Ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái tới quá trình tạo màng biocellulose trên môi trường tảo xoắn spirulina (LV01968)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ KIM NGOAN

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ NHÂN TỐ SINH THÁI
TỚI QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG BIOCELLULOSE
TRÊN MÔI TRƯỜNG TẢO XOẮN SPIRULINA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ KIM NGOAN

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ NHÂN TỐ SINH THÁI
TỚI QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG BIOCELLULOSE
TRÊN MÔI TRƯỜNG TẢO XOẮN SPIRULINA
Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2016

LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung , ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ
em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin đƣợc cảm ơn gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã quan
tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày … tháng 08 năm 2016
Học viên

Nguyễn Thị Kim Ngoan


LỜI CAM ĐOAN
Đề tài đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Đinh Thị Kim
Nhung, em xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây
là kết quả nghiên cứu của riêng em. Đề tài này không trùng với bất cứ đề tài
nào đã từng đƣợc công bố.
Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày … tháng 08 năm 2016
Học viên
Nguyễn Thị Kim Ngoan


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................. 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................. 3
5. Điểm mới của đề tài ................................................................................... 3
6. Những đóng góp của đề tài ............................................................................ 3
NỘI DUNG .................................................................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới ............. 4
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới ........................... 4
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter............................................. 4
1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter ............................ 6
1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .................................................................. 6
1.2.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật...................................................................... 7
1.3. Điều kiện nuôi cấy................................................................................... 8
1.3.1. Độ pH ....................................................................................................... 8
1.3.2. Nhiệt độ .................................................................................................... 8
1.3.3. Độ thông khí ............................................................................................. 8
1.4. Biocellulose ............................................................................................. 8
1.4.1. Cấu trúc .................................................................................................... 8
1.4.2. Một số tính chất ........................................................................................ 9
1.4.3. Cơ chế tổng hợp........................................................................................ 9
1.4.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter ............... 12
1.4.5. Ứng dụng của Biocellulose ..................................................................... 13


1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Biocellulose hiện nay ....................... 14
1.51. Trên thế giới ............................................................................................ 14
1.5.2. Tại Việt Nam ........................................................................................... 16

1.6. Sơ lược về tảo xoắn Spirulina ............................................................... 17
1.6.1. Lịch sử .................................................................................................... 17
1.6.2. Phân loại tảo Spirulina........................................................................... 18
1.6.3. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina ...................................................... 18
1.6.4. Nghiên cứu ứng dụng ............................................................................. 21
1.7. Sơ lược về tia UV (tia cực tím) .............................................................. 21
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 22
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu ........................................................ 22
2.1.1. Giống ...................................................................................................... 22
2.1.2. Hóa chất và thiết bị................................................................................. 22
2.1.3. Môi trường.............................................................................................. 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 23
2.2.1. Phương pháp vi sinh ............................................................................... 23
2.2.2. Phương pháp hóa sinh ............................................................................ 26
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng tảo xoắn cho quá
trình tạo màng Biocellulose.............................................................................. 28
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ, dinh
dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng Biocellulose ........................................ 29
2.2.5. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose............ 30
2.2.6. Phương pháp xử lý màng Biocellulose ................................................... 30
2.2.7. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu .................................................... 31
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 32
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose
trên môi trường tảo xoắn Spirulina .......................................................... 32


3.1.1. Phân lập vi khuẩn axetic từ môi trường tảo xoắn Spirulina ................... 32
3.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose mỏng,
dai, bề mặt nhẵn trong thời gian ngắn nhất ..................................................... 33
3.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, khoáng tới khả năng tạo

