Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin, glycinbetain và hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tương ở điều kiện thiếu nước và nhiễm mặn

Tên đề tài: Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin, glycinbetain và hoạt
độ một số enzym trong mầm đậu tương ở điều kiện thiếu nước và nhiễm
mặn
Người hướng dẫn khoa học :PGS.TS Nguyễn Văn Mã
TS. Trần Khánh Vân
Người thực hiện: Th.S Nguyễn Thị Thao
I. Mở đầu
1.1. Lý do chọn đề tài
Theo báo cáo của Chương trình Lương thực Thế giới dự đoán rằng: các hiện
tượng thời tiết cực đoan như lũ lụt, hạn hán, cháy rừng và bão nhiệt đới sẽ
gây thiệt hại cho ngành nông nghiệp, đe dọa an ninh lương thực cho hàng
triệu người. Việt Nam là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề
nhất bởi biến đổi khí hậu vì có một đường bờ biển dài và các vùng châu thổ
thấp. Hơn nữa, Việt Nam phụ thuộc rất nhiều vào nông nghiệp. Nhiệt độ môi
trường ấm lên một mặt có thể tạo thuận lợi cho sự phát triển một số cây
trồng nhất định, nhưng mặt khác gây bất lợi cho những cây trồng khác. Năng
suất cây trồng đang chậm lại chính là kết quả của những sự kiện liên quan
đến biến đổi khí hậu như lượng mưa giảm và nhiệt độ tăng cao, diện tích đất
nhiễm mặn tăng lên. Vì vậy, ngoài việc phải chống đỡ, thực vật cần phải có
khả năng “sống chung” với điều kiện khí hậu ngày càng cực đoan.
Nghiên cứu về giống cây trồng chịu hạn, chịu mặn và biện pháp nâng
cao khả năng chống chịu của cây trồng đang là chủ đề được nhiều nhà khoa
học quan tâm. Kết quả nghiên cứu của Giri J (2011) về glycinbetain của cây
trong điều kiện stress [12], kết quả nghiên cứu của Diego Ariel, Marta
Rosalia Gulotta, Carlos Alberto Martinez và Marco Antonio Oliva về prolin
và glycine betaine ở prosopis alba trong điều kiện stress muối [11], kết quả
nghiên cứu của Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị


Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003) về mối tương quan giữa hàm
lượng prolin và tính chống chịu ở cây lúa cho thấy vai trò của nhóm chất

duy trì áp suất thẩm thấu [1]. Nghiên cứu của Điêu Thị Mai Hoa, Nguyễn
Phương Thảo, Lê Thị Thanh Hiếu (2011) về ảnh hưởng của áp suất thẩm
thấu cao đến sự nảy mầm, hoạt tính enzyme α-amylase và tích lũy prolin của
mầm đậu xanh (Vigna radiata) [3] và Trần Thị Phương Liên (1999) khi
nghiên cứu về một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng hạn [5] đều
cho thấy cây trồng khi chịu tác động stress của môi truờng sẽ có những biến
đổi về sinh lý, sinh hoá thích nghi. Kết quả nghiên cứu của các tác giả
Atitop, Akimosva, Talamosva, Topchiepva về tính chống chịu của thực vật
trong thời gian đầu tác động nhiệt độ bất lợi cho thấy biểu hiện rõ hai giai
đoạn chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường gồm: các phản ứng không
đặc thù giúp thực vật chống chịu để tồn tại và những phản ứng đặc thù để
thực vật thích nghi [13].
Hướng nghiên cứu sâu tìm hiểu các quá trình, cơ chế phản ứng chống chịu
trong cây đã được nhiều nhà khoa học chú ý nhưng cho đến nay vẫn còn
nhiều điều chưa được thỏa mãn, chưa đủ sức đáp ứng là cơ sở khoa học cho
việc canh tác hiệu quả trong bối cảnh toàn thế giới phải không ngừng nâng
cao năng suất và phẩm chất cây trồng trong điều kiện khắc nghiệt của môi
trường. Nhiệm vụ của chúng tôi đặt ra là tiếp tục làm rõ hơn những luận
điểm trước đây về ảnh hưởng của các tác nhân stress môi trường, góp phần
làm rõ thêm những phản ứng sâu về sinh lí và đặc điểm của quá trình chống
chịu đối với hai loại tác nhân stress chính ở nước ta đối với một loài thực vật
có nhiều giá trị trong đời sống và xuất khẩu. Nghiên cứu này có thể là nền
tảng cho các nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực phân tử và các nghiên cứu
ứng dụng nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng. Vì vậy, chúng tôi lựa
chọn đề tài “Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin, glycinbetain và


hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tương ở điều kiện thiếu nước và
nhiễm mặn”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin và glycine betaine trong mầm đậu
tương ở điều kiện thiếu nước và khả năng phục hồi sau thiếu nước.
- Nghiên cứu động thái hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tương ở điều
kiện mặn và khả năng phục hồi sau nhiễm mặn.
1.3. Những đóng góp mới của đề tài
1) Lần đầu tiên ở Việt Nam tiến hành nghiên cứu sâu về ảnh hưởng của 2
tác nhân môi trường gây stress điển hình: thiếu nước và nhiễm mặn tới một
số biến đổi bên trong của quá trình nảy mầm: hoạt độ các enzym phân hủy
chất dự trữ trong hạt nảy mầm, enzym chống oxy hóa, hàm lượng các chất
bảo vệ tế bào khỏi stress (prolin, glycinbetain) trong suốt quá trình nảy mầm
bị stress và động thái hoạt động của chúng sau thời gian bị stress.
2) Nghiên cứu động thái hoạt động của các chất chống stress và các chất
thúc đẩy hạt nảy mầm có thể góp phần làm rõ mối quan hệ của phản ứng tự
vệ và khả năng sinh trưởng ở giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển cá
thể của đậu tương nói riêng và thực vật nói chung. Đồng thời nghiên cứu
góp phần làm rõ và sâu sắc thêm vai trò sinh lí của các chất chống stress.
3) Cho phép so sánh ảnh hưởng của 2 loại tác nhân stress tới quá trình nảy
mầm và sinh trưởng mầm và khả năng phục hồi sau stress của chúng.
II. Tổng quan tài liệu
2.1. Đặc điểm thực vật học và hóa sinh hạt đậu tương
Đậu tương có tên khoa học là (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ
Đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có bộ NST 2n = 40.
Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân,


lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ
có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định
đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu. Các công trình nghiên cứu cho
thấy những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho
hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất.

Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, lá đậu tương là lá
kép với 3 lá chét, nhưng đôi khi cũng có 4 - 5 lá chét. Đậu tương là cây tự
thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc
trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp,
thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông khi chín có màu vàng hoặc xám.
Hạt đậu tương không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh
một phôi lớn. Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan... Vỏ
hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen... đa số là
hạt màu vàng. Khối lượng hạt rất đa dạng dao động từ 20 - 400 mg/ hạt.
Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng
của giống. Thời gian sinh trưởng của cây đậu tương thường chia ra nhóm
chín sớm, trung bình và muộn.
2.2. Nguyên nhân thiếu nước ở thực vật và ảnh hưởng của thiếu nước tới
thực vật
Nguyên nhân gây thiếu nước ở thực vật:
Nguyên nhân thứ 1: do lượng nước dự trữ cho cây hấp thụ trong đất bị cạn
kiệt nên cây không thể hút đủ nước và mất cân bằng nước.
Nguyên nhân thứ 2: độ ẩm không khí quá thấp làm cho quá trình thoát hơi
nước của cây quá mạnh gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên dưới
khoang khí khổng và không gian bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh
cũng có thể dẫn đến mất cân bằng nước trong cây.


Nguyên nhân thứ 3: xảy ra do trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây
hút được nước mặc dù trong môi trường không thiếu nước. Rễ cây không lấy
được nước trong khi quá trình thoát hơi nước vẫn diễn ra nên cây mất cân
bằng nước. Cây không hút được nước trong môi trường là do nhiệt độ thấp,
do nồng độ dung dịch môi trường quá cao. Khi đó sẽ có sự chênh lệch
gradient nồng độ, cây không những không thể hút được nước mà còn làm
cho nước từ trong tế bào chất thoát ra ngoài.

Ảnh hưởng của thiếu nước đến thực vật
Tác động của hạn lên cây chủ yếu theo hai hướng chính là: làm tăng nhiệt độ
cây và gây mất nước trong cây. Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng,
vừa là sản phẩm khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các
quá trình chuyển hoá sinh học. Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi
chất xảy ra. Sự tác động của hạn, gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm
cho cây bị héo. Hạn hán làm giảm mạnh quang hợp. Khi hàm lượng nước
trong lá còn khoảng 40 - 50% quang hợp của lá sẽ bị đình trệ cản trở sự sinh
trưởng của cây. Như vậy, ảnh hưởng cực đoan của hạn ở bất cứ ở giai đoạn
sinh trưởng nào của cây trồng cũng ảnh hưởng đến các yếu tố cấu thành
năng suất và sản lượng cây trồng.
Đặc biệt, giai đoạn nảy mầm là giai đoạn đầu trong chu kỳ sinh trưởng phát
triển của cây. Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ, trong hạt bắt đầu tăng tính thủy
hóa của keo nguyên sinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo, dẫn đến
các biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất trong hạt liên
quan đến sự nẩy mầm. Đặc trưng nhất là tăng hoạt tính của các enzym thủy
phân phân giải polysacarit, protein và các hợp chất phức tạp khác thành các
chất đơn giản dẫn đến thay đổi hoạt động thẩm thấu. Các sản phẩm thủy
phân này dùng làm nguyên liệu cho quá trình tăng lên mạnh mẽ của phôi
hạt, vừa làm tăng áp suất thẩm thấu trong hạt giúp cho quá trình hút nước


