NGHIÊN cứu lý THUYẾT về PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT hợp CHẤT PROTIT

hướng dẫn đọc toàn văn báo cáo KQNC

!
!

Bạn muốn đọc nhanh
những thông tin cần thiết ?
Hy đọc qua Mục lục bên tay trái bạn trước khi
đọc báo cáo ( với Acrobat 4.0 trở lên, cho trỏ chuột vào
mỗi đề mục để đọc toàn bộ dòng bị che khuất )

! Chọn đề mục muốn đọc và nháy chuột vào đó
!
!

Bạn muốn phóng to hay thu nhỏ
trang báo cáo trên màn hình ?
Chọn, nháy chuột vào 1 trong 3 kích th
thưước
có sẵn trên thanh Menu

, hoặc

! Mở View trên thanh Menu, Chọn Zoom to
! Chọn tỷ lệ có sẵn trong hộp kích th
thưước
muốn,, Nhấn OK
hoặc tự điền tỷ lệ theo ý muốn

Chúc bạn hài lòng
với những thông tin đđưược cung cấp

NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP
TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT PROTIT
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hợp chất thiên nhiên (Natural product) là một trong những lĩnh vực rất thú
vị trong bộ môn Hóa Hữu cơ. Lĩnh vực này nghiên cứu về thành phần, cấu tạo và
tính chất của những hợp chất thiên nhiên và cách trích ly chúng từ nguồn thiên
nhiên vô tận.
Protit là hợp chất cao phân tử sinh học, có trong cơ thể động vật và thực
vật, chủ yếu là trong động vật. Protit bao gồm protein và proteit, là những hợp
chất quan trọng và cần thiết trong đời sống của động vật, thực vật và cả con
người.
Protein là một trong những thành phần quan trọng nhất của động vật và
thực vật. Tất cả các enzyme, hầu hết các hoóc môn, một phần lớn hệ thống miễn
dịch của chúng ta, tất cả các cơ và rất nhiều các mô khác của cơ thể được tạo
nên bởi protein.
Protein đóng vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người, nó là
thành phần dinh dưỡng cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung cấp vật
liệu như da, lông, tơ phục vụ sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như
gia tăng thời gian bảo quản.
Nhiều năm qua việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung
cấp protein, đặc biệt là các enzyme, đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và
sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.
Phần lớn enzyme sử dụng trong công nghiệp là các protein ngoại bào từ các
cơ thể. Nhiều loại trong số này vẫn còn được sản xuất từ các chủng gốc tự nhiên
của vi sinh vật. Tuy nhiên, trong sản xuất protein/enzyme để sử dụng trong các
lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng và cho các ứng dụng trị liệu, công nghệ
1

protein/enzyme và công nghệ DNA tái tổ hợp đã thể hiện một vai trò ngày càng
quan trọng.
Nhiều loại loại protein/enzyme được sản xuất trong các hỗn hợp nội bào
phức tạp đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình tinh sạch chúng. Những
protein/enzyme được tinh sạch này thường được sản xuất để sử dụng trong trị
liệu, do đó phải cố gắng hướng tới các tiêu chuẩn tinh sạch rất cao và để có được
điều này người ta cần phải phát triển các quy trình tinh sạch phức tạp.
Vì những lý do đó tôi chọn đề tài: "Nghiên cứu lý thuyết về phương pháp
tách chiết hợp chất protit".
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm hiểu về protit, cấu tạo, tính chất và phân loại protit.
- Các phương pháp tách chiết, tinh sạch protit.
3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Cơ sở lí thuyết, phương pháp tách chiết protit.
- Phạm vi nghiên cứu: Các phương pháp tách chiết protit.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong khóa luận này nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
- Nghiên cứu tài liệu, giáo trình liên quan đến phương pháp tách chiết
protit.
- Nghiên cứu ví dụ cho phương pháp tách chiết, tinh sạch protit.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nghiên cứu lí luận: Đọc các giáo trình, tài liệu tham khảo
liên quan đến phương pháp tách chiết protit và ví dụ về phương pháp tách chiết
protit.
- Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia: Lấy ý kiến của giáo viên trực tiếp
hướng dẫn và các giáo viên khác trong lĩnh vực đề tài để hoàn thiện nội dung và
hình thức của khóa luận này.

