục được cấy trên môi trường nuôi

phòng thí nghiệm. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn.
Ghi nhận kết quả: nồng độ N_NH4+ trong nước thải đang xử lý mỗi ngày

cấy vi khuẩn chuyển hóa photpho và kiểm tra sự hình thành poly-P, kết quả
chọn hai dòng vi khuẩn LV8b (poly-P trong dung dịch cao nhất [11,61

cho đến khi đạt tiêu chuẩn nước thải loại A (QCVN 24: 2009/BTNMT).

mg/l]) và LV1 (poly-P trong dung dịch thấp nhất [- 5,98 mg/l]) để thực hiện
các thí nghiệm tiếp theo sau.

ii. Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp
Mục đích: Nhằm xác định khả năng xử lý nước thải nhà máy sữa tổng
hợp với nồng độ N_NH4+ ban đầu 20 ÷ 25 mg/l của các dòng vi khuẩn

4.3 Định danh vi khuẩn
Tiến hành nhận diện 05 dòng vi khuẩn (P11, P14, LV1, LV8b, TR3) đã

chuyển hóa nitơ được chọn ở thí nghiệm 3.2.2.2, từ đó chọn ra dòng vi
khuẩn tốt nhất để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.

chọn bằng phương pháp 16S rDNA. Kết quả cho thấy: Hai dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học P14 và P11 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 2 nhân tố (vi khuẩn và thời gian) được bố
trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp và đo nồng độ N_NH4 +
trong nước thải, sau đó bổ sung NH4Cl để đạt nồng độ khoảng 20 ÷ 25

Enterobacter aerogenes dòng CTSP30 16S rDNA (EU855208.1) là 99%;
Dòng vi khuẩn LV1 (chuyển hóa nitơ, photpho) có tỷ lệ tương đồng với vi
khuẩn Arthrobacter mysorens 16S rRNA dòng LMG 16219T
(AJ639831.1), Arthrobacter mysorens dòng DSM 12798 16S rRNA (NR

mg/l. Sau khi đo pH, lấy mẫu đếm mật số, tiến hành cho nước thải vào các
keo nhựa [7 lít] với thể tích 3 lít/keo. Chủng 5% dịch vi khuẩn vào các keo

025613.1) là 99%; Dòng vi khuẩn TR3 (chuyển hóa nitơ) có tỷ lệ tương
đồng với vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus dòng PVAS6 16S rRNA

chứa nước thải, dùng đũa thủy tinh khuấy đều trong 1 phút và để trong điều
kiện tự nhiên của phòng thí nghiệm. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung
vi khuẩn.
Ghi nhận kết quả: nồng độ N_NH4 + khuẩn trong nước thải đang xử lý

(GU130530.1), Acinetobacter calcoaceticus 16S rRNA, dòng MTCC:9488
(FM210755.1) là 99%; Dòng vi khuẩn LV8b (chuyển hóa photpho) có tỷ lệ

mỗi ngày xử lý và COD, N_NO3-, N_tổng số nước thải trước và sau xử lý.

99%.

3.2.7.3 Vi khuẩn chuyển hóa photpho
Ở phần này, các loạt thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá khả năng

4.4 Kết quả kiểm tra khả năng tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ,

chuyển hóa photpho của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được chọn ở thí
nghiệm 3.2.2.3 trong nước thải nhân tạo (thành phần nước thải nhân tạo là
môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa photpho dạng lỏng) và nước thải
nhà máy sữa tổng hợp có bổ sung KH2PO4 để nồng độ PO43- đạt khoảng 9 ÷
11 mg/l, từ đó chọn ra dòng tốt nhất để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Nhân nuôi mật số các dòng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm 3.2.2.3
-

trong môi trường BM/NO3 đã khử trùng trong bình tam giác 250 ml đặt

tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium dòng NY-3 16S rRNA
(EU918562.1), Bacillus megaterium dòng EI-6 16S rRNA (FJ613535.1) là

photpho của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển
hóa nitơ, chuyển hóa photpho đã qua tuyển chọn và định danh trong
nước thải nhà máy sữa
4.4.1 Khả năng tạo kết tụ sinh học của hai dòng vi khuẩn P11 và P14
i. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu quả kết tụ của hai
dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P11 và P14
• Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến khả năng kết tụ


16

13

4.1.2 Phân lập vi khuẩn từ môi trường tối thiểu để chọn lọc vi khuẩn

chuyển hóa nitơ, photpho
Từ 13 mẫu chất thải rắn và nước thải (11 mẫu nước, 2 mẫu rắn) của 6

trên máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng (25 ÷ 270C) đến khi

chuồng bò ở một số tỉnh, thành phố ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, nhà máy
sữa Vinamilk Cần Thơ và trạm thu mua sữa tại TP.HCM đã phân lập được

24 giờ nữa rồi sử dụng cho các thí nghiệm.

