Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học bùi xuân đồng, nguyễn huy văn

BÙI XUÂN ĐỒNG
NGUYỄN HUY VĂN

,. ‫؛؛؛‬٠‫ﰐ‬
‫ﺓ‬.‫؛‬

٠

DÙNG TRONG
CÔNG n g h ệ
S.NH HỌC
e O ậ *KcotỶ í<ị*i ã

t k ٧ ‫ م ح‬٠‫ ء‬ả

dc*ị

‫ م ﺀ‬٠

‫ ب ش ع ء‬،‫ية‬

X in vui long:

٠
٠
٠

Khôĩig xé sách
Không gạch. viết, vẽ tên sách

THU VIEN DAI HOC NHA TRANG

3000011696
[

٠

/

‫ج‬

NHÀ XUẤT BẢN
KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT


BÙI XUÂN ĐỒNG, NGƯVÊN HƯY VĂN

VI NẤM
DÙNG TRONG
C Ô N G NGHỆ SINH HỌC

N H À X U Ấ T BẢN KHOA HỌC VẢ KỸ T H U Ậ T
HẢ NÔI - 20»0


Lòi nói đầu

Hiện nay ở nước ta, tài liệu về sinh học và công nghệ sinh học quá
thiếu thốn. Chúng tôi viết tập sách này nhằm gdp phần nhỏ khắc phục
tình hình trên.
Tập sách gồm 3 chương độc lập :

Chương 1 : Kỹ thuật lên men aOatoxin
(Thạc sĩ Nguyễn Huy Văn,
GS.TS. Bùi Xuân Đổng)
Chương 2 : Công nghệ biến đổi sinh học
(GS.TS. Bùi Xuân Đổng)
Chương 3 : Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học
(GS.TS. Bùi Xuân Đồng)
Nội dung trên được ١áết nhằm phục vụ việc đào tạo trong và trên
đại học ở các trường cố chuyên ngành vi sinh vật, làm tài liệu tham
khảo đối với các cán bộ giảng dạy, nghiên ổứu sinh học, công nghệ sinh
học, những người làm công tác chuyên môn có liên quan và các bạn đọc
quan tâm đến các chuyên ngành này. Chúng tôi rất mong nhận được sự
giúp đỡ, gdp ý kiến của bạn đọc.

Bùi Xuân Đồng, N gu yến Huy Văn


MỤC LỤC
Lời nói đầu
Chương ĩ - Ký th u ậ t lên m en aA atoxin

1. Chọn lọc các chủng vi nấm có khả năng tạo thành các
aílatoxin Bl, B2, Gl, G2
2. Lên men và chiết xuất aAatoxin
Tài liệu tham khảo chính
Chươnỵ ĩĩ - C ông n gh ệ biến đổi sin h học

1. Những vi sinh vật cd hoạt tính biến

đổi sinh học

2. Những phương pháp sử dụng trong công nghệ biến đổi sinh
học
..3. Cơ chất biến đổi sinh học
4. Phàn ứng biến đổi steroid của các loài vi sinh vật
Tài liệu tham khảo ch ín h
CìĩươtĩỊ» /// ~ Vi nấm d ù n g trong cô n g n gh ệ sinh học

1. Nấm tiếp hợp dùng trong công nghệ sinh học
2. Nấm bất toàn dùng trong công nghệ sinh học
Tài liệu tham khảo chính


ChuơỉiịỊ ỉ

KỸ THUẬT LẾN MEN AFLATOXIN

Từ năm 1960, loài vi nấm Aspergillus flavus được phát hiện là
nguyên nhân gây chết khoáng 10 vạn gà tây con ở nước Anh với các tổn
thương ở gan (gan bị hoại tử, chảy máu trong gan, tăng sinh ống mật,
v. v. ), và tiếp theo đó phát hiện mycotoxin do loài vi nấm này tạo thành
trong thức àn và trong môi trường nuôi cấy cũng gây cùng loại tổn
thương gan ở súc vật thí nghiệm và gia cầm, súc vật chăn nuôi khác
(vịt con, chuột, thỏ, khỉ, lợn, bò, cừu, V.V.). Mycotoxin đổ được chiết xuất
tinh khiết và được gọi là aílatoxin. Nám 1961, nghĩa là chỉ một nám sau
khi phát hiện aflatoxin, mycotoxin này đă được xác định là ngoài bệnh
cáp tính no'i trên, còn cd khả năng gây ung thư gan với liểu lượng nhỏ
ăn nhiểu ngày ở các động vật thí nghiệm. Các điều tra dịch tễ học ở
các vùng dân cư khác nhau trên thế giới cũng cho thấy ở các vùng mà
khẩu phần thức ăn hàng ngày co' chứa một hàm lượng aflatoxin tương

đoi cao, tỷ lệ người bị bệnh ung thư gan cao hơn ở các vùng khác.
Aspergillus flavus Link ex Fries cùng với loài A.parasiticus Speare đả được
xác định là !hai loài vi nấm cd tỷ lệ chủng tạo thành aflatoxin cao nhất
trong môi trường nuôi cấy, cũng như trên nhiéu loại thực phẩm, ngũ cốc
(lạc, đỗ tương, ngô, gạo, lúa mi, v.v.) và cả trên một số vị thuốc nam,
thuốc bắc nguổn gốc thực vật như n/^ư tất (radix Achyranthis bidentatae),
liên nhục (semen Nelumbii), nhân sâm (radix Ginseng), v.v. bị mốc
íCỈ.Moreau 1974, B.X.Đổng và ct. 1998).
Vài thí dụ vể kết quả nghiên cứu khả năng gây ung thư gan thực
nghiệm trên súc vật và điểu tra dịch tễ học (bảng 1.1 và bảng 1.2) :


Bảng LI.

Kết quả thực nghỉệm trên chuột vê khả nang gây ung thư gan
của aOatoxín (Theo B.X.Đồng, 1976)

Liíợng aílaíoxin trong thức ăn ‫ ﺍ‬n 1g
aflatoxinikg ch٧ ột ١

Thời gian ổn

Tỳ ỉệ ch٧ ột bi.

(ngày)

^ng thư gan

5.0

370

14/15

35

XO

340
294

11/15
5/9

1.0

223

8/15

0)2
0.1

360

2/10

361
384

1/10

0.005

0/10

Bảng 1.2, Tỷ lệ dân sổ bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxln trung binh
cỏ tren thực phẩm (Theo Alaln Rellly, 1993).
Tên nước hoặc uùng

Hàm lượng aílatoxín

Số người mắc ung thư

trong thực phổm

gan trên 100.000

iv، y‫؛‬kg ١

ngườiỉnâm

Vùng cao Kenya

0.1

1)2

Song Kha (Thái Lan)

0.2

2.0

Thảo nguyên vừìg cao (Swaziland)
Vừtg cao trung bình Kenya

0.2

2 ‫ا‬2

0‫ا‬2

2‫ا‬5

Thảo nguyên cao trung bình (Swaziland)

0.3

3.8

Vùng thấp Kenya

03

40

Ratbari (Thái Lan)

1,6

4 ‫ا‬0

Thảo nguyên vừ ١g thấp (Swaziland)
Môzămbic

1.5
7.8

9.2
13.0

Về hda học, aílatoxin ĩà nhom các hợp chất co ĩihân difuranocumarin.
N^íờ‫ ؛‬ta đả phát h‫؛‬ện và xác định cấu trUc dược 16 hợp chất này, kể
cả các dẫn chất dã biến đổ‫ ؛‬trong cơ thể dộng vật (hỉnh 1 .1 . và bàng
1 .:1).
٥

H ì ắ 1.1.