màng Biocellulose của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T9..... 39
3.2.1. Ảnh hưởng của cacbon ........................................................................... 39
3.2.2. Ảnh hưởng của nitơ ................................................................................ 41
3.2.3. Ảnh hưởng của KH2PO4 ......................................................................... 42
3.2.4. Ảnh hưởng của MgSO4.7H2O ................................................................. 43
3.2.5. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường lựa chọn 44
3.3. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng tạo màng Biocellulose
từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T9 ..................................... 45
3.3.1. Ảnh hưởng của pH................................................................................. 45
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .......................................................................... 47
3.3.3. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường và điều
kiện lựa chọn .................................................................................................... 49
3.4. Xử lý màng làm mặt nạ dưỡng da .......................................................... 49
3.4.1. Phương pháp 1 ....................................................................................... 50
3.4.2. Phương pháp 2 ....................................................................................... 51
3.4.3. Phương pháp 3 ....................................................................................... 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
1. Kết luận .................................................................................................... 53
2. Kiến nghị .................................................................................................. 53
CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ ............................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 55
PHỤ LỤC .................................................................................................... 60


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter ........................................................... 4
Hình 1.2. Sợi cellulose của màng Biocellulose ............................................... 9
Hình 1.3. Sợi cellulose của thực vật ............................................................... 9
Hình 1.4.Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter .............. 10

Hình 1.5.Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter ... 12
Hình 1.6. Hình dạng tảo Spirulina dưới kính hiển vi .................................... 19
Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn axetic của mẫu phân lập ................................ 32
Hình 3.2. Hình thái tế bào học của 2 chủng Gluconacetobacter T6 và T9 .... 37
Hình 3.3. Màng Biocellulose thu được ở môi trường MT3............................ 45
Hình 3.4. Màng Biocellulose thu được sau khi sấy ....................................... 50
Hình 3.5. Màng Biocellulose thu được sau khi chiếu đèn UV ....................... 51
Hình 3.6. Màng Biocellulose thu được sau khi sấy và chiếu đèn UV ........... 52


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ......... 6
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của Spirulina .......................................... 20
Bảng 3.1. Thành phần của tảo xoắn Spirulina ......................................... 35
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thành màng cellulose của 6 chủng
Gluconacetobacter .................................................................. 35
Bảng 3.3. Hàm lượng axit axetic tạo thành của 6 chủng Gluconacetobacter ... 36
Bảng 3.4. Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng
Gluconacetobacter................................................................... 37
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng
Biocellulosecủa chủng G. xylinus T9......................................... 40
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4)2SO4 đến khả năng tạo
màng Biocellulose của chủng G. xylinus T9............................... 41
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khả năng tạo màng
Biocellulosecủa chủng G. xylinus T9......................................... 42
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng tạo
màng Biocellulosecủa chủng G. xylinus T9 ............................... 44
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men tạo màng
Biocellulosecủa chủng G. xylinus T9......................................... 46
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự hình thành màng

Biocellulose của chủng G. xylinus T9 ........................................ 47
Bảng 3.11. Màng sau khi xử lí theo phương pháp 1 .................................. 50
Bảng 3.12.Màng sau khi xử lí theo phương pháp 2................................... 51


