ỨNG DỤNG LOCUS PCR TRONG PHÂN BIỆT VI SINH VẬT

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM
Khoa Dược


CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ

ỨNG DỤNG LOCUS – PCR TRONG PHÂN BIỆT
VI SINH VẬT

Nhóm thực hiện

: Ngô Văn Cường
Nguyễn Ánh Hồng
Trần Thạch Thảo

Lớp

: Cao học 2015 - 2017

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS. Trần Cát Đông

TP.HCM - 2015


LỜI MỞ ĐẦU
Vi sinh vật (microorganisms) là những sinh vật nhỏ bé đến mức chỉ thấy
được chúng dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Từ xa xưa
người ta đã biết ứng dụng các vi sinh vật có ích (tuy chưa biết tới sự tồn tại của
chúng) để chế biến thực phẩm (như nấu rượu, làm tương, mắm, nước mắm…), ủ
phân, ngâm vỏ cây lấy sợi, trồng luân canh với cây họ đậu…; hoặc sử dụng các
biện pháp để ngăn chặn tác hại của vi sinh vật (như ướp muối thịt, phơi khô cá,

làm mứt…). Bên cạnh đó, cũng có những vi sinh vật có hại gây bệnh hiểm
nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm mặc dù chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ trong
thế giới vi sinh vật.
Định danh vi sinh vật ngày này là một đòi hỏi cấp thiết để hỗ trợ cho các ngành:
nông nghiệp, lâm nghiệp, y tế…. Có nhiều phương pháp truyền thống được sử
dụng trong nhiều nghiên cứu phân loại nhưng không có phương pháp nào tỏ ra
vạn năng thích hợp cho mọi đối tượng vi sinh vật, tính chính xác chỉ có thể đạt
được khi kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Ngày nay, những tiến bộ trong
sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và
nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Một yếu tố trong sự phát triển nhanh của sinh
học phân tử là tính bao quát đặc trưng của các kỹ thuật mới và sự theo đuổi táo
bạo các vấn đề mới tạo ra cơ hội áp dụng chúng. Phản ứng chuỗi polymerase
(polymerase chain reaction PCR) là một trong những kỹ thuật ứng dụng rộng rãi
nhất trong sinh học phân tử với những lý do sau: là một phương tiện nhanh, rẻ,
và đơn giản để tạo ra một số lượng tương đối lớn các bản sao phân tử DNA từ
một lượng nhỏ vật liệu DNA gốc, ngay cả khi nguồn DNA có số lượng tương
đối thấp.
Trong kỹ thuật PCR, MLST (multilocus sequence typing) được đánh giá là một
trong những kỹ thuật tốt nhất để phân loại kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn như:
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae và S.aureus. Ví dụ: Bartual
và cộng sử đã sử dụng kỹ thuật này để phân loại các chủng A. baumannii dựa
2


vào trình tự gen có độ dài từ 305 đến 513bP tại các vùng bảo tồn (conserved
regions) của 7 loại gen: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi, và rpoD. Kỹ thuật
MLST được đánh giá để phân loại kiểu gen tốt hơn kỹ thuật PFGE và RFLP và
là một trong số rất ít các kỹ thuật được gọi là “thư viện” để sắp xếp, phân loại và
được sử dụng trong các nghiên cứu dịch tễ học của chủng A.baumannii, qua đó
có thể xác định các chủng gây dịch, kháng kháng sinh, hay kháng độc tố nhằm

giám sát sự lây truyền chúng trong phạm vi quốc gia và thế giới. [6]
Để hiểu rõ hơn kỹ thuật MSLT trong việc định danh vi sinh vật, nhóm chúng tôi
đã lựa chọn thực hiện tiểu luận “Ứng dụng Locus – PCR trong phân biệt vi sinh
vật” dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Cát Đông.

3


MỤC LỤC

4


CÁC TỪ VIẾT TẮT
A

: Adenin

ARN

: Acid ribonucleic

DNA

: Desoxyribonucleic acid

dNTP

: Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

: Ethylene Diaminetetra acetic Acid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PEG

: Polyethylene glycol

RELP

: Restriction Length Fragment Polymorphism

rep – PCR

: Repetitive Sequence – Based PCR

PFGE

: Pulsed Field Gel Electrophoresis

MLSA

: Multilocus Sequence Analysis

MLST

: Multilocus Sequence – Typing

MLEE

: Multilocus enzyme electrophoresis

MST

: Minimum spanning tree

ST

: Sequence type

UPHMA

: Unweighted pair group method with arithmetic mean

5


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Quy trình nuôi cấy vi sinh vật...................................................................2
Hình 1.2: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ ...............................................................8
Hình 1.3. Quy trình RFLP – PCR để định danh vi sinh vật.....................................10
Hình 1.4. Quy trình rep-PCR trong định danh vi sinh vật........................................11
Hình 3.1. Nhiễm sắc thể đồ sau khi lai hóa...............................................................27
Hình 3.2. Biểu đồ mối liên hệ gene giữa 107 chủng dựa trên 6 đoạn gen...............30
Hình 3.3. Cây phân loài dựa trên các trình tự gen rpoA của 92 chủng Enterococcus.
Listeria monocytogenes được coi như là một nhóm bên ngoài.................................35

