NGHIÊN cứu QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC từ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP NHỜ CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ ưa NHIỆT thermotoga neapolitana DSM 4359

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Ngọc Huyền

NGHIÊN CỨ U QUÁ TRÌNH SẢ N XUÂT́ HYDRO SINH HỌ C
TỪ RÁ C THẢ I NÔNG NGHIỆP NHỜ CHỦ NG VI KHUẨN KỊ KHI ́ ƯA NHIỆT Thermotoga Neapolitana
DSM 4359

Chuyên ngành: Vi sinh vật họ c
Mã số: 60420107

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - Năm 2014

MỞ ĐẦU

1


Thế giới vào những năm đầu của thế kỷ thứ 21 đang đứng trước nhiều vấn đề cần phải đối mặt. Trong đó vấn
đề thiếu năng lượng là một vấn đề cấp bách mang tính toàn cầu và cần phải sớm có biện pháp giải quyết.
Những nguồn năng lượng hóa thạch như than đá, dầu mỏ, khí thiên nhiên thì không phải là vô tận. Với sự
phát triển của ngành công nghiệp trên thế giới như hiện này thì những nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng cạn kiệt
và sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của xã hội cũng như đời sống con người.
Hơn nữa, đặc điểm các tài nguyên hóa thạch là trong thành phần hóa học đều có chứa các nguyên tố cacbon,
hydro, oxy, nitơ, lưu huznh, đặc biệt trong than còn có kèm theo chất phóng xạ urani và thori, do đó sử dụng những

nguồn nhiên liệu này sẽ gây ra ảnh hưởng lớn đối với môi trường *1+.
Trong đó việc khai thác nhiên liệu sinh học là một phương thức tạo ra năng lượng rất được quan tâm hiện
nay vì hiệu suất cao, ít tốn kém và thân thiện với môi trường *4+. Điển hình là việc khai thác nguồn năng lượng hydro
sinh học - một nguồn năng lượng thay thế sạch vô cùng ưu thế trong tương lai từ chủng vi sinh vật kị khí ưa nhiệt cao
Thermotoga neapolitana DSM 4359[20].
Đây là một hướng đi mới mẻ và đầy triển vọng nhưng cũng không kém phần khó khăn và nhiều thách thức.
Do đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh học từ rác thải nông nghiệp nhờ
chủng vi khuẩn ưa nhiệt Thermotoga neapolitana DSM 4359” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được quy trình sản xuất hydro sinh học từ một số cơ chất khác nhau như (glycerol, xylose, glucose…).
2. Đưa ra kết quả thăm dò một số nguồn phế thải nông nghiệp làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình sản xuất
hydro sinh học nhờ sự lên men của vi khuẩn kị khí ưa nhiệt Thermotoga neapolitana DSM 4359.

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Thực trạng nguồn năng lƣợng thế giới và nhu cầu tìm nguồn năng lƣợng thay thế
1.1.1 Dầu mỏ
Nguồn tài nguyên thiên nhiên từ biển đã trở thành tiêu điểm cạnh tranh quốc tế. Dầu mỏ vẫn được coi là nguồn năng
lượng chính cho toàn thế giới tới năm 2025.
1.1.2. Khí tự nhiên
Cùng với dầu mỏ, gần đây, khí thiên nhiên đã và đang được coi là một trong những nguồn nhiên liệu có nhu cầu tiêu
thụ rất lớn trên thế giới với nhu cầu hàng năm tăng nhanh nhất
1.1.3. Than
Là nguồn nhiên liệu hóa thạch được sử dụng từ lâu nhất trên thế giới. Tổng trữ lượng than trên toàn thế giới được
ước tính khoảng 1.083 tỷ tấn, đủ cung cấp cho khoảng 170 năm nữa với mức tiêu thụ như hiện nay.
1.2. Hydro là một nguồn năng lƣợng ƣu việt
Hydro là một nguyên tố hóa học trong hệ thống tuần hoàn các nguyên tố với nguyên tử khối bằng 1. Ở trạng
thái tự do và trong các điều kiện bình thường, hydro không màu, không mùi và không vị, tỉ trọng bằng 1/14 tỉ trọng
o
của không khí. Nhiệt độ cháy của hydro có thể lên đến 3.000 C nếu cháy trong ôxy, cao nhất so với tất cả các loại khí
o
o

khác như khí methane (CH4) đạt 2.148 C, propane (C3H8) đạt 2.385 C [32, 34].
1.3. Một số phƣơng pháp sản xuất hydro sinh hoc
1.3.1. Sản xuất hydro bằng điện
Sản xuất H2 bởi điện bằng cách cho dòng điện qua một điện dẫn điện trong nước (kiềm hoặc polyme), kết quả
tách phân tử H2O thành H2 và oxy (O2). Hydro được sản xuất bởi điện có chất lượng tương đối cao, không có carbon,
lưu huznh, hoặc hợp chất được tạo ra trong quá trình.
1.3.2. Sản xuất hydro bởi khí metan (SMR)
Quá trình SMR thường sử dụng hơi nước ở nhiệt độ cao (800oC) phản ứng với khí mêtan (CH4), tạo thành
H2 và carbonmonoxide (CO). Sau đó khí CO phản ứng với hơi nước để tạo thành carbondioxide (CO2) và bổ sung
H2.
1.3.3. Sản xuất Hydro bởi hơi nước của oxy hóa hydrocacbon
Hydro có thể sản xuất bằng cách oxy hóa hơi nước hoặc dung dịch của nhiều hydrocacbon khác nhau như
methanol, ethanol, glycerol, glucose hoặc sử dụng nhiệt độ và chất xúc tác

