Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối nấm cordyceps militaris

Khóa luận tốt nghiệp 2016

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Vũ
Duy Nhàn, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hóa hoc – Vật liệu/ Viện Khoa học và
Công nghệ quân sự và các anh chị Phòng Hóa sinh, đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập và làm đề tài tại đây.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Viện Đại học
Mở Hà Nội, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại
trường và thực hiện luận văn này.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể
lớp 12-02 hoa ông Nghệ Sinh ọc đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong
quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi in chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Thắm

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH


Khóa luận tốt nghiệp 2016

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU .................................................................................. 3
1.1. Giới thiệu về Cordycceps militaris ...........................................................................3

1.1.1. Hiện trạng và vai trò của Cordyceps militaris ..............................................3
1.1.2.Thành phần hóa học chính của Codyceps militaris .......................................5
1.1.2.1.Cordycepin ..................................................................................................5
1.1.2.2.Adenosine ...................................................................................................6
1.1.2.3. Acid cordycepic .........................................................................................6
1.1.2.4. Nucleotides ................................................................................................ 7
1.1.2.5. Protein và các axit amin .............................................................................8
1.1.2.6. Acid béo và nguyên tố đa, vi lượng ...........................................................8
1.1.2.7. Polysaccharide ...........................................................................................8
1.1.3. Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris ...................................9
1.1.3.1. Cải thiện chức năng gan ..........................................................................10
1.1.3.2. Giải độc thận ........................................................................................... 10
1.1.3.3. Giảm đường huyết....................................................................................10
1.1.3.4. Điều trị bệnh phổi ....................................................................................11
1.1.3.5. Điều trị bệnh tim mạch ............................................................................11
1.1.3.5. Tăng cường khả năng miễn dịch.............................................................. 11
1.1.3.6. Hỗ trợ điều trị ung thư .............................................................................11
1.1.3.7. Chống rối loạn tình dục ...........................................................................12
1.1.3.8. Tăng sức bền, chống mệt mỏi ..................................................................12
1.1.3.9. Chống lão hóa .......................................................................................... 13
1.2. Polisaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris ............................................13
1.2.1. Đặc điểm về các Polisaccharide trong sinh khối nấm Cordyceps militaris
.......................................................................................................................................13
1.2.2. Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Codyceps sp ............................ 14
1.3. Tình hình nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ Cordyceps militaris ......................16

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH


Khóa luận tốt nghiệp 2016

1.3.1. Tình hình nghiên cứu polysaccharide trên thế giới..........................................16
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .............................................................. 18
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 21
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu ...........................................................................21
2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................21

2.1.2. Thiết bị và hóa chất......................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu. ......................................................................................22
2.2.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide từ quả thể Codyceps militaris ....22
2.2.1.1.Khảo sát phương pháp chiết .....................................................................22
2.2.1.2.Khảo sát điều kiện chiết:...........................................................................24
2.2.2.

Xác định hàm lượng polisaccarit theo phương pháp phenol-sulfuric của

Michel. DuBois, K. A. Gilles và cs, 1956. ....................................................................24
2.2.3.Thu nhận polysaccharide bằng phương pháp kết tủa ..................................27
2.2.4.Phương pháp phân tích IR: ..........................................................................28
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 29
3.1.Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tách chiết Polysaccharide ................................ 29
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết ............................................29
3.1.2. Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết. .........................................................30
3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất tách chiết .....................31
3.2.1. Nghiên cứu xác định nhiệt độ chiết ............................................................ 31
3.2.2. Nghiên cứu xác định thời gian chiết ........................................................... 31
3.2.3. Nghiên cứu xác đinh tần suất chiết ............................................................. 32
3.3. Bước đầu xây dựng quy trình tách chiết.................................................................33
3.4. Bước đầu xác định các nhóm cấu trúc của Polysaccharides tách chiết được .........37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 41

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH


Khóa luận tốt nghiệp 2016
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nội dung

C.

Cordyceps

C. militaris

Nhộng trùng thảo

C.sinensis

Đông trùng hạ thảo

sp.

Species – Một loài

spp.

Species plural – Nhiều loài

ĐTHT

Đông trùng hạ thảo

EtOH

Ethanol

EPS

Exopolysaccharide ( Extrancellular polysaccharide) polysaccharide ngoại bảo

SOD

Chất chống oxy hóa

P1

Polysaccharide thu được từ dịch sau khi chiết với nước.

P2

Polysaccharide sau khi thu được từ phần bã đã bổ sung
NaOH 4%

P3

Polysaccharide sau khi kết tủa

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

Khóa luận tốt nghiệp 2016
DANH MỤC HÌNH
ình 1.1: Đông trùng hạ thảo Codyceps militaris ............................................... 4
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Codycepin.......................................................... 5
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Adenosine .......................................................... 6
Hình 1.5: Công thức cấu tạo polysaccharide. .................................................... 13
Hình2.1 : Sản phẩm Codyceps militaris nuôi cấy tại Viện Quân sự .................. 21
Hình2.2 : Mẫu dùng tách chiết. .......................................................................... 21
Hình 2.3: Bể ổn nhiệt dùng trong quá trình chiết ............................................... 23
Hình 2.4: Máy siêu âm ........................................................................................ 24
Hình 2.5: Mẫu đo đường đường chuẩn............................................................... 26
ình 2.6: Đồ thị đường glucose (µg/ml)............................................................. 26
Hình 2.7: Máy ép KBr ......................................................................................... 31
ình 2.8: Máy đo phổ Impact 410 ...................................................................... 28
Hình 3.1: Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu C. militaris ................. 29
Hình 15: Kết quả khảo sát phương pháp chiết ................................................... 30
Hình 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt độ ................................................................... 31
Hình 3.5: Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu C. militaris .................. 32
Hình3.8: phổ hồng ngoại IR của mẫu CM-jd-CPS2 chuẩn ................................ 37
Hình 3.9: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P1 .......................................................... 38
Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P2 ........................................................ 38
Hình 3.11: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P3………………………………………...41