Hình 3.4. Cây phân loài dựa trên các trình tự gen pheS của 92 chủng Enterococcus.
Listeria monocytogenes được coi như là một nhóm bên ngoài.................................36
Hình 3.5. Cây xác định trình tự locus xây dựng cho các Streptococcus nhóm B....42

6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Các đoạn gen được sử dụng trong phân tích MLST................................28
Bảng 3.2. Thuộc tính các chủng trong 49 kiểu chuỗi xác định bởi các alen của 6 đoạn
gene.............................................................................................................................30
Bảng 3.3. Các trình tự mồi được sử dụng để khuếch đại và giải trình tự gen pheS và
rpoA........................................................................................................................33
Bảng 3.4. Số lượng dòng vi khuẩn Streptococcus nhóm B ở các quốc gia..............37
Bảng 3.5. Đặc tính của các locus trong hệ thống GBS MLST.................................41
Bảng 3.6. Chuỗi nucleotid mồi cho GBS MLST

41

7


I. TỔNG QUAN
1.1.
1.1.1.

Đại cương vi sinh vật [55]

Định nghĩa vi sinh vật
Vi sinh vật là những sinh vật đơn bào hoặc đa bào nhân sơ hoặc nhân thực có kích

thước nhỏ, không quan sát được bằng mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi. Vi
sinh vật bao gồm vi khuẩn (bao gồm cả cổ khuẩn), virus, nấm, tảo, nguyên sinh động
vật
1.1.2.
•
•

Đặc điểm chung của vi sinh vật
Kích thước nhỏ, kích thước vi sinh vật thường được đo bằng micromet
Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh. Phân giải hầu hết các loại chất có trên thế
giới, kể cả những chất rất khó phân giải, hoặc những chất gây hại đến nhóm
sinh vật khác. Bên cạnh khả năng phân giải, vi sinh vật còn có khả năng tổng
hợp nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp, trong điều kiện nhiệt độ, áp suất bình

•
•
•

thường.
Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh
Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị
Phân bố rộng, chủng loại nhiều. Số lượng và chủng loại thay đổi theo thời gian.
Hệ sinh thái của vi khuẩn phong phú, đa dạng, từ lạnh đến nóng, từ chua đến

kiềm, từ háo khí đến kị khí
1.1.3. Ứng dụng của vi sinh vật [3]
• Trong tự nhiên: tham gia vào quá trình phân giải các xác hữu cơ trong tự nhiên,
các chất thải công nghiệp và sinh hoạt
• Trong năng lượng: tăng sinh khối dầu hỏa, khí đốt, than đá.
• Trong công nghiệp lên men: sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất như acid,

enzym, cồn, các chất kháng sinh, acid amin, vitamin…
• Trong di truyền học: chuyển gen, DNA tái tổi hợp…
1.2.
1.2.1.
•

Định danh vi sinh vật
Mục đích của việc định danh [3]
Việc định danh vi sinh vật nhằm xác định nhanh chủng loài, đánh giá mức độ
nguy hiểm, khả năng lây truyền của vi sinh vật, nắm được các hình thái phát

•

triển của vi sinh vật nhằm đưa ra giải pháp hợp lý
Xây dựng cơ sở dữ liệu quan trọng trong nghiên cứu vacxin, đánh giá chất

lượng, vệ sinh, an toàn thực phẩm
• Định danh vi sinh vật ngày nay được đánh giá là một ngành kỹ thuật then chốt
hỗ trợ cho các ngành sản xuất như: nông nghiệp, lâm nghiệp, y tế, dược
phẩm…
1.2.2. Nguyên lý cơ bản của định danh vi sinh vật [3]
8


Trong định danh vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống, vi khuẩn được định danh
dựa vào đặc tinh hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn
lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng
như sắc tố tạo thành
Trong địnhdanh vi sinh vật bằng công nghệ phân tử, việc định danh cơ bản là sử dung
phương pháp so sánh. Để xác định một vi sinh vật chưa biết, ta so sánh mọi chuỗi của

nó tương ứng với chuỗi đã xác định. Sự tương đồng giữa hai chuỗi sẽ cho chúng ta kết
quả dương tính. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu cho các chuỗi then chốt và tính độc nhất
của nó sẽ bộc lộ đặc tính của vi sinh vật. Chuỗi được sử dụng sẽ vào hai trường hợp:
• Đoạn mẫu được trích từ một bản sao chủ động, thể hiện được mã vùng của hệ
gen
• Đoạn mẫu không hoạt động không giải được mã vùng của hệ gen.
Trong hai trường hợp trên, bộ gen không hoạt động có khả năng thích ứng tốt hơn nên
có khả năng thể hiện sự biến thiên cao hơn.