47 dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu VC7b, VC8b, VC17a, VC17b,
VC17c, VC18, VC19, VC21, VC22, VC33, VC36, PR1b, PR4, PR5, PR6,

chuyển hóa photpho trong môi trường nước thải nhân tạo
Mục đích: Nhằm đánh giá khả năng tích lũy poly-P của các dòng vi

PR7a, PR7b, PR7c, PL1a, PL3a, PL6a, PL6b, LV1, LV2a1, LV2a2, LV3,
LV4a, LV5, LV8b, OM4, OM5, OM6, OM10, OM12, OM13, BT1, BT2,

khuẩn tích lũy poly-P được chọn ở thí nghiệm 3.2.2.3 trong nước thải nhân
tạo ở điều kiện xử lý có sục khí [2 giờ/ngày] và không có sục khí.

BT3, BT5, BT12, SL3, SL5, SL8, 3b4b, 3b7b, TR2, TR3. Đa số khuẩn lạc
các dòng vi khuẩn phân lập đều có dạng tròn, màu trắng đục, mô, bìa
nguyên, kích thước 0,2 ÷ 2,0 mm và khi bảo quản ở 4 0C thường phát triển
đặc tính nhầy. Hầu hết 47 dòng phát triển trên môi trường tối thiểu có hình

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 3 nhân tố (vi khuẩn, sục khí và thời gian)
được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Thực hiện: Pha nước thải nhân tạo, sau đó bổ sung KH2PO4 để nồng độ

PO43- đạt 9 ÷ 11 mg/l. Cho nước thải vào các keo nhựa [5 lít], 3 lít nước

que ngắn, có khả năng chuyển động.
4.2 Tuyển chọn vi khuẩn

thải/keo. Bổ sung vi khuẩn vào các keo chứa nước thải với liều lượng là 5%
(kết hợp hai dòng vi khuẩn thì mỗi dòng sẽ chủng 2,5%), dùng đũa thủy

4.2.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
Qua quá trình kiểm tra khả năng kết tụ của 36 dòng vi khuẩn tổng hợp

tinh khuấy đều trong 1 phút và để trong điều kiện tự nhiên của phòng thí
nghiệm. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Thời gian sục khí

chất kết tụ sinh học với dung dịch Kaolin, chọn được 2 dòng vi khuẩn có tỷ
lệ kết tụ cao nhất là P11 (tỷ lệ kết tụ 81,79%) và P14 (tỷ lệ kết tụ 83,86%)

2 giờ/ngày, lưu lượng khí trên mỗi bình khoảng 10 lít/phút.
Ghi nhận kết quả: nồng độ PO43- trong nước thải đang xử lý mỗi ngày

để thực hiện ở các thí nghiệm tiếp theo.

xử lý, đo hàm lượng poly-P trong nước thải sau xử lý.

4.2.2 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Kết quả kiểm tra cho thấy đa số các dòng vi khuẩn không có khả năng
phát triển hoặc phát triển rất yếu trên môi trường có bổ sung nitrit. Ở nồng

ii. Đánh giá khả năng xử lý photpho trong nước thải nhà máy sữa tổng

độ 700 mM (N_NH4+, N_NO3 -), có 04/47 dòng (PR7b, LV1, OM5, TR3)
phát triển trên cả hai môi trường, trong đó 2 dòng LV1 và TR3 có khả năng

máy sữa tổng hợp với nồng độ PO43- ban đầu 9 ÷ 11 mg/l của các dòng vi
khuẩn được chọn ở thí nghiệm 3.2.2.3, từ đó chọn ra dòng vi khuẩn tốt nhất

khử nitrat mạnh nhất. Chọn 2 dòng LV1 và TR3 để thực hiện thí nghiệm
tiếp theo.

để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 2 nhân tố (vi khuẩn và thời gian), 3 lần

4.2.3 Vi khuẩn chuyển hóa photpho

lặp lại.

