Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây trinh nữ hoàng cung – crinum latifolium l , amaryllidacceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*****

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)
Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC
Mã số: 62.73.15.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Người cam đoan,

Nguyễn Hữu Lạc Thủy


i

MỤC LỤC
MỤC LỤC............................................................................................................... i
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH...................................................................................... v

DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................. vii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tổng quan thực vật học cây Trinh nữ hoàng cung ......................................... 3
1.2. Tổng quan hóa học của chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung .................. 5
1.3. Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung ........ 14
1.4. Chiết hoạt chất từ dược liệu bằng dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn ............. 21
1.5. Các phương pháp nghiên cứu hóa học của cây Trinh nữ hoàng cung........... 22
1.6. Phương pháp thiết lập chất đối chiếu........................................................... 24
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 27
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 27
2.2. Trang thiết bị .............................................................................................. 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 40
3.1. Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid từ cây
Trinh nữ hoàng cung.......................................................................................... 40
3.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ....................................................................... 46
3.3. Thiết lập chất đối chiếu ............................................................................... 69
3.4. Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính và định lượng
alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC ............................................................. 82
3.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột lá
Trinh nữ hoàng cung.......................................................................................... 99


ii

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 102
4.1. Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung ........... 102
4.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ...................................................................... 107

4.3. Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết Trinh nữ hoàng cung ........................ 111
4.4. Quy trình định lượng alcaloid và flavonoid từ lá Trinh nữ hoàng cung...... 112
4.5. Các chỉ tiêu cần thiết của Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC ....................... 117
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN PHỤ LỤC


iii

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASEAN

Association of Southeast Asian Nations
(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

AL-NK

Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt

AL-SA

Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm

AL-SFE

Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE

AR-96

Phân đoạn alcaloid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96%

As

Hệ số bất đối

CĐC

Chất đối chiếu

CE

Caplillary Electrophoresis (Điện di mao quản)

Corr Area

Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa)

CZE

Caplillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng)

d

doublet (đỉnh đôi)

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DSC

Differential Scanning Calorimetry (Nhiệt vi sai)

DMSO

Dimethylsulfoxyd

DVT

Dấu vân tay

ESI

Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun ion)

FL-NK

Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt

FL-SA

Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm

FL-SFE

Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE

FR-96

Phân đoạn flavonoid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96%

GC

Gas Chromatography (Sắc ký khí)

GC-MS

Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)

GLP

Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc)

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

IR

Infrared (Hồng ngoại)


iv

J

Coupling constant (Hằng số ghép)

LC-MS

Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

L-SFE

Cao toàn phần chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE

MEKC

Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động)

MS

Mass Spectrometry (Khối phổ)

NMR

Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân)

PĐ

Phân đoạn

PDA

Photo Diode Array (Dãy diod quang)

PCRS

Primary Chemical Reference Standard
(Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)

PTN

Phòng thí nghiệm

RSD

Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

Rs

độ phân giải giữa pic có thời gian lưu nhỏ và lớn hơn kề bên

S

Diện tích pic (µV x giây)

s

singlet (Đỉnh đơn)

SKĐ

Sắc ký đồ

SCRS

Secondary Chemical Reference Standard
(Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SFE

Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TCKN

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm

TR

Thời gian lưu (phút)

TM

Thời gian di chuyển (phút)

TNHC

Trinh nữ hoàng cung

TGA

Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng)

TT

Thuốc thử

UV-Vis

Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)

VLC

Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không)

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC ................................................................................. 5
Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học của alcaloid khung crinin ....................................... 6
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) ......... 6
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) và cấu trúc khung galanthamin (D) 7
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) và cấu trúc khung cheryllin (F) .... 7
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong chi Crinum ............................. 8
Hình 1.7: Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC .................... 10
Hình 3.1: Hình lá và cụm hoa của cây TNHC (Crinum latifolium L.) ................... 40
Hình 3.2: Hình hoa Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) .......................... 40
Hình 3.3: SKĐ các hợp chất phân lập từ các phân đoạn alcaloid. .......................... 48
Hình 3.4: SKĐ các hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid AR và flavonoid. ..... 48
Hình 3.5: Cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ NMR (500 MHz, CDCl3) của (2). ....... 58
Hình 3.6: Cấu trúc hóa học của 6-ethoxyundulatin................................................ 58
Hình 3.7: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC crinamidin bằng HPLC. .............. 71
Hình 3.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC. ............ 72
Hình 3.9: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC lycorin bằng HPLC..................... 72
Hình 3.10: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC hippadin bằng HPLC. ............... 73
Hình 3.11: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC astragalin bằng HPLC............... 73
Hình 3.12: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC isoquercitrin bằng HPLC. ......... 74
Hình 3.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. ................................................ 85
Hình 3.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. .................... 89
Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE............................................ 92