1.3. Định danh bằng phương pháp truyền thống [5], [54]
1.3.1. Các bước tiến hành
a. Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc ở đĩa thạch

Hình 1.1. Quy trình nuôi cấy vi sinh vật
9


b. Nhận diện đặc điểm khuẩn lạc điển hình
c. Nhuộm và đánh giá hình dạng, cách sắp xếp và tính bắt màu của vi

khuẩn
d. Thực hiện các thử nghiệm sinh hóa định danh và kĩ thuật kháng sinh đồ

Một số phản ứng sinh hóa thường dùng cho định danh
• Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrat: E. coli, Enterobacter
•
•

aerogenes
Thử nghiệm catalase

Thử nghiệm oxydase: Pseudomonas aeruginosa, Neisseria

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

gonorrhoeae
Thử nghiệm phân giải Ure
Thử nghiệm coagulase
Thử nghiệm idol
Thử nghiệm MR
Thử nghiệm VP
Thử nghiệm lên men đường
Thử nghiệm khử citrat
Thử nghiệm phân giải hồng cầu
Thử nghiệm khả năng di động
Thử nghiệm hóa lỏng gelatin

Các Kit thuốc thử dùng cho việc định danh: API20E KIT
Phân biệt bằng thực khuẩn thể: các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác
nhau
Phân biệt theo Typ huyết thanh: dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi
sinh vật

Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bactericin): loại vi khuẩn tạo ra loại
bateriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó
1.3.2. Ưu điểm
•
•
•

Đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô nhỏ
Tiết kiệm được chi phí
Định danh được các vi khuẩn thường gặp

1.3.3. Nhược điểm
•
•
•

Chỉ định danh được một số vi sinh vật có đặc trưng riêng
Khó nhận biết chính xác loài vi khuẩn
Tốn thời gian

10


1.4. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử [1], [2], [3], [4]
1.4.1. Phân tích acid nucleic
Kĩ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc
acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự DNA và
lai DNA
a. Phân tích DNA plasmid

Phương pháp phân tích bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid về kính thước,
tinh sạch plasmid và xử lý bằng enzyme cắt hạn chế, sau đó điện di trên gel agarose và
so sánh sự đa hình của các mảnh cắt để phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau.
• Tách plasmid theo các phương phá p: dùng Caeseium, KIT QUAGENE, …
• Điện di plasmid trên gel agarose: sau khi thu được plasmid thì phải tiến hành
kiểm tra trước khi phân tích kết quả điện di trên gel agarose để biết phổ plasmid
và kích thước của chúng
• Kỹ thuật dấu vân tay phân tích plasmid với enzyme cắt hạn chế: giúp phân biệt
sự khác nhau của các plasmid có cùng kích thước. Các plasmid từ các chủng
khác nhau có phổ khác nhau về các đặc điểm cắt bời enzyme cắt hạn chế
Ứng dụng: nghiên cứu chủng E.coli (O157: H7) gây bệnh từ thực phẩm
b. Phân tích DNA nhiễm sắc thể
Nguyên tắc: Phương pháp phân tích bao gồm việc tách DNA của nhiễm sắc thể và cắt
bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật khác nhau. Việc tách các
mảnh đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trường xung điện (PFGE =
Pulsed Field Gel Electrophoresis).
Chọn enzym cắt hạn chế: Kỹ thuật BRENDA, dựa vào kết quả nghiên cứu các vị trí
cắt bộ gen vi sinh vật
Kỹ thuật điện di trong trường điện từ: sự di động khác nhau của DNA chủ yếu phụ
thuộc vào kích thước, kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Kĩ thuật này
được ứng dụng cho các nghiên cứu phân biệt vi sinh vật ở mức độ loài
1.4.2. Phương pháp lai DNA
Nguyên tắc: DNA tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp
không cần xử lý với enzyme cắt hạn chế) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển

11


đến màng lai. Mẫu dò (probe) được chuẩn bị và lai với màng DNA ở trên. Kết quả
ghép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu DNA khác nhau.

