Bài thuyết trình về: "Alkali and Halotolerant Catalase from Halomonas sp. SK1: Overexpression in Escherichia coli, Purification, Characterization, and Genetic Modification"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------
Môn học: Những vấn đề vi sinh hiện đại
Chủ đề: Alkali- and Halo-tolerant Catalase from Halomonas sp. SK1: Overexpression
in Escherichia coli, Purification, Characterization,
and Genetic Modification

Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 814-9 (2004)
Le Huyen Ai Thuy, Krisana Phucharoen, Akira Ideno, Tadashi Maruyama and Takao Shinozawa.

GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy
Th.S Lao Đức Thuận
Th.S Trương Kim Phượng.


I.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

II. TỪ KHÓA
III.TỔNG QUAN
IV. NỘI DUNG – KẾT QUẢ


I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Biểu hiện vượt mức catalase có khả năng chịu muối và chịu
kiềm có nguồn gốc từ Halomonas trên vi khuẩn E.coli, tinh
sạch, xác định đặc tính và biến đổi di truyền

II. TỪ KHÓA

− Alkali - and halo-tolerance Catalase
− Halomonas
− Overexpression
− Escherichia coli UM2
− Genetic modification


III. TỔNG QUAN

1. Catalase
-. Bản chất hóa học: là enzyme chống oxi hóa trong hệ thống bảo vệ tế
bào.
2H2O2

Catalase

2 H2O + O2

-. Catalases điển hình:
+ 200 – 340 kDa.
+ Có vai trò trong quá trình hô hấp đối với hầu hết sinh vật, có cấu trúc tứ
phân với 4 tiền chất.


2. Halomonas sp. SK1

− Trực khuẩn, Gram (-).

− Thích nghi trong điều kiện hiếu khí tùy nghi.
−

Có khả năng sinh trưởng dưới điều kiện nồng độ muối cao và kiềm cao.

−

Có hoạt tính tổng hợp catalase điển hình.


3. Escherichia coli UM2

− Khuyết gen catalase do đột biến trên gene katE và gene katG.
− Gene katE và gene katG lần lượt mã hóa cho gene kháng ampicillin và
kanamycin.


4. Chaperone
+ Chuỗi polypeptide tương tác, thúc đẩy sự gấp cuộn của protein.
+ Phân loại chaperone dựa vào trọng lượng phân tử.
+ Ngoài ra, chaperone còn có vai trò trong lắp ráp các phân tử phức tạp, hỗ trợ
các protein tạo hình sai hoặc kết tụ được tái gấp cuộn,…
(Yujin E. Kim,∗ Mark S. Hipp,∗ Andreas Bracher, Manajit Hayer-Hartl, and F. Ulrich Hartl. 2013. Molecular Chaperone Functions in Protein Folding and Proteostasis. Annual
Review of Biochemistry. 82:323–55.)


5. Vật liệu

a. Gen mục tiêu
b. Dòng tế bào chứa gen mục tiêu

c. Dòng tế bào chủ
d. Hệ thống vectơ
e. Yếu tố chỉ thị


a. Gen mục tiêu oHktA
(Original Alkali- and Halo-tolerant Catalase)

-

Có nguồn gốc từ vi khuẩn Halomonas sp. SK1.
Gen mã hóa cho catalase điển hình oHktA (57.8 kDa)

0
- Đặc tính của oHktA: nhạy với nhiệt, mất hoạt tính ở 37 C trong 5 phút.


b. Dòng tế bào chứa gen mục tiêu
Vi khuẩn Halomonas sp. SK1:
- Phân lập từ nước thải của nhà máy dệt ở Gunma, Nhật Bản.
-Nuôi cấy trong môi trường 2xYT trong điều kiện hiếu khí ở 370C.


c. Hệ thống vector

- Plasmid pKK223- 3
- Plasmid pET21a +
- Plasmid pACYC184

Plasmid pKK223- 3
(Amersham Pharmacia Biotech, USA)

•
•
•
•
•

tac_promoter: 43-71
EcoRI (G▼AATTC): 4584-3
HindIII(A▼AGCTT) 45544559
Ampicillin:
3177-4037
rrnB_terminator: 4144-4346

/>

Plasmid pET21a +
(Novagen )

•
•
•
•

T7_promoter: 309-327
T7_terminator: 1-129
NdeI: 237-242 (CA▼TATG)
HindIII: 173-178

(A▼AGCTT),

•
•
•

SalI: 179-184 (G▼TCGAC)
SphI: 535-540 (GCATG▼C)
His•Tag coding sequence 140-157 https
://www.addgene.org/browse/sequence_vdb/2549


Plasmid pACYC184
(Nippon Gene, Tokyo, Japan)

•
•
•

SalI: 2146-2151 (G▼TCGAC)

•

CAT/CamR:

SphI: 2057-2062 (GCATG▼C)
p15A_origin:
581-1493
659 - 444

https
://www.addgene.org/browse/sequence_vdb/1679


d. Dòng tế bào chủ
Vi khuẩn Escherichia coli UM2
(Giáo sư C. P. Loewen, Đại học Manitoba, Canada)

-

Nuôi cấy trong môi trường 2xYT, pH=11, nhiệt độ 37°C, điều kiện hiếu
khí trong 8-16h.


e. Yếu tố chỉ thị/sàng lọc:

-

IPTG (isopropyl-β-D thiogalactopyranoside)

 Cơ chất cảm ứng

-

Gen kháng Ampicilin.
Gen kháng Chloramphenicol.


6. Kỹ thuật tạo dòng

/>

7. SDS - PAGE

-

(Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Phương pháp điện di một chiều trên gel Polyacrylamide.
Protein được biến tính bằng SDS
 Xác định trọng lượng phân tử của protein.


Hình:Bộ điện di SDS-PAGE
/>

8. NATIVE – PAGE
(NATIVE– Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

-

Là phương pháp điện di một chiều trên gel Polyacrylamide, pH = 8.8.
- Protein không bị biến tính.
- Xác định trọng lượng phân tử; kiểm tra thành phần và cấu trúc của
protein.


NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1. Thiết lập plasmid biểu hiện oHktA.
Thu nhận gDNA của Halomonas sp. SK1

Phản ứng PCR khuếch đại oHktA với cặp mồi hkt1 và hkt2 (sản phẩm PCR:1530 bp)

Phản ứng cắt sản phẩm PCR và pKK223-3 bằng EcoRI và HindIII
Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pKK223-3 –oHktA

Điện biến nạp vector tái tổ hợp pKK223-3 –oHktA vào tế bào vi khuẩn E.coli UM2

Nuôi cấy/Sàng lọc trên môi trường thạch 2xYT (pH= 7.4) bổ sung ampicillin



Nuôi cấy, sàng lọc và thu nhận oHktA
Nuôi cấy hệ thống tế bào E.coli UM2 mang vector tái tổ hợp
pKK223-3 –oHktA có/hoặc không có IPTG, trong 6h, ở 37°C.

Ly tâm thu nhận tế bào.
Huyền phù hóa trong dung dịch đệm A

Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm và ly tâm thu dịch nổi

Tinh sạch oHktA bằng phương pháp sắc kí cột DEAE-Toyopearl và Chelating-Sepharose Fast Flow.

Các phân đoạn protein được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE và xác định hoạt tính bằng phương
pháp
Native-PAGE *