6

Rs

cấu trúc há, học cUn các aflatoxin


Ban}* 1.3. Cac nhom hi'ia chiic cua cat. ailatoxin
A Hdtoxin

«3

«4

«5

X

B١

H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
OH
OH
OH
H

CH3
CH3
CH3

CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H
CH3
CH3
CH3
CH3

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
OH
0
0
0
0
OH

H2
.OCH2 (lacton)
Hz
-OCHj (lacton)

Gi
^2
.2
82 a
G2a
1- rnethoxy-B ١
2- m ethoxy-B ١
2-ethoxy-Bi
2-ethoxy-Gi
Aflatoxincol (Ro)

P١
M2
BGM1
Dihydro.

H2
-OCHj (lacton)
H2
H‫؛‬
-OCHj (lacton)
Hz
H2
H2

H‫؛‬
-OCH2 (lacton)
Hz

aflatoxin

Trong 16 aflatoxin da diidc phat hien, ngiidi ta dac bi§t chu y den
cac aflatoxin B ٠, G|, B2 va G2 vi do' la 4 aflatoxin cd doc tinh cao nhat,
dong thdi la cac aflatoxin duac sinh ra v6i so liidng nhieu nhat ck trong
tii nhien cung nhii trong moi triidng nuoi cay.
Ve Cd che gay benh, cac ket qu^ thi nghiem in vivo va in vitro cho
thay aflatoxin lien ket vdi ADN trong nhan te bao (mot phan tif gam
aflatoxin cd moi li§n ket vdi 600 phta tii gam ADN). Su li§n k^t nay
gay lie che enzim polymeraza cua ARN. Mat khac, tac dung han che trong
tong hdp ARN va tac dung dc chd' polymeraza t-ARN la cac nguyen nhan
lam giAm sut tong hdp protit trong te bao. NgUdi ta cung da chufng minh
rang vong a, ^-lacton khong bao hoa cd trong phan td aflatoxin lam cho
hdp chat nay cd boat tinh gay ung thu, va cung chinh vong lacton nay
gay lie che tong hdp ADN nhan te bao, do dd lam roi loan sii tang
trudng binh thudng cua te bao (M.F. Nexterin va V.I.A. Vixxarionova,
1971).
Nhu chung ta biet, cung nhu cac chat ddc hai khac, aflatoxin qua
dudng tieu hda vao mot so te bao gan, tich tu va bi chuyen hda thanh
cac d^n chat gidm ddc tinh hay mat han ddc tinh, d6ng thdi, vdi mot
ham liidng aflatoxin nhat dinh, cac te bao nay bi td’n thiidng nhii tren
vita ndi, cd nghia la gan da bi ton thiidng.


Ò Việt Nam, thông báo khoa học đầu tiên vể phát hiện aflatoxin
(từ một số chủng vi nấm dùng.để lên men sản xuất nước chấm bằng đỗ

tương) vào năm 1970. Từ đd đến nay, nhiều công trinh nghiên cứu về
aflatoxin, các mycotoxin khác và các loài vi nấm tương ứng đã được thực
hiện về điều tra phát hiện trên lương thực, thực phẩm, dược liệu, vẽ lên
men aflatoxin về thực nghiệm trên súc vật thí nghiệm, về dược lý học,
vế thú y v.v.
Hầu như tất cả các thí nghiệm, các công trình nghiên cứu ndi trên
đều cẩn cd aílatoxin tinh khiết. Mặt khác, các phương pháp kiểm nghiệm
aflatoxin hiện nay trên thế giới đểu cần đến aflatoxin chuẩn. Giá loại hda
chất chuẩn này rất đắt (vài nghìn USD/lg), nước ta đang hoàn toàn phải
nhập từ nước ngoài. Vì vậy, việc từng bước biểu biết và nấm \âifng công
nghệ sàn xuất loại hda chất này là một trong các mục tiêu cùa công
nghệ sinh học nước ta.
Cũng như đối với các sản phẩm lên men vi sinh vật khác (enzini,
acid amin, acid hữu cơ, thuốc kháng sinh, V.V.), việc nghiên cứu sản xuất
aflatoxin gồm các giai đoạn sau :
- Chọn lọc các chủng cd khả năng tạo thành các aflatoxin Bl, B2,
Gl, G2, trước hết là các aflatoxin Bl, Gl.
٠ Căn cứ vào các đặc điểm sinh học của loài Aspergillus flavus (hoặc
A. parasiticus) như nhu cẩu dinh dưỡng, nhu cầu oxy, pH môi trường,
nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, V.V., xác định các thông số lên men tối ưu.
- Lên men và chiết xuất aflatoxin.
- Kiểm tra sản phẩm
I. CHỌN LỌC CÁC CHỦNG VI NẤM
AFLATOXIN BI, B2, G l, G2

có KHÀ NĂNG TẠO THÀNH CÁC

Như trên đã trình bày, các aílatoxin Bl, Gl, B2, G2 là các aflatoxin
cd độc tính cao nhất (giảm dần theo thứ tự), nghỉa là cd khả năng gây
bênh lớn nhất, đặc biệt là các aflatoxin Bl, Gl. Vĩ vậy trừ các nghiên

cứu riêng biệt, việc kiểm nghiệm aflatoxin đối với lương thực, thực phẩm,
thức ăn gia súc, gia cầm thông thường chỉ tiến hành với các aflatoxin
Bl, Gl, do đd nhu cầu chất chuẩn về aflatoxin chủ yếu là 2 aflatoxin
này.
Chúng ta cũng biết rằng cho đến nay Aspergillus flavus và A.
parasiticus được xác định là 2 loài cd khả năng tạo thành aflatoxin cao
nhất. Hai loài vi nấm này, đặc biệt là loài A.fl.avus cd tỷ lệ số chủng
tạo thành aflatoxin lớn, đổng thời cd một sô chủng tạo thành nhiều

8


aflatoxin, nghia là cơ khả nàng cho hiệu suất lên men cao. ٧ ‫ ؛‬lẽ dơ, khỉ
chọn các chơng vi nấm dể lên men aíìatoxin, dặc bỉệt la dể lên men
aflatoxin Bl, n^íời ta phân lập và chọn lọc các chủng thuộc loài A.flavus.
Các chủng thuộc loài A.parasiticiis thường tạo thành dồng thOi các
aflatoxin Bl, a i . Thỉ dụ các chhng Aspergillus flavus NRRL 3357 và
Aspergillus parasiticus NRRL 2999 cha một trung tâm nghiên cứu nOng
học ở Mỹ tạo thành cổc aflatoxin Bl, GI nuOi cấy trên lạc (bầng 1.4).
Bíìng 1.4. Lượng ailatoxin đUík: tạo thàiih Ы)1 các chủng Aspergillus flavus
NRRL 3357 va A.parasiíicus NRRL 2999 (nhỉệt độ nuOí cấy 25٤٠c,
íheo Noris KimiirU) 19»8)
!

('ỚC chùng vì nám

Ailatoxin Bì ippm ١

AílaToxin (M ịppm)

Số r١gày nuôi cây

Số ngày nuôi cấy

3

5

7'

9

NRRL 3357

4‫ا‬8

63‫ا‬9

43,8

37)6

Aspergillus parasiticus
NRRL 2999

3‫ا‬1

67,4

38,7

30,0

3

5

7

9

8,7

110)3

90,6

50,7

Aspergillus HdV'us

Dể cơ những chủng vi nấm thuộc các loài Aspergillus flavus và A.
parasiticus, chúng ta cơ thể mua các chủng dơ ở các Bảo tàng giông vi
sinh vật trên thế giới hoặc ở một số cơ sở giữ giống vi sinh vật trong
nước.
Ve các Bảo tàng giống vi sinh vặt trên thế giới, cơ thể kể làm thí
dụ niột số cơ sở sau :
•

ATTC (American Type Culture Collection) - Parklawn Drive

Rockville, u . S.A.