2


- Phương pháp học hỏi và tổng kết: Học hỏi kinh nghiệm của các anh, chị
khóa trước, sau đó rút ra kinh nghiệm cho bản thân và tổng kết những kiến thức
đã tìm hiểu để hoàn thành khóa luận.
6. Đóng góp của khóa luận
- Đưa ra được lí thuyết về phương pháp tách chiết, tinh sạch protit, một hợp
chất quan trọng đối với con người, động vật và thực vật.
- Giới thiệu về protit gồm cấu trúc, tính chất, phân loại. Giúp chúng ta nhận
ra được tầm quan trọng của protit trong đời sống.
7. Cấu trúc khóa luận
Ngoài phần Mở đầu, Kết luận và Danh mục tài liệu tham khảo, khóa luận
gồm 3 chương:
Chương 1: Tổng quan sơ lược về protit.
Chương 2: Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein.
Chương 3: Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội
tạng và đầu tôm sú bằng phương pháp sắc kí lọc gel.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN SƠ LƯỢC VỀ PROTIT
1.1. Giới thiệu về protit
Protit là hợp chất cao phân tử sinh học, có trong cơ thể động vật và thực
vật, chủ yếu là trong động vật. Thực vật tổng hợp protit từ CO 2 và H2O bằng
quang hợp cùng với các nguyên tố khác như N, P, S, Fe, Mg có trong muối tan
của đất, còn cơ thể động vật có thể tự tổng hợp được một số aminoaxit, gọi là
aminoaxit thế, còn đại đa số aminoaxit là đưa từ ngoài vào cơ thể, từ đó có thể

tổng hợp ra protit.
Khi thủy phân đến cùng sẽ tạo thành các α-aminoaxit, thường protit có khối
lượng phân tử khoảng 104 đến 107.
1.2. Phân loại protit
Protit được chia ra làm hai loại chính: protein và proteit:
1.2.1. Protein
Protein là loại protit đơn giản, cấu trúc chỉ từ những α-aminoaxit khác
nhau. Các α-aminoaxit kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết
peptit (gọi là chuỗi polypeptit).
H
|
(gốc hữu cơ R) R – C – COOH (nhóm cácbôxylic)
|
NH2 (nhóm amin)
Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các
bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
Protein bao gồm hai loại chủ yếu: Protein tan trong nước và protein
không tan trong nước.
1.2.1.1. Protein tan trong nước
Protein tan trong nước thường kết tủa khi đun nóng, khó kết tủa trong
dung dịch muối.

4


 Albumin là protein đơn giản phổ biến nhất. Nó được tìm thấy ở trong
máu, dịch tế bào, dịch tuỷ sống. Anbumin có trong lòng trắng trứng, mô bắp thịt,
sữa. Anbumin chứa trong sữa cùng với protit khác gọi là cazein, bọt nổi lên khi
đun sôi sữa chủ yếu là anbumin. Albumin hoà tan trong nước và các dung dịch
muối. Anbumin trung tính, tương đối khó kết tủa trong dung dịch muối, vón lại

khi đun nóng. Albumin đông khi đun nhưng ở các nhiệt độ khác nhau: albumin
trứng đông ở nhiệt độ 560ºC, albumin huyết thanh ở 670ºC, albumin sữa ở
720ºC.
Albumin của động vật (như albumin huyết thanh của máu) khi thuỷ phân
cho 19 axit amin và thành phần các axit amin ít khác nhau ở các động vật (trừ
vịt). Albumin thường chứa số lượng lớn các axit amin sau: leucin, axit glutamic,
axit aspartic, lysin, còn các axit amin như methionin, tryptophan, glycocol... số
lượng ít hơn. Trọng lượng phân tử của albumin khoảng 35.000 - 70.000, điểm
đẳng điện nằm trong khoảng 4,6-4,7.
Albumin thường tạo thành các phức chất với lipid, axit béo, axit amin,
kháng thể...nên có quan điểm cho rằng nó giữ vai trò tích cực trong trao đổi vật
chất.
1.2.1.2. Protein không tan trong nước
Protein không tan trong nước có tính axit hoặc bazơ yếu, không tan trong
dung dịch muối. Loại này có vài nhóm sau:
 Globulin không tan trong nước, là axit yếu, tan trong dung dịch muối
loãng, kết tủa trong dung dịch muối đặc hơn. Globulin có trong protit của lòng
đỏ trứng, trong máu, cơ bắp thịt, thường là chất đầu để hình thành protit thực
vật. Globulin hầu như nằm cùng với albumin và rất phổ biến trong tự nhiên. Nó
có nhiều trong máu động vật, trong các cơ quan, tế bào, trong các dịch lỏng của
cơ thể.
Globulin chứa khoảng 14-19 axit amin quan trọng như: leucin, vang, ly sin,
axit glutamic, sâm, treo nin. Trọng lượng phân tử của globulin khoảng 90.000 1.500.000 hoặc lớn hơn, điểm đẳng điện nằm trong khoảng 5,0-7,5.
5


 Histon là protein có cấu tạo đơn giản là protit có tính bazơ, có trong hồng
cầu, trong các nucleoproteit leucocit. Histon dễ tan trong nước, không tan trong
dung dịch amoniac loãng. Nó chứa số lượng axit amin quan trọng ít hơn so với
albumin và globulin. Trong histon không có cystein, cystin, tryptophan, mà chủ