vào hạt nhanh chóng. Tuy nhiên, giai đoạn nảy mầm của hạt là một trong
những giai đoạn quan trọng và mẫm cảm với nhiều yếu tố môi trường bất
thuận đặc biệt là hạn và mặn. Khi gieo hạt trong áp suất thẩm thấu (ASTT)
cao, hạt sẽ bị cản trở sự hút nước và do đó các quá trình sinh lý, hóa sinh
trong hạt bị ức chế và nảy mầm bị kìm hãm [9]. Nếu thiếu nước trong giai
đoạn này sẽ làm giảm tỷ lệ mọc mầm ngoài ra còn ảnh hưởng rất lớn đến
sinh trưởng của cây mầm, tốc độ nảy mầm của hạt sẽ chậm lại, rễ mầm
ngắn, khả năng sinh trưởng của cây mầm kém, mầm được hình thành còi

cọc, cây mầm nhanh ra lá, có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và
phát triển của cây trưởng thành sau này… Ngoài ra, nếu thiếu nước quá lâu,
cây mầm có thể bị khô, héo và chết, dẫn đến giảm đáng kể tỷ lệ nảy mầm và
cây con được tạo thành.
2.3. Tình hình nhiễm mặn và ảnh hưởng của muối tới thực vật
Tình hình đất nhiễm mặn
Chưa có các số liệu chính xác về diện tích đất nhiễm mặn trên thế giới mà
chỉ có ước tính của các nhà khoa học đất trên thế giới. Dregne (1977) đã ước
tính có khoảng 2 tỷ ha đất bị nhiễm mặn. Massoud ( 1974) đã ước tính thế
giới có 932 triệu ha đất nhiễm mặn. Trong đó, có 316 triệu ha ở các nước
đang phát triển. Theo Dudal và Pumell (1986), các đất nhiễm mặn chiếm
khoảng 7% diện tích đất thế giới.
Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng
năm những vùng trồng lúa ven biển đều chịu thiệt hại rất nhiều do sự xâm
thực của nước biển (Lê Sâm, 2003). Theo thống kê diện tích đất ngập mặn
năm 1992 là 494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha, và đến năm 2005 là
gần 676.000 ha [17]. Nguyên nhân mặn là do muối biển, phổ biến là mặn


NaCl. Thực tế, trên các vùng đất mặn cuả nước ta hiện nay hoặc bỏ hoang
hoá hoặc trồng trọt một số cây hạn chế với năng suất thấp. Chính vì vậy mà
việc nghiên cứu bản chất sinh lý tính chống chịu mặn của thực vật có ý
nghĩa rất lớn trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trong việc tạo ra các giống
có tính chống chịu mặn và việc tìm các biện pháp tăng cường tính chống
chịu mặn cho cây. Đã có rất nhiều nghiên cứu đề cập đến vấn đề này, nhưng
cho đến nay bản chất sinh lý của tính chống chịu mặn của cây vẫn chưa hoàn
toàn sáng tỏ [16].
Tác động của mặn đến thực vật
Tác hại của mặn phụ thuộc vào nồng độ muối, loại muối, đất, giống và giai
đoạn sinh trưởng phát triển của cây. Mặn ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng

phát triển của cây và cuối cùng ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Khi đất
bị nhiễm mặn sẽ ảnh hưởng đến khả năng hút nước của cây, quá trình vận
chuyển các chất trong cây, quá trình thoát hơi nước và trao đổi chất của cây.
Mặn đã làm rối loạn trao đổi chất, đặc biệt là trao đổi protein [17].
2.4. Vai trò của prolin, glycin betanin trong chống chịu stress môi trường
Prolin: (pirolidin cacboxylic) là một amoniaxit ưa nước có công thức
phân tử C5H9NO2. Trong phân tử prolin có chứa vòng pirolidin được tạo
thành do sự kết hợp của nhóm amin bậc 1 với cacbon ở mạch bên. Prolin
được tổng hợp từ glutamine. Quá trình này được kích thích bởi axit absisic
và stress. Hiện nay con đường tổng hợp prolin đã được mô tả khá đầy đủ,
nhưng sự phân giải prolin mới chỉ được hiểu biết rất ít. Tỷ lệ prolin trong
cây được điều khiển bởi enzyme P5CS (delta 1 – pyrrolin – 5 – cacboxylat
synthetaza) và enzyme phân giải PDH (prolin dehydrogennaza). Vai trò của
prolin chống chịu stress ở thực vật thể hiện: prolin tham gia điều chỉnh áp