Phép lai được tiến hành dựa vào cấu trúc sợi đôi DNA từ hai sợi đơn với các cầu liên
kiết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung. Mức độ lai sẽ phụ thuộc vào tính đặc hiệu (sự
tương đồng) giữa mẫu dò và mẫu gốc cũng như điều kiện cho phép lai thực hiện (nhiệt
độ, nồng độ muối, pH, tỷ lệ mẫu dò, kích thước mẫu dò)
a. Các bước trong phân biệt vi sinh vật dựa vào lai DNA
Chọn mẫu dò DNA: đôi khi không cần phải là toàn bộ gene mà chỉ là một đoạn gene
mã hóa cho một đặc tính đặc trưng.
Phương pháp đánh dấu DNA: trực tiếp (tạo tính hiệu dựa vào liên kết hóa trị của nhóm
tín hiệu với mẫu dò và thực hiện phép lai giữa mẫu nghiên cứu và mẫu dò) hoặc gián
tiếp (thực hiện phép lai giữa mẫu dò và mẫu DNA đích, phản ứng giữa nhóm chức
năng và protein bám đặc hiệu với nhóm chức tín hiệu thông báo và cuối cùng là tạo ra
tín hiệu từ nhóm chức tín hiệu)
Quá trình lai để định danh vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và
lai với chất mang
b. Phân tích RELPs với kĩ thuật lai DNA
Các phổ DNA phức tạp sau khi xử lý với enzyme cắt hạn chế sẽ được làm biến tính
và chuyển lên màng nitroxeluloza hay nylon. Màng sẽ được lai với mẫu dò thích hợp,
kết quả phổ phép lai sẽ rõ và không quá phức tạp do nó chỉ hiển thi các mảnh DNA bắt
cặp với mẫu dò. Mẫu dò có thể là đoạn DNA tách dòng từ một gene đã biết, đoạn DNA
ngẫu nhiên có chức năng không xác định hoặc đoạn ARN ribosom từ một loài sinh vật
nào đó (kĩ thuật ribotyping)
•

Kĩ thuật ribotyping: hữu hiệu cho việc định danh vi sinh vật do gen mã hóa cho
ARN ribosom có độ bảo thủ cao. Gen ARN ribosom được tổ chức thành các
operon mà các gen riêng rẽ mã cho các ARN kích thước 5S, 16S và 23S chúng
được các nhau bằng các đoạn DNA spacer không mã cho gene nào. Nếu dùng
mẫu dò hỗn hợp giữa 16S và 23S thì kết quả phép lai sẽ hiển thị các mảnh
tương ứng với phần của gen này trong khi dùng mẫu dò là đoạn của các gen đã
12

được tác dòng có thể đưa đến kết quả hiển thị cả phần gen tương đồng và chuỗi
spacer.
c. Ứng dụng
Lai DNA là một kỹ thuật quan trọng cho định type và nghiên cứu dịch tễ học nhiều
loại vi sinh vật khác nhau
1.4.3. Nhân gen và kĩ thuật giải trình tự DNA
Kĩ thuật lai DNA đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều
đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành
nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện được
với nhiều loài vi sinh vật hay virus hoặc trong các trường hợp khác cần có thời gian
dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho các kỹ thuật lai hay định type. Khó khăn
này được khắc phục bằng các làm tăng nguồn DNA đích một cách nhanh chóng bằng
kỹ thuật nhân gen PCR
1.4.3.1. Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction)
a. Định nghĩa PCR
Là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch là Phản ứng chuỗi
trùng hợp, hay "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh
học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử
dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên
cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di
truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định
huyết thống.
b. Đoạn mồi
Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn
ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường
là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của
sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm
bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm

khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của
sợi DNA mới.
13


Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ biến tính của nó (Tmmelting) phụ thuộc vào nhiệt độ biến tính của mồi, được định nghĩa là nhiệt độ dưới
lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ
biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên
DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn
bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80 °C sẽ gây ra
nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của
đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75 °C.
c. DNA mẫu: chứa đoạn DNA cần khuếch đại.
Nồng độ DNA mẫu phải nằm trong giới hạn quy định. Kích thước của DNA mẫu cũng
không được quá lớn (> 3 kb). Nồng độ DNA mẫu phụ thuộc từng loại kỳ thuật PCR.
d. DNA - polymerase enzyme: xúa tác cho việc khuếch đại DNA.
Ngày nay, các phản ứng PCR chủ yếu sử dụng các enzyme polymerase chịu nhiệt,
được gọi là Taq polymerase. Các enzyme này đa số có nguồn gốc từ vi khuẩn E. coli
hay các vi khuẩn không chịu nhiệt khác, được tái tổ hợp di truyền gen chịu trách
nhiệm sản xuất enzyme polymerase chịu nhiệt. Nhờ có enzyme polymerase chịu nhiệt
mà người làm thí nghiệm không cần mở nắp tube phản ứng để bổ sung enzyme
polymerase sau mỗi giai đoạn biến tính (94oC) của mỗi chu kỳ nhiệt. Bên cạnh đó,
enzyme polymerase chịu nhiệt cho kết quả PCR đặc hiệu hơn nhờ có thể thực hiện
được giai đoạn bắt cặp của mồi trên sợi khuôn ở nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu của mồi
thay vì phải luôn luôn để nhiệt độ bắt cặp mồi và nhiệt độ kéo dài sợi bổ sung ở 37 oC
như trong kỹ thuật PCR nguyên thủy.
e. Nguyên lý của PCR
Sử dụng nhiệt độ để làm biến tính sợi đội DNA thành hai mạch đơn. Sau đó ở nhiệt độ
thấp hơn mồi sẽ được gắn vào hai sợi đơn theo chiều nhất định. Tiếp theo DNApolymerase sẽ gắn vào sợi trống kéo dài dọc theo sợi DNA. Sau khi hoàn thành 1 chu
kỳ, sợi DNA mới tạo thành sẽ trở thành DNA mẫu cho những chu kỳ tiếp theo.