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH


Khóa luận tốt nghiệp 2016
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại khoa học........................................................................................................ 3
Bảng 1.2: Hàm lượng của một số loại đường có trong polysaccharide của quả thể và sợi
nấm Codyceps militaris. .............................................................................................................. 14
Bảng 1.3: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide được thu nhận từ một số loại
nấm................................................................................................................................................. 15
Bảng 2.1: Thiết bị dùng trong thí nghiệm .................................................................................. 22
Bảng 2.3: Các dung môi có độ phân cực tăng dần theo tham số Snyder lực của dung môi . 23
Bảng 2.4: Xây dựng phương trình đường chuẩn glucose......................................................... 25
Bảng 3.1: Hàm lượng polysaccharide từ Cordyceps militaris ................................................. 36
Bảng 3.2: So sánh phổ IR giữa các mẫu .................................................................................... 39

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH


Khóa luận tốt nghiệp 2016

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây rất nhiều loài nấm được quan tâm đến như
nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng phục vụ chăm sóc sức khỏe
con người ngày một tăng lên. Ngoài ra chúng được các nhà nghiên cứu y dược
học hết sức chú ý vì sự đa dạng về các hợp chất sinh học có trong mỗi loại.
Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm
như Codyceps sinensis ( Berk.) hoặc Codyceps militaris (L. ex Fr.)Link lên ấu
trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu trùng
của loài Hepialus armoricanus. Là một loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã
được cả thế giới biết đến, đông trùng hạ thảo cùng tam thất, linh chi, nhân sâm
tạo thành bộ tứ thần dược. Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi
Đông trùng hạ thảo là vị thuốc để bồi bổ sức khỏe người và hỗ trợ điều trị hàng
loạt bệnh như cải thiện chức năng phổi và thận chống ung thư điều hòa miễn
dịch và tác dụng hạ huyết áp. Mặt khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại

đều xác định. Đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể
người.
Polysaccharide là một trong những thành phần có hoạt tính sinh học chính
của Đông trùng hạ thảo cũng như nhiều loài nấm dược liệu khác, trong đó đã
được chứng minh như chống ung thư, điều hòa miễn dịch và tác dụng chống oxy
hóa đáng lưu ý. Việc nghiên cứu các đặc tính chống oxy hóa của polysaccharide
từ Cordyceps militaris đã được nghiên cứu rộng rãi.
Như vậy việc tách chiết, tinh sạch làm tăng cường tác dụng dược lý của
các hoạt chất polysaccharide từ nguồn quả thể Cordyceps militaris (L. ex Fr)
Link là rất quan trọng trong điều kiện hiện nay. Khi đó sẽ giải quyết một phần
nào trong công tác chăm sóc sức khỏe cho con người. Từ đó có thể ứng dụng để
sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng từ các nguồn nguyên liệu
polysaccharide là rất cần thiết.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

1


Khóa luận tốt nghiệp 2016
militaris” với các mục tiêu sau: Xác lập được quy trình tách chiết polysaccharide
từ nguồn Cordyceps militaris nuôi trồng được.
Nội dung nghiên cứu chủ yếu cần giải quyết:
Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối
nấm Cordyceps militaris.
Bước đầu xác định một số nhóm chức cơ bản trên các mẫu polysaccharide
phân lập được.

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

2


Khóa luận tốt nghiệp 2016

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về Cordycceps militaris
1.1.1. Hiện trạng và vai trò của Cordyceps militaris
Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm
như Cordyceps sinensis ( Berk.) hoặc Cordyceps militaris (L. ex Fr.)Link lên ấu
trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu trùng
của loài Hepialus armoricanus. Vào mùa đông bào tử nấm bắt đầu ký sinh và sử
dụng các chất dinh dưỡng của ấu trùng Hepialus armoricanus để sinh trưởng và
phát triển thành sợi nấm. Mùa hè đến khi các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh
sáng thích hợp quả thể nấm bắt đầu hình thành và vươn ra khỏi thân xác ấu trùng
và phát triển nhanh thành quả thể trưởng thành. Đầu của quả thể nấm là một thể
đệm (stroma) hình trụ thuôn nhọn. Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên được phát
hiện vào mùa hè, phân bố tập trung ở các cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500
đến 5000m. Đó là các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân
Nam [11,14].
Bảng 1.1: Phân loại khoa học
Giới

Nấm

Ngành

Ascomycota

Phân ngành

Ascomycotina

Lớp

Ascomycetes/ Pyrenomycetes

Bộ

Hypocreales

Chi

Cordyceps

Loài

Cordyceps militaris

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

3


Khóa luận tốt nghiệp 2016

Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo Codyceps militaris
Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên hai loài chính
người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Codyceps sinensis và

Codyceps militaris. Loài nấm Cordyceps sinensis phân bố chủ yếu ở vùng núi
cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao trên 4000m so với mực nước biển như
vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng thuộc Nepan và Butan. Loài Nấm
Cordyceps militaris, phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ 2000-3000m so
với mực nước biển, có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả
thể như cordycepin, mannitol, cordypolysaccharide, superoxide dismutise và
nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn cao hơn của loài Cordyceps
sinensis. Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu chính của loại nấm
Cordyceps militaris được các nhà khoa học thống kê như sau: kìm hãm sự phát
triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C.et
al.,2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J. et al., 2001). Nhiều nghiên cứu
cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan
(Nan J.X et al. 2001), sự lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H.,
2005). Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và
lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S
et al., 2005) [14,16].
Hiện nay trên thế giới mỗi năm sản lượng nấm dược liệu đạt được lên tới
hơn 10 triệu m³, trong đó Codyceps sinensis (Berk.) Sacc. Và Cordyceps
militaris (L. ex Fr.) Link.. Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam Codyceps