suất thẩm thấu nội bào và tham gia bảo vệ màng, protein [10] và là nguồn
dự trữ năng lượng, các bon, ni tơ khi TV phục hồi sau stress.
Glycinbetain (GB): GB là chất hữu cơ rất dễ hoà tan trong nước và không
độc ngay cả ở nồng độ cao. GB tích tụ nhiều nhất trong lá cây. GB được
tổng hợp trong lá từ chất dẫn xuất là axít amin glycine hoặc choline. Vì có
sẵn trong lá cây cho nên vai trò hàng đầu của GB là bảo vệ màng tế bào của
lá, duy trì thẩm thấu, đảm bảo hoạt động của cơ quan quang hợp khi có
stress, chống ROS.
Theo kết quả nghiên cứu của La Việt Hồng và cộng sự trên giống đậu
tương DT 51 cho thấy: trong một số điều kiện bất lợi, thực vật nói chung
thực hiện nhiều cơ chế để chống chịu trong đó có sự tổng hợp một số chất
thẩm thấu tương thích như prolin, glycin betain. Từ đó phân tích sự tương
quan giữa hàm lượng prolin và glycinbetain. Kết quả cho thấy sự tương quan
dương chặt chẽ giữa prolin và glycinbetain trong lá đậu tương [4]. Kết quả

nghiên cứu khác của Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Thị Minh Ngọc trên đối
tượng đậu tương cũng cho thấy sự biến động prolin trong đời sống thực vật
[6].
2.5. Vai trò của các enzym phân giải chất dự trữ trong hạt mẩm
Enzym α - amylaza là enzym xúc tác cho quá trình thủy phân tinh
bột, glycogen và các polyxacarit tương tự. Chúng phân giải các liên kết 1,
4-glucozit ở giữa chuỗi mạch polyxacarit tạo thành các đextrin phân tử
thấp. Do đó dưới tác dụng của enzym này, dung dịch tinh bột nhanh
chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị giảm độ nhớt
mạnh. Hàm lượng đường tan là sản phẩm của quá trình thủy phân tinh
bột. Sự tăng hoạt độ enzym α-amylaza làm tăng hàm lượng đường tan
trong cây. Đường tan là một trong những chất tham gia điều chỉnh ASTT


trong tế bào. Sự gia tăng hoạt độ enzym α-amylaza sẽ làm tăng hàm lượng
đường tan do đó làm tăng ASTT và tăng khả năng phản ứng của cây đối
với hạn.
Proteaza là enzym phân giải protein thành các sản phẩm có khối lượng
phân tử nhỏ như axit amin, chuỗi polipeptit, đây là những nguyên liệu khởi
đầu cho quá trình tổng hợp nên protein cấu trúc và các loại protein chức
năng khác. Chất dự trữ chủ yếu trong hạt đậu tương là protein nên enzym
proteaza là enzym hoạt động chủ đạo trong quá trình biến đổi hóa sinh của hạt
nảy mầm tạo nguồn nguyên liệu cho hô hấp, cung cấp năng lượng và chất
trung gian cho quá trình tổng hợp chất cần thiết cho nảy mầm và cây con sinh
trưởng. Hàm lượng protein trong mầm đậu tương cao nên sự phân giải protein
diễn ra mạnh mẽ ngay ở pha thấm nước. Trong quá trình nảy mầm hoạt độ
protein cũng tăng theo đồng thời lượng protein phân giải sẽ ngày càng nhiều
cung cấp năng lượng và nguyên liệu sơ cấp cho mầm đậu tương tổng hợp các
chất mới.
2.6. Vai trò của các chất chống oxy hoá

Trong cơ thể thực vật ở điều kiện bình thường, dưới sự kiểm soát chặt chẽ
của các enzym chống oxi hoá superoxide dismutaza (SOD), catalaza (CAT),
peroxidaza ( POX), ascorbat peroxydaza( APX), glutation reductaza ( GR)
có khả năng làm bất hoạt hay loại bỏ các gốc tự do chứa oxy như:
superoxide ( O2++), hydrogen peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl tự do (OH-).
Những dạng ôxy hoạt hoá (ROS –reactive oxygen species) trên là sản phẩm
chuyển hoá của oxy, khi cơ thể gặp điều kiện sống bất lợi như hạn, lạnh,
mặn…hàm lượng các dạng này tăng đột biến, gây hiện tượng “ stress oxy
hoá”. Trong tế bào, chúng có thể làm thay đổi tính thấm, độ dẫn điện, phân


giải thành phần photpholipit, dẫn đến phá huỷ màng, gây tổn thương ADN
và các cơ quan bộ phận, gây chết tế bào[2].
Enzym catalaza và peroxidaza là enzim phổ biến trong thực vật, xúc
tác phản ứng ôxi hóa sinh học, có vai trò quan trọng đối với quá trình hô hấp
và chuyển hóa năng lượng ở thực vật. Đây là phương thức giải độc cho cây
khỏi hydrôxyperôxit (H2O2) sinh ra trong quá trình trao đổi chất, đặc biệt
tăng khi bị stress.
III. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1.