f. Qui trình PCR chuẩn

14


Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 1)
(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó
phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính
đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ
còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
(2) Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi
DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi
và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45-60 °C). Sử dụng sai nhiệt độ trong
giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một
cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.
(3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt
động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNApolymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài
mảnh DNA cần khuếch đại.

15


Hình 1.2: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ. (1) Nóng chảy ở 96°C. (2)Gắn mồi
ở 68°C. (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase). (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành.
Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi
lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.
g. Tối ưu hoá PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí nghiệm (vi
khuẩn, virus, DNA,...). Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA,
ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực

riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với
đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet.
Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục
16


đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác. Phản ứng có kiểm
soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được thực hiện, để
kiểm tra sự nhiễm bẩn.
h. Ứng dụng PCR
Phát hiện vi sinh vật. Tính ưu việt của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus
hay một tế bào vi khuẩn nào đó cũng đủ cho phản ứng xảy ra và khuếch đại tới mức có
thể phát hiện được trong thời gian ngắn.
Chuẩn bị DNA làm mẫu dò với số lượng lớn cho phép lai DNA. Các mẫu dò có thể
được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến hành phản ứng khuếch đại.
Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn các phương pháp đánh dấu truyền
thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt gãy (nick translation) hay đánh dấu với
mồi ngẫu nhiên (rDNA rDNAom primer labeling)
i. Các kỹ thuật PCR dùng trong định danh vi sinh vật
Kỹ thuật PCR - RFLP (Restriction Length Fragment Polymorphism): khai thác những
khác biệt trong trình tự DNA. Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến
hành kết tủa với ethanol. Kết tủa được hòa với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với
enzyme cắt hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong
một số trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phận giải cao hơn. Chú
ý rằng thông thường hoạt tính enzyme giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể
ước lượng 50% hiệu quả khuếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng

17

Hình 1.3. Quy trình RFLP – PCR để định danh vi sinh vật

Kỹ thuật rep – PCR (Repetitive Sequence – Based PCR): dựa trên nguyên tắc nhân các
đoạn gen lặp lại. Thuật ngữ rep – PCR là chỉ phương pháp chung sử dụng cặp mồi đặc
hiệu để nhân các chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Các
chuỗi lặp lại có độ bảo thử cao trong các đối tượng thuộc Enterobacteriaceae và một số
đối tượng khác. Có thể trực tiếp thiết kế cặp mồi cho các đoạn gen bảo thủ để thu được
kết quả dấu vân tay sau khi nhân gen dùng toàn bộ gen của các vi sinh vật có mang các
đoạn gen bảo thủ này. Sau khi điện di có thể phát hiện được trên agarose các đoạn gen
có kích thước khác nhau từ các nguồn vi sinh vật khác nhau. Phương pháp này dùng
cho phát hiện đa hình các đoạng gen chung cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn

18


Hình 1.4. Quy trình rep-PCR trong định danh vi sinh vật. Bước 1: Mồi repPCR gắn với những trình tự chuyên biệt lặp lại thông qua gen. Nhiều mảnh với
chiều dài khác nhau được khuếch trương. Bước 2: Những mảnh này có thể phân
lập dựa trên kích thước và trọng lượng . Một hồ sơ dấu vân tay rep-PCR được
thiết lập chứa nhiều dải với kích thước và cường độ đa dạng
Kỹ thuật MLST (Multilocus Sequence Typing): xác định dòng dõi vi khuẩn chỉ bằng
việc phân tích các trình tự nucleotide dữ liệu từ nhiều địa điểm của nhiễm sắc thể. Kỹ
thuật này được phát triển nhờ vào kỹ thuật điện di enzym đa locus (multilocus enzyme
electrophoresis, MLEE). Sự phát triển của kỹ thuật MLST thông qua xác định trình tự
nucleotide và cho phép phân tích dữ liệu di truyền chính xác của các thế hệ từ bất kỳ
locus trên nhiễm sắc thể của nhiều phân lập