2


1.3.4. Lên men sinh hydro phụ thuộc ánh sáng
Như chúng ta đã biết, ánh sáng và nước là những nguồn tài nguyên phong phú, do đó, trong vấn đề sản xuất hydro thì
sự quang phân sinh học nước thành H2 và O2 là một giải pháp đầy hứa hẹn.
1.3.5. Lên men tối sinh hydro
Trái ngược với sự lên men sáng sinh hydro, lên men không phụ thuộc ánh sáng hay lên men tối sinh hydro là
một quá trình sản xuất sinh học có thể được thực hiện một khoảng thời gian ngắn hơn để tạo thành khí hydro, khí
CO2, acid acetic và acid lactic cùng một vài chất khác *5, 15+.
1.4. Sản xuất H2 sinh học theo con đƣờng lên men tối
H2 có thể được sản xuất sinh học bởi vi sinh vật, và do những yêu cầu đã được đề cập ở trên cho nguồn năng
lượng mới, một số vi sinh vật sản xuất H2 đã được phân lập và nghiên cứu trong một vài năm gần đây *10, 33+. Tất cả
các phương pháp được biết đến của việc sản xuất H2 sinh học dựa trên các enzym xúc tác cho các phản ứng hóa học
+
2H + 2 e ↔ H2.

1.5. Một số loài vi khuẩn sản xuất hydro thông qua con đường lên men tối
1.5.1. Vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt
1.5.2. Vi khuẩn kị khí không bắt buộc
1.5.3. Vi khuẩn hiếu khí
1.6. Giới thiệu về Thermotoga neapolitana
1.6.1. Lịch sử
Thermotoga neapolitana được phân lập lần đầu vào năm 1986, tại trầm tích núi lửa biển nông gần Lucrino,
vịnh Naples, Italia *35+.
1.6.2. Phân loại
Thermotoga neapolitana thuộc:
Siêu giới: Vi khuẩn;
Ngành: Thermotogae;
Lớp: Thermotogae;
Bộ: Thermotogale;
Họ: Thermotogaceae;
Chi: Thermotoga [33]
1.6.3.Đặc điểm hình thái và sinh thái
•
Tế bào hình que, Gram âm, tồn tại riêng biệt hoặc theo cặp; dài: 1,1 - 1,5 μm, rộng: 0,6 μm
1.6.4. Đặc điểm hệ gen
•
NST dạng tròn
•
Hệ gen có 1800 kb
•
Tỉ lệ G + C là 41,3 % *35+
Đặc điểm tế bào và chuyển hóa
1.6.5. Hydrogenase của Thermotoga
+
Enzyme chịu trách nhiệm sản xuất hydro (H2) kết hợp hydro và proton tương đương (2H + 2e-) là những

hydrogenase (EC 1.12.99.6 và EC1.12.7.2) cũng tác động ngược lại vào quá trình oxy hoá của phân tử hydro
1.6.6. Những đặc điểm của phù hợp với việc sản xuất hydro
Trong chi Thermotoga, Thermotoga neapolitana được coi là “mạnh” nhất vì thích nghi với các điều kiện khác
nhau, các nguồn cacbon khác nhau và sản sinh ra lượng hydro cao nhất
1.7. Các nguồn nguyên liệu tái sinh
1.7.1. Chất thải sản xuất đường
Sản xuất đường là ngành công nghiệp quan trọng phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới. Trong quá trình sản
xuất đường nhiều loại chất thải khác nhau như mật đường, bã mía, và nước thải được tạo ra. Các loại rác thải là môi
trường thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật.
1.7.2. Chất thải sản phẩm sữa
Chất thải sản phẩm sữa, trong đó có sữa hoặc dư lượng pho mát và sữa, được biết là có một lượng lớn các
chất hữu cơ có giá trị COD dao động từ 5 và 50g/L (Seifert et al. 2010a).
1.7.3. Bã đậu
1.7.4. Glycerol

3


1.7.5. Rơm, rạ

CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Chủng giống
Chủng được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu là Thermotoga neapolitana DSM 4359 và được mua tại
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Đức
2.2. Các thiết bị và dụng cụ thực hiện thí nghiệm
2.2. 1. Các thiết bị
- Máy đo OD
- Hệ thống sắc kí khí GC
- Hệ thống sắc kí lỏng cao áp
- Nồi lên men 5L