Đối tượng nghiên cứu

Đậu tương (Glycine Max (L) Merrill) là giống cây trồng phổ biến ở nước ta
và trên thế giới. Ở nước ta, đậu tương là cây trồng được sử dụng phổ biến
cho cả người và vật nuôi. Hàm lượng protein cao trong hạt đậu cũng như
nhiều hợp chất có giá trị khiến đậu tương trở thành một trong những thực
phẩm quan trọng trên thế giới. Thành phần dinh dưỡng của đậu tương rất
phong phú, hàm lượng protein cao nên đậu tương được dùng chế biến
thực phẩm giàu dinh dưỡng và đáp ứng nhu cầu của con người như: bột

ngũ cốc, bột đậu tương, giá đỗ... Cây đậu tương dễ trồng, có khả năng
thích nghi tương đối rộng với các loại đất trồng nhờ khả năng cố định đạm
của các vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây. Ngoài ý nghĩa về mặt
dinh dưỡng, kinh tế, đậu tương còn có tác dụng cao trong việc cải tạo đất,
góp phần cắt đứt dây truyền sâu bệnh trong luân canh với cây trồng khác.
Giống đậu tương DT84 được công nhận là giống quốc gia năm 1995.
Giống DT84 là giống được trồng phổ biến hiện nay và có tiềm năng năng
suất cao, thích hợp cả 3 mùa vụ. Tuy nhiên, giống DT84 có tính chống
chịu trung bình.
3.2.

Địa điểm tiến hành thí nghiệm:


Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học thực nghiệm – Sinh lý Thực vật trường
Đại học Sư phạm Hà Nội.
3.3. Bố trí thí nghiệm
3.3.1. Chuẩn bị
- Dụng cụ: khay nhựa, giấy thấm khử trùng, nước cất.
- Hoá chất: dung dịch NaCl 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%,
dung dịch đường 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%
- Hạt giống đậu tương. Chọn những hạt giống khỏe, đều đặn, lấy hạt trong
cùng một năm và cùng một nơi nhân ra.
- Điều kiện gieo hạt: nhiệt độ thích hợp cho quá trình nảy mầm 28 0C, phát
triển trong điều kiện chiếu sáng 10giờ/ ngày.
3.3.2 Thí nghiệm thăm dò thời gian thổi khô liên tục, nồng độ dung dịch NaCl
và nồng độ dung dịch đường phù hợp nghiên cứu.
Theo kết quả nghiên cứu của Kozushco (1984): ở lá hàm lượng nước bị mất từ
40% - 50% so với tổng lượng nước của lá sẽ khởi động cơ chế chống chịu. Vì
vậy chúng tôi thăm dò thổi khô liên tục ở các thời gian khác nhau để xác định

thời gian thổi khô làm mất 40% luợng nước của hạt nảy mầm để nghiên cứu
[14].
Theo Volcova (1984): nồng độ dung dịch đường ảnh hưởng mạnh đến hút
nước của mầm hạt đậu là 8,6%. Vì vậy chúng tôi thăm dò tìm nồng độ đường
phù hợp nghiên cứu [15].
Chúng tôi bố trí thí nghiệm thăm dò:
- Sử dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x 8 (cm)) có lót giấy thấm bên
trong đã khử trùng. Mỗi giống gieo 100 hạt/ 1 khay/1 nồng độ nghiên cứu.
Mỗi công thức lặp lại 3 lần.
- Gieo hạt trong điều kiện cung cấp lượng nước 80- 110% so với khối lượng
của hạt (đối chứng).


- Gieo hạt trong điều kiện thổi khô liên tục 1h/ 1 ngày, 2h/ 1 ngày, 3h/ 1
ngày, 4h/ 1 ngày, 5h/ 1 ngày, 6h/ 1 ngày, 7h/ 1 ngày bằng luồng khí vô trùng
của box cấy.
- Gieo hạt trong điều kiện dung dịch NaCl có nồng độ: 0,5% ,1%, 1,5%, 2%,
2,5%, 3%, 3,5%, 4% .
- Gieo hạt trong điều kiện dung dịch đường saccaroza có nồng độ: 5%, 6%,
7%, 8%, 9%, 10% , 11%, 12%.
- Chế độ chăm sóc: ban đầu gieo hạt và với các công thức cung cấp nước, bổ
sung dung dịch muối, dung dịch đường được cung cấp lượng nước cất và
dung dịch các hoá chất 80 – 110% so với khối luợng của hạt hàng ngày.
Theo dõi tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của mầm trong từng điều kiện
sau 1, 2, 3, 4 ngày gieo hạt.
3.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
Sau khi lựa chọn được thời gian thổi khô, nồng độ dung dịch NaCl và nồng
độ dung dịch đường nghiên cứu, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm: Sử
dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x 8 (cm)) có lót giấy thấm gấp nếp bên
trong đã khử trùng. Mỗi khay gieo 100 hạt đậu tương. Mỗi khay ứng với một

công thức thí nghiệm. Mỗi công thức lặp lại 3 lần.
- Gây hạn nhân tạo bằng phương pháp thổi khô
Gồm các công thức nghiên cứu:
ĐC: cung cấp lượng nước đầy đủ (100 - 110% so với khối lượng của hạt.)
K1: thổi khô sau 1 ngày gieo hạt.
PHk1: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 1(K1).
K2: thổi khô sau 2 ngày gieo hạt.
PHk2: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 2(K2).
K3: thổi khô sau 3 ngày gieo hạt.
PHk3: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 3(K3).