yếu là arginin và lysin (20-30%). Histon được Koccel tìm thấy trong nhân
tế bào, trong thành phần của nucleoprotein và các protein phức tạp khác. Điểm
đẳng điện của histon nằm trong khoảng 9,0 - 11,0.
 Protamin có tính bazơ mạnh, không chứa S, có trong cá nhà táng được
coi là chất protit đơn giản nhất trong protit, cho muối kết tinh. Protamin được
Miser và Koccel tìm thấy trong thành phần của nucleoprotein của tế bào sinh
dục cá. Sau đó còn phát hiện ở lách, tuyến điều và các cơ quan khác.
Protamin có trọng lượng phân tử thấp (2.000-8.000), thành phần chứa ít axit
amin (6 - 8), trong đó chủ yếu là axit amin điamin (tới 80% arginin). Khi đun
protamin không đông và không sa lắng, nó chỉ sa lắng bởi muối kim loại nặng.
Điểm đẳng điện của protamin nằm trong khoảng 10,5 - 12,0.
 Prolamin có trong ngũ cốc, tan trong rượu 80%. Chất tiêu biểu là glyadin,
là thành phần chính của gluten. Gluten (protit dính, tách được khi lọc tinh bột) là
hỗn hợp protit, ưu tiên có glyadin tan trong rượu còn các protit khác không tan
trong rượu. Prolamin có nhiều ở các hạt thảo. Đặc điểm của prolamin là tính hoà
tan trong cồn 70% và không tan trong nước. Khi thuỷ phân prolamin thường cho
nhiều thoăn và axit glutamic (43%).
 Keratin là chất chủ yếu của tóc, lông, sừng, móng, lớp thượng bì...hoàn
toàn không tan, kể cả trong dung dịch axit, kiềm. Khi thuỷ phân cho nhiều cystin
(7 - 12%) và axit glutamic (4 - 17%).
 Colagen (và procolagen) là protein của sợi mô liên kết ở gân, ở da, ở
dưới da, có trong cơ bắp, xương, … Nó không hoà tan trong nước, nhưng khi tác
động lâu của nhiệt sẽ trở thành dạng hoà tan là gelatin. Keo dán chế ở da trâu
chính là colagen. Hàm lượng glycin của colagen khá cao (25%), nhưng về nhiều
axit amin không thay thế được thì lại thiếu.
6


1.2.2. Proteit
Proteit là loại protit phức tạp, ngoài thành phần protein còn có các thành

phần khác gọi phi protein.
 Photphoproteit: là proteit chứa axit photphoric, có tính axit. Chất phổ
biến là cazein có trong sữa, vitelin có trong lòng đỏ trứng.
 Nucleoproteit có trong nhân tế bào, khi thủy phân cho protein và axit
nucleic.
 Chromoproteit là proteit bao gồm protein và chất có màu, chẳng hạn như
hemoglobin.
 Glucoproteit có nhiều trong tuyến thận, gan, khi thủy phân cho protein và
các chất đường olyosaccarit hay polysaccarit.
 Lipoproteit khi thủy phân cho protein và chất béo.
 Về mặt cấu trúc, protit được chia ra làm hai loại: prrotit sợi và protit dạng hạt
cầu.
1.3. Cấu trúc của protit
Cấu trúc của protit rất phức tạp, nhất là các proteit, song về cơ bản gồm các
loại khác nhau phụ thuộc vào mạch phân tử và tương tác giữa các phân tử.
Cấu trúc không gian: có 4 bậc cấu trúc cơ bản
Cấu trúc bậc 1: Là trình tự sắp xếp các amino axit trong chuỗi polipeptit, là
chuỗi axit amin ở dạng mạch thẳng, có tính đặc thù bởi số lượng, thành phần,
trật tự sắp xếp các axit amin.
Cấu trúc bậc 2: Được tạo thành từ các chuỗi protein bậc 1 xoắn cuộn vào
nhau một cách đều đặn. Các protein có thể xoắn tạo nên cấu trúc xoắn α hoặc
gấp khúc tạo nên cấu trúc gấp β.
Cấu trúc bậc 3: Là hình dạng không gian ba chiều của protein do kiểu bậc 2
cuộc xếp theo kiểu đặc trưng cho từng loại protein.
Cấu trúc bậc 4: Do các cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo thành khối
protein có dạng hình cầu.
7


Hình 1.1. Cấu trúc không gian của protein

1.3.1. Cấu trúc bậc nhất
Protit

là

một

chuỗi

aminoaxit kết hợp với nhau
bằng liên kết peptit tạo nên một
chuỗi mạch dài polypeptit gọi
là cấu trúc bậc nhất.
Cấu trúc bậc nhất được
thiết lập bằng phương pháp
phân tích nhóm cuối.
Trong mạch peptit, ngoài liên kết bình thường trong mạch còn có liên kết
sunfua giữa các phần của mạch, gọi là liên kết sunfua nội phân tử, thường là
giữa hai gốc cystein trong cùng mạch.
Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các axit
amin trên chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi
polypeptit, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính

8


chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit
amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.
1.3.2. Cấu trúc bậc hai
Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptit trong không gian. Chuỗi

polypeptit thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và
cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở
gần nhau. Các protein sợi như keratin, Collagen... (có trong lông, tóc, móng,
sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều nếp gấp β hơn.
Tính cứng của mạch peptit do hạn chế khả năng quay của liên kết như trên
đã nói, ngoài ra cấu trúc ba chiều của phân tử peptit còn do hai nhân tốt khác:
liên kết giữa các mạch và tương tác van der Waals hay tương tác Coulomb.
Liên kết giữa các mạch là liên kết đisunfua, chẳng hạn giữa hai đơn vị
cystein của hai mạch như trong insulin, đã hạn chế sự quay của phân tử.
Liên kết hiđro giữa hai phân tử hay trong nội bộ phân tử do mạch peptit có
chứa nhóm CO và NH. Liên kết hidro giữa oxi của CO với H của NH.
Liên kết sunfua và hiđro làm cho peptit có cấu dạng gọi là cấu trúc bậc hai
(có tài liệu gộp cấu trúc bậc một và hai thành cấu trúc chung bậc nhất).

Hình 1.2. Cấu trúc bậc 2 của protein
9


1.3.2.1. Cấu trúc vòng xoắn α
Cấu trúc này tự quay quanh nó mỗi vòng có chiều cao là 5.4 A º có chiều
cao là 5.4 A. Nên chúng ta nói rằng chuỗi xoắn α tương ứng khoảng 3.6
amino axit mỗi vòng.
Cấu trúc này được bền vững hóa nhờ liên kết hiđro gắn với nguyên tử
nitơ tích điện âm của liên kết peptit và nhóm nguyên tử -CO- tích điện âm của
amino axit thứ 4 trên vùng tận cùng của amino axit của liên kết peptit. Bên
trong chuỗi helix, mỗi liên kết peptit (trừ liên kết kề với 2 đầu của chuỗi)
tham gia vào liên kết peptit đó. Mỗi vòng liên tiếp của chuỗi helix chứa 3 đến
4 liên kết hiđro. Tất cả liên kết hiđro đó tạo nên tính ổn định cho cấu trúc
chuỗi xoắn helix.

Hình 1.3. Cấu trúc vòng xoắn α
1.2.3.2. Cấu trúc nếp gấp β
Trong dạng cấu trúc polypeptit này không có dạng xoắn ốc, thay vì thế, nó
có dạng zigzag hơn là xoắn α.

10


Các chuỗi polypeptit zigzag có thể được sắp xếp kế tiếp nhau tạo thành cấu
trúc một loạt các nếp gấp gọi là phiến (sheet); liên kết hiđro được tạo bởi các
đoạn kề nhau của chuỗi polypeptit. Các chuỗi polypeptit trong một phiến có thể
song song hoặc đối song (cùng hoặc ngược hướng amino – carboxyl tương ứng).
Cấu trúc này khá giống nhau, mặc dù đoạn lặp lại ở cấu trúc song song là ngắn
o

o

hơn (6.5 A , ở cấu trúc đối song là 7 A ) và kiểu liên kết hiđro khác nhau.
Phiến β song song ít xoắn hơn dạng đối song và luôn bị chôn vùi. Ngược
lại, phiến đối song có thể thấy sự xoắn rõ rệt hơn và dễ hòa tan hơn.

Hình 1.4. Cấu trúc nếp gấp β
1.3.3. Cấu trúc bậc ba
Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có
hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein.
Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức
năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R
trong các mạch polypeptit.
Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfua (-S-S-), nhóm
-R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định

điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các

11


nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết
hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu.

Hình 1.5. Cấu trúc bậc ba của protein
1.3.4. Cấu trúc bậc bốn
Khi protein có nhiều chuỗi polypeptit phối hợp với nhau thì tạo nên cấu
trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptit liên kết với nhau nhờ các liên kết
yếu như liên kết hyđro.
Chuỗi polypeptit (có cấu trúc bậc một) được xoắn lại thành ống trụ (cấu
trúc bậc hai), ống trụ cuộn tròn lại thành trụ (cấu trúc bậc ba), các thành trụ kết
hợp lại với nhau thành một tổ hợp các phân tử protein (cấu trúc bậc bốn).

Hình 1.6. Cấu trúc bậc bốn của protein
12


1.4. Tính chất của protit
1.4.1. Tính chất lưỡng tính
Do thành phần protit là các phân tử axit amin, mà axit amin là chất lưỡng
tính nên protit cũng là phân tử lưỡng tính, có điểm đẳng điện đặc trưng cho từng
loại protit. Nói chung, điểm đẳng điện nằm trong vùng axit pH = 4,6 - 6,3. Đặc
tính của protit là tính chất của dung dịch đệm.
Ngoài ra, do trong thành phần amino axit của protein có 2 nhóm:
- Các amino axit: trong cấu tạo có 2 nhóm COOH, trong đó 1 nhóm dùng
để tạo liên kết peptit còn một nhóm hình thành ion COO-.

- Các amino axit kiềm: trong cấu trúc có 2 nhóm NH2, trong đó một
nhóm tạo liên kết peptit còn một nhóm hình thành NH 3 .