19


Hình 1.4. Quy trình MLST trong định danh vi sinh vật

II. KỸ THUẬT MLST (Multilocus Sequence Typing)

2.1. Giới thiệu về MLST [11], [25], [29], [30], [31], [37], [38], [44]
Kỹ thuật MLST (Multilocus Sequence Typing) lần đầu tiên được đề xuất vào năm
1998 như là phương pháp định danh cho phép xác định các đặc tính rõ ràng của vi
khuẩn gây bệnh Neisseria meningitidis phân lập một cách tiêu chuẩn hóa, dễ dàng tái
thiết lập lại, và dễ thực hiện [29], [30].Kể từ đó, phương pháp này đã được áp dụng
cho một số lượng lớn và ngày càng tăng trên các vi sinh vật bởi các phòng thí nghiệm
y tế công cộng và các tổ chức nghiên cứu. Dữ liệu MLST chia sẻ bởi các nhà nghiên
cứu trên toàn thế giới thông qua internet, đã được khai thác thành công trong các ứng
dụng khác nhau, từ điều tra dịch tễ đến phân tích dân số và tiến hóa của vi sinh vật.
Kỹ thuật MLST (Multilocus Sequence Typing) được tiếp cận hiện nay được phát triển
nhờ rất nhiều vào kỹ thuật tiên phong multilocus enzyme điện di (MLEE), mà từ đó
20


đặt tên dựa vào tên gọi của MLEE [44]. Một sự phát triển khái niệm then chốt là sự
thừa nhận rằng vi khuẩn không nhất thiết phải có một cấu trúc dân số các dòng vô tính
[37], [38], dẫn đến nhận thức rằng công nhận mô hình trao đổi gien giữa các vi khuẩn,
và từ đó có thể xác định dòng dõi vi khuẩn chỉ bằng việc phân tích các trình tự
nucleotide dữ liệu từ nhiều địa điểm của nhiễm sắc thể. Sự phát triển của kỹ thuật
MLST thông qua xác định tự nucleotide và cho phép phân tích dữ liệu di truyền chính
xác của các thế hệ từ bất kỳ locus trên nhiễm sắc thể của nhiều phân lập [31]. Một lợi
thế của dữ liệu trình tự nucleotide là chúng có thể được phổ biến qua Internet, đặc biệt
là World Wide Web [11], [25].

2.2. Nguyên tắc [26], [45], [46]
MLST là một kỹ thuật truy tìm nhiều locus. Các phương thức đặc trưng phân lập cho
chủng loài vi sinh vật sử dụng các đoạn trình tự DNA của nhiều gen giữ
nhà (housekeeping gene). Gen giữ nhà (housekeeping gene) chỉ chiếm một tỉ lệ rất

nhỏ trên DNA, là một gen cấu trúc điển hình, chịu trách nhiệm mã hóa cho các sản
phẩm cần thiết cho sự tồn tại và chuyển hóa của tế bào, có tính đặc thù cho vi sinh
vật. Đoạn DNA gồm khoảng 450-500 bp của mỗi gen giữ nhà được sử dụng, vì chúng
có thể được lập trình tự chính xác trên cả hai sợi bằng cách sử dụng một chuỗi DNA
tự động. Đối với từng gen giữ nhà, các trình tự khác nhau có mặt trong một loài vi
khuẩn được xem như alen phân biệt, và với mỗi cô lập, các alen ở mỗi locus xác định
hồ sơ alen hoặc kiểu chuỗi (ST).
MLST so sánh trực tiếp trình tự DNA khác nhau trong một bộ gen giữ nhà và đặc
trưng cho chủng bởi hồ sơ alen độc đáo của mỗi chủng vi sinh vật. Các nguyên tắc
của MLST rất đơn giản: các kỹ thuật liên quan đến khuếch đại trình tự DNA bằng
PCR. Nucleotide khác biệt giữa các chủng có thể được kiểm tra tại số lượng gen khác
nhau phụ thuộc vào mức độ phân biệt mong muốn.
Các quy trình của MLST bao gồm: 1) thu thập dữ liệu, 2) phân tích dữ liệu và 3)
phân tích trình tự multilocus. Trong phần đầu tiên, chẩn đoán xác định biến thể thu
được bằng cách xác định trình tự nucleotide của đoạn gen. Trong phân tích dữ liệu tất
cả các chuỗi duy nhất được gán các số alen và kết hợp thành một hồ sơ alen và được
gán một kiểu chuỗi (ST). Nếu các alen mới và ST được tìm thấy, chúng được lưu trữ
21