2.2.2. Các dụng cụ
Bình serum 30ml, nắp cao su và nắp nhôm, kim tiêm để nuôi cấy kị khí. Gas-tight syringe (P/N 008160; 1MRVLL-GT; C04-A1831- Australia) để lấy mẫu khí cho GC, dụng cụ kẹp nắp nhôm Handy crimper for aluminum seal.
2.3. Môi trƣờng nuôi cấy
2.3.1. Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất đơn giản
2.3.2. Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất là bã đậu
Tiền xử lí bã đậu:
•
Bã đậu khi mang về sẽ được xử lí nhiệt 90o trong 15 phút để tiêu diệt các vi khuẩn tiêu thụ Hydro
•
Các chỉ tiêu COD , tổ ng Nitơ, tổ ng Photpho đươ ̣c phân tích ta ̣i Viê ̣n Hoá cơ bản - Trường Đa ̣i ho ̣c Bách khoa
Hà Nội
2.3.3. Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất là glycerol
2.3.4. Môi trường nuôi cấy với cơ chất là rơm, rạ
2.4. Phương pháp sục khí nitơ và kiểm soát pH làm tăng hiệu suất tạo thành hydro
Dòng khí nitơ tinh khiết được sục với tốc độ 50ml/phút ngay sau khi sản lượng hydro trong môi trường nuôi
cấy đạt mức tối đa.
2.5. Sản xuất hydro trên quy mô lớn sử dụng nồi lên men 5L
- 100ml chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM được nuôi cấy trong 900ml môi trường tinh khiết dưới
điều kiện nhiệt độ 75°C, pH7.5 sử dụng hệ thống điều khiển biotron. pH được giữ ổn định bằng việc thêm NaOH 2N.
2.7. Các phƣơng pháp phân tích
Sự phát triển của tế bào được đánh giá bằng khối lượng tế bào khô (dry cell weight - DCW) và mật độ tế bào
(opical density - OD600) đo bằng máy đo OD. Khí H2 trong headspace được lấy bởi gas-tight syringe, thể tích mỗi lần hút
là 100 µL (Australia) và được xác định bằng phương pháp sắc kí khí GC
Acid acetic và acid lactic được xác định bằng hệ thống sắc kí lỏng cao áp
Kế t quả thu đươ ̣c đươ ̣c xử lý bằ ng phương pháp thố ng kê sinh ho ̣c .

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu sự tạo thành hydro của chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 từ các nguồn đường đơn
3.1.1. Hoạt hóa, nuôi cấy chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359
Dựa vào kết quả đo OD và đo lượng khí hydro bằng máy GC, nhận thấy chủng vi khuẩn Thermotoga

neapolitana DSM 4359 đã sinh trưởng tốt và sinh ra khí hydro.
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đơn giản đến sự sản sinh hydro của chủng Thermotoga neapolitana DSM
4359
Có thể thấy: hàm lượng hydro cao nhất thu được ở nồng độ các cơ chất glucose, xylose đều là 5g/L, với hàm
lượng lần lượt là: 19.68 và 20.01(mmol/L).

4


3.1.3. Khảo sát một số nguồn nitơ phổ biến cho sự sản xuất hydro sinh học từ chủng vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt DSM
4359 và đánh giá khả năng sinh hydro
Do đó, có thể thấy rằng hàm lượng hydro cao nhất thu được ở nồng độ các nguồn nitơ là cao nấm men,
peptone và NH4 NO3 đều là 2g/L, với hàm lượng lần lượt là: 20.01; 19.27; 13.16 (mmol/L).
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất hydro của DSM 4359
o
Khi nhiệt độ nuôi cấy tăng từ 50 đến 75 C thì lượng hydro sinh ra và sự phát triển của tế bào tăng dần và đạt
o
giá trị cực đại ở 75 C, với sản lượng hydro thu được tăng từ 9.82 đến 20.09 (mmol/L) và giá trị OD tăng từ 0.15 đến
0.39
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới quá trình sản xuất hydro của chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM
4359
Khi giá trị pH tăng từ 5 đến 7.5 thì cho thấy có sự tăng tích lũy hydro nhanh chóng từ 6.56 đến 20.13 mmol/L
Sự phát triển của vi khuẩn thì đạt giá trị cực đại là OD600 = 0.39 khi giá trị pH là 7.
3.4. Nghiên cứu phƣơng pháp sục khí nitơ làm giảm áp suất khí trong bình nuôi cấy để tăng hàm lƣợng hydro
Hơn nữa, dưới điều kiện sục khí nitơ và kiểm soát pH, sự sản xuất hydro cao hơn nhiều so với không có sự sục
khí nitơ nhưng không bao gồm sự kiểm soát pH. Lượng khí hydro thu được khi áp dụng phương pháp sục khí nitơ và
kiểm soát pH tăng lên đến 2.98±0.1 mol hydro/mol glucose tiêu thụ sau nuôi cấy.
3.5. Hàm lƣợng acid hữu cơ đƣợc tạo trong quá trình sản xuất hydro của
T. neapolitana
Sau 24h nuôi cấy, pH môi trường giảm nhanh xuống dưới mức tối ưu (7-6.8), cùng với đó, tốc độ sinh hydro