K4: thổi khô sau 4 ngày gieo hạt
PHk4: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 4(K4)..
K5: thổi khô sau 5ngày gieo hạt
PHk5: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 5(K5).
Chúng tôi tiến hành xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ngay sau khi thổi khô
và sau khi tưới nước phục hồi 1 ngày.
- Gây hạn sinh lí bằng dung dịch đường
Sử dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x 8 (cm)) có lót giấy thấm bên trong
đã khử trùng. Mỗi khay gieo 100 hạt . Mỗi khay ứng với một công thức,
mỗi công thức lặp lại 3 lần.
ĐC: cung cấp lượng nước đầy đủ (80- 110% so với khối lượng của hạt).
Đ1: mẫu trồng trong dung dịch đường sau 1 ngày gieo hạt
PHđ1: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd đường 1 ngày
Đ2: mẫu trồng trong dung dịch đường sau 2 ngày gieo hạt
PHđ2: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd đường 2ngày
Đ3: mẫu trồng trong dung dịch đường sau 3 ngày gieo hạt
PHđ3: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd đường 3 ngày
Đ4: mẫu trồng trong dung dịch đường sau 4 ngày gieo hạt

PHđ4: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd đường 4 ngày
Đ5: mẫu trồng trong dung dịch đường sau 5 ngày gieo hạt
PHđ5: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd đường 5 ngày
Chúng tôi tiến hành xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ngay sau khi gây hạn
và sau khi tưới nước phục hồi 1 ngày.
- Gây mặn nhân tạo bằng dung dịch muối (NaCl)
Sử dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x 8 (cm)) có lót giấy thấm bên trong
đã khử trùng. Mỗi khay gieo 100 hạt . Mỗi khay ứng với một công thức,
mỗi công thức lặp lại 3 lần.


ĐC: cung cấp lượng nước đầy đủ (80- 110% so với khối lượng của hạt).
M1: mẫu trồng trong dung dịch muối sau 1ngày gieo hạt
PHm1: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd muối 1 ngày)
M2: mẫu trồng trong dung dịch muối sau 2 ngày gieo hạt
PHm2: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd muối 2ngày)
M3: mẫu trồng trong dung dịch muối sau 3 ngày gieo hạt
PHm3: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd muối 3ngày)
M4: mẫu trồng trong dung dịch muối sau 4ngày gieo hạt
PHm4: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd muối 4 ngày)
M5: mẫu trồng trong dung dịch muối sau 5 ngày gieo hạt
PHm5: phục hồi ( trồng trong nước cất sau khi trồng trong dd muối 5 ngày)
Chúng tôi tiến hành xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ngay sau khi gây mặn
và sau khi tưới nước phục hồi 1 ngày.
3.4. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
3.4.1. Xác định tỷ lệ nảy mầm và khả năng sinh truởng của mầm
- Xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt khi tiến hành thí nghiệm.
Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều dài rễ mầm đạt từ 3 mm trở
lên, khả năng nảy mầm được tính theo công thức sau :
Tỷ lệ nảy mầm của hạt = số hạt nảy mầm/tổng số hạt gieo x 100, đo

hàng ngày trong 5 ngày.
- Xác định khả năng sinh trưởng của mầm
+ Chiều dài mầm của mầm (mm): dùng thước chia đến mm đo
chiều dài của mầm từ chóp rễ đến chồi mầm. Thời gian đo sau khi gieo
là 1, 2, 3, 4 và 5 ngày.
+ Khối lượng tươi của mầm (g): rửa sạch mầm bằng nước, dùng giấy
thấm thấm sạch nước, sau đó cân bằng cân phân tích ở thời điểm sau khi
gieo 1, 2, 3, 4 và 5 ngày.


3.4.2. Xác định hàm lượng prolin bằng phương pháp Bates và cs (1973)[7]
Nguyên tắc thí nghiệm: dựa trên phản ứng giữa prolin và dung dịch
ninhydrin trong axit tạo hợp chất màu vàng, hấp thụ bước sóng đặc trưng
520nm. Công thức tính hàm lượng prolin xác định trên cơ sở tham khảo
Reigosa Roger M.J.
Prolin (µg/g) = X (µg/ ml) x V (ml) x df / w(g)
Trong đó: X: giá trị OD520 của mẫu
V: thể tích dịch chiết
df: hệ số pha loãng
w: khối lượng mẫu
3.4.3. Xác định hàm lượng glycinbetain theo Grieve và Grattan (1983)[7]
Nguyên tắc thí nghiệm: dựa trên phản ứng glycine betaine với 1,2diclometan tạo lớp chất hữu cơ được xác định mật độ quang học ở bước
sóng 365nm.
Công thức tính hàm lượng glycinbetain:
Glycine betaine (mg/ g) = Y(µg/ ml) x V(ml) x df/( 1000 x w (g))
Trong đó: Y: nồng đội glycinbetain tính theo đường chuẩn của glycinbetain.
(µg/ ml)
V: thể tích mẫu dịch chiết
df: hệ số pha loãng
w: khối lượng mẫu