•

всем

•

CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures) > Baam, Netherlands

•

CCF (Culture Collection of Fungi, Department of Sciences) Prague, Czech.

•

CMI (Commonwealth Mycological Institute) - Kew, Surrey,
England.

•

IFM (Institute for Food Microbiology) - Chibaken, Japan

(British Conimonwenlth Collections of Microorganisms) London, England

9


•

ITCC (Indian Type Culture Collection) ~ New Delhi. India

•

ICP (Laboratoire de Cryptogamie, Museum national d’Histoire
naturelle) - Paris, France.

•

NRRL (Northern Regional Research Laboratoiy, u .s . Department of
Agriculture) - Peorin, U.S.A.

0 Việt Nam, các cơ sở sau cổ thể cung cấp các chủng thuộc 2 loài
vi nấm nói trên :
- Bảo tàng giống vi sinh vật, Đại học quốc gia, Hà Nội.
- Bộ môn Thực vật, Đại học Dược, Hà Nội.
Chúng ta cấn chú ý là các chủng vi nấm được giữ ở các bảo tàng
hay các cơ sở giữ giống thường đã được cấy truyền nhiều lần, do đó đã
giảm hoạt tính sinh học, hiệu suất lên men aflatoxin không cao bằng các
chủng mới phân lập từ cơ chất tự nhiên hay từ các sản phẩm nông
nghiệp.
Để chọn lọc các chủng của các loài Aspergillus flavus và A.parasiticus
từ lạc nhân, cổ thể tiến hành theo sơ đồ các thí nghiệm ở bàng 1.5.
Bàng 1,5, Sơ đồ các thí nghỉệm chọn iọc các chủng vi nấm thuộc các loàỉ
Aspergillus flavus và A,parasiticus để lên men aflatoxin
Thí nghiệm 1

thuộc nhóm loài
(T kháng sinh)

Phương
Thí nghiệm 2

: Phân lập các chủng
: Môi trưòng Czapek
pháp : Ulater

Mục đích

MÔI trướng

Mục đích

: Đjnh

AspergiHus ílavus

loại để chọn các chủng thuộc các loài

A.dayus

và

A.

parasỉĩicus
I

I

MÔI trường : MÔI trường Czapek
Phương pháp : Định loại h١inh thái
Thí nghiệm 3

Mục đích : Lên men các chủng thuộc các loài
MÔI trưòng : Môi trường Czapek sủa đổi
Phương pháp

Thí nghiệm 4

Mục đích

: Lên

A.fìam4s

và

/4. parasiricus

men lỏng trong bình nón

: Sơ bộ chọn các chủng
: sắc ký cột nhỏ

tạo thành atlatoxln

Phương pháp
Thí nghiệm 5

Mục đích

: Chọn
;

Phương pháp

các chừig tạo thành atlatoxin cho hiệu suất cao
Chiết xuất atlatoxin bằng dung môi
Đjnh lượng atlatoxln bằng sắc ký bản mỏng

Thí nghiệm 6

Mục đích
cao nhất

: Lên

Phương pháp

10

men kiểm tra chừig tạo thành atlatoxln cho hiệu suất

: Như

ỏ thí nghiệm 5


1.1. P hân lập các ch ủ n g thuộc nhóm loài Aspergilíus flavus

(th í nghiệm 1).

})ể các chủng thuộc nhdm loài này được thuần khiết (không bị lẫn
vi khuẩn hoặc các loài vi nấm khác), chúng ta phải phân lập khuẩn lạc
của các loài thuộc nhdm loài này từ trên mặt môi trường thạch trong
hộp lổng đặt các hạt lạc, từ ngày thứ hai, và chậm nhất là ngày thứ
nám kể từ khi đặt lạc vào môi trường. Thường từ cuối ngày thứ hai trở
đi, khuẩn lạc của một số loài vi nấm tăng trưởng nhanh đã che phủ một
phấn khuẩn lạc của các loài vi nấm khác, gây khd khăn cho việc phân
lập.
Khuẩn lạc các loài thuộc nhdm loài Aspergillus flavus ở các ngày tuổi
từ thứ hai đến thứ năm là những khuẩn lạc non, chưa cd những đặc
điểm phân loại đặc trưng.ở các khuẩn lạc này, các bộ máy sinh bào tử
trần cũng chưa trưởng thành hoàn toàn, do đd cũng chưa cd những đặc
điểm phân loại đặc trưng cần thiết.
Vì hai lý do chính trên (phân lập khi khuẩn lạc còn non, khuẩn lạc
non không cd các đặc điểm phân loại đặc trưng), chúngta không phân
lập được các chủng của từng loài Aspergiỉlus flavus hoặc A.parasiticus
riêng biệt trên môi trường đặt lạc, mà phải phân lập tất cả các chủng
của
2 loài vi nấm này cùng với các chủng của các loàicd một số đặc
điểm hỉnh thái của khuẩn lạc giống với các đặc điểm cùng loại của 2
loài vi nấm ndi trên, ndi cách khác, chúng ta phân lập các chủng từ
khuẩn lạc của tất cả các loài tmng nhdm loài Aspergillus flavus (xem
giải thích về nhdni loại trong phần định loại ở đoạn dưới).
Việc phân lập các chủng thuộc nhdm loài Aspergillus flavus được tiến
hành cụ thể như sau :
Môi trường phân lập :

Môi trường Czapek (bổ sung kháng sinh) :

NaNOj

3,0g

K2HPO 4

l ١0g

MgSƠ4, 7 H2O
KCl

0>5g
0,5g

FeSƠ43, 7 H2O

O.Olg

Saccharose

30,Og

Thạch

20,Og

(Tetracyclin)

0,5g).

11


Nước cất

1000 ml

*(Có thể thay bằng : penicillin 0,25g -f streptoniycin 0,25g).
Ngâm thạch vào khoảng 400 ml nước cất để thạch trương nở. Nếu
thạch ở dạng sợi, cát sợi thành từng đoạn dài ] - 2 cm. Hòa tan các
thành phần khác của môi trường trong phần nước cất còn lại, đổ dung
ỏịch này vào hỗn hợp nước thạch.
Đun sôi cho thạch tan hoàn toàn, rồi phân phối môi trường vào trong
các bình ndn cò dung tích 100 - 200 ml, tiệt trùng trong nổi hấp ở
120١^٠C trong 20 min. Trước khi phân phối môi trường vào trong các hộp
lổng, bổ sung kháng sinh (tetracyclin 0,5g cho 1 lit môi trường) để ức
chế sự phát triển của vi khuẩn. Dùng phần môi trường không bổ sung
kháng sinh để làm thạch nghiêng trong các ống thử cổ đường kính 12 15 mm.
Kỹ íhuậí phân iập :

Để phân lập các chủng vi nấm từ lạc, có thể dùng phương pháp
Ulster áp dụng chung cho việc phân lập vi nấm từ các loại hạt. Tiến
hành như sau :
Tách các hạt lạc làm 2 nửa, đặt các nửa hạt lạc này trên mặt môi
trường thạch trong hộp lồng, lá mầm úp xuống môi trường. Mỗi hộp lổng,
dật 10 nửa hạt cách đểu nhau.
Tiến hành trong điều kiện vô trùng (trong tủ cấy đã tiệt trùng).
Nuôi cấy ở tủ ấm 28-f ì^ c .
Phân lập từ ngày thứ hai đến ngày thứ nám vào các ống thạch
nghiêng các khuẩn lạc màu lục, vàng lục trong tủ cấy.