cũng giảm dần. Các acid hữu cơ như acid lactic và acid acetic cũng được tạo ra liên tục song song với việc tạo hydro và
tốc độ sản xuất của chúng tăng nhanh từ 12 đến 36h nuôi cấy.
3.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất vô cơ tới quá trình sản xuất hydro của T. neapolitana
Vậy nồng độ tối ưu của KH2PO4, MgCl2.6H2O, Na2HPO4.12H2O, và NaCl lần lượt là 150mg/L, 20mg/L, 400mg/L
và 20g/L, một cách riêng rẽ.
3.7. Bước đầu thăm dò, nghiên cứu sự tạo thành hydro từ nguồn rác thải nông nghiệp và nguồn phụ phẩm của quá
trình sản xuất bio-diezel nhờ sự lên men kị khí của chủng vi khuẩn DSM 4359
3.7.1. Khảo sát và lựa chọn loại nguyên liệu đầu vào-phụ phẩm của quá trình sản xuất bio-diezel cho sự tạo thành
hydro
Hiệu suất hydro được tạo ra sau 49h đối với glycerol tinh khiết và phụ phẩm glycerol lần lượt là 1.02 ± 0.05
mol H2/mol glycerol tiêu thụ và 1.28± 0.06 mol H2/mol glycerol tiêu thụ.
3.7.2. Xác định các thành phần dinh dưỡng khác cần bổ sung cho quá trình sinh trưởng và quá trình tạo thành H 2
Khảo sát và lựa chọn loại nguyên liệu đầu vào - phụ phẩm của quá trình sản xuất sản xuất đậu phụ
Với cơ chất bã đậu thô, sản lượng hydro thu được tương đối thấp, đạt giá trị cao nhất là 5.2 mmol/L tại thời
điểm 42h đến 48h. Giá trị pH giảm dần từ 7.5 đến 5.7 sau 48h nuôi cấy.
Khi sử dụng bã đậu đã qua xử l{ làm cơ chất cho thấy rằng sản lượng hydro cao hơn nhiều so với lượng hydro
khi sử dụng bã đậu thô làm cơ chất. Lượng hydro thu được tăng lên khoảng 2.8 lần và đạt giá trị cao nhất là 14.6
mmol/L tại thời điểm 48h nuôi cấy
3.7.3. Khảo sát và lựa chọn loại nguyên liệu đầu vào là chế phẩm phân hủy lignocellulose từ rơm rạ cho sự tạo
thành hydro
3.7.3.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho tiền xử lý rơm rạ
o
o
o
Ở nhiệt độ trung bình từ 80 C đến 100 C/30 phút loại bỏ 3,0 - 7,0% lignin. Ở nhiệt độ 121 C loại bỏ đượ c tỷ lệ
lignin cao nhât́ là 55,79%.
o
Tăng thời gian tiền xử lý bằng dung di ̣ch ammoniac 10% từ 10 phút đến 60 phút ở 121 C đã thu được kết
quả trong 60 phút loại bỏ đượ c 65,21 % lignin. Hàm lượng glucose xử l{ là 57,07 %.
o

Tiền xử lý vớ i axit sulfuric 1% ở nhiệt độ 121 C trong thờ i gian 50 phút thì sẽ cho hiệu quả cao nhât́ và xử l{
đượ c 65,97% xylose.
3.7.3.2. Thành phần của rơm rạ sau tiền xử lý
Theo phương pháp 2.3.4, có được kết quả phân tích thành phần của rơm rạ như sau: 41% cellulose; 17.8%
lignin; và một số chất khác
3.7.3.3. Sản lượng hydro sử dụng cơ chất rơm rạ đã qua xử lý

5


Để xác định ảnh hưởng của cơ chất rơm rạ đến sản lượng hydro, chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong thời
gian từ 24 giờ đến 120 giờ sử dụng cơ chất rơm rạ thô và rơm rạ đã qua tiền xử l{ với nồng độ 5g/L.
tiền xử l{ rơm rạ giúp làm tăng sản lượng hydro một cách đáng kể so với khi không qua tiền xử l{. Sản lượng
hydro đạt mức cao nhất11.52 mmol/L, cao hơn gần 4 lần so với khi sử dụng rơm rạ thô làm cơ chất (3.28 mmol/L), với
85.4% cơ chất được tiêu thụ, mức độ chuyển hóa đường là 95.7% đối với xylose và 73% với glucose.
3.8. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro bằng phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch culture) sử
dụng nồi lên men 5 L
Để sản xuất hydro liên tục và làm tăng sản lượng hydro. Phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung sử dụng
nồi lên men 5L được thực hiện sử dụng 5g/L glucose làm cơ chất, pH được duy trì ở mức 7.0 bằng 2N NaOH, tốc độ lắc
400rpm, với 4 đợt bổ sung cơ chất tại các thời điểm 39, 57, 78 và 99h nuôi cấy
Tổng kết lại sau 5 pha nuôi cấy liên tục với 4 lần bổ sung cơ chất, tốc độ sản xuất hydro trung bình đạt 3.15
mmol/L/h.
3.9. Đánh giá khả năng sử dụng nguyên liệu đầu vào đối với quá trình sản sinh hydro của chủng vi khuẩn nghiên
cứuTrên quy mô nhỏ, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sử dụng bình với thể tích 120mL. Với pH tối ưu ban đầu được
đưa vào là 7.5 và nhiệt độ luôn duy trì ở mức 70°C
KẾT LUẬN
1. Đã hoạt hóa và nuôi cấy được chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 - chủng vi khuẩn kí khí ưa nhiệt
dùng để nghiên cứu sản xuất hydro sinh học. Đã xác định được nồng độ cơ chất ban đầu phù hợp
2. Đã nghiên cứu khảo sát được nguồn nitơ phù hợp là 2g/L cao nấm men, cho sản lượng hydro đạt 20.01
mmol/L. Đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 là nhiệt