Như vậy, phân tử protein vừa có khả năng phân ly như một axit tạo COOvừa có khả năng phân ly như một chất kiềm tạo NH 3 nên mang tính lưỡng tính.
1.4.2. Phản ứng màu
Protit cũng có phản ứng màu, như phản ứng biure, milon, xangtoproteit,
ninhidrin.
 Phản ứng biure: protein phản ứng với CuSO 4 trong môi trường kiềm cho
dung dịch màu xanh tím. Phản ứng Biure giúp nhận ra liên kết peptit.
 Phản ứng xangtoproteit: Protein phản ứng với HNO 3 đặc tạo ra kết tủa
màu vàng. Thực chất đây là phản ứng nitro hóa nhân thơm có trong protein như
phenylalanin, tyrosin, tryptophan.
 Phản ứng ninhidrin: protein tác dụng với dung dịch ninhidrin trong nước
cho dung dịch màu xanh. Phản ứng này đặc trung cho α-amino axit có trong
phân tử protein.

13


1.4.3. Tính tan
Tính tan của protit thay đổi phụ thuộc vào khối lượng phân tử, trật tự kết
hợp giữa các phân tử, tương tác giữa các phân tử, nhất là sự hình thành liên kết
hiđro và đisunfua và còn phụ thuộc vào dung môi, môi trường, nhiệt độ...
Các protein hình sợi như keratin (của móng, tóc, sừng), fibroin (của tơ tằm)
hoàn toàn không tan trong nước. Protein hình cầu của anbumin, globulin của sữa
và của máu có thể tan trong nước tạo thành dung dịch keo vì trên bề mặt phân tử
có nhiều nhóm nguyên tử phân cực tích điện, các phân tử lưỡng cực của nước bị
hấp thụ bởi các nhóm nguyên tử nêu trên, tạo thành màng nước bao quanh phân
tử protein gọi là lớp vỏ hiđrat hóa.
Tại điểm đẳng nhiệt protein tan kém nhất, nếu thêm axit hoặc kiềm có thể

làm tăng độ tan.
Một số muối trung tính có thể làm ảnh hưởng đến độ tan của protein. Tính
tan của protein tan khi nồng độ muối thấp, khi nồng độ muối cao gây ra sự kết
tủa protein. Ở nhiệt độ thấp tính tan của protein giảm.
1.4.4. Sự biến tính của protit
Tính chất của protit thay đổi dưới tác động của các tác nhân vật lý hoặc hóa
học gọi là sự biến tính protit, như:
 Nhiệt
 Các bức xạ tử ngoại
 Sự biến đổi độ pH
 Các chất tẩy rửa
 Các dung môi hữu cơ (trừ nhiệt độ dưới 0oC)
 Dung dịch ure hay guanidin
 Sự pha loãng đơn giản hay sự khuấy đơn giản cũng có thể là nguyên
nhân gây sự biến tính của protit, điều này rất cản trở khi ta muốn tinh
chế một protein.
Quá trình biến tính đã gây ra sự thay đổi cấu trúc của phân tử protit, làm
thay đổi liên kết.
14


Sự biến tính có thể là quá trình thuận nghịch hay không thuận nghịch. Điều
này xảy ra khi có sự chuyển từ trạng thái trật tự cao xuống trạng thái ít trật tự.
Ở trạng thái tự nhiên, protein có cấu dạng bền nhất theo quan điểm năng
lượng ở những điều kiện trong tế bào; nếu ta thay những điều kiện này, các cấu
dạng của protein sẽ bị biến tính, các liên kết hyđro và các liên kết khác cũng sẽ
đứt và gây nên sự xáo trộn cấu trúc bậc hai và bậc ba.
1.4.5. Sự kết tủa protit
Rất nhiều hợp chất phản ứng với protein tạo thành dạng kết tủa không màu,
bao gồm các hợp chất:

- Các muối của kim loại nặng: HgCl2, CuSO4, (CH3COO)2Pb,
(CH3COO)2Zn.
- Các axit: HNO 3 , axit axetic, axit tricloaxetic.
- Các dung môi hữu cơ: Ancol etylic, axeton, ancol metylic.
Có hai loại kết tủa: Kết tủa thuận nghịch và kết tủa bất thuận nghịch.
Kết tủa thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây ra
kết tủa, protein lại tan trong nước tạo thành dung dịch keo như trước và vẫn giữ
nguyên tính chất của chúng. Kết tủa thuận nghịch không làm thay đổi tính chất
của protein.
Ví dụ như cho dung dịch (NH4)2SO4 vào dung dịch lòng trắng trứng sẽ xuất
hiện kết tủa bông của globulin. Khi loại bỏ (NH4)2SO4, kết tủa globulin lại tan
trở lại trong nước tạo thành dung dịch keo.
Kết tủa bất thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây
kết tủa, protein mất khả năng tạo dung dịch keo bền. Kết tủa bất thuận nghịch
làm thay đổi tính chất của protein.
Khi đun nóng trứng hoặc sữa, thì sau khi đun chúng không thể trở về dạng
đồng thể như ban đầu. Kết tủa bất thuận nghịch cũng xảy ra trong trường hợp có
mặt của muối kim loại nặng như Fe, Cu, Hg, Pb. Các tác nhân này thường làm
thay đổi lớp vỏ hiđrat hóa và lớp vỏ điện tích.