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

4


Khóa luận tốt nghiệp 2016
militaris (L. ex Fr) Link bắt đầu được nuôi quy mô công nghiệp ở một số địa
phương như: Hà Nội, Tam Đảo, Thành phố Hồ Chí Minh. Hàm lượng hoạt chất
adenosine trong sản phẩm đạt bình quân là 0,33 – 1,45mg/g và Cordycepin là 39mg/g. Trong hai năm vừa qua, Viện Hóa học – Vật liệu, Viện Khoa học và
Công nghệ Quân sự/BQP cùng với một số đơn vị trong cả nước như Viện Bảo

vệ thực vật.. đã nghiên cứu thành công công nghệ nhân giống, nuôi trồng quy
mô công nghiệp đối với chủng Cordyceps militaris (L. ex Fr) Link và đã triển
khai chuyển giao cho nhiều cơ sở ở Hà Nội, Đà Lạt, Nha Trang, Thành phố Hồ
Chí Minh.
1.1.2.Thành phần hóa học chính của Codyceps militaris
Codyceps militaris có chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học nhưng quan
trọng nhất là adenosine, codycepin, polysaccharide. Ngoài ba thành phần trên
khi phân tích nấm người ta còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị như các
ribonucleotid, mannitol, các protein, polyamin, vitamin (E, A, B1, B2, B12…)
và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…)..[4].
1.1.2.1.Cordycepin
Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ C.militaris năm 1950 do
Cunningham và cộng sự thực hiện, sau đó chúng được tìm thấy ở C. sinensis và
C. kyushuensis. Mặc dù cordycepin có thể được tổng hợp hóa học nhưng chỉ cho
sản lượng thấp. Các loài Cordyceps sp tự nhiên chứa lượng codycepin vào
khoảng 0,006 – 6,36 mg/g. Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong tự
nhiên nồng độ cordycepin trong quả thể C. militaris cao hơn C. senisis với hàm
lượng lần lượt là 2,65 và 1,64 mg/g [4].

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Codycepin

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

5


Khóa luận tốt nghiệp 2016
Cordycepin là một dẫn xuất của nucleoside mà tại vị trí 3’ không có O
khác với thực thể ribose. Trọng lượng phân tử của cordycepin C10H13N5O3 là
251, có nhiệt độ nóng chảy là 230 - 231ºC, độ hấp thụ cao nhất ở 259nm.

Cordycepin có thể hòa tan trong saline, cồn ấm hoặc methanol nhưng không
tan trong benzen, ether hoặc chloroform, các nhà khoa học thường sữ dụng
saline khử trùng và và đệm phosphates để hòa tan cordycepin [3]. Cordycepin
có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng vius. Phát hiện gần đây hơn,
cho thấy khả năng điều hòa sản phẩm của interleukins trong tế bào lympho T.
Cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thông qua methyl hóa acid
nucleic, ức chế sự phát triển của Clostridium và Clostridium perfringens,
nhưng không có tác động naog tới Bifidobacterium spp. Và Lactobacillus spp.
Do Ahn và cộng sự đã chứng minh năm 2000 [4].
1.1.2.2.Adenosine
Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể vào được cho là phong phú ở
hầu hết các loài Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 tới 14,15 mg/g. Khi
thu nhận nấm Cordyceps trong tự nhiên, nồng độ adenosine là 2,45±0,03mg/g
trong quả thể và ở nấm C.militaris cao hơn ở C.sinensis hàm lượng chỉ có
1,643±0,03mg/g, trong khi đó hàm lượng trong sợi nấm C.militaris lên men là
1,592±0,03mg/g gần tương tự C.senisis trong tự nhiên. Adenosine được cho là
có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch [17].

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Adenosine
1.1.2.3. Acid cordycepic
Theo dược điển củaTrung Quốc, axit cordycepic hay D-mannitol, một đồng
phân của axit quinic với cấu trúc polyol được sinh tổng hợp trong quá trình phát triển
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

6


Khóa luận tốt nghiệp 2016
của nấm C. militaris và được sử dụng như là một dấu hiệu trong kiểm soát quá trình
nuôi. Axit cordycepic được tách ra từ C.militaris từ những năm 1957, chứng minh có

tác dụng lợi tiểu và phòng ngừa biến chứng sau phẫu thuật cắt thận, làm giảm ho và
hen suyễn. Đặc biệt axit cordycepic có thể cung cấp sự bảo vệ hiệu quả và trong điều
trị cho các bệnh nhân sau nhồi máu não và chấn thương, cải thiện vi tuần hoàn não
và lưu lượng máu não, thúc đẩy phục hồi thần kinh và bảo tồn các khu vực thiếu máu
cục bộ, giảm điều tiết áp lực nội sọ, giảm sự hình thành dịch não tủy và não mô hàm
lượng nước. Mặc dù axit cordycepic là an toàn cho bệnh nhân xuất huyết nội sọ, tuy
nhiên vẫn được khuyến cáo không nên sử dụng ở các những bệnh nhân suy thận, suy
thận mãn tính và bệnh tiểu đường. Ngoài ra, một số nghiên cứu cho rằng axit
cordycepic có thể điều trị bệnh viêm màng não. Các nghiên cứu gần đây cho thấy
axit cordycepic có thể nâng cao hiệu quả của các tế bào mô đệm sau khi xuất huyết
trong não và gia tăng hình thành tế bào mới xung quanh các xuất huyết trong não
[3,17]
1.1.2.4. Nucleotides
Các nucleotide là một trong những thành phần có hoạt tính trong C.militaris,
tuy nhiên thông thường adenosine, cordycepin được sữ dụng là loại hoạt chất
dùng để đánh giá chất lượng của đông trùng hạ thảo còn nhiều loại nucleotid
khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin [17]
1.1.2.4. Sterol
Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là chất thiết yếu của vitamin D2, có
giá trị dược liệu quan trọng. hàm lượng ergosterol trong quả thể nhân tạo của
Cordyceps rất cao (10,68mg/g) cao hơn nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có 1,44
mg/g [17]. Ergosterol trong C.sinensis có thể được xác định bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performace Liquid Chromatography) do
Li và cộng sự thực hiện năm 1991, được cho là chất ophiocordin, ở
C.puseudomilitaris là chất bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide
với các trọng lượng phân tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở
C.militaris.
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