độ 75°C, pH7.5, tốc độ lắc 100rmp.
3. Đã bước đầu tìm hiểu một số nguồn cơ chất tái tạo, sẵn có như bã đậu, phụ phẩm glycerol từ quá trình sản xuất
dầu diezel sinh học, từ rơm, rạ. Hàm lượng hydro đạt được lần lượt là: 15mmol/L; 20mmol/L; 11.5mmol/L, từ
các nguồn tương ứng.
4. Đã nghiên cứu sản xuất hydro trên quy mô 5L trong phòng thí nghiệm và nghiên cứu quá trình sản xuất hydro
bằng phương pháp nuôi cấy theo mẻ có bổ sung (fed-batch), hiệu suất thu được trung bình 3.15 mmol
hydro/mol cơ chất.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục đi sâu tìm hiểu về các điều kiện nuôi cấy chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 để tối ưu hóa
môi trường nuôi cấy nhằm thu được nguồn hydro lớn nhất.
Phát triển quy mô nuôi cấy từ nuôi cấy mẻ sang nuôi cấy liên tục trong thời gian dài để tìm hiểu khả năng sản
sinh hydro và có những ứng dụng thiết thực trên quy mô công nghiệp

INTRODUCTION
World in the early years of the 21st century is facing many problems that must be faced. In this issue of energy
shortage is a pressing issue globally and measures are needed urgentlyaddressed.
Fossil energy sources such as coal, oil, natural gas, it is not endless. With the evelopment of industry in the world as it
is currently the source of this energy will be depleted rapidly and will influence the development of society and human
life.
Furthermore, the characteristics of the fossil resources in the chemical composition contain the elements carbon,
hydrogen, oxygen, nitrogen, sulfur, particularly in the coal also accompanied by uranium and thorium radioactive
substance, so using this fuel source will cause a big impact on the environment [1].
In which the exploitation of biofuels as a way to generate energy is of particular concern now because of the high
performance, low cost and environmentally friendly [4]. Typically, the exploitation of bio-energy hydrogen - a clean
alternative energy source is extremely dominant in the future of anaerobic microorganisms Thermotoga neapolitana
DSM high thermophilic 4359 [20].

6

This is a new direction and promising but equally difficult and challenging. So I proceed to implement the project, "the
study of biological hydrogen production from agricultural waste by thermophilic bacteria Thermotoga neapolitana
DSM 4359" with the following objectives:
1. Develop a process of biological hydrogen production from a number of different substrates (glycerol, xylose,
glucose ...).
2. Given the results of exploration a source of agricultural waste as raw material for the process of biological hydrogen
production by fermentation of thermophilic anaerobic bacteria Thermotoga neapolitana DSM 4359.
CHAPTER 1 - OVERVIEW
1.1. Current status of the world's energy resources and the need to find alternative energy sources
1.1.1.Oil
Natural resources from the sea has become the focal point of international competition. Oil is still considered the
main energy source for the world by 2025.
1.1.2.NaturalGas
Along with oil, recently, natural gas has been regarded as one of the fuels have a huge demand in the world with
annual demand rising fastest
1.1.3.Coal
As fossil fuels are used in the world for a long time. Total coal reserves worldwide are estimated at 1,083 billion tons,
enough for about 170 years at current consumption
1.2. Hydrogen is an energy source strengths Vietnam
Hydrogen is a chemical element in the periodic system of elements with atomic mass by 1 In the free state and in the
normal conditions, hydrogen colorless, odorless and tasteless, density is equal to 1 / 14 air density. Combustion
temperature of hydrogen can be up to 3.000oC if burning in oxygen, the highest compared to all other gases such as
methane (CH4) reached 2.148oC, propane (C3H8) reached 2.385oC [32, 34].
1.3. Some methods of biological hydrogen production
1.3.1. Production of hydrogen by electricity
H2 production by electricity by an electric current through the conductive water (alkaline or polymer), resulting in
separation of H2 and H2O molecules into oxygen (O2). Hydro electricity is produced by a relatively high quality, not
carbon, sulfur, or compounds that are created in the process.
1.3.2. Hydrogen production by methane (SMR)
SMR process usually uses steam at high temperature (800oC) reacts with methane (CH4), forming H2 and