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

cs

: Cộng sự

CFU

: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

g/l

: gam trên lít

G. xylinus

: Gluconacetobacter xylinus

G. xylinus T9 : Gluconacetobacter xylinus T9
mm

: milimet

stt

: số thứ tự

T2

: Gluconacetobacter xylinus T2

T4

: Gluconacetobacter xylinus T4

T6

: Gluconacetobacter xylinus T6

T8

: Gluconacetobacter xylinus T8

T9

: Gluconacetobacter xylinus T9

T12

: Gluconacetobacter xylinus T12

UV

: Ultraviolet

Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Màng sinh học (Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của
thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4
glucozit). Cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ không chứa
các hợp chất cao phân tử nhƣ: ligin, peptin, hemicellulose, và sáp nến... Do
vậy chúng có những đặc tính vƣợt trội về độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ
đàn hồi [36].
Với những đặc tính hóa, lí ƣu việt trên nên màng Biocellulose đƣợc
xem nhƣ là một nguồn polymer sinh học mới, nó thu hút đƣợc sự chú ý của
nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX và đƣợc ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực khác nhau nhƣ: trong công nghiệp sản xuất giấy, màng
Biocellulose đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao [24]; Trong
công nghệ môi trƣờng, màng Biocellulose làm màng phân tách để xử lý nƣớc
và biến đổi độ nhớt của nƣớc [32]. Trong y học, màng Biocellulose đã đƣợc
ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da,
làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con
ngƣời [5]; Ngoài ra, màng Biocellulose còn đƣợc dùng làm chất mang đặc
biệt cho các sợi pin và tế bào năng lƣợng [27], làm môi trƣờng cơ chất trong
sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm...
Nguyên liệu dùng để nuôi Gluconacetobacter rất đa dạng: nƣớc dừa
già, rỉ đƣờng, nƣớc mía, nƣớc vo gạo. Các loại môi trƣờng này đã đƣợc
nghiên cứu khá nhiều. Tuy nhiên môi trƣờng dinh dƣỡng tảo xoắn dùng để

nuôi Gluconacetobacter chƣa đƣợc nghiên cứu. Tảo xoắn Spirulina là một
loại vi sinh vật có hình xoắn sống trong nƣớc mà ngƣời ta quen gọi là Tảo

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
2

xoắn với tên khoa học là Spirulina platensis. Thực ra đây không phải là một
sinh vật thuộc ngành tảo (Algae) vì tảo thuộc nhóm sinh vật có nhân thật
(Eukaryotes). Spirulina thuộc vi khuẩn lam (Cyanobacteria), chúng thuộc
nhóm sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryotes), sinh khối của
chúng rất giàu dinh dƣỡng và có nhiều tác dụng chữa bệnh nên đã đƣợc nuôi
trồng ở quy mô công nghiệp và đƣợc sản xuất dƣới dạng viên để phòng chống
nhiều loại bệnh tật. Các phân tích cho biết thành phần dinh dƣỡng của sinh
khối tảo xoắn là protein: > 52 %; độ ẩm < 7.0 %; chất khoáng: < 14 %; tổng
số carotenoid: > 5000 mg/kg; Beta-carotene (tiền vitamin A): > 2250 mg/kg;
sắc tố Zeaxanthin: 3000 mg/kg; sắc tố C-phycocyanin: 8.0 %; Phycocyanin
(thô): > 17.3 %; Vitamin B12: 3000 mcg/kg; Vitamin K: 20 mg/kg. Đáng chú
ý là ở chỗ sinh khối này chứa tới 50- 62 % protein với đủ các loại acid amin
cần thiết cho nhu cầu dinh dƣỡng của cơ thể. Ngoài ra còn chứa phong phú
vitamin B12, Beta-carotene, xanthophyll và nhiều nguyên tố khoáng [40]. Với
những thành phần cấu tạo đặc biệt về sự cân bằng kì diệu các thành phần dinh
dƣỡng. Tảo Spirulina mang lại cho con ngƣời sức mạnh về trí lực, thể lực và
vẻ đẹp cho các lứa tuổi, giới tính khi sử dụng thƣờng xuyên.

Với thành phần dinh dƣỡng và các tác dụng nói trên, tảo xoắn rất có thể
là môi trƣờng lý tƣởng để nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter. Chính vì vậy
tôi quyết định chọn đề tài “Ảnh hƣởng của một số nhân tố sinh thái tới quá
trình tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng tảo xoắn Spirulina”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số nhân tố sinh thái đến quá trình hình
thành màng Biocellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus tuyển chọn
trong môi trƣờng tảo xoắn Spirulina. Từ đó tìm ra đƣợc môi trƣờng dinh
dƣỡng thích hợp cho vi khuẩn tuyển chọn.