7

Khóa luận tốt nghiệp 2016
1.1.2.5. Protein và các axit amin
Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1 – 33%.
Protein này bao gồm 18 loại aminoacid gồm có aspartic, threonine, serine,
glutamate, proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine,
phenylalanine, lysine, histidine, cytine và trytophan. Hàm lượng amino acid sau
khi thủy phân hầu hết là 20 -25%, lượng thấp nhất là 5,53%, cao nhất là 39,22%.
Hàm lượng cao nhất là glutamate, tryptophan và tyrosine. Các chủng Cordyceps
spp.cũng chứa các loại protein, peptides, polyamines và tất cả các amino acid
thiết yếu. Thêm nữa, Cordyceps spp cũng chứa các loại dipeptide vòng hiếm gặp
có vòng gồm có cyclo-[Gly-Pro], cyclo-[Leu-Pro], cyclo-[Val-Pro], cyclo[AlaLeu], cyclo-[Ala-Val] và cyclo[Thr-Leu]. Một lượng nhỏ polyamines như 1,3diamino propane, cadavarine, spermidine và putrescine cũng được tìm thấy
[3,17].
1.1.2.6. Acid béo và nguyên tố đa, vi lƣợng
Axit béo bao gồm carbon, hydro và oxy là thành phần chính của lipid,
phospholipid và glycolipid, chúng được phân loại thành acid béo no và không no
ở Cordyceps, lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84% gồm có C16:1, C17:1,
C18:1, C18:2. Acid linoleic chiểm hàm lượng cao nhất 38,44% bao gồm C14,
C15, C16, C17, C18, C29 và C22. Acid palmitic và acid octadecanoic chiếm
hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86% và 15,78%. Các acid béo không no có
chức năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch. Chứa một loạt
các hợp chất dinh dưỡng như acid amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin
tan trong nước như B1, B2, B12 và các nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na,
Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ti, Cr, Ga, V [17].
1.1.2.7. Polysaccharide
Codyceps militaris có chứa rất nhiều loại đường bao gồm mono-, di- và
các oligosachride, và nhiều polysaccharides phức tạp gồm có cyclofurans (
đường 5C, mạch vòng, chưa rõ chức năng), beta-glucans, beta-mannans, và

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

8


Khóa luận tốt nghiệp 2016
phức hợp polysaccharides có cả đường 5 và 6C cùng tham gia vào các chuỗi
nhánh, dùng cả cầu nối alpha- và beta-.
Các polysaccharides chính trong nấm là một dạng glucans với các mối
liên kết glycoside chứa các liên kết (1/3) – (1/6) – β glucans và (1/3) – 1 –
glucans. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides
đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ thực vật
lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích được thông qua sự khác
nhau trong cấu trúc hóa học của polysaccharide. Các polysaccharide có khả
năng chống lại hoạt động của các tế bào ung thư chúng bao gồm homopolyme
có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose,
arabinose, fructose, ribose và các acid glucuronic. Trong một số loài nấm,
polysaccharide liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ
polysaccharide – protein hoặc polysaccharide – peptide cấu trúc có hoạt tính
kháng u mạnh hơn. Cấu trúc 1/3 – β – glucans có khả năng kháng khối u được
biết đến nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho biết những glucans có được hoạt
tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng hoặc phân
nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị như
acid

glucuronic,

xylose,

galactose,

mannose,

arabinose

hoặc

ribose.

Heteroglycans là một nhóm lớn polysaccharides lớn hoạt tính sinh học đa dạng
được phân loại là galactans, fucans, xylans và mannans [17].
1.1.3. Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris
Các nhà y học cổ truyền trong và ngoài nước đã nghiên cứu sữ dụng nấm
ĐTHT Cordyceps militaris để điều trị thành công các chứng bệnh như rối loạn
máu, viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối
loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính, ung thư
phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục. viện nghiên cứu nội tiết
Thượng Hải ( Trung Quốc) cũng đã dùng nấm ĐTHT để điều trị cho các bênh
nhân bị liệt dương, kết quả đạt được khá tốt.

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

9


Khóa luận tốt nghiệp 2016
1.1.3.1. ải thiện chức năng gan
Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu thực hiện trên 70 bênh nhân
viêm gan B mãn tính và xơ gan, khi sữ dụng nấm ĐTHT hoặc là hỗn hợp thảo
dược với thành phần chính là nấm linh chi, kết quả cho thấy có 68% người bệnh

có nhóm phản ứng lâm sáng tốt (với nhóm sử dụng ĐTHT) và chỉ có 57% phản
ứng tốt (với nhóm hỗn hợp thảo dược chứa nấm linh chi). Điều này cho thấy
nấm đông trùng hạ thảo tốt hơn nấm linh chi trong việc triều trị bệnh gan hay xơ
gan cho người.
Thí nghiệm cũng được thực hiện trên 22 bệnh nhân xơ gan ở liều lượng
6g/ngày cũng cho thấy kết quả rất khả quan khi thử nghiệm các chức năng gan
sau thời gian điều trị bằng Đông trùng hạ thảo [13]
1.1.3.2. Giải độc thận
Bác sĩ y học cổ truyền cho rằng nấm ĐTHT có tác dụng làm tăng chức
năng thận rất nhiều. rất nhiều công trình y học hiện đại xác nhận là nhờ nấm có
khả năng làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục
tiết. thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị từ
3-5g ĐTHT/ngày, kết quả cho thấy chức năng thận được cải thiện đáng kể. Mặt
khác chức năng của hệ miễn dịch cũng được nâng cao hơn so với nhóm đối
chứng. Một nghiên cứu khác trên 57 bệnh nhân bị hỏng thận do sữ dụng
gentamixin, người ta quan sát thấy bệnh nhân có sữ dụng nấm ĐTHT với lượng
4,5g/ngày thì thận được bảo vệ tốt hơn, 89% chức năng thận được phục hồi,
giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chứng khi dùng giả dược
hay sử dụng biện pháp khác chỉ cho kết quả 45%. Thử nghiệm trên 69 bệnh
nhân ghép thận, kết quả là nấm ĐTHT đã làm giảm độc tính của Cyclosporine
trên thận [6].
1.1.3.3. Giảm đường huyết
Nấm ĐTHT có hiệu quả với hệ thống chuyển hóa glucose trong máu. Các
nhà khoa học nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95% bệnh nhân được cải thiện chỉ
số đường huyết khi sử dụng 3g nấm/ngày. Hiệu quả này đạt được là do tác dụng
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