15


1.4.6. Hoạt tính sinh lý
Protein cũng như polypeptit có vai trò rất quan trọng và rất đa dạng trong
sự sống của sinh vật. Để đơn giản và vắn tắt, có thể nói vai trò chủ yếu của
protein là vai trò cấu trúc hóa. Chẳng hạn; α-keratin là cấu tử cấu trúc nên tóc,
da lông, móng. Collagen là nguyên liệu cấu thành các mô liên kết như xương,
sụn, gân. Fibroin là tơ của các mạng nhện và của kén…
Một số protein là nguồn dự trữ. Ovalbumin có bản chất làm nguồn thức ăn

trong lòng trắng trứng. Cazein có vai trò quan trọng trong sữa. Một số protein
làm vai trò của hoocmon như insulin điều hòa quá trình trao đổi chất của
glucozơ, β-endorphin, giống như morphin, gây ra sự đau tự nhiên cho cơ thể.
Một polypeptit khác là mellitin có 26 aminoaxit, là chất độc của ong, có
chức năng sinh học bao gồm các khả năng thấm sâu vào màng tế bào và phân
hủy erythrocyt (tế bào máu đỏ).
Protit còn đóng vai trò của enzym, có liên quan tới cấu trúc phân tử, lực
tương tác nội và giữa các phân tử, liên quan tới tính chất hóa học của nhóm
chức, tính axit và tính bazơ, tính oxi hóa và khử, cũng liên quan tới sự thay đổi
năng lượng và tốc độ phản ứng.

16


CHƯƠNG 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG QUÁ TRÌNH
TINH SẠCH PROTEIN
2.1. Chuẩn bị dịch protein thô
Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa
protein về dạng dịch. Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu,
nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng siêu âm. Các phương
pháp kể trên thích hợp để xử lý các mô mềm, mô động vật, thực vật. Đối với vi
khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất là nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật
liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lý với lysozyme (enzyme phá vách tế
bào). Đối với những loại tế bào có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một
số trường hợp phải sử dụng máy ép tạo áp suất cao để phá vỡ tế bào. Một số
trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phá mẫu.
2.2. Ổn định protein trong dịch chiết thô
Sau khi giải phóng khỏi vách tế bào, protein bắt đầu chịu tác động phá hoại
của nhiều yếu tố khác nhau. Do vậy việc đầu tiên là phải tạo điều kiện ổn định
cho protein.

Sự ổn định của protein phụ thuộc vào độ phân cực hay lực ion, pH, sự có
mặt hay vắng mặt của ion kim loại, sự oxy hóa, protease nội bào và nhiệt độ.
Thông dụng nhất là sử dụng giá trị pH sinh lý hoặc đệm Tris và phosphate. Các
ion Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ thường làm tăng sự ổn định của protein, trong khi
các ion kim loại nặng Ag  , Cu 2 , Pb 2 , Hg 2 thường làm biến tính protein, đặc
biệt protein chứa nhóm -SH.
Để tránh nhiễm bẩn bởi ion kim loại nặng, nên chuẩn bị đệm từ hóa chất
sạch trong dụng cụ thủy tinh hoặc dùng tác nhân EDTA 10 -4 M bổ sung vào
đệm. Để giảm thiểu tác động của quá trình oxy hóa (đặc biệt với các phân tử
protein chứa nhóm –SH) cần bổ sung thêm mecaptoetanol, cystein và
dithiotheitol 10-3 M vào đệm.

17


Để giảm thiểu tác động của protease nội bào cùng giải phóng cần bổ sung
chất ức chế protease như phenyl metyl sufonyl florua. Tốt nhất là dịch thô được
bảo quản ở nhiệt độ thấp.
2.3. Các phương pháp tủa protein
Có 5 phương pháp lắng tủa protein: tủa bằng muối, lắng tủa bằng dung môi
hữu cơ, lắng tủa điểm đẳng điện, lắng tủa bằng polyme không mang điện và lắng
tủa bằng các chất đa điện phân.
2.3.1. Tủa bằng muối Sunfat ở các nồng độ khác nhau.
Để tinh sạch protein ở mức độ phòng thí nghiệm, tủa bằng amonium sulfat
thường được sử dụng bước đầu trong quy trính tách chiết và tinh sạch protein. Ở
các nồng độ muối cao protein sẽ tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính.
Khi cho thêm muối vào protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion,
chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy các phân tử
protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Khi đủ một
lượng muối vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này được thực hiện

trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính. Sau đó thu
tủa protein bằng cách ly tâm và hòa tan trở lại trong dung dịch đệm có nồng độ
muối thấp. Dung dịch lúc này vẫn chứa nhiều muối còn lại trong tủa.
Có nhiều phương pháp để rửa muối khỏi protein nhưng người ta thường
loại muối bằng phương pháp thẩm tích hay phương pháp lọc gel. Dung dịch sau
khi rửa sạch muối được giữ để sử dụng cho các quá trình tinh sạch và phân tích
tiếp theo.
2.3.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ
Các dung môi hữu cơ như: acetone, isopropanol, ethanol (được dùng nhiều
nhất). Ưu điểm của phương pháp là cho kết quả tủa tốt hơn so với tủa bằng
muối, không cần loại muối trước khi chạy sắc ký, cách tiến hành đơn giản.
Nhưng khi tủa bằng dung môi hữu cơ phải thực hiện trong điều kiện lạnh vì nếu
tủa ở nhiệt độ thường sẽ làm biến tính protein, lượng dung môi cần dùng tương
đối nhiều.