trong cơ sở dữ liệu sau khi xác minh. Trong phần cuối cùng của MLST mối liên hệ
của các phân lập được thực hiện bằng cách so sánh hồ sơ alen. Các nhà nghiên cứu
làm nghiên cứu dịch tễ học và tiến hóa bằng cách so sánh ST của các phức hợp vô
tính khác nhau. Một tập hợp lớn các dữ liệu được tạo ra trong quá trình xác định trình
tự, sau đó phần mềm tin học được sử dụng để sắp xếp, quản lý, phân tích và hợp
nhất tất cả các dữ liệu sinh học.
Để cân bằng giữa thời gian và chi phí và hiệu lực kết quả chấp nhận được khoảng
bảy đến tám gen nhà giữ được thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm.
Trích dẫn Staphylococcus aureus là một ví dụ, bảy gen giữ nhà được sử dụng trong
kỹ thuật MLST. Những gen này bao gồm kinase carbamate (arcC), dehydrogenase

shikimate (aroE), glycerol kinase (glpF), guanylate kinase (gmk), acetyltransferase
phosphate (PTA), isomerase triosephosphate (tpi) và acetyl coenzyme A
acetyltransferase (yqiL) theo quy định của website MLST. Tuy nhiên, cũng có khi
mười gen giữ nhà sẽ được sử dụng. Như đối với vi khuẩn Vibrio vulnificus, các gen
giữ nhà được sử dụng là glucose-6-phosphate isomerase (glp), gyrase DNA, tiểu đơn
vị B (gyrB), malat-lactate dehydrogenase (mdh), methionyl-tRNA synthetase (metG),
phosphoribosylaminoimidazole synthetase (purM), threonine dehyrogenase (dtd),
decarboxylase diaminopimelate (Lysa), tiểu đơn vị alpha transhydrogenase (pntA),
dihydroorotase (pyrC) và tryptophanase (tnaA). Như vậy cả về số lượng và loại gen
giữ nhà dùng trong kỹ thuật MLST có thể khác nhau từ loài này sang loài.
Đối với mỗi gen giữ nhà, các trình tự khác nhau được phân công như alen và các alen
ở locus cung cấp một hồ sơ alen. Một loạt các hồ sơ sau đó có thể là dấu hiệu nhận
biết cho định danh các chủng vi sinh vật. Các trình tự khác nhau tại ngay cả một
nucleotide đơn được gán như là alen khác nhau nhưng không có giá trị để xem xét sự
khác biệt số lượng nucleotide giữa alen, vì vậy chúng ta không thể phân biệt được sự
khác nhau ở nhiều địa điểm nucleotide là kết quả của nhiều đột biến điểm hoặc một
trao đổi tái tổ hợp đơn. Một số lượng lớn của các alen tiềm năng tại mỗi locus cung
cấp khả năng phân biệt hàng tỷ hồ sơ alen khác nhau, và một chủng có alen phổ biến
nhất tại mỗi locus sẽ chỉ được dự kiến xảy ra bởi cơ hội khoảng một lần trong 10.000
chủng. Mặc dù MLST cung cấp khả năng phân biệt cao, sự tích tụ của những thay đổi
nucleotide trong gen giữ nhà là một quá trình tương đối chậm và hồ sơ alen của một
22


chủng vi khuẩn là đủ ổn định theo thời gian nên phương pháp này là lý tưởng cho
nghiên cứu dịch toàn cầu.
Mối liên hệ của các phân lập được hiển thị như một dendrogram xây dựng bằng cách
sử dụng ma trận của sự khác biệt giữa các cấu hình cặp alen của họ, eBURST hoặc
một cây bao trùm tối thiểu MST (Minimum spanning tree). Các dendrogram chỉ là
một cách thuận tiện để hiển thị những phân lập mà có cấu alen giống hệt nhau hoặc

tương tự có thể được giả định là có nguồn gốc từ một tổ tiên chung; các mối quan hệ
giữa phân lập mà có sự khác nhau ở hơn ba trong số bảy loci có thể sẽ là không đáng
tin cậy và không nên được đưa đến suy luận phát sinh loài của họ. [45] [46] Các
MST kết nối tất cả các mẫu trong một cách như vậy mà khoảng cách tóm tắt của tất
cả chi nhánh của cây là tối thiểu. [26]

2.3. Quy trình của kỹ thuật MLST
2.3.1. Nguyên liệu
2.3.1.1. Thu thập cô lập (Isolate Collection)
Một mẫu đại diện của các dân số vi khuẩn mà phương pháp này sẽ phát triển nghiên
cứu
2.3.1.2. Preparation of Killed Cell Suspensions
1.
2.
3.
4.
5.

Đĩa nuôi cấy vi khuẩn (Freshly grown plates of bacterial cultures)
Bồn nước sôi (Boiling water bath)
Đệm PBS (Sterile phosphate-buffered saline )
Ống (Eppendorf) 1,5- 2,0 ml (không dùng ống hai lớp hoặc đi men theo).
Băng gạc vô trùng.