10

Khóa luận tốt nghiệp 2016
của nấm ĐTHT trong việc tăng độ nhạy của chất insulin, và các enzyme chuyển
hóa glucose gan, glucokinase. Kết quả này khẳng định rằng việc sử dụng nấm
ĐTHT trong việc kiểm soát chỉ số đường huyết mà không gây ra các phản ứng
phụ [6].
1.1.3.4. Điều trị bệnh phổi
Tác dụng điều trị bệnh về đường hô hấp của ĐTHT đã được Y văn cố ghi
nhận từ hàng nghìn năm nay bao gồm bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính
(COPD) và bệnh viêm phế quản. Nghiên cứu lâm sàng tại trường đại học Y Bắc
Kinh trên 50 bệnh nhân hen suyễn khi được điều trị bằng nấm ĐTHT nhận thấy
tình trạng bênh nhân đã được cải thiện có khoảng 81,3% số bệnh nhân sau khi
sữ dụng nấm 5 ngày so với nhóm điều trị bằng các thuốc kháng histamine thông
thường [11]
1.1.3.5. Điều trị bệnh tim mạch
Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm giảm những mạch máu, làm tăng
lượng tuần hoàn não và tim thông qua cơ chế hưng phấn thực thể M ở cơ trơn
thành mạch. Mặt khác, đông trùng hạ thảo còn có khả năng điều chỉnh lipit máu,
làm giảm choesterol và lipoprotein, hạn chế quá trính tiến triển của tình trạng xơ
vỡ động mạch. Đông trùng hạ thảo làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp, có tác
dụng hạ đường huyết, chống rối loạn những nhịp tim và điều tiết khí oxy cho
máu. Chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim, giữ ổn định nhịp đập của tim. Vì
vậy giúp phòng ngừa những bệnh liên quan đến tim mạch [10].
1.1.3.5. Tăng cường khả năng miễn dịch
Thí nghiệm ở 61 bệnh nhân bị bệnh lupus trong 5 năm kết quả cho thấy
việc dùng nấm đông trùng hạ thảo với liều 3 g/ngày và chất Artesmisinine với
lượng 0,6g/ngày đã làm giảm căn bệnh trên.
1.1.3.6. ỗ trợ điều trị ung thư
Nhiều nghiên cứu lâm sàng được tiến hành tại Trung Quốc và Nhật bản
trên những bệnh nhân ung thư cho kết quả khả quan. Nghiên cứu trên 50 bệnh

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

11


Khóa luận tốt nghiệp 2016
nhân ung thư phổi đã được uống 6g nấm ĐTHT/ngày, cùng với liệu pháp vật lý
trị liệu thì khôi u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46%. Nghiên cứu trên một số
các bệnh nhân bị các dạng ung thư khác nhau, khi sử dụng nấm ĐTHT trong hai
tháng với liều lượng là 6g/ngày, kết quả cho thấy có cải thiện về triệu chứng trên
đa số bệnh nhân. Số lượng tế bào máu trắng bằng hoặc cao hơn 3000 mm³ ngay
cả khi sử dụng liệu pháp chiếu xạ hay hóa chất thì các tham số miễn dịch cơ thể
đã không bị thay đổi đáng kể trong khi kích thước khối u giảm đi nhiều trên một
nữa bệnh nhân. Như vậy kết hợp sữ dụng nấm Đông trùng hạ thảo với các liệu
pháp hóa trị cho kết quả khả quan giảm giảm tác dụng phụ của các liệu pháp
trên [6,7]
1.1.3.7. hống rối loạn tình dục
Nấm ĐTHT dùng để điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ giới
bao gồm giảm ham muốn, lảnh cảm hoặc liệt dương. Nghiên cứu được tiến hành
tại trung quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn, sau 40 ngày sữ dụng
3g ĐTHT/ngày, thì có 64,8% bệnh nhân đã cải thiện được tình trạng tình dục
công trình nghiên cứu khác trên các đối tượng người cao tuổi, cả nam và nữ đều
có triệu chứng giảm ham muốn, liệt dương và các bệnh suy giảm sinh lý khác,
sử dụng 3g/ngày tỏng vòng 40 ngày, các chỉ số đo được như thời gian sống của
tinh trùng, số lượng tinh trùng đã tăng lên, còn tỷ lệ khiếm khuyết cuat tinh
trùng giảm xuống đối với đa số các đối tượng, hơn gấp đôi số người bị liệt
dương cũng như ghi nhận có cải thiện về tình trạng tình dục. đối với nữ giới,
chứng đa khí hư, tình trạng rối loạn kinh nguyệt, ham muốn tình dục cũng được
cải thiện [6,10].
1.1.3.8. Tăng sức bền, chống mệt mỏi

Theo báo cáo điện tử thì khi sữ dụng mỗi ngày 3g nấm ĐTHT thì kết quả
làm gia tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính. Năm
2004, tại Mỹ các nhà khoa học đã thí nghiệm cho người 40 – 70 tuổi, nếu sữ
dụng nấm ĐTHT trong 12 tuần thì có sự gia tăng sức bền thể lực. sự gia tăng
swucs mạnh được thể hiện ở cả hai yếu tố đó là gia tăng Adenosine Triphophate
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