18


2.3.3. Tủa bằng điểm đẳng điện
Tại điểm đẳng điện, protein bị mất điện tích nên gây tủa. Phương pháp này
cho kết quả rất cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp
với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ.
2.3.4. Tủa bằng các loại polyme
Bao gồm: polyacrylic axit, polysaccarit, polyphotphat. Ưu điểm của
phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polyme, hiệu suất
tạo kết tủa cao. Chi phí cho phương pháp này cao.
2.3.5. Tủa bằng chất đa điện phân
Thường dùng polyetylen glycol có phân tử lượng 6.000 và 20.000. Có thể
sử dụng với lượng chất này rất nhỏ, hiệu suất tạo kết tủa cao. Nhược điểm của
phương pháp là rất đắt tiền và dễ gây biến tính protein.

2.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch protein
Sau khi nhận được dịch tủa protein, công việc tiếp theo sẽ là chiết tách, tinh
sạch để nhận được các phân đoạn protein khác nhau.
2.4.1. Mục tiêu
Mục tiêu của quy trình tinh sạch là nhằm thu được một lượng protein tối
đa dựa trên lượng hoạt tính thu được so với hoạt tính tổng của protein trong dịch
chiết ban đầu. Hơn nữa sản phẩm protein nhận được cũng phải đạt hoạt tính tối
đa, có nghĩa là protein không bị mất hoạt tính trong quá trình bảo quản, không bị
phân giải, và độ tinh sạch cũng phải đạt tối đa, nghĩa là không có sự hiện diện
của các protein hay các đại phân tử sinh học khác.
Không có cách nào để dự đoán hoạt tính của một protein đã được tinh
sạch trong một số điều kiện nhất định nào đó, vì vậy quá trình tinh sạch được
tiến hành cho đến khi nào hoạt tính đặc hiệu của protein (Unit/mg) tăng đến một
giá trị không đổi sau một vài công đoạn của quy trình tinh sạch.

19


2.4.2. Sơ đồ tinh sạch protein
Sơ đồ chung cho quá trình tinh sạch protein có thể được biểu diễn như
sau:

Nguồn
(nguyên liệu)

a)

Nghiền
sơ bộ,
tách các

bào quan

Nghiền

b)

Các bào quan

Trích ly

Phân tách bằng phương
pháp ái lực hấp phụ

Dịch chiết
Quy trình
tinh sạch
(quy mô
lớn)

c)

Enzyme tinh
sạch

Sản phẩm thô
Tinh sạch (quy mô
nhỏ)

Sơ đồ 2.1. Quá trình tinh sạch protein
Trong sơ đồ tổng quát này, quy trình tinh sạch cho một protein nào đó bao

gồm: (a) Nguồn nguyên liệu, (b) Phương pháp nghiền, (c) Phương pháp tinh
sạch.

20


2.4.2. Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein.
Bảng 2.1. Các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein
Đặc tính
Phương pháp
Kích thước hay khối  Ly tâm
lượng
 Sắc ký lọc gel
 Thẩm tích, siêu ly tâm
Độ phân cực
(a) Điện tích
 Sắc ký trao đổi ion
 Sắc ký tập trung
 Điện di
 Điện di điểm đẳng điện
(b) Tính kỵ nước
 Sắc ký tương tác kỵ nước
Tính tan
 Thay đổi pH
 Thay đổi lực ion
 Thay đổi hằng số điện môi
Tâm bám đặc hiệu  Sắc ký ái lực hấp phụ
hay các tương tác  Sắc ký với ion kim loại cố định
cấu trúc đặc hiệu
trên giá thể

 Giải ái lực hấp phụ
 Sắc ký ái lực hấp phụ với các
chất nhuộm màu.
 Hấp phụ miễn dịch
 Sắc ký đồng hóa trị