Để tiếp các ống thạch nghiêng đâ cấy nấm vào tủ ấm ở nhiệt độ
trên. Theo dõi nấm mọc trong các ống thạch nghiêng từ ngày thứ hai
đến ngày thứ mười để kiểm tra độ thuần khiết của chủng vi nấm. Loại
các chủng vi nấm bị nhiễm vi khuẩn hay các loài vi nấm không thuộc
nhóm loài Aspergíllus flavus. Ghi nhãn cho mỗi ống thạch nghiêng : ngày
phân lập, môi trường phân lập, ký hiệu nguổn gốc chủng ١/i nấm (nơi thu
nhận mẫu lạc).
Chúng ta gọi mỗi khuẩn lạc trong một ống thạch nghiêng là một
chủng vi nấm, và cho mỗi chủng vi nấm đó một số hiệu để lưu trữ và
sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

12


1.2. Đ ịnh loại đ ể ch ọn các chủng th u ộc cá c loài Asperf^illus flavus v à
A.parasiticus (th í nghiêm 2)
Môi trường dịnh loại : inôi trường Czapek

rjấy truyền các chủng thuộc nhdm loài Aspergillus flavus đã phân lập
trong ống thạch nghiêng sang môi trường Czapek trong hộp lổng. Cấy một
điểm ở trung tâm trên mặt môi trường, sao cho ở mỗi hộp lổng chỉ co'
1 khuẩn lạc. Muốn vậy, cần chạm rất nhẹ đầu que cấy vào khuẩn lạc
trong ống thạch nghiêng, chuyển nhanh và nhẹ tay đầu que cấy sang môi
trường trong hộp lổng. Cũng cần chú ý thực hiện tốt các điều kiện vô
trùng khi thực hiện thao tác này (trong phòng co' trang bị lamine hoặc
trong buồng cấy đã tiệt trùng, thao tác trên ngọn lửa đèn cồn, đầu kim
loại của que cấy được đốt đỏ trên ngọn lửa đèn cổn và làm nguội trong
môi trường ở mép khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, tiệt trùng tay kỹ
bàng cổn 70^١, V.V.). Mỗi chủng nấm trong ống thạch nghiêng được cấy
sang 3 hộp lổng. Chọn một hộp lổng co' khuẩn lạc đẹp nhất để làm tiêu

bản vi học.
Vì việc phân lập các chủng thuộc nho'm loài Aspergillus flavus chỉ co'
thể cán cứ vào 1 - 2 đặc điểm của khuẩn lạc, nên thường phân lập cả
các chủng của các nhdm loài khác của chi Aspergillus, và đôi khi cả các
chủng của chi vi nấm khác, nên để định loại chắc chắn các chủng của
các loài Aspergills flavus và Aparasiticus cần tiến hành lần lượt các bước
sau (sau khi đã cấy truyền chủng vi nấm từ ống thạch nghiêng sang các
hộp lổng) :
- Xác định các đặc điểm hinh thái của khuẩn lạc.
- Xác định các đặc điểm của bào tử trần và bộ máy mang bào tử
trấn.
- Định loại chủng vi nấm đến chi Aspergillus.
- Định loại chủng vi nấm đến nhdm loài Aspergillus flavus
- Định loại chủng vi nấm đến loài A.flavus hoặc loàiA.parasiticus.
Xúc định các đặc điểm hình thái cùa khuẩn

lạc :

(‫؛‬uan sát và ghi chép tất cả 3 hộp lồng của một chủng và xác định
các đậc điểm sau ở khuẩn lạc 2, 5 và 12 ngày tuổi :
Đường kính trung bình của khuẩn lạc.
(^hiều cao tối đa của khuẩn lạc
Dạng mặt của khuẩn lạc (dạng hạt, dạng sợi nấm nằm ngang hay
dạng sợi thảng đứng).
Màu sắc của mặt trên khuẩn lạc (màu sác của các khối bào tử trần
tạo thành ở trên mặt khuẩn lạc).
Màu sắc của mặt dưới (mặt sau) khuẩn lạc (màu sác của hệ sợi nấm
nến và màu sác của sắc tố hòa tan nếu co').
13

Các đặc điểm khác trên mặt khuẩn lạc nếu cđ : giọt tiết (exudat),
các sợi nấm thứ cấp, các bd sợi, các hạch nấm, v.v.
Xác định các đặc điểm cùa bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần :

Các đặc điểm này được xác định trên tiêu bản vi học với thuốc
nhuộm màu Xanh methyl hoặc Xanh Coton C4B 0,5% trong lactophenol.
Các đặc điểm cần xác định :
Sợi nấm : cd hay không vách ngang, đường kính, màu sác nếu cd,
nhản hoặc cd gai, các dạng hình thái đặc biệt nếu cd.
Bộ máy mang bào tử trần : các thành phần của bộ máy mang bào
tử trấn (tế bào chân, giá bào tử trần, bọng đỉnh giá, cuống thể bình, thể
bình), hình dạng, kích thước, màu sắc, bể mặt cd gai hay nhẵn của các
thành phần này. Các thành phần phụ như bd giá, sợi cứng nếu cd.
Bào tử trần ٠. hình dạng, kích thước, màu sắc, mặt nhẵn hay cd gai,
kiểu phát sinh bào tử, dạng tập hợp của bào tử trần (chuỗi song song,
chuỗi phân ly, khối cầu, tia tỏa tròn, khối chuỗi hình chùy, V.V.). Các loại
bào tử khác nếu cd (hình 1.2).
Đ ịnh loại ch ủ n g nấm đến chi

AspergUliểs

M ich. ex. Fr.

Trong hệ thống phân loại ngành Nấm (Mycota, Mycophyta) của
Saccardo (1886), chi Aspergillus thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales (bộ

H)nh L2. So. đồ bộ máy mang bào tử trần (coniđí) của chỉ Aspergillus Mich, ex Fr.

a - Bộ máy mang bào ٠từ trần kliông có cuống thề bình,

b - Bộ máy mang bào tứ trần có cuống thề bình

14


Hyphales), lớp Deuteromycetes (Fungi imperfecti). Theo hệ thống phân loại
căn cứ vào đặc điểm hình thái kết hỢp với đặc điểm phát sinh bào tử
trần củia Nấm bất toàn (Fungi imperfecti), chi Aspergillus thuộc tổ chi
Phidloconidiae, lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ
Nấm bíất toàn (Deuteromycotina). ngành Nấm (Mycota).
So sánh các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và các đặc điểm vi
học tromg bàng 1.6 để định loại chi Aspergillus.
Bàng /■.ố. Các nhóm phân loại (taxon) và các đặc điểm phân loạỉ tương ứng
để định loại các chủng vi nám đến chi Aspergillus.
( cỉc n ỉìó rìỉ p h ố fi loạ i

Các đặc điểm phân loại tương ứng

Deuteromycotina

SỢi nấm ngăn vách

Hyphomycetes

Chí có bào từ vô tính là bào tủ trần (không có bào tủ hửu tính. Đôi
khi có bào tủ áo).

Euhyphomycetidae

Giá bào từ trần (conidiophore) tự do (không ỏ trong túi giá (pycnidium)

hay trong đĩa giá (sporodochium)

PhialDConidiae

Bào tứ trần thuộc tip cơ bản euconidi (bào tư trần chỉ đưộc tạo thành
bời tế bào sinh bào từ trần).