vi

Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE................... 95
Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC. ........................................... 97
Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC.......................................... 98
Hình 4.1: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic. ............. 113
Hình 4.2: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient. .............. 113
Hình 4.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích bằng CZE và MEKC. . 114
Hình 4.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong methanol. ................................ 115
Hình 4.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong đệm dinatri tetraborat 25 mM. . 115
Hình 4.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong dung dịch acid H3PO4.............. 115
Hình 4.7: SKĐ so sánh khả năng rửa giải mẫu flavonoid TNHC bằng HPLC với pha
động methanol và acetonitril . .............................................................................. 116

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC........................... 29
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ lá TNHC kết hợp hai phương pháp SFE
và phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70%........................................................ 32
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid từ lá TNHC .............. 42
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ rễ TNHC. ...................................... 42
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid bột lá kết hợp hai phương pháp chiết. 45
Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) và (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE. .................. 50
Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA. .............................. 82


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L. ............................................. 11
Bảng 3.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất bằng phương pháp ngấm kiệt. ................. 41
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết. ..................... 43
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất lên hiệu suất chiết. .................. 44
Bảng 3.4: Kết quả tách phân đoạn mẫu AL-SFE và FL-NK bằng VLC. ................ 46
Bảng 3.5: Các hợp chất tinh khiết phân lập được từ cao chiết TNHC. ................... 47
Bảng 3.6: Kết quả phân lập alcaloid từ phân đoạn ALS1. ..................................... 48
Bảng 3.7: Kết quả triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo. ........................ 49
Bảng 3.8: Kết quả phân lập (2) và (3) từ PĐ n–hexan. .......................................... 49
Bảng 3.9: Kết quả phân lập các (8), (9), (10) từ PĐ alcaloid AL-NK. ................... 51
Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) của hợp chất (2)............... 56
Bảng 3.11: Các tương tác proton trên phổ COSY, HMBC của hợp chất (2). ......... 57
Bảng 3.12: Kết quả độ tinh khiết; hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng. ........ 69
Bảng 3.13: Thành phần pha động và bước sóng phát hiện của quy trình xác định độ
tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC. ............................. 70
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC. .... 70
Bảng 3.15: Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các CĐC bằng HPLC. ........ 74
Bảng 3.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy của các CĐC. ........................ 75
Bảng 3.17: Dữ liệu phổ IR của các CĐC. .............................................................. 75
Bảng 3.18: Kết quả đánh giá đồng nhất lô của các CĐC sau khi đóng gói. ............ 77
Bảng 3.19: Kết quả phân tích robust A của CĐC crinamidin. ................................ 79
Bảng 3.20: Kết quả phân tích robust A của CĐC 6-hydroxycrinamidin................. 79
Bảng 3.21: Kết quả phân tích robust A của CĐC hippadin. ................................... 80
Bảng 3.22: Kết quả phân tích robust A của CĐC lycorin. ..................................... 80
Bảng 3.23: Kết quả phân tích robust A của CĐC astragalin. ................................. 81


viii

Bảng 3.24: Kết quả phân tích robust A của CĐC isoquercitrin. ............................. 81

Bảng 3.25: Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC. .............. 81
Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng 6 alcaloid bằng HPLC.................. 83
Bảng 3.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 83
Bảng 3.28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 86
Bảng 3.29: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). .................................... 87
Bảng 3.30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). . 88
Bảng 3.31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng HPLC (n = 6)............................... 90
Bảng 3.32: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). ........................ 90
Bảng 3.33: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6). ......................................... 91
Bảng 3.34: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6). ............................... 93
Bảng 3.35: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9). ......................................... 93
Bảng 3.36: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6). ........................... 94
Bảng 3.37: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6). .................................. 96
Bảng 3.38: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9). ............................. 96