12


Khóa luận tốt nghiệp 2016
(ATP) và giải phóng năng lượng trong ty lạp thể của tế bào cũng như hệ số sữ
dụng hiệu quả oxy của tế bào trong quá trình giải phóng năng lượng [6,10].
1.1.3.9. hống lão hóa
Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (Superoxide Dismutase) là chất chống
oxy hóa cao, nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể.
1.2. Polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris
1.2.1. Đặc điểm về các Polysaccharide trong sinh khối nấm Cordyceps
militaris
Polysaccharides là các polyme ngưng tụ được hình thành từ một lượng lớn
monosaccharide được liên kết với nhau bởi O-glycosidic. Một liên kết glycosidic
được hình thành từ một nửa là glycosyl của hemiacetal (hoặc hemiketal) kết hợp với
nhóm hydroxyl của mono khác để hình thành nên một đơn vị glycosyl trong chuỗi
polysaccharide. Polysaccharides có cấu trúc mạch thẳng hoặc phân nhánh, tuy theo
số lượng các monome chứa trong polysaccharides mà được chia thành hai nhóm:
homopolysaccharides

chỉ

bao

gồm

một

loại

monosaccharide

và

heteropolysaccharides được hình thành từ hai hay nhiều chủng loại monosaccharide.

Hình 1.5: công thức cấu tạo polysaccharide.
Các glycosidic liên kết với nhau tại các vị trí, như liên kết α - (1/2), (1/3),
(1/4) hay β - (1/2), β - (1/3), β - (1/4). Cả hai homopolysaccharides và
heteropolysaccharides có thể chứa các liên kết dạng α, β phụ thuộc vào đơn vị hình
thành lên chúng. Các heteropolysaccharides không chỉ khác nhau về đơn vị cấu tạo,
số lượng và trình tự của các đơn vị monosaccharide mà chúng cũng khác nhau về
trình tự của các mối liên kết glycosidic. Điều này dẫn đến một đa dạng gần như vô
hạn trong cấu trúc của các polysaccharide.

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

13


Khóa luận tốt nghiệp 2016
Các polysaccharides chính trong nấm Cordyceps có một số dạng glucans với
các mối liên kết glycosidic được hình thành từ liên kết (1/3) - (1/6) – β glucans và

(1/3) - 1 - glucans. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của
polysaccharides được chứng minh kháng khối u, trong khi với polysaccharide thu
nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể được giải thích được
thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các polysaccharide.
Bảng 1.2: Hàm lượng của một số loại đường có trong polysaccharide của quả
thể và sợi nấm Codyceps militaris. [15]
Một số loại đƣờng

Hàm lƣợng (mg/g khối lƣợng khô)
Quả thể

Sợi nấm

Arabinose

11.38 ± 0.97

Nd

Fuctose

21.23 ± 3.48

7.31 ± 1.44

Mannitol

117.66 ± 2.23

112.55 ± 3.08

Ribose

86,76 ± 8.79

Nd

Sucrose

Nd

53.07 ± 9.10

Trechalose

23.61 ± 1.02

16.89 ± 0.72

Tổng

260.64 ± 16.49

189.82 ± 10.68

(nd: không phát hiện được)
1.2.2. Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Codyceps sp
Polysaccharide đã được các nhà khoa học khẳng định có hiệu quả trong
việc hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính, nan y như: chống lại sự hoạt động của tế
bào ung thư.

Polysaccharide thư thường có cấu tạo từ đơn giản đến phức tạp chứa các
đường glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và axit
glucuronic. Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết với các protein hoặc
peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc polysaccharide - peptide cấu
trúc này có hoạt tính kháng khối u mạnh hơn. Ngoài cấu trúc 1/3 - β -glucans có khả
năng kháng khối u đã được chứng minh trên cơ sở nghiên cứu lâm sàng, các nghiên
cứu đã chỉ ra glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo của mình các
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

14


Khóa luận tốt nghiệp 2016
phân tử thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose đã liên
kết với các đơn vị khác trong chuỗi ở một số vị trí, với các chuỗi bên là các đơn vị
được hình thành từ axit glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose, hoặc
ribose.
Bảng 1.3: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide được thu nhận
từ một số loại nấm
Chủng nấm

Nguồn thu nhận
polysaccharide

Kháng khối u dạng

Cordyceps militaris

Sinh khối

Khối u ác tính, ung thư phổi

Phellinus gilvus

Cơ thể nấm

Ung thư phổi

Ganoderma lucidum

Cơ thể nấm

Ung thư phổi, ung thư vú

Lentinula edodes

Cơ thể nấm

Ung thư vú

Lepista inversa

Cơ thể nấm

Ung thư phổi

Grifola frondosa

Cơ thể nấm

Ung thư vú

Đặc tính kháng khối u của các polysaccharides có thể bị ảnh hưởng bởi kích
thước của phân tử, mức độ phân nhánh, hình thức, và khả năng hòa tan trong nước.
Nói chung, các polysachcharide càng có trọng lượng phân tử lớn và hòa tan trong
nước tốt có khả năng kháng khối u cao hơn. Một số nghiên thu được trên lâm sàng
cho biết về khả năng kháng khối u cao thuộc về phức hợp polysaccharide - protein
tách ra từ quả thể, đây là các heteropolysaccharides có chứa galactose, glucose,
mannose và fucose. Ngoài ra một số polysaccharides có chứa hoạt tính cao được tách
chiết từ các khuẩn ty dưới dạng sợi nấm chủ yếu là glucans chứa protein với trọng
lượng phân tử khoảng 10 – 103 Da. Hầu hết các polysaccharides công bố có hoạt
động kháng u đã biết đều có cấu trúc cơ bản β-glucan chỉ khác nhau về loại hình liên
kết glucosidic [10] . Do vậy, hoạt động chống khối u đòi hỏi có cấu trúc đặc trưng
như liên kết β-(1-3) trong chuỗi chính của glucan và thêm vào đó là nhánh β-(1-6).
Nếu β-glucans chủ yếu là mạch thẳng, chứa các nhánh không quá dài, chúng sẽ cho
thấy hoạt động chống ung thư. Polysaccharide cho thấy khả năng chống tế bào ung
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