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
3

3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng
Biocellulose trên môi trƣờng tảo xoắn Spirulina.
3.2. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng tới khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng vi khuẩn G. xylinus T9 tuyển chọn.
3.3. Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng vi khuẩn G. xylinus T9 tuyển chọn.
3.4. Bƣớc đầu xử lý màng làm mặt nạ dƣỡng da.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tƣợng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng

Biocellulose phân lập từ môi trƣờng tảo xoắn.
4.2. Phạm vi nghiên cứu: Ảnh hƣởng của một số nhân tố sinh thái đến
khả năng tạo màng Biocellulose của chủng G. xylinus T9 đã tuyển chọn.
5. Điểm mới của đề tài
Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn G. xylinus T9 có khả năng lên men
tạo màng Biocellulose từ nguồn nguyên liệu mới - tảo xoắn Spirulina. Trên cơ
sở đó tìm đƣợc môi trƣờng và điều kiện thích hợp cho chủng G. xylinus T9
sinh trƣởng và phát triển, rút ngắn thời gian tạo màng.
6. Những đóng góp của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn G. xylinus T9
có khả năng lên men tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng tảo xoắn
Spirulina. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu bổ sung cho các nghiên cứu và ứng
dụng của chủng vi khuẩn G. xylinus trong đời sống.
- Ý nghĩa thực tiễn
Tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng tảo xoắn Spirulina có triển
vọng ứng dụng vào trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực thẩm mỹ dƣỡng da.
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
4
NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới

1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter
thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizommycetes. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn axetic, là loài vi
khuẩn tạo đƣợc nhiều Biocellulose nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào
Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành cellulose
trong 1 giờ [22].
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy,
vấn đề này vẫn đang gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những
nghiên cứu tiếp theo.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học
Gluconacetobacter là trực khuẩn
hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc
khoảng 2µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp
thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử [14]. Các tế bào
đƣợc bao bọc bởi màng nhày có bản chất là
hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi
nhuộm axit H2SO4, bắt màu hồng khi
nhuộm fucshin. Gluconacetobacter có

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan

Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
5

khả năng tích lũy 4,5 % acid acetic trong môi trƣờng, khi nồng độ acid trong
môi trƣờng khá cao sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [4], [25].
1.1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành
khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu
trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trƣờng [26].
Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng ở điều kiện tĩnh,
chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trƣờng một lớp màng Biocellulose.
Ngƣợc lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích
thƣớc không đều nhau và phân tán trong môi trƣờng dinh dƣỡng tạo ra những
đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [14], [33].
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lí:
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35oC, pH: 4 - 6.
Nhiệt độ và pH tối ƣu tùy thuộc vào giống. Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn
toàn ngay cả trong môi trƣờng tối ƣu. Gluconacetobacter có khả năng chịu
đƣợc pH thấp nên ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm acid acetic vào môi trƣờng
nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [37].
+ Đặc điểm sinh hóa:
Năm 1950, Frateur đã chính thức đƣa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer...[30]. Theo quan điểm
này Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,
bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng
khác trong cùng một chi đƣợc trình bày ở bảng 1.1 dƣới đây:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
6

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
[30]
Đặc điểm

STT

1
2
3

4

5

6

7

Hiện tƣợng

Oxy hoá ethanol thành acid Chuyển hoá môi trƣờng chứa Bromphenol

Kết
quả
+

acetic

Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

Hoạt tính catalase

Hiện tƣợng sủi bọt khí

+

Sinh khối không phát triển

_

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men

+

Sinh trƣởng trên môi trƣờng
Hoyer
Chuyển hoá glycerol thành
dihydroxyaceton

Chuyển hoá glucose thành Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
acid
Kiểm tra khả năng sinh sắc
tố nâu
Kiểm tra khả năng tổng hợp
cellulose

trên môi trƣờng chứa CaCO3

+

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon đƣợc cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dƣỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hóa học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lí của từng loại vi sinh vật [7], [8].
Ngƣời ta sử dụng đƣờng làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị
dƣỡng. Đƣờng đơn ở nhiệt độ cao có thể chuyển hóa thành loại hợp chất có
màu tối khó hấp thụ. Trong môi trƣờng kiềm sau khử trùng, đƣờng còn dễ bị
chuyển hóa làm biến đổi pH môi trƣờng. Để tránh hiện tƣờng này khi khử