Aspergillus

Bào tử trần thuộc tip phialoconidi (tế bào sinh bào từ trần là phialid).
Bào từ trần không ngăn vách.
Bộ máy mang bào từ trần hình hoa cúc, gổm : giá bào từ trần không
phân nhánh, bọng đính giá (vesicle), cuống thể bình (metulae) xếp trên
mặt bọng đính giá (một số loài không có cuống thể bVìh),thể bình
(phialid) xếp thành cụm trên đính cuống thể bình hoặc trực tiếp ỏ trên
mặt bọng đính giá (chủ yếu ỏ các loài không có cuổng thể bình), khối
bào từ trần khô (không có chất nhày) gổm các chuỗi bào từ trần dài
tụ họp lại thành hình cột (in column), hình cầu, hVih tia tỏa tròn. Bao
giờ cũng có tê bào chán (foot-cell) ờ gốc glá bào tử trần.

Nếu chủng vi nấm có các đặc điểm phân loại ở trong bảng 1.6,
chủng đó thuộc chi Aspergillus.
D ịn h loại ch ủ n g vi nấm đến nhóm loài A spergillus flavu s

Cho đến hiện nay, chuyên luận phân loại chi Aspergillus của Raper
và Fennell (1966) vẫn được dùng làm tài liệu chính để định loại các loài
của chi vi nấm này. Chi Aspergillus trong chuyên luận này cd 133 loài
và 18 thứ, được tập hỢp trong 18 nhổm loài. Vì vậy trước khi dịnh loại
đến 1'oài một chủng vi nấm đã được định loại là thuộc chi Aspergillus,
cán x;ác định chủng dó thuộc nhóm loài nào trong 18 nhóm loài ndi trên.

Nhdm loài Aspergillus flavus đặc trưng bởi các đặc điểm sau :

15


Khuẩn lạc (các khối bào tử trần trên mật khuẩn lạc) màu lục, lục
vàng, lục nâu, xanh lục.
Bọng đỉnh giá cđ cuống thể bình và thể bình, xen lẫn một số lượng
nhỏ các bọng chỉ mang thể bình (trừ một loài và một thứ cố bọng đỉnh
giá chỉ mang thể bình).
Bọng đỉnh giá hình cầu (trừ các bọng đỉnh giá chỉ mang thể bình).
Khối bào tử trần (conidial head) hình cầu, hình tia tỏa tròn (sau tách
thành hình cột ở vài loài).
Định loại ch ủ n g vi nấm đến cá c loài Aspergillus yZavu،٢ Link e x F r .
và Á. parasiticus Speare

Sau »khi định loại chủng vi nấm đến nhdm loài
flovus), khâu cuối cùng trong việc định loại một
định loài của chủng vi nấm đó.
Nhóm loài Aspergillus flavus gổm 9 loài và 2
lo،ài Aspergillus flavus và A.parasiticus trong nhòm
khóa phân loại trong bảng 1.7.

(nho'm loài Aspergillus
chủng vi nấm là xác
thứ. Để định loại các
loài này, có thể dùng

Bảng 1.7, Khóa định loại nhóm loài Aspergillus flavus
a. Bọng đỉnh giá chỉ mang thể b ìn h ............................................ b

a. Bọng đính giá mang cả cuống thể bình và thể bình, có rất ít bọng đính giá chí mang
thồ. b ìn h ................................... ٠ ........................................................... c
b, Khối bào từ trần hình tia tỏa tròn, đưòng kính 400

٠
500

/ím . . .

. . . /t. pdrasiricus
b Khối bào từ trần hình cột,

dài
. .

Speare.

400 - 500 /،m . . .
. A.ilavus Link ex.Fr.var.a)/í/m/;đm Rap.

c Khuẩn lạc mỏng, thưa thỏt sộinấm và bào từ
mach) . . .

(chi. phát triển

et Fenn.

tốt ỏ môi trưòng cao íúa

. . . A.z(waws

Kwon et

Fennell

c Khuẩn lạc phát triển bình thường............................................ d

d

Bào từ trần hình elip kể cả khi dã già . . .
. . . A.suboHvaccus Rap.et Fenn.
A.c/ai^aỉo-íỉduus Rap.et Fenn.
A.av^cnacCIỈS Smith

d.

Bào từ trẩn hĩnh cầu hoặc phần lỏn hình c ẩ u ................................ e

e. Bào

từ trần sần sùi . . .
. . . A.ramarii
A.t/ãi^o-^urcaris Batista

Ib

et

Kita
Naia

e. Вас tiJ tran ráp hoặc cổ gal rO r ệ t ...........................................g
g. Khuẩn lac màu lục vàng, lục nầu, sau chuyển thầnh lục nẫu, nâu. Giá bàO tư trẩn dài 1,5
cr٣١ cO thể tơi 4,5 cm . . .
٠

. . . A.orvzdc ^hlhury١ СоѴчГч, л, ‫)؛‬Гуідс lAhlburgl CoVxtx \‫ ة ل‬٢ . ettusus
iTiraboschi) ОЧлака
g. Khuẩn lạc màu vàng, lục vầng, xanh lục, sau không chuyển màu. Gỉấ bào tư trần ngắn
(dà dươi 1.0 cm) . . .
. . . A .tlavuắink

ex

Fr. (Minh 1.3)

Sau khi đã định loạ‫ ؛‬chủng vi nấm theo khOa phân loại nhOm loài
Aspergillus flavus, cấn kiểm tra lại tất cả các đặc điểm phân loại của 2
lohi A.flavus và A.parasiticus ỏ hẩng 1.8 để tránh sai sOt.
Bảng LH. ^ác đặc đỉém phân loại của các loàỉ ệe rg illu s flavus Link
ex Fr. và A.pamiticm Speare tren môỉ trường Czapek, nhỉệt độ nuôỉ cấy

28 + 11 ,1‫ ﺍ؛‬١« ngày tuổí
‫؛‬

f)ệc (lìểm
K huẩnl.c
Dạng mặt
Màu sắc

Màu mặt sau
Giọt tiết
Sắc tố hòa tan quanh
khuẩn lạc
Đường kính (cm)
Giá bèo tử trấn
Bề mặt
Chiểu dài ịjnrr\)
Đường kính (/ím)
Khốỉbèo tử trẩn
Hĩnh dạng
Đưòng kính, chiểu dài (/im)
Ị Bọngđìnhgiá
Hinh dạng
Dưòng kính (/Cuốngthẩbình
Có mặt
Kich thưỏc (//m)
Thổbình
Hinh dạng
Kích thước {um)
B .o từ trẩ n
Hĩnh dạng
Bề mát
Đưòng kinh, trục lỏn Ụim)

Aiflavus

A.pârdsiticus

Dạng len
b٧c vàng
Khbng mầu, nầu hổng
Cb hoặc không
Không

Dạng len, xốp nhộ
Lục vàng, xanh lục
Crem, nâu nhạt
Không
Khbng

6,0

٠
8,0

3,0 - 5,5

*
Rấp hoậc nhẩn
500-800 (100-150)
15-20 (5.10)

Rấp hoậc nhẩn
300 - 700
Cầu, tia tba trbn

Tia tba trdn, cột

300

٠ ‫ج‬ỖO)

00 ٠ 300)

300 - 450
h١٠nh binh
20 - 35

Cầu (chUy) 25 - 45 (10 - 20)
Cố (không)
5,0-10 X 3,6-5,5

Không

Hlnhblnh
6,5-12,0 X 3,0 - 6.0

HÌnh binh
7,0-9.0.3,0-4,5

Cầu, hlnh trưng
Cố gai
3,0 - 6,0

Cầu
Rấp hoậc cb gai
3,5 - 5,5

_____

‫إ؛‬.‫ةر !؛!زأ!؛!ﻵﻷ‬۴ ‫ﺑﺮ‬1‫ﺟ ﻮ ﺑ ﻤ ﻌ ﺆ د‬
ĩh

ữ

v ìê

S
٠٠

17


( iìú tfiicfi -

I rc١ng ngoặc đt ١n ; đặc ttiôm các thành phAn cùa l١ộ n٦،áy n٦ang bài ١ tư lì An chi cu
the hình của l(١
)ài A.flavlis.