2.3.1.3. PCR khuếch đại đoạn gene
1.
2.
3.
4.
5.

6.
7.
8.

Mẫu DNA.
Mồi chuyển tiếp và đảo ngược
DNA polymerase enzyme (Taq polymerase).
Deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP).
Đệm (cung cấp các enzyme).
Magnesium chloride (cung cấp các enzyme).
Đĩa vi kháng với nhiệt độ cao hoặc ống công suất microfuge 0,6 ml.
Thermocycler.

2.3.1.4. Gel điện di [14]
23


1.
2.
3.
4.

Agarose.
Ethidium bromide: 10 mg / mL dung dịch.
Tải đệm.
TBE đệm: Một nước dùng 10X (0.89M Tris-HCl, 0.89M axit boric,

20 mM axit ethylenediaminetetraacetic [EDTA], pH 8,3.
5. Nguồn điện.
6. Transilluminator UV.

2.3.1.5. Sản phẩm PCR tinh sạch
1.
2.
3.
4.
5.

1,5 ml ống eppendorf.
Polyethylene glycol (PEG) 8000.
Natri clorua.
Ethanol 70%.
Máy ly tâm.

2.3.1.6. Trình tự phản ứng
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Sản phẩm tinh khiết PCR (DNA template).
Mồi chuyển tiếp và đảo ngược.
Kit trình tự chứa DNA polymerase và dNTP dán nhãn.
Đĩa vi hoặc ống 0,6 µl.
Thermocycler
DNA sequencer.

2.3.1.7. Tiêu chuẩn hóa giải trình tự sản phẩm
1.

2.
3.
4.

1.5-mL Eppendorf.
3M sodium acetate, pH 4.6.
Ethanol, 95% DNA 70%.
Máy li tâm

2.3.2. Phương pháp
2.3.2.1. Cố định những tế bào chết
1. Đun nóng nước cho đến khi sôi.
2. Dán nhãn ống eppendorf vít trắng rõ. Đảm bảo rằng các nhãn này sẽ

không bong ra trong các bước gia nhiệt.
3. Bôi 0,5 ml PBS trong mỗi ống eppendorf.
4. Làm cho hệ thống treo rất dày của vật bằng cách quét khuẩn lạc từ mỗi

đĩa nuôi cấy bằng cách sử dụng một tăm bông hoặc một vòng lặp và
đánh bông PBS trong ống.
5. Đặt ống trong bồn tắm nước sôi và để trong 20 phút.
24


6. Lưu trữ các mẫu ở -20 °C .Về nguyên tắc, những mẫu này là đã chết và

ổn định ở nhiệt độ phòng. Một khi thiếu tính khả thi đã được khẳng định,
chúng có thể được xử lý trong phòng thí nghiệm và phân phối như vật
chất không do nhiễm trùng
2.3.2.2. Khuếch đại DNA

1. Khởi động: Các hỗn hợp phản ứng được làm nóng đến 94 °C trong 1

phút để làm biến tính DNA.
2. Các bước sau đây được lặp đi lặp lại cho 25-30 chu kỳ:
a. Biến tính ở 94°C trong 30 s.
b. Ủ mồi ở 50 - 60°C trong 30 s. Điều này cho phép các cặp mồi
để ràng buộc vào DNA mẫu.
c. Mở rộng ở 72°C. Trong bước này, các polymerase Taq sử
dụng các dNTP để tổng hợp một sợi DNA mới bổ sung cho mẫu.
Thời gian của bước này phụ thuộc vào độ dài của đoạn đó là
được khuếch đại.
3. Kéo dài cuối cùng ở 72°C trong vòng 5-10 phút để đảm bảo rằng tất cả

các đoạn được hoàn toàn mở rộng.
4. Phản ứng nên được tổ chức tại 4°C cho đến khi loại bỏ khỏi Máy PCR
2.3.2.3. Gel agarose điện di
1. Chuẩn bị 1% (w / v) agarose gel bằng cách thêm 1 g agarose đến 100 mL
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

đệm TBE.
Đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi sôi.

Để lại nó để làm mát trong 2-3 phút.
Thêm 5 µL của ethidium bromide.
Lắp bàn chải gel và chờ đợi cho đến khi là rắn.
Điền vào các bể điện di với TBE.
Chèn gel vào bể và loại bỏ các lược.
Trộn 5 µL của PCR sản phẩm với 2 µL bốc đệm.
Kết nối các bồn chứa gel với nguồn điện.
Đặt điện áp đến 140 V và để nó chạy khoảng 15-20 phút.
Hiển thị gel sử dụng một transilluminator UV.

2.3.2.4. Tinh sạch Amplicons
25