15


Khóa luận tốt nghiệp 2016
thư có thể chứa các cấu trúc khác như hetero-β-glucans, heteroglycan, β-glucanprotein, α-manno-β-glucan liên kết glucoside [10].
Hợp chất exopolysaccharide (EPS) là một polysaccharide ngoài bào, có thể
được thu nhận bằng lên men chìm từ một số loài nấm lớn. Một số nghiên cứu đã rất
thành công trong thu nhận EPS và sinh khối nấm Cordyceps trong lên men chìm trên
môi trường gồm glucose-peptone-cao nấm men với lượng EPS cao nhất là (0,21,01g/L) thu được sau từ 7-15 ngày lên men. Lượng sản phẩm thu được thường
trùng với động học phát triển hệ sợi, hình thái nấm và trạng thái dinh dưỡng. Trong
số các các nghiên cứu, sản phẩm tổng hợp ngoại bào ở một số chủng nấm Cordyceps
đạt được có mức độ cao khi lên men trên môi trường khoai tây-malt-peptone. Như

vậy, sự tích lũy EPS trong nuôi lỏng tương quan chặt chẽ với lượng sinh khối nấm
tạo ra. Sự sinh tổng hợp các dạng EPS trong lên men chìm sẽ phụ thuộc đặc điểm
sinh học của các chủng nấm. Hơn nữa, sự sản xuất polysaccharide ngoại bào có vai
trò như như một chất bám dính trên bề mặt, cố định các enzyme, ngăn cản sự mất
nước của sợi nấm, lưu trữ các chất dinh dưỡng dư thừa.
1.3. Tình hình nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ Cordyceps militaris
1.3.1. Tình hình nghiên cứu polysaccharide trên thế giới
Một số nghiên cứu đã được thực hiện về tách chiết và tinh sạch các
polysaccharides từ nấm sợi nấm trên thế giới như:
Theo (Li et al., 2006) đã nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và hoạt động
chống oxy hóa của polysaccharide từ C.Militaris. Hiện nay, quả thể C.Militaris
có sẵn như là nguyên liệu làm thuốc và sức khỏe sản phẩm thực phẩm ở Trung
Quốc, Hàn Quốc và Đông Nam Á. Hoạt tính sinh học polysaccharides là phổ
biến trong các loại nấm, và hầu hết có cấu trúc ở các loài khác nhau. Một số
nghiên cứu đã được tiến hành để xác định chính xác các cấu trúc của những
khác nhau polysaccharides. Trong nghiên cứu này, CM-hs-CPS2 được chiết xuất
từ C.Militaris được nuôi trồng trên môi trường gạo rắn. Các kết quả của các
thành phần cấu trúc của nó đã chỉ ra CM-hs-CPS2 được hình thành từ mannose,
glucose và galactose với tỷ lệ mol 1,35: 8,34: 1,00. CM-hs-CPS2 gồm có
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

16


Khóa luận tốt nghiệp 2016
pyranose và liên kết bởi α-glycosidic liên kết, là một loại polysaccharide có tính
axit sulfate chứa acetamido nhóm. Trong vài năm qua, những đặc điểm cấu trúc
của nhiều polysaccharides thu được từ C.militaris nuôi cấy đã được báo cáo [8].
Hai polysaccharides (CPS-2 và CPS-3) được phân lập từ C. Militaris nuôi
bởi Yu. CPS-2 bao gồm chủ yếu là các loại đường rhamnose, glucose và

galactose với tỷ lệ mol 1: 4,46: 2,43. CPS-3 là một polysaccharide, mà chứa
glucose với một liên kết của α-D-glucose (Yu et al., 2004). Sau đó,
polysaccharide P70-1 cũng thu được từ quả thể của C. militaris (Yu et al., 2007).
Với môi trường axit polysaccharide phân lập từ C. Militaris trồng trên đậu tương
nảy mầm gồm có galactose, arabinose, xylose, rhamnose và acid galacturonic
(Ohta et al., 2007). Lee và các cộng sự của ông đã báo cáo thuộc tính cấu trúc
của CPMN Cha II và CPMN Cha III được lấy từ các sợi nấm nuôi của C.
militaris. CPMN Cha II là một galactomannan 1, 6-nhánh-glucan với β-liên kết
và cấu thép cuộn ngẫu nhiên (Lee et al., 2010a). CPMN Cha III là một β-1, 4nhánh β-1, 6- galactoglucomannan (Lee et al., 2010b). Các tế diễn giải của
polysaccharide khác biệt cấu trúc từ Kết quả trên thân thể đến một thực tế rằng
họ đã C. chủng Militaris khác nhau. Hơn nữa, môi trường nuôi cấy khác nhau
(tằm nhộng, trung bình gạo rắn và nước dùng) có thể góp phần cấu trúc khác
nhau của polysaccharide [9].
Sun và cộng sự nghiên cứu các điều kiện khai thác trên C.Sinensis sợi
nấm và thấy rằng tỷ lệ của nguyên bột nguyên liệu và nước là 1: 2,5, thời gian
chiết là 24 h và pH 7,5-8,0 là tốt, thấy rằng nhiệt độ là yếu tố quan trọng đối với
việc chiết polysaccharide. Kết quả tốt nhất thu được khi tiến hành tách chiết và
thực hiện hai lần với 0,1 g của sợi nấm bột trong 20 ml nước cất (pH = 4,2) ở
100°C 70 phút [12]
Wang et al. tiến hành nghiên cứu sự khác biệt trong phương pháp khai
thác polysaccharide từ C.Militaris, bằng phương pháp siêu âm với dung môi:
nước và cồn. Kết quả cho thấy C.Militaris polysaccharide thô đạt 10,97% khi

Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

17


Khóa luận tốt nghiệp 2016
khai thác được thực hiện với nước và 80% công suất khi có sự hỗ trợ của vi sóng

trong 20 phút [12]
Có rất nhiều polysaccharide trong các chủng Codyceps spp. Wang tìm ra
hàm lượng polysaccharide chứa trong sợi nấm của C.Sinensis là 157,3 mg/g và
khi so sánh hàm lượng đường tổng giữa thể trùng và quả thể có chút khác nhau
tương ứng 24,2 và 24,9% nhưng hàm lượng trong sợi nấm vẫn cao nhất chiếm
39,4%. Theo phương pháp đo màu sử dụng acid sulphuric (Dubois 1956), lại
thấy rằng hàm lượng của polysaccharides trong C.Sinensis và C.Hawkesii lần
lượt là 3,5 và 0,7% thấp hơn so với C.Sinensis [11].
C.Militaris được cho là chủng thích hợp nhất trong chi nấm Codyceps,
chúng có thể được nuôi cấy tốt trong môi trường rắn hoặc lỏng. Huang và cộng
sự, đã nghiên cứu các thành phần của bột quả thể và sợi nấm của C.Militaris và
nhận thấy rằng hàm lượng đường tổng là 260,64 và 389,47 mg/g, nhưng sự giảm
hàm lượng đường trong quả thể lại cao hơn trong sợi nấm khi thu nhận từ tự
nhiên và nuôi nhân tạo.. Trong môi trường nhân tạo, lượng polysaccharide trong
sinh khối khô là 0,14%. [11,14]
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình công bố liên quan
đếnsinh khối nấm Cordyceps militaris như: một số nhóm nghiên cứu đã bước đầu
công bố một số kết quả trong việc sản xuất chế phẩm từ các chủng nấm Cordyceps
sp. như: TS. Nguyễn Mậu Tuấn tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông lâm
nghiệp Lâm Đồng, đã nghiên cứu và sản xuất thành công loại dược liệu quý này trên
nhộng tằm. Sản phẩm thu nhận được có chất lượng tốt nhưng khó khăn khi triển khai
đại trà với qui mô lớn và kiểm soạt sự tạp nhiễm; GS.TS. Đái Duy Ban cùng các
cộng sự tại công ty Daibio cũng đã và nhân nuôi thành công nấm Cordyceps sp. trên
giá thể là côn trùng xén tóc; TS. Phạm Văn Nhạ, Trung tâm Đấu tranh sinh học
thuộc Viện Bảo vệ thực vật (Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam) đã nuôi cấy
thành công nấm Đông Trùng Hạ Thảo bằng phương pháp lên men bề mặt trên cơ
chất gạo lứt và nhộng tằm và chỉ tập trung vào hai hợp chất chính là Cordycepin có
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

18


Khóa luận tốt nghiệp 2016
chức năng phòng chống u xơ, tiền ung thư và Adenosin là thuốc điều trị trong tim
mạch. Kết quả Cordycepin đạt 0,14 mg/gram sinh khối tươi và Adenosine là 0,32
mg/g sinh khối tươi với thời gian nuôi cấy từ 60 đến 75 ngày; Cử nhân Công nghệ
Sinh học Nguyễn Thị Hồng, Công ty Cổ phần Dược thảo Thiên Phúc, đã nghiên cứu
hoàn thiện quy trình sản xuất nấm Đông Trùng Hạ Thảo trên giá thể gạo và nước dừa
cỏ bổ sung một số vi chất. Sản phẩm được đánh giá chất lượng cao với hàm lượng
cordycepin đạt 0,67 mg/g. Đến nay Công ty đã có hai xưởng sản xuất nấm Đông
Trùng Hạ Thảo, một tại Hòa Đức, Hà Nội và một tại Đà Lạt, Lâm Đồng. Hiện tại,
với năng suất nuôi cấy 20.000 lọ ĐTHT mỗi tháng, Công ty cung cấp 50% cho các
đơn vị chế biến dược liệu trong nước, 30% xuất khẩu sang Đức và Thái Lan, 20% tự
tiêu thụ trong nước,… Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của TS. Trương Bình Nguyên tại
Viện Sinh học Tây Nguyên đã bước đầu thự hiện lên men nấm Cordyceps trên bình
tam giác, thu nhận sinh khối và dịch lên men, tách chiết các hợp chất và giá khả năng
chống oxy hóa của các hoạt chất này trong việc kháng lại acetylcholinesterase nhằm
điều trị bệnh Alzheimer. Hiện nay, tại Việt Nam chưa có nghiên cứu công bố cũng
như ứng dụng lên men trên các thiết bị lên men hiện đại nhằm sản xuất các dược chất
có hiệu quả từ nấm Cordyceps. Để đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng cho sản xuất
ngày càng nhiều, do vậy các nghiên cứu thu nhận sinh khối chủng Cordyceps trên
các thiết bị lên men nhằm tạo ra một lượng lớn nguyên liệu sử dụng trong sản xuất là
điều cấp thiết.
Đối với nghiên cứu tách chiết và tinh sạch polysaccharide từ Cordyceps
militaris cũng như các loài Cordyceps khác như: Nghiên cứu điều kiện lên men
nấm Cordyceps để nâng khả năng sinh tổng hợp cordycepic acid, polysaccharide
[3], Phân lập các polisaccharide từ nấm hầu thủ lên men dịch thể và đánh giá
hoạt tính kháng u của chúng [2]... Và như các nghiên cứu trên thế giới đã cho
chúng ta thấy được công dụng và tầm quan trọng của polysaccharide đối với sức

khỏe con người. Vấn đề ngày càng được xã hội quan tâm nhiều nhất.
Cordyceps militaris được nuôi trồng trong điều kiện nhiệt độ, đổ ẩm, ánh
sáng ổn định thuận tiện cho việc kiểm soát sự sinh trưởng và phát triển của
Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH

19