3.4.4. Xác định hoạt độ của enzym amylaza theo Nguyễn Văn Mùi [7]
Nguyên tác thí nghiệm: các nhóm khử được giải phóng ra từ thuỷ phân tinh
bột sẽ khử axit 3,5- dinitrosalixilic, kết quả là hình thành sản phẩm có màu
có thể đo được bằng quang phổ ở bước sóng 540nm.
Công thức tính:
U/ml = µmol maltose (release) x df / (0,5 x 3)


Trong đó: µmol maltose: lượng maltose được giải phóng ra, được tính dựa
vào đường chuẩn maltose.
df: hệ số pha loãng
0,5: thể tích dịch chiết enzym sử dụng phản ứng
3.4.5. Xác định hoạt độ enzym proteaza theo phương pháp Anson cải tiến
theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001)[7]
Nguyên tắc thí nghiệm: proteaza tác dụng với cơ chất casein. Sau một thời
gian protein còn lại được kết tủa bằng axit tricloaxetic, xác địng sản phẩm
tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu. Sản phẩm
được đo quang phổ ở bước sóng 750nm.
Công thức tính hoạt độ của 1 ml dung dịch enzym :
X( U/ml) = a.8.b/t
Trong đó: X: là số đơn vị hoạt độ trong 1ml dịch triết enzym
Thể tích hồn hợp của phản ứng và TCA là 8 (ml)
a: số µmol tiozin tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang
của ống thí nghiệm và ống đối chứng.
b: hệ số pha loãng của dung dịch enzym.
3.4.6. Xác định hoạt độ enzym catalaza bằng phương pháp quang phổ [7]
Nguyên tắc: dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng UV 230 – 250 nm của H 2O2.
Catalaza xúc tác sự phân huỷ H2O2 dẫn đến giảm sự hấp thụ theo thời gian.
Hoạt độ enzym có thể đo được bằng sự giảm độ hấp thụ này.
Công thức tính hoạt độ enzym theo thể tích:

U/ ml enzym= 3,45 x df / (0,1 x t)
Trong đó: 3,45: tương ứng với 3,45 µmol H 2O2 bị phân huỷ trong 3 ml hỗn
hợp phản ứng, làm giảm độ hấp thụ A240nm từ 0,45 xuống 0,4.
df: yếu tố pha loãng
0,1: ml enzym phân tích


3.4.7. Xác định hoạt độ enzym peroxidaza bằng phương pháp so màu sử
dụng pyrogallol làm cơ chất theo Nguyễn Văn Mùi [7]
Nguyên tắc: peroxidasza phân gải H2O2 thành H2O và O2, khi có mặt của
chất cho hiro là pyrogallo. Sự oxi hoá pyrogallo thành sản phẩm có màu là
purpurogallin có thể được đo quang phổ ở bước song 430 nm với khoảng
thời gian đặc hiệu. cường độ sản phẩm tỷ lệ với hoạt độ enzym.
IV. Nội dung nghiên cứu của đề tài
Chương 1: Động thái hàm lượng các chất có vai trò bảo vệ mầm đậu tương
trong điều kiện thiếu nước và nhiễm mặn
1.1. Động thái hàm lượng prolin của mầm đậu tương trong điều kiện stress
1.1.1. Sự biến động hàm lượng prolin trong pha gây hạn và pha phục hồi sau
hạn của mầm đậu tương
1.1.2. Sự biến động hàm lượng prolin trong pha gây mặn và phục hồi sau
mặn của mầm đậu tương
1.2. Động thái hàm lượng glycinbetanin của mầm đậu tương trong điều kiện
stress môi trường
1.2.1. Sự biến động hàm lượng glycinbetain trong pha gây hạn và phục hồi

sau hạn của mầm đậu tương
1.2.2. Sự biến động hàm lượng glycinbetain trong pha gây mặn và phục hồi

sau mặn của mầm đậu tương
Chương 2: Động thái hoạt độ enzym phân giải chất dự trữ của mầm hạt đậu

tương trong điều kiện thiếu nước và nhiễm mặn
2.1. Động thái hoạt độ enzym amylaza trong lá mầm đậu tương khi chịu
stress môi trường
2.1.1. Sự biến động hoạt độ enzym amylaza trong pha gây hạn và pha phục
hồi sau hạn của mầm đậu tương


2.1.2. Sự biến động hoạt độ enzym amylaza trong pha gây mặn và pha phục
hồi sau mặn của mầm đậu tương
2.2.

Động thái hoạt độ enzym proteaza trong lá mầm đậu tương khi chịu
stress môi trường

2.2.1. Sự biến động hoạt độ enzym proteaza trong pha gây hạn và pha phục
hồi sau gây hạn của mầm đậu tương
2.2.2. Sự biến động hoạt độ enzym proteaza trong pha gây mặn và pha phục
hồi sau mặn của mầm đậu tương
Chương 3: Động thái hoạt độ các enzym chống oxi hoá của mầm đậu tương
trong điều kiện thiếu nước và nhiễm mặn
3.1. Động thái hoạt độ enzym catalaza trong mầm đậu tương khi chịu tác
động stress môi trường
3.1.1. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha gây hạn và phục hồi
sau hạn của mầm đậu tương
3.1.2. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn và phục hồi
sau mặn của mầm đậu tương
3.2. Động thái hoạt độ enzym peroxidaza của mầm đậu tương khi chịu stress
môi trường
3.2.1. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây hạn và phục
hồi sau hạn của mầm đậu tương