1.3. Sơ bộ ch ọn các ch ủ n g th u ộ c các loài Aspergillus Jiavua v٢à A. pưrusotỉcus
tạo thàn h aflatoxin (th ỉ nghiệm 3 và 4).

i___.1

٠-

10jUm

hrmh y.ư. Bào tỉr trần và bộ máy mang bào tử trần của loài ÁsperịỊỈllus fUivus Link ex

Fries (loại bộ máy mang bào tử trần có cuống thề bình) :
A - Các thành phần của bộ máy mang bào từ trân.
I. Sọi nấm ; 2. Tế bào chân ; 3. Giá bào tử trần ; 4. Bọng đỉnh gia ;
5. Cuống thề bình ; 6. Thề bình ; 7. Bào tiV trần .
B - Bào tử trần.

c - Bộ máy mang bào tử trần tnrỏTig thành vói khối bào tử trần
hình tia tỏa tròn.

Vì không phải tất cả các chủng của các loài Aspergillus flavus và
A.parasiticus đều tạo thành aflatoxin^ nên trước khi lên men để chiết xuất
aflatoxin, cẩn chọn nhanh và loại bỏ các chủng không tạo thành các
nivcotoxin này. 0 Pháp chảng hạn, 25% số chủng củaloài A.flavus phân
lập từ lươngthực, thực phẩm và thức án gia súc tạo thành aílatoxin, ở
một sổ nước châu Phi và một số vùng ở Tây Nam Á, số chủng này là
50%. Một thông báo ở Mv nám 1973 cho biết các chủng của loài A.flovus
tạo thành aflatoxin trên lạc chiếm 96%, ở hạt bông chiếm 78%, ở lúa
mạch chiếm 49% và ở gạo là 35%. Kết quả một khảo sát ở Hà Nội cho

18


biết các mẫu lạc lấy ở 10 địa điểm khác nhau có 60% sô chủng của loài
vi nám no'i trên tạo thành aOatoxin (theo B.X.Đổng, 1976).
('ác số liệu trên chỉ cố ý nghỉa hạn chế vì điều kiện nghiên cứu,
khảo sát khác nhau (sảii phẩm chưa mốc hay đã mốc, các phương pháp
phân lập vi nấm, phương pháp phát hiện aAatoxin, V.V.), nhưng cho chúng
ta thấy cần phải loại các chủng thuộc các loài A.fĩavus và A.parasiticus

không tạo thành aflatoxin trong nghiên cứu lên men afĩ.atoxin.
C^ác kết quả nghiên cứu ở Tổ bộ môn Vi nấm - Kháng sinh trường
Đại học Dược Hà
Nội cho thấycđ thể dùng phương pháp phát hiệnnhanh
aAatoxin để chọn lọc các chủng thuộc các loài A.fLavus và A.parasiticus
tạo thành mycotoxin này.
Mỏi trường lên men : môi trường Czapek không có thạch, trong đđ
natri nitrat được thay bằng amoni nitrat cùng lượng (theo kết quả nghiên
cứu của D.Ba và ct., 1997), nước cất được thay bằng nước chiết ngô (60g
ngô hạt, 500 ml nước cất, đun sôi trong lh30 min, lọc qua gạc, bổ sung
nước cất cho đủ 1000 ml). Tiệt trùng ở 120٧ c, 30 min.
Cấy mỗi chủng vi nấm vào 3 bình nđn cđ dung tích . 100 ml, mỗi
bình chứa 20 ml môi trường (điều kiện vô trùng). Nhiệt dộ nuôi cấy :
28-f r ١c . Thời gian nuôi cấy : 6 ngày. Lắc ngang : 120 lắc/min.
Xác định nhanh aílatoxin bằng phương pháp sác ký cột nhỏ (SKCN),
tiến hành như sau :
Chuẩn bị sẵn nhiều bộ dụng cụ SKCN. Mỗi bộ SKCN gổm : 1 lọ
thủy tinh cđ chiều cao 5 cm, đường kính trong miệng lọ khoảng 2 cm
(cd thể dùng lọ đựng bột penicilin tiốm), 1 ống .thủy tinh cd chiều dài
10 cm, đường kính trong 0,5 cm, nhồi silicagel vào ống (1 ± 0,lg), nút
2 đầu ống bảng bông dày 0,5 cm (hình 1.4j.
Cô ở ngọn lửa nhỏ dịch lên men trong các bình ndn đến khi vừa
cạn hết nước. Đổ vào mỗi bình nón 10 ml methanol hoặc chloroíorm, lắc
10 min để hòa tan aAatoxin nếu có trong dịch lên men. Đổ dung môi
đ،ã hòa tan cắn vào lọ thủy tinh của bộ SKCN (khoảng 2 - 3 ml, trên
nửa chiều cao của lọ). Láp ống thủy tinh chứa silicagel bột vào nút đã
khoan lỗ vừa khít với ống. Đẩy ống silicagel xuống cho đầu mút của ống
ngập hết bông trong lớp dung môi. Khi dung môi đă chạy lên hết lớp
bỏng ở đầu nuit trên của ông, lấy ống ra khỏi lọ và sấy khô ống ở 60٢١C
(thường trong 5 min). Phát hiện vết có huỳnh quang xanhhoặc lục trên

cột silicageỉ ở đèn tử ngoại (IIV) cd A365 nm. Tiến hành song song với
atlatoxin chuẩn hòa tan trong cùng loại dung môi (nổng độ dung dịch
aílatoxin chuẩn ; 2//g/ml).

19


ầ

_Nút bông

Silicagel bòt

Ông thuỷ tinh

Lo thuỷ tinh
Nút bỏng
Dung mòi
(hoà tan dịch
lèn men đã
khò can)

Hình 1.4, Bộ dụng cụ sắc ký cột nhỏ

Chủng vi nấm cđ dịch lên men có vết huỳnh quang xanh hay lục
cùng màu và cùng vị trí trong cột silicagel với vết huỳnh quang của các
aílatoxin chuẩn, chủng đđ cđ khả năng tạo thành aAatoxin. Thường chỉ
cẩn tiến hành với 2 loại aAatoxin chuẩn : aAatoxin BI (cd huỳnh quang
xanh), aAatoxin GI (cố hu}mh quang lục).
Phương pháp trên cũng cố thể dùng để phát hiện nhanh sự cổ mặt

của aAatoxin trên các loại lương thực, thực phẩm, thức ă.. gia súc.
Cd thể dùng phương pháp sắc ký bản mỏng để phát hiện và chọn
sơ bộ các chủng tạo thành aAatoxin của các k \ ì vi nấm.
1.4. Chọn các ch ủ n g tạ o th àn h aA atoxỉn ch o h iệu suất cao (th í nghiệm
5 và 6)

Môi trường lên men và phương pháp lên men aAatoxin tiến hành
như ở 1.3.
Để chọn các chủng tạo thành aílatoxin cho hiệu suất cao, cẩn tiến
hành định lượng aAatoxin của các dịch lên men nói trên. Việc định lượng
này gổm 2 bước (hình 1.5).
~ Chiết xuất aAatoxin của dịch lên men bằng dung môi.
- Định lượng aữatoxin bàng sác ký bản mỏng (SKBM).
Để định lượng aAatoxin nên dùng các bản mỏng silicagel đúng tiêu
chuẩn, thí dụ các bản mỏng sịlicagel Kieselgel 60 F ^54 của hàng Merck,
dày 0,2 mm, kích thước 15 X 15 hoặc 20 x 20 cm.