carbonmonoxide (CO). Then carbon monoxide reacts with steam to form carbon dioxide (CO2) and additional H2.
1.3.3. Hydrogen production by steam reforming of hydrocarbon oxidation
Hydrogen can be produced by oxidation of water vapor or solution of many different hydrocarbons such as
methanol, ethanol, glycerol, glucose, or use heat and catalysts
1.3.4. Dependent hydrogen fermentation light
As we all know, light, and water resources are abundant, so the problem is the hydrogen production photolysis of
water into H2 and biological O2 is a promising solution.
1.3.5.Darkfermentationhydrogen
In contrast to the bright hydrogen fermentation, fermentation regardless of light or dark fermentation hydrogen
production is a biological process can be done over a short period of time to form hydrogen gas, CO2 , acetic acid and
lactic acid and some other substances
1.4. Biological H2 production under dark fermentation pathway
H2 can be produced by biological organisms, and because of the requirements mentioned above for new energy
sources, a number of microbial H2 production has been isolated and studied in a few years here [10, 33]. All known
methods of producing bio-based H2 enzymes catalyze chemical reactions ↔ 2H + + 2 e-H2.
1.5. Some bacteria produce hydrogen through dark fermentation pathway
1.5.1.Strictanaerobes
1.5.2. Anaerobic bacteria are not required
1.5.3.Aerobicbacteria
1.6.About Thermotoga neapolitana
1.6.1.History
Thermotoga neapolitana was first isolated in 1986, in shallow marine sediments near Lucrino volcano, Bay of Naples,

7


Italy [35].
1.6.2.Classification
Thermotoga neapolitana under:
Super Men: Bacteria;

Industry: Thermotogae;
Grade: Thermotogae;
Ministry: Thermotogale
They are: Thermotogaceae;
Sub: Thermotoga [33]
1.6.3.Dac morphological and ecological
• Cells rod-shaped, Gram-negative, exist separately or in pairs; Length: 1.1 to 1.5 micron, width: 0.6 micron
1.6.4. Features genome
• NST circular form
• 1800 kb genome
• G + C ratio was 41.3% [35]
Features and cell metabolism
1.6.5. Hydrogenase of Thermotoga
Enzyme responsible for the production of hydrogen (H2) and hydrogen protons combine equivalent (2H + + 2e-) is the
hydrogenase (EC 1.12.99.6 and EC1.12.7.2) and opposite effects on the oxidation of molecular hydrogen
1.6.6. These characteristics suitable for the production of hydrogen
In spending Thermotoga, Thermotoga neapolitana is considered "strong" because most adapted to the different
conditions, different carbon sources and produces the highest amount of hydrogen
1.7. The recycled materials
1.7.1. Waste production line
Sugar production is an important industry spread worldwide. During production lines of different types of waste, such
as molasses, bagasse and waste water is generated. These wastes are suitable environment for the growth of
microorganisms.
1.7.2. Waste milk products
Waste milk products, including milk or cheese and milk residues, is known to have a large amount of organic matter
COD values ranged between 5 and 50 g / L (Seifert et al. 2010a).
1.7.3. Soybean Meal
1.7.4.Glycerol
1.7.5. Straw
Chapter 2 - MATERIALS AND METHODS

2.1.Strains
Isolates were selected to conduct the study was Thermotoga neapolitana DSM 4359 and was purchased at Deutsche
Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen (DSMZ), Germany
2.2. The equipment and instruments performed experiments
2.2.1.Thedevice
-GaugeOD
-GCgaschromatographsystem
-Ahigh-pressureliquidchromatography
-Cooker5Lfermentation
2.2.2.Tools
Average serum 30ml, rubber stopper and aluminum cap, needles for anaerobic culture. Gas-tight syringe (P / N 008
160; 1MR-VLL-GT; C04-A1831- Australia) to sample gas for GC, Handy tools crimper for aluminum clamp aluminum lid
seal.
2.3. Culture medium
2.3.1. Culture medium with simple carbon sources
2.3.2. Culture medium with carbon sources as bean dregs

8


Preprocessorbeangrounds:
• Soybean Meal will be bringing the heat treatment 90 ° for 15 minutes to kill the bacteria consume hydrogen
• The target COD, total nitrogen, total phosphorus concentrations were analyzed at the Institute of Basic Chemistry Polytechnic University of Hanoi
2.3.3. Culture medium with glycerol as carbon sources
2.3.4. Culture medium with the substrate straw
2.4. Aeration method to control nitrogen and pH increase performance form hydrogen
Pure nitrogen gas flow rate is bathed with 50ml / min immediately after the production of hydrogen in the culture
medium reached maximum.
2.5. Production of hydrogen on a large scale using 5L fermentor
- 100ml Thermotoga neapolitana DSM strains were grown in 900ml pure environment under temperature conditions

of 75 ° C, pH7.5 using Biotron control system. pH is kept constant by the addition of 2NNaOH.
2.7.Theanalyticalmethod
The growth of cells was assessed by cell dry weight (dry cell weight - DCW) and cell density (density opical - OD600)
was measured by a OD. H2 gas in the headspace was obtained by gas-tight syringe, a suction volume of 100 uL
(Australia) and is determined by means of gas chromatography GC
Acetic acid and lactic acid system is determined by high pressure liquid chromatography
The results obtained were processed by means of biostatistics.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1.
Bùi Thanh Huyền, “Bức tranh năng lượng thế giới”, Chuyên đề năng lượng- VnGG,
Chương 11.
2.
vật.
3.

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà (2009), Sinh trưởng và phát triển của vi sinh
Trần Vạn Thọ, “Phân loại sơ lược”, Chuyên đề năng lượng- VnGG, Chương 2.