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
7

trùng môi trƣờng có chứa đƣờng ngƣời ta thƣờng chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở
110oC trong 30 phút. Từ các loại đƣờng đơn tốt nhất nên sử dụng phƣơng pháp
hấp gián đoạn (phƣơng pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác
nhau ngƣời ta sử dụng các nồng độ đƣờng không giống nhau, với vi khuẩn
thƣờng dùng 0,2 - 0,5 % đƣờng, hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá đƣợc các
loại đƣờng ở dạng đồng phân D [5], [37]. Gluconacetobacter sinh trƣởng chính
trong môi trƣờng có ethanol, glucose, glycerol. Có thể sinh trƣởng trong môi
trƣờng chỉ có D - mantolse. Hầu hết các chủng không sử dụng saccarose.
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nƣớc thịt, nƣớc
chiết ngô, nƣớc chiết nấm men, nƣớc chiết đại mạch...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với sinh vật.
1.2.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trƣờng có sử dụng NH4+ trong
môi trƣờng sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42-, Cl-...) làm hạ thấp rất nhiều trị số
pH của môi trƣờng. Muối anion của các acid hữu cơ ít làm chua môi trƣờng
hơn do đó có lúc đƣợc sử dụng nhiều hơn (mặc dù đắt hơn) [5].
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,
xạ khuẩn nhƣng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết
NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trƣờng. Vi sinh vật có khả năng

đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là nguồn
cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho sinh vật. Vi sinh vật không có khả
năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không
chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất
của vi sinh vật.

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
8

1.3. Điều kiện nuôi cấy
1.3.1. Độ pH
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trƣờng có pH
thấp. Do đó trong môi trƣờng nuôi cấy cần bổ sung thêm axit axetic nhằm axit
hóa môi trƣờng, đồng thời axit axetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn
chặn sự phát triển của các vi sinh vật có hại.
1.3.2. Nhiệt độ
Theo Beyger nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Gluconacetobacter vào
khoảng 25 – 350C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến một mức nào đó
sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.
1.3.3. Độ thông khí
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do đó, điều
kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong thực tế
độ thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp Biocellulose.

1.4. Biocellulose
1.4.1. Cấu trúc
Biocellulose có đƣờng kính bằng 1/100 đƣờng kính của cellulose thực
vật (PC-Plant Cellulose). Màng Biocellulose đƣợc cấu tạo bởi chuỗi polyme β 1,4 glucopyranose mạch thẳng, có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose
thực vật nhƣng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [22].
Chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thƣớc 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô (microfibril) [32], những sợi này kết hợp với nhau tạo
thành bó và cuối cùng tạo dải ribbol [36]. Dải ribbol có chiều dài trong
khoảng từ 1-9 nm. Những dải ribbol đƣợc kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với
những dải ribbol của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals
tạo thành cấu trúc mạng lƣới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
9

nuôi cấy. Kích thƣớc bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh
trƣởng [6], [10].

Hình 1.2. Sợi cellulose của màng Biocellulose

Hình 1.3. Sợi cellulose của thực vật

1.4.2. Một số tính chất

Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở
chỗ chúng không có sự kết hợp hemicellulose, lignin hay những thành phần
phụ khác mà đƣợc cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song
song cấu thành mạng lƣới cellulose [1]. Do đó màng Biocellulose có độ bền
cơ học cao, độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nƣớc lớn… hơn hẳn
cellulose của thực vật [25]. Cụ thể:
+ Độ tinh sạch: màng Biocellulose có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so
với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn
toàn
+ Độ bền cơ học: màng Biocellulose có độ bền tinh thể cao, sức căng
lớn, trọng lƣợng lớn, ổn định về kích thƣớc
+ Tính hút nƣớc: màng Biocellulose có khả năng giữ nƣớc đáng kể (lên
đến 99%), có tính tơi xốp, độ ẩm cao.
1.4.3. Cơ chế tổng hợp
Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trƣờng có nguồn
dinh dƣỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12…và các chất
kích thích sinh trƣởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
10

bằng cách hấp thụ dinh dƣỡng từ môi trƣờng bên ngoài vào cơ thể, một phần
để cơ thể sinh trƣởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra
môi trƣờng. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hƣớng từ đáy lên

bề mặt trong môi trƣờng nuôi cấy. Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo
thành cellulose nhƣ sau: Các tế bào Gluconacetobacter khi sống trong môi
trƣờng lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ
đƣờng glucose, kết hợp đƣờng với axit béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng
tế bào. Tiền chất này đƣợc tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế
bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.

Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter
Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bƣớc
đƣợc điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa
nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [17], [20].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó
UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất.
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
11

Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
Giai đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa
chuyển glucose thành glucose-6-phosphate.Enzyme phosphoglucomutase tiếp

tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua
phản ứng isome hóa. Glucose-1- phosphate nhờ enzyme UDP-glucose
pyrophosphorylase chuyển hóa thành UDP-glucose. Cuối cùng, UDP-glucose
đƣợc tổng hợp nên sẽ đƣợc chuyển hóa thành cellulose và cellulose đƣợc tiết ra
môi trƣờng ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase.
Enzym này đƣợc hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP [19].
Một số chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đƣờng
fructose hiệu quả hơn. Hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển
fructose thành fructose-1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ chuyển
hóa thành fructose-bi-phosphate nhờ enzym fructose-1-phosphatekinase.
Enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa
thành fructose-6-phosphate. Glucose-1-phosphate lại tham gia vào quá trình
chuyển hóa tƣơng tự nhƣ trên để tạo ra cellulose [19].
Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan đƣợc nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó
các chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der
Waals. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó
chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16
chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi,
sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi [19].

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
12

Hình 1.5. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn
Gluconacetobacter
1.4.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter
Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung
quanh môi trƣờng hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng, điều này
ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng
cellulose có khả năng giữ nƣớc nên nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất
dinh dƣỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hƣởng của tia UV (tia tử
ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nƣớc của các lớp cellulose mà các tế
bào vi khuẩn kháng lại đƣợc những thay đổi không thuận lợi trong môi trƣờng
sống nhƣ: giảm độ ẩm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại. Các vi khuẩn
Gluconacetobacter có thể tăng trƣởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao [21].
Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ
chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter đƣợc bao
bọc bởi Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách
Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế bào giảm chỉ còn khoảng
3% [33].
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
13

Ngoài ra, màng Biocellulose là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn

Gluconacetobacter luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trƣờng lỏng và không
khí. Chính mạng lƣới này làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi
trƣờng và làm tế bào thu nhận chất dinh dƣỡng một cách dễ dàng hơn so với
khi tế bào ở trong môi trƣờng lỏng không có mạng lƣới cellulose. Trong môi
trƣờng tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để
hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng Biocellulose là một điển
hình.
Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose đƣợc tổng hợp bởi
Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thể sử dụng khi vi sinh vật
này bị thiếu dinh dƣỡng. Sự phân hủy cellulose đƣợc xúc tác bởi enzyme exo
gluconase hay endo glucanase.
1.4.5. Ứng dụng của Biocellulose
Màng Biocellulose đã thu hút đƣợc sự chú ý của nhiều nhà khoa học
trên thế giới và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong công nghệ môi
trƣờng, các nhà khoa học đã dùng màng Biocellulose làm màng phân tách để
xử lý nƣớc, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lƣợng [32], dùng
màng nhƣ một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang,
làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học. Trong công nghiệp giấy, màng
Biocellulose đƣợc sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất lƣợng cao [24].
Trong công nghiệp thực phẩm, nó đƣợc ứng dụng để sản xuất thạch dừa, một
món ăn đƣợc ƣa chuộng ở Đông Nam Á, làm vỏ bao xúc xích,…Trong y học
và dƣợc phẩm, màng Biocellulose đƣợc dùng để trị bỏng, làm da nhân tạo,
mặt nạ dƣỡng da,…