20


Aflatoxin chuẩn : các aflatoxin Bl, Gl, B2, G2 hoặc ít nhất các
aflatoxin Bl, Gl (thí dụ các aílatoxin chuẩn của hãng Fluka AG, Chem.
Fabrik CH-9470 Buchs ~ CHLB Đức;.

Hình /.5. So. đồ quỉ trình định lượng aílatoxin đề chọn các chủng thuộc các loài
Aspergillus flavus và Aparasiticus cho hiệu suất lên men aflatoxin cao (SKBM :
sắc ký bản mổng).

Cố thể dùng một trong các hệ dung môi khai triển SKBM sau :
Chloroform - Methanol (97 : 3)

' Chloroform - Methanol (95 : 5)
Aceton ٠■ Chloroform ( 1 : 9 )
So sánh màu huỳnh quang và trị số Rf của dịch chiết methanol với
aflatoxin chuẩn ở u v có Ẳ : 365 nm.
21


Để khẳng định thêm các vết huỳnh quang trên sắc ký đổ là aflatoxin,
phun acid ‘ nitric 50% lên sác ký đồ, các vết aílatoxin đổi thành huỳnh
quang màu vàng, hoặc phun acid sulfuric 25% lên sác ký đồ, các vết
aflatoxin đổi thành hu5mh quang màu đỏ gạch.
Để định lượng aflatoxin, cũng dùng SKBM như trên với dịch chiết
methanol pha loãng, so sánh cường độ huỳnh quang của các dung dịch
aflatoxin chuẩn đã biết trước nồng độ. Dịch chiết được chấm trên bản
mỏng silicagel với các thể tích khác nhau, cùng trên bản mỏng chấm các
dung dịch aflatoxin chuẩn.
Hàm lượng aílatoxin cđ trong dịch lên men được tính theo công thức :
A =

S .Y .V
W .Z

A

Lượng aílatoxin trong 1 lít dịch lên men (ng)

s

Thể tích dung dịch aAatoxin chuẩn được chấm trên bản mỏng

(n l)

Y : Nồng độ của dung dịch chuẩn aflatoxin (ng/ml)
V : Thể tích dịch chiết (rd)
z : Thể tích của dịch chiết chấm trên bản mỏng cd cường độ huỳnh
quang bằng cường độ hu}mh quang của s (ni)
w : Khối lượng dịch lên men dùng trong định lượng (g)■

Ngoài phương pháp sắc ký cột nhỏ và SKBM, các phương pháp sắc
ký lỏng cao áp, sắc khí khí, phương pháp ELISA (Enzyme linked
Immunosorbent Assay) và phương pháp RIA/Radio Immunosorbent Assay)
cũng đã được dùng với mức độ khác nhau ở vài nước để xác định hàm
lượng aflatoxin.
Sau khi đã chọn được chủng vi nấm tạo thành aflatoxin nhiều nhất
trong môi trường lên men, cần lên men lại và định lượng nhiều lẩn để
cd sô liệu trung bình về lượng aflatoxin này.
Các chủng vi nấm này cẩn được giữ giông trên thạch nghiêng, bằng
phương pháp đông khô hoặc nitơ lỏng.
2. LÊN MEN VÀ CHIẾT XUẤT AFLATOXIN

Aflatoxin cũng như nhiểu mycotoxin khác là các sản phẩm trao đổi
chất thứ cấp trong quá trình sinh trưởng, phát triển, quá trình trao đổi
chất của một số loài vi nấm, chủ yếu là các lài Aspergillus flavus và A.
parasiticus. Cũng như nhiểu sản phẩm trao đổi chất thứ cấp khác của vi
sinh vật, của thực vật, người ta chưa biết rõ vai trò của các sản phẩm
22


này đối ѵ^і đời sống của các sinh vật noi tren. Cd thể sự tạo thành các
sán Ị)hfam tnao đổi chất này gắn hến với SIÍ kinì hãm dị hOa của một số

‫ﺩ؛‬07‫ ﺍ' ﺍﺍﺍ‬ở ^ai đoạn dinh dưỡng do sư híing nhanh n^iốn glncid trong môi
trường c١,١a cơ thể vi sinh -vật, và do đd khl giai đoạn này kết thúc, nhỉều
onzỉn١ ìaiới cd vai trO trong sự tạo thành các sần phẩm trao dổi chất. thiỸ
cáp xuất hiện ÍJ. Rỉvl.ère, 197‫) ﺓ‬. Và c.tí t.hể cửng vi vậy mà aflatoxin dược
t‫؛‬.io t.hanh khi
bắt dầu hỉ.nh thành- bộ máy sinh bào tử trẩn, tang dần
dến giai đoạn sinh bào tử trán mạnh (ngày lên men thứ sáu), rổi giảm
sUt.
Mặc db các
và sií rạo t.hành
cdc loài vi nấm,
phẩm trao dổi
men atlatoxin.

mối liên hệ trao dổi chất giữa sự tạo thành bào tử trấn
aflatoxin chưa dược rõ, nhưng các diều kiện nuôi dưỡng
này liên quan rõ ràng dến kết quà tạo thành các sàn
chất thư cấp cUa chUng, ndi cách khác, dến kết quẩ lên

2.1. L en m en aflatoxin bởi các loài Aspergillus flavus và A.parcusiticus
À inavus và A.parasiticus là những loài nấm hoại sinh, do dd chUng

cd khả năng phân gỉải các xác cơ thể hoặc các hợp chất hữu cơ bên
ngoài cơ thể sổng dUng làm chất định dưỡng. Dể lên men tạo thành
adat ٢١xịn, chUng ta phài cung cấp cho các chUng nuôi cấy cUa 2 loài vi
nấm này các chất dinh dưỡng thích hợp và nuôi cấy các chUng dd trong
những diều kiện pH, nhiệt độ, thơi gian thỉch hợp.
N^iồn dinh, dưỡng cacbon. Như chUng ta biết, nấm cd thể sử dụng
các ngudn thức àn cacbon rất khác nhau, hẩu như không cd loại hợp
chất cacbon hữu cơ nào mà không cd loài nấm này hay loài nấm khác

không sử dụng dược. Tuy nhiên mỗỉ loài nầm đổng hda loại hợp chất,
này tdt hơn loại hợp chất khá‫ ؟‬. M ậ t khác, dể thực hiện các quá trinh
sinh t.rưởng, phat triển khác nhau, nấm thường lại cd những nhu cầu
khOng gidng nhau vể loại thức ản này, thi dụ loại dường thích hợp với
SIÍ tỉm thàn.h .hệ sợl nấm chưa chắc: dã thích hỢp với sự tạo thành các
cơ quan sinh sản (như bộ máy sinh bào tử trẩn và bào tử trần), hoặc
các sản phắn١ trao dổi chất. VI vậy sự thích hợp của một nguồn thdc an
cacbon dược đánh gia bằng những chỉ tiêukhác nhau : mức độ sinh
trưởng tối da của hệ sợi nấm, mứcđộ tạo thành tổỉ da số lượng bầo tử,
mức độ tạo thanh tối da các- sẩn phẩm trao dổi chất. Việc chọn chỉ tiêu
nào phụ thuộc vào mục dlch của quá trinh lên men (lên men thu nhận
sinh khOi hay lên men thu nhận sần phẩm trao dổi chất).
Trừ một số ít các loài vi nấm cO thể sử dụng nguổn thức ần cacbon
là các alcan như parafin, các hydrocarbua trong xảng dầu, các acid béo.