Tài liệu tiếng Anh
4.
Tien Anh Ngo, Ha Thi Viet Bui, (2011), “Study on biohydrogen production from
various substrates by Thermotoga neapolitana DSM 4359”, VNU, J. Scen Nat Sci & Tech,
27 (2S), 292-296.
5.
Chieh-Lun Cheng, Yung-Chung Lo, Kuo-Shing Lee, Duu-Jong Lee, Chiu-Yue Lin,
Jo-Shu Chang (2011), “Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock”,
Bioresource Technology102, pp. 8514–8523.
6.

Duu-Jong Lee, Kuan-Yeow Show, Ay Sud (2011), “Dark fermentation on
biohydrogen production: Pure culture”, Bioresource Technology 102, pp. 8393–8402.
7.
Elsayed Elbeshbishy, Hisham Hafez, Bipro Ranjan Dhar, George Nakhl, (2011),
“Single and combined effect of various pretreatment methods for biohydrogen production
from food waste”, International journal of hydrogen energy 36, pp. 1379 - 1387.

9


8.

Guwy A.J., R.M. Dinsdale, J.R. Kim, J. Massanet-Nicolau, G. Premier, (2011),

“Fermentative biohydrogen production systems integration”, Bioresource Technology 102,
pp. 8534–8542.
9.
Jannesh, H.W., R. Huber, S. Belkin, K.O. Stetter, (1988),“sp. nov. of the extremely
thermophilic, eubacterial genus Thermotoga”, Arch. Microbiol.,150.
10.
Lars G. Ljungdahl, Michael W. Adams Larry L. Barton, James G. Ferr, Michael K.
Johnson, Biochemistry and Physiology of Anaerobic Bacteria.
11.
Li´vian Ribeiro Vasconcelos de Sa´, Marcone Augusto Leal de Oliveir, Magali
Christe Cammarota, Andrea Matos, Viridiana Santana Ferreira, (2011), “Simultaneous
analysis of carbohydrates and volatile fatty acids by HPLC for monitơring fermentative
biohydrogen production”, International journal of hydrogen energy, 36, pp. 5177 – 5186.
12.
Mi-Sun Kim, Dong-Yeol Lee, Dong-Hoon Kim, (2011), “Continuous hydrogen
production from tofu processing waste using anaerobic mixed microflora under hermophilic

conditions”, International journal of hydrogen energy, 36, pp. 8712 – 8718.
13.
Nima Nasirian, Morteza Almassi, Saeid Minaei, Renatus Widmann, (2011),
“Development of a method for biohydrogen production from wheat straw by dark
fermentation”, International journal of hydrogen energy, 36, pp. 411 – 420.
14.
Reith J.H., R.H. Wijffels and H. Barten, Bio- methane & bio – hydrogen, pp. 103 121.
15.
Pallavi Sinha, Anjana Pandey, (2011), “An evaluative report and challenges for
fermentative biohydrogen production”, International journal of hydrogen energy36, pp.
7460 – 7478.
16.
Patrik R. Jones (2008), “Improving fermentative biomass-derived H2-production by
engineering microbial metabolism”, International journal of hydrogen energy, 33, pp. 5122
– 5130.
17.
S.Van Ooteghem, P. H. Yue, S. Beer, Thermotoga neapolitana: A microaerophile
producing hydrogen in the presence of oxygen, National Energy Technology Laboratory.
18.
Shinsuke Sakai, Tatsuo Yagishita, (2007), “Microbial Production of Hydrogen and
Ethanol From Glycerol-Containing Wastes Discharged From a Biodiesel Fuel Production
Plant in a Bioelectrochemical Reactor With Thionine”, Biotechnology and Bioengineering,
98 (2).
19.
Suellen A. Van Ooteghem, Stephen K. Beer, Paul C. Yue, (2001), Hydrogen
Production by the Thermophilic Bacterium, Thermotoga neapolitana, National Energy
Technology Center, U.S. Department of Energy.
20.
Susan E. Childers, Madeline Vargas, Kenneth M. Noll, (1992), “Improved Methods
for Cultivation of the Extremely Thermophilic Bacterium Thermotoga neapolitana”,

American Society for Microbiology, 58 (12), pp. 3949-3953.

10


21.

Takesi Ito, Yutaka Nakashimada, Koichiro Senba, Tomoaki Masui, Naomichi Nishio

(2005), “Hydrogen and ethanol production from Glycerol –containing wastes discharged
after biodiesel manufacturing process”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 100 (3),
pp. 260-265.
22.
Tam Anh D. Nguyen, Jun Pyo Kim, Mi Sun Kim, You Kwan Oh, Sang Jun Sim
(2008), “Optimization of hydrogen production by hyperthermophilic eubacteria,
Thermotoga maritima and Thermotoga neapolitana in batch fermentation”, International
journal of hydrogen energy 33, pp.1483 – 1488.
23.