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
14

Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask)
Hiện nay trên thế giới xu hƣớng làm đẹp từ các sản phẩm tự nhiên
không chứa chất hóa học đang rất thịnh hành. Hàng loạt các hãng mĩ phẩm
lớn đều tập trung nghiên cứu cho ra những sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc
tự nhiên không có hoặc rất ít tác dụng phụ trong đó có mặt nạ dƣỡng
da (Biocellulose mask). Biocellulose mask đƣợc sản xuất bằng công nghệ vi
sinh và nguồn nguyên liệu chính là nƣớc dừa. Màng thu đƣợc đƣợc xử lí
thành phẩm và bổ sung thêm các hoạt chất với các hƣớng ứng dụng khác
nhau nhƣ: làm trắng da, trị mụn hay làm mờ vết nám…
Ở Việt Nam, mặt nạ Biocellulose từ nƣớc dừa lần đầu tiên đƣợc sản
xuất tại tỉnh Bến Tre đƣợc kiểm nghiệm nhiều lần tại trung tâm kiểm nghiệm
dƣợc và mĩ phẩm Bến Tre và đƣợc sở y tế xét duyệt chấp nhận (Số công bố
013/11CBMP-BT do sở y tế Bến Tre cấp). Đây là lần đầu tiên mặt nạ 100%
thiên nhiên xuất hiện ở nƣớc ta, có nguồn gốc từ nƣớc dừa, hoàn toàn không
cần dùng khăn giấy hay sợi để làm khuôn định hình nhƣ các loại mặt nạ
thƣờng thấy trên thị trƣờng. Khác với các mặt nạ hóa chất trên thị trƣờng có
tác dụng hóa chất ngay lập tức và không tốt về lâu dài cho da mặt, mặt nạ
nƣớc dừa có công dụng từ từ mang đến làn da trắng sáng, mịn màng một cách
tự nhiên và đẹp nhất. Mỗi tấm mặt nạ đƣợc đóng riêng trong từng túi nhôm
kín, độ dày 1 mm, 2 mm, 3 mm, trọng lƣợng 60 gram [41].
1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Biocellulose hiện nay
1.51. Trên thế giới
Vi khuẩn Gluconacetobacter và màng Biocellulose đã thu hút đƣợc sự
chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực: công nghệ môi trƣờng, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y
học... Các nghiên cứu hiện nay về màng Biocellulose trên thế giới đã tập trung

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan


Luận văn thạc sĩ

ĐHSPHN2
15

vào vấn đề đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng Biocellulose vào
các lĩnh vực khác nhau.
Nghiên cứu về màng Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter và
những ứng dụng của nó đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả
Brown dùng màng Biocellulose làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí
nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng tế bào [27].
Brown, Jonas và Farad, dùng màng nhƣ một chất để biến đổi độ nhớt, để làm
ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm
hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Barbara Surma và cộng sự (2008), Jonas và
Farad (1998) dùng màng Biocellulose để sản xuất giấy chất lƣợng cao, làm cơ
chất để cố định protein thay cho sắc kí. Đặc biệt, trong y học, ngƣời ta đã chế
tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và
chitosan, hoặc cellulose và polyvinul, các phức chất này đƣợc sử dụng làm da
tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều
trị các bệnh tim mạch.
Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng đƣợc ứng dụng
trong phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng Biocellulose còn đƣợc sử dụng
làm mặt nạ dƣỡng da cho phụ nữ, làm giấy chất lƣợng cao, microbial
cellulose đƣợc dùng chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua

dệt), thực phẩm phụ gia,...
Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh
hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng hình thành màng Biocellulose; nghiên
cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên
cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao từ màng vi khuẩn; nghiên
cứu về con đƣờng hình thành cellulose ở vi khuẩn, cấu trúc sợi cellulose và
đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả năng hình thành cellulose
và khả năng sinh axit acetic [22]; trong khi đó Alina Krystynowicz và cộng sự
GVHD: Đinh Thị Kim Nhung

HV: Nguyễn Thị Kim Ngoan