23


phần lớn các loài vi nấm cd nguồn thức ăn cacbon thích hợp là hydrat
cacbon. Mặc dù hai loài A.flavus và A.parasiticus có các enzim phân giải
tinh bột, nhưng nguồn hydrat cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng và
phát triển của 2 loại vi nấm này là saccharose và glucose. Môi trường
Czapek và Czapek-Dox lần lượt cđ nguồn thức án này là sacoharose và
glucose là những môi trường tối ưu của A.flavus và A.parasừicus, và cũng
là những môi trường chủ yếu để định loại các loài vi nấm này.
Nguồn dinh dưỡng nitơ - Các loài nấm khác nhau cố nhu cẵu khác
nhau về nguồn dinh dưỡng nitơ, và thường cổ khả năng sử dụng cả các
nguồn nitơ hữu cơ và các nguồn nitơ vô cơ.
Cd những loài vi nấm sinh trưởng, phát triển tốt trong môi trường
cd muối amon, ngược lại một số loài vi nấm khác phát triển tốt hơn ở

môi trường cd nitrat. Nhiều loài trong đd cd các loài A ,flavus và A.
parasiticus cd khả năng đổng hda các muối amon và nitrat. Đôi khi cd
những loài vi nấm không phát triển được trên các môi trường chứa muối
amon, do khi cơ thể đổng hda NH 4'.', trong môi trường sẽ tích lũy các
anion (S04^", HP 04 ^~, c r, V.V.), làm hạ thấp pH cửa môi trường. Ngược
lại, nitrat là những muối kiểm sinh lý. Khi cơ thể vi nấm đổng hda N 03 ",
môi trường sẽ tích lũy cáọ cation (K^, Na^, v.v.)y do đd làm tâng pH của
môi trường. Các loài A .flavus và A.parasiticus là các loài đồng hda tốt cả
các muối nitrat và amon, tuy nhiên trong lên men aAatoxin, một số thí
nghiệm chứng tỏ rằng khi sử dụng muối amon làm nguồn dinh dưỡng
nitơ, lượng aAatoxin tạo thành bởi các chủng của 2 loài vi nấm nhiều
hơn (D.Ba và ct., 1977, T.D. Cardona, 1992).
Ngoài các nguổn nitơ vô cơ, nhiểu loài vi nấm sử dụng tốt nhiều
nguồn nitơ hữu cơ (protein, pepton, peptid, acid amin, V.V.). ‘Nghiên cứu
ảnh hưởng của các acid amin đến sự tạo thành aAatoxin của A.flavus,
người ta thấy acid glutamic, prolin kích thích sự tạo thành các aAatoxin
B, tiyptophan kích thích sự tạo thành các aAatoxin G, alanin, asparagin,
histidin, lysin, methionin không làm tàng hiệu xuất lên men aAatoxin (M.F.
Nexterin, V.I.A.Vixxarionova, 1966). Riêng với asparagin, một sô người khác
lại bổ sung acid amin này vào môi trường lên men aAatoxin, vi thu nhận
được lượng aAatoxin từ môi trường lên men này lớn hơn lượng aAatoxin
từ môi trường lên men cd cùng thành phần nhưng không được bổ sung
asparagin (D.Ba và ct., tài liệu đã dần).
Các nguyên tố khoáng ” Các muối khoáng là những thành phần không
thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy, lên men các sản phấm trao đổi
chất của vi nấm, vì những thành phần này cd những chức năng sinh lý
và cấu trúc quan trọng ở tế bào vi nấm.

24

Các ngiiyên tố khoáng cần thiết đối với sự sinh trưởng, phát triển
của vi nấm gổm các nguyên tố đa lượĩỉg (P, s, K, Mg, Ca) và các nguyên
tố vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni, V.V.).
p thường chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của tế bào
vi nấm, tham gia vào cấu tạo một số hợp chất hữu cơ của tế bào như
nucleoprotein, photphoprotein, V.V., cổ mặt trong nhiều coenzim quan trọng
như AJ3P, ATP, ƯDP, UTP, CoA, v.v. s tham gia vào quá trình trao đổi
glucid của tế bào, tham gia hoạt hốa nhiều loại enzim như amylaza,
invertaza, ATP-aza, v.v. Mg ngoài tính chất là một cofactơ đối với nhiều
enzini, cũng tham gia hoạt hổa nhiều enzim như esteraza, photphopheraza,
carboxylaza, transacetylaza, v.v. Nồng độ Mg trong tế bào được xác định
là cd ảnh hưởng rõ rệt đến việc liên kết hay tách rời nhau các tiểu phấn
60S và 40S của ribosom. Ca cố vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều
thành phần quan trọng trong tế bào vi nấm (giữa các nucleotit, giữa
protein và acid nucleic), ảnh hưởng đến sự hình thành các cấu trúc không
gian ổn định cùa ribosom, nhân, v.v. Fe là nguyên tố vi lượng (cũng được
coi là nguyên tố đa lượng) tham gia vào cấu trúc porphyrin sắt của hệ
thống enzim chuyển vận electron như cytochrom, cytochromoxydaza, cũng
tham gia vào hoạt hốa một số enzim như carboxylaza, arginaza, v.v. Các
I١g ٧ yên tố vi lượng khác chủ yếu tham gia vào hoạt hđa các enzim khác
nhau.
Nhiều loài vi nấm cố tính mẫn cảm rất cao đối với sự cđ mật và
nống độ của các muối khoáng trong môi cấy, môi trường lên men (thay
đổi một số đặc điểm hình thái, sinh trưởng, phát triển), do đó cần phải
cho đủ (không thừa, không thiếu) các thành phần muối khoáng trong mỗi
loại môi trường.
Trong lên men aAatoxin, các muối ZhSƠ4, FeSƠ4, K2HPO 4, MgSƠ4,
CaCl·^ với nồng độ thích hợp cố tác dụng tốt đối với sự tạo thành các
mycotoxin này.

Nguồn dinh dưỡng của môi trường là yếu tố ảnh hưởng quyết định
đến sự sinh trưởng, phát triển, đến sự tạo thành aAatoxin của các loài
A.ỊĨavus, A.parasiticus. Ngoài ra pH của môi trường, nhiệt độ nuôi cấy
cũng cố ảnh hưởng như vậy đến hiệu xuất lên men aữatoxin. pH ban
đầu ít ảnh hưởng đến sự tạo thành aAatoxin, tuy nhiên pH tối ưu đối
với sự sinh trưởng của A. Aavus trong khoảng pH 4 và 5 (Diemer vâ
Davis, 1969). Nhiệt độ tối ưu đối với sự sinh trưởng cũng như đối với
sự tạo thành aAatoxin là nhiệt độ trong khoảng 24 - 28.C, trên 45.C và
dưới 12 ١^٠C, A.Aavus không mọc hoặc mọc rất yếu (Schroeder và ct., 1967).
A.fĩai)us và A parasiãcus có thể sinh trưởng tốt và tạo thành aAatoxin ở

25