Tam-Anh D. Nguyen, Se Jong Han, Jun Pyo Kim, Mi Sun Kim, You Kwan Oh, Sang

Jun Sim (2008), “Hydrogen production by the hyperthermophilic eubacterium, Thermotoga
neapolitana, using cellulose pretreated by ionic liquid”, International journal of hydrogen
energy, 33, pp. 5161 – 5168.
24.
Tatsuo Yagishita, ShinsukeSakai, Bioelectrochemical Hydrogen and Ethanol
Production from Glycerol as a By-Product of BDF Production, National Institute of
Advanced Industrial Science and Technology (AIST).
25.
Thauer, R.K., K. Jungerman, K. Decker

(1977), “Energy conservation in
chemotrophic anaerobic bacteria”, Bacteriol. Rev., 41.
26.
Thiruchitrambalam Valliyappan (2004), Hydrogen or Syn Gas Production from
Glycerol Using Pyrolysis and Steam Gasification Processes, University of Saskatchewan
Saskatoon, Saskatchewan, Master thessis.
27.
You-Kwan Oh, Subramanian Mohan Raj, Gyoo Yeol Jung, Sunghoon Park, (2011),
“Current status of the metabolic engineering of microorganisms for biohydrogen
production”, Bioresource Technology, 102, pp. 8357–8367.
28.
Yung-Chung Lo, Yi-Chen Su, Chieh-Lun Cheng, Jo-Shu Chang, (2011),
“Biohydrogen production from pure and natural lignocellulosicfeedstock with chemical
pretreatment and bacterial hydrolysis”, International journal of hydrogen energy, 36, pp.
3955 – 3963.
29.
Chieh-Lun Cheng, Yung-Chung Lo, Kuo-Shing Lee, Duu-Jong Lee, Chiu-Yue Lin,
Jo-Shu Chang “Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock”, Bioresource.
Technol, (2011), 102, (18), 8514 – 8523.
30.
Reith J.H., R.H. Wijffels and H. Barten (2003), “Bio-methane &Bio-hydrogen”,
Dutch Biological Hydrogen Foundation
31.
David B. Levin, Richard Chahine, (2010), “Challenges for renewable hydrogen
production from biomass”, Inter J of Hydrogen Energy, 35, (10), 4962 – 4969.
32.
Suellen A. Van Ooteghem, Stephen K. Beer Paul C. Yue, (2001), “Hydrogen
Production by the Thermophilic Bacterium, Thermotoga neapolitana”Proceeding of 2001 of
Hdrogen program review.

11


33.

Tam-Anh D. Nguyen, Kyoung, , Mi Sun Kim, , Sang Jun Sim, (2008), “Thermophilic

hydrogen fermentation from Korea rice straw by Thermotoga neapolitana”, International
journal of hy drogen energy 35 (2009) 13392–13398
34.
Patrik R. Jones (2008), “Improving fermentative biomass-derived H2-productionby
engineering microbial metabolism”, International journal of hydrogen energy 33 (2008)
5122–510.
35.
Barry D. Solomon, Abhijit Banerjee “A global survey of hydrogen energy research,
development and policy”, Energy Policy 34 (2006) 781 – 792
36.

Pallavi Sinha, Anjana Pandey, (2011) “An evaluative report and challenges for

fermentative biohydrogen production, International Journal of hydrogen energy 36(13),
7460–7478.
37.

Duu-Jong Lee, Kuan-Yeow Show, AySu (2012) “Dark fermentation on biohydrogen

production: Pure culture”, Bioresource Technology 102 (2011) 8393–8402.
38.
Show K.Y. , D.J. Lee, J.H. Tay, C.Y. Lin, J.S. Chang (2012), “Biohydrogen
production: Current perspectives and the way forward”, International journal of hydrogen

energy, 37(20), 14983-15840.
39.
Angela A Abreu, Dimitar Kara kashev, Irini Angelidak, Diana Z Sousa and M
Madalena Alves (2012) “Biohydrogen production from arabinose andglucose using extreme
thermophilic anaerobicmixed cultures”, Biotechnology for Biofuels, 5(6).
40.
Martina Cappelletti, Giacomo Bucchi, Jocelia De Sousa Mendes, Andrea Alberini,
Stefano Fedi, Lorenzo Bertin and Dario Frascari, (2012) “Biohydrogen production from
glucose, molasses and cheese whey by suspended and attached cells of four
hyperthermophilic Thermotoga strains, Chemical Technology & Biotechnology, 87 (9),
1291-1301.
41.
Kuan-Yeow Show, Duu-Jong Lee, Jo-Shu Chang (2012) “Bioreactor and process
design for biohydrogen production”, Bioresource Technology
42.
Hui Wang, Zelun Zhi, Jian Wang, Shenghua Ma (2012) “Comparison of various
pretreatment methods for biohydrogenproduction from cornstalk”, Bioprocess Biosyst Eng
(2012) 35:1239–1245.
43.
Chin-Chao Chen, Biswarup Sen, Yeong-Song Chuang, Chia-Jung Tsai, Chyi-How
Lay (2012) “Effect of enfluent recycle ratio in a continuous anaerobic biohydrogen
production system”, Journal of Cleaner Production, 32, 236-243.
44.
Cortright RD. Hydrogen generation from biomass – derived Compounds Utilizing
aqueous – phasere forming. In:Vehicle Power and propulsion, 2005 IEEE conference;
September 2005.doi:10.1109/VPPC.2005.1554603.

12

45.

Chornet E, Czernik S. Renewable fuels: harnessing hydrogen. Nature 2002; 418;

964-7
46.
Kumar A, Jain SR, Sharma CB, Joshi AP, Kalia VC (1995); Increased H2 production
by immobilized microorganisms, World J Microbiol Biotechnol 11, 156-159

13