Qui mô
 Lớn và nhỏ
 Nhỏ
 Nhỏ









Lớn và nhỏ
Nhỏ
Nhỏ
Nhỏ
Nhỏ
Lớn
Lớn và nhỏ
Lớn

2.4.3. Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein
Sau khi đánh giá về những ưu và khuyết điểm của các phương pháp tinh

sạch khác nhau, cần phải xác định một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các
phương pháp tinh sạch và trình tự của các phương pháp này trong quy trình tinh
sạch. Trong thực tế cần phải nhấn mạnh rằng rất ít khi chỉ cần một hay phối hợp
của hai phương pháp mà có thể tinh sạch được protein. Quy trình tinh sạch cụ
thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
 Qui mô và hiệu suất tinh sạch.
 Thời gian cần thiết cho quá trình tinh sạch.
 Trang thiết bị hiện có.
Ngày nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thực sự có hiệu quả trong
việc làm sạch protein. Do đó, việc làm sạch protein thật sự chỉ có hiệu quả khi ta
21


biết lựa chọn các phương pháp riêng kết hợp với nhau, tạo ra phương pháp nối
tiếp nhau một cách hài hòa nhất.
2.4.4. Tinh sạch protein
Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein còn có chất cao phân tử khác
như polysaccharid, axit nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các
chất lipid, muối khoáng,...
Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử
lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay
đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết
hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng
của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối
trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di.
Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân
tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử
dụng ngay cho việc định lượng và định danh.
Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy

vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu
cho pha cố định và pha di động.
Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là
sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử, sắc ký trao đổi ion dựa vào điện
tích của phân tử, sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử
khác và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân
giải cao nhờ vào áp suất.
Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein. Phương pháp chiết tách và tinh
sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột. Trong trường hợp này, các phân đoạn
protein được cho chạy qua cột nhồi bằng các hạt agarose hoặc polyacrylamit nhỏ
được cải biến cho phù hợp. Có một số phương án khác nhau trong việc sử dụng
cột tách chiết và tinh sạch protein. Các quy trình khác nhau được thiết lập có thể
22


khác nhau do đặc tính khác nhau của các loại protein. Ở đây mơ tả một số
phương pháp, trong các phương pháp này, protein được phân lập dựa vào kích
thước và tính tích điện của chúng.
2.4.4.1. Sắc ký trao đổi ion
-

-

-

-

-

-+ ++ +

+ + -+
+ + -+
+- +
+
++ +
+ +

+-+
+
- +
+ +-

+- + +
+
+ +

+
++ +
+ +
+
++ +
+ +
+
++ +
+ +

-

+
++ +

+ +
+
++ +
+ +

+
+ +- ++ +
+
++ +
+ +
- +
++ +
+ +

+
+ -+ +
+ +
+
++ +
+ +
-

+
++ +
+ +
+
++ +
+ +
+
++ +

+ +
-

Cân bằng

Nạp mẫu

Hấp thu mẫu

-

-

+
++ +
+ +
+
++ +
+ +

-+ ++ +
+ + -+
+ + -+
+- +
+
++ +
+ +

++
- + +

+
+ -

+- + +
+
+ +

-

-

Tách, rửa

Tái tạo cột

Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion
Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân lập dựa trên điện
tích ion hóa bề mặt của chúng bằng việc sử dụng các vật liệu làm cột là các hạt
mang các nhóm chức tích điện âm hoặc dương (đây còn được gọi là pha tĩnh).
Các phân tử protein tương tác yếu với các hạt (chẳng hạn như một phân tử
protein tích điện dương được cho chạy qua cột mang các hạt tích điện âm) sẽ
được hồi lưu khi sử dụng một dung dịch muối lỗng chảy qua cột sau đó (dung
dịch chạy mẫu được gọi là pha động). Các phân tử tương tác với pha động càng
mạnh, càng cần dung dịch hàm lượng muối cao để hồi lưu mẫu (bởi muối làm
"trung hòa" các vùng mang điện tích) và vì vậy cho phép các phân tử protein
được giải phóng khỏi cột.
Bằng việc tăng dần nồng độ muối trong các dung dịch đệm thu hồi mẫu,
các phân tử protein khác nhau, kể cả các phân tử có đặc tính tích điện gần giống
nhau cũng được phân tách thành các phân đoạn khác nhau khi chúng được hồi
lưu từ cột.

23


2.4.4.1.1. Kỹ thuật trong sắc ký trao đổi ion
 Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột
- Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột.
- Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa
và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra
những bọt khí nằm giữa các hạt nhựa.
- Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung
dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống.
- Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng cách cho dung dịch đệm
chảy qua cột, cuối cùng kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột.
 Nạp mẫu chất lên đầu cột
- Dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cột, lọc bằng tờ
giấy lọc hay ngang qua một lớp celite.
- Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa.
Điều quan trọng nhất là làm sao để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu
chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của
mẫu.
- Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát
mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại, dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu
cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột.
- Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa
2.4.4.2. Sắc ký lọc gel
Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cơ sở đặc điểm khác
nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước. Khác với trong kỹ thuật
sắc ký trao đổi ion, các hạt được sử dụng để nhồi cột trong kỹ thuật này không
mang các nhóm tích điện mà thay vào đó là mang các lỗ có kích thước khác
nhau. Các phân tử protein càng nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất

cả các lỗ; vì vậy, thời gian chạy qua cột dài hơn và thời gian hồi lưu muộn hơn.
Ngược lại, các phân tử protein kích thước càng lớn càng có thời gian hồi lưu
(chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn.
24