đạt được mật số lớn hơn hoặc bằng 109 tế bào/ml (khoảng 48 giờ), sau đó ly
tâm lạnh và lấy sinh khối chuyển sang môi trường tối thiểu nhân nuôi tiếp
i. Đánh giá khả năng chuyển hóa photpho của các dòng vi khuẩn

hợp của các dòng vi khuẩn chuyển hóa photpho
Mục đích: Nhằm đánh giá khả năng xử lý photpho trong nước thải nhà


14

15

Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp và đo nồng độ PO433-

trên (3 lít) để tiếp tục xử lý nitơ, photpho còn lại trong nước thải (phần

trong nước thải, sau đó bổ sung thêm KH2PO4 để nồng độ PO4 đạt 9 ÷ 11
mg/l. Sau khi đo pH, lấy mẫu đếm mật số, tiến hành cho nước thải vào các

trong phía trên). Bổ sung vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho để xử lý nitơ,
photpho trong điều kiện xử lý đã tìm được ở thí nghiệm trước. Xác định

keo nhựa có thể tích 7 lít với thể tích 3 lít/keo. Chủng 5% dịch vi khuẩn vào
các keo nhựa chứa nước thải, dùng đũa thủy tinh khuấy đều trong 1 phút và

COD, TSS, N_ tổng số, P_tổng số trong nước thải trước và sau xử lý.
Sau khi đã chọn ra 01 qui trình xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp,

để trong điều kiện tự nhiên của phòng thí nghiệm. Tiến hành xử lý nước
thải với điều kiện xử lý (có sục khí 2 giờ/ngày hoặc không có sục khí) được

tiến hành bố trí thí nghiệm xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp ở qui mô
lớn hơn.

chọn ở thí nghiệm 3.2.5.3-i. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi
khuẩn.

3.3 Phân tích mẫu và xử lý số liệu
Mẫu đem xác định các chỉ tiêu gồm COD, TSS, N_tổng số, P_tổng số,

Ghi nhận kết quả: nồng độ PO43- trong nước thải đang xử lý mỗi ngày
xử lý, đo hàm lượng photpho tổng số trong nước thải trước và sau xử lý.
3.2.8 Ứng dụng kết hợp các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho tốt nhất để xử lý nước thải

poly-P được bảo quản lạnh, gởi kiểm mẫu ở phòng thí nghiệm Chuyên sâu –
Trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Kỹ Thuật và Ứng Dụng Công Nghệ Đường 3/2 – Quận Ninh Kiều - Thành phố Cần Thơ.
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, số liệu được xử lý

nhà máy sữa tổng hợp
Mục đích: Nhằm tìm ra một qui trình xử lý nước thải nhà máy sữa ở qui

thống kê bằng phần mềm Excel, phân tích phương sai (ANOVA) để tính sự
khác biệt có nghĩa sử dụng LSD ở mức độ 1% (LSD0.01), vẽ đồ thị.

mô phòng thí nghiệm dựa trên sự kết hợp giữa các dòng vi khuẩn tổng hợp
chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn chuyển hóa

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

photpho được chọn từ các thí nghiệm trước.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên, 3 lần lặp.
Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp, đo nồng độ N_NH4+,

4.1 Phân lập vi khuẩn
4.1.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
Từ 06 mẫu chất thải sữa từ trại bò sữa ở Đồng bằng Sông Cửu Long,
Nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ và trạm thu mua sữa tại thành phố Hồ Chí

PO43- trong nước thải và sử dụng NH4Cl, KH2PO4 để điều chỉnh nồng độ
N_NH4+ về 20 ÷ 25 mg/l, nồng độ PO43- về 9 ÷ 11 mg/l. Sau khi đo pH,

Minh, phân lập được 36 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất kết tụ

sinh học, trong đó 17 dòng vi khuẩn từ môi trường phân lập vi khuẩn tổng

nồng độ N_NH4+, PO43-, tiến hành điều chỉnh pH nước thải theo thí nghiệm
trước và cho nước thải sữa vào các keo nhựa (7 lít), mỗi keo nhựa chứa 4 lít

hợp chất kết tụ sinh học polysaccharid (T1, T2, T3, T5, T6, T12, T14, T15,
T19, T7, T10, T11, T20, T21, T22, T23, T25) và 19 dòng vi khuẩn từ môi

nước nước thải. Sau đó, bổ sung muối kim loại theo thí nghiệm trước và vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, dùng đũa thủy tinh khuấy đều hỗn hợp

trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein (P1, P2, P3,
P4 P5, P6, P11, P14, P15, P18, P7, P8, P9, P10, P19, P20, P21, P22, P26).

trong 1 phút. Để yên hỗn hợp 30 phút. Lấy mẫu nước thải ở phần trong phía
trên để xác định các chỉ tiêu. Loại bỏ phần cặn lắng và lấy phần trong phía

Đa số các khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng đục, bìa nguyên, bề mặt trơn,
nhầy, ướt và mô. Có sự khác biệt về độ nhầy giữa khuẩn lạc.