3.2.2. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn và phục
hồi sau mặn của mầm đậu tương
Chương 4: Khả năng nảy mầm và sinh trưởng của mầm đậu tương trong
điều kiện thiếu nước và nhiễm mặn
4.1. Tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của mầm đậu tương trong pha gây hạn và
phục hồi sau hạn


4.2. Tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của mầm trong pha gây mặn và phục hồi
sau mặn
IV. Kết luận
-Trong quá trình nảy mầm của hạt đậu tương, xác định chất hình thành sớm
giúp hạt nảy mầm chống chịu với điều kiện stress môi trường.
- Vai trò của chất hình thành cơ chế chống chịu ở các giai đoạn khác nhau
trong quá trình nảy mầm của hạt.
- Ảnh hưởng của stress môi trường đến các chất có vai trò quan trọng trong
quá trình nảy mầm.
- Biến động của các chất đã được hình thành giúp cây chống chịu trong pha
phục hồi của quá trình nảy mầm.
- So sánh mức độ ảnh hưởng của hai loại stress và khả năng phục hồi sau
stress đó trong quá trình nảy mầm.
V. Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội,
Lê Trần Bình (2003), “Mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống
chịu ở cây lúa”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 1(1), tr. 85 – 91.
2. Mai Văn Chung (2014), “ Các gốc ôxy tự do trong phản ứng bảo vệ của
cây đậu”, tạp chí Khoa học và Công nghệ Nghệ An, số 3, Tr16-19.
3. Điêu Thị Mai Hoa, Nguyễn Phương Thảo, Lê Thị Thanh Hiếu (2011),
“Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cao đến sự nảy mầm, hoạt tính enzyme αamylase và tích lũy prolin của mầm đậu xanh (Vigna radiata)”, Tạp chí
khoa học, Đại học Sư Phạm Hà Nội, Số 56,Ttr. 106 – 114.

4. La Việt Hồng và cộng sự (2014), “Sự tương quan giữa hàm lượng prolin
và glycinbetain ở lá đậu tương vào giai đoạn ra hoa trong điều kiện nhiệt độ


thấp, mặn và han”. Tạp chí khoa học và giáo dục Trường ĐHSP Đà Nẵng,
số 10 (01).
5. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học
phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở
Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội.
6. Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Thị Minh Ngọc (2008), “Hàm lượng prolin
trong quá trình sinh trưởng của đậu tương”, Nghiên cứu cơ bản trong khoa
học sự sống, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Tr.342 – 344.
7. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp
nghiên cứu Sinh lý học Thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
8. Nguyễn Tấn Lê, Vũ Đình Ngàn (2010), “ Nghiên cứu đời sống của cây lạc
( Arachis hypogea L.) trong điều kiện nóng hạn ở vụ hè tại Đà Nẵng”, Tạp
chí Khoa học và Công nghệ, Số 5, Tr.117- 124.
9. Vũ Ngọc Thắng, Nguyễn Ngọc Quất, Nguyễn Thu Huyền, Nguyễn Quang
Dũng, Nguyễn Văn Thắng, Vũ Đình Chính (2011), “ Ảnh hưởng của hạn
đến khả năng nảy mầm của một số giống đậu xanh triển vọng”, Tạp chí
Khoa học và Phát triển, Tập 9, Số 6, Tr.912- 919.
10. Delauney A.J, Verma DP.S (1993), “ Proline biosynthesis and
osmoregulation

in plants”. The plant journal, V4. pp: 215- 223.

11. Diego Ariel, Marta Rosalia Gulotta, Carlos Alberto Martinez và Marco
Antonio Oliva (2004), “ The effects of salt stress on growth, nitrate
reduction and praline and glycinebetaine accumulation in Prosopis alba”,
Braz. J. Plant Physiol, 16 (01), pp: 39 – 46.

12. Giri J (2011), “ Glycinebetaine and abiotic stress tolerance in plants”,
Plant Signaling & Behavior 6:11, 1746- 1751.
13. Titop, Akimosva, Talamosva, Topchiepva, Tính chống chịu của thực vật
trong thời gian đầu tác động nhiệt độ bất lợi (bản dịch)


14. Kozushco (1984), Xác định khả năng chịu hạn của hạt ngũ cốc theo sự
thay đổi các thông số chế độ nước (bản dịch).
15. Volcova (1984), Xác định khả năng chịu nóng và chịu hạn tương đối của
các mẫu hạt đậu bằng phương pháp cho nảy mầm trong dung dịch sacaroza
và xử lý nhiệt (bản dịch).
16. />17. />%20hoc/NC%20Kha%20nang%20chiu%20man%20v%C3%A0%20da
%20dang%20DT%20cua%20lua.pdf.