MỘT QUY TRÌNH MỚI DỰA TRÊN SẮC KÝ CỘT ĐỂ LÀM SẠCH BROMELAIN BẰNG TRAO ĐỔI ION CỘNG VỚI GEL CHROMATOGRAPHIES LỌC

MỘT QUY TRÌNH MỚI DỰA TRÊN SẮC KÝ CỘT ĐỂ LÀM SẠCH
BROMELAIN BẰNG TRAO ĐỔI ION CỘNG VỚI GEL
CHROMATOGRAPHIES LỌC
Trừu tượng hóa:
Bioproducts cách ly và quy trình phương pháp làm sạch bằng ánh nắng là đoạn quan
trọng của công nghiệp công nghệ sinh học.
Bromelain là en - zim mà có giá trị thương mại lớn và được quan tâm đến nhiều thứ trong
dược, tiêu hoá, và công nghiệp dệt, giữa người khác. Mục tiêu này nghiên cứu là để phát
triển phương pháp mới cho sự làm trong sạch bromelain từ phế liệu thân phát sinh từ
nông nghiệp chế biến cây dứa. Bromelain đã được làm sạch sử dụng hai sắc ký lỏng
bước, sự trao đổi i - on cộng sắc ký sự lọc gel. Sử dụng phương pháp luận mà được phát
triển tạo ra en - zim với trọng lượng phân tử của 30 kDa ( xác nhận bằng SDS - Trang ),
phục hồi cao của hoạt động enzim ( 89% ), và với purifi - cation yếu tố của 16.93, kết quả
cao hơn phương pháp luận mô tả trong văn chương. HPLC cho thấy hiện diện của hai
đỉnh cao trong sắc phổ sự trao đổi i - on và chỉ một prô - tê - in trong sắc phổ sự lọc gel.
Kết quả cho thấy, tùy vào nơi đến của bromelain, tiến trình có thể bị chặn đứng sau khi
bước sự làm trong sạch đầu tiên. MALDI - TOF cô miễn là dấu vân tay khối pép - tít của
bromelain và MALDI-MS / cô phân mảnh hồ sơ và trình tự của ion của m / z 951 và
1584. Do đó, kết nối và cấu trúc hoá học của bromelain được xác nhận. Hơn nữa, chưa kể
thế mạnh của nó khác phương pháp luận, nó có thể được áp dụng cho lợi dụng nông
nghiệp và công nghiệp cây dứa phế liệu.
© 2014 Elsevier B.V. tất cả các quyền đều được bảo lưu
1. Giới thiệu
Sự cô lập và tinh chế các chế phẩm sinh học là quá trình rất tầm quan-trọng trong
ngành công nghiệp công nghệ sinh học, chiếm 80-90% tổng chi phí sản xuất. Hơn
nữa, sự phát triển của đơn giản, phương pháp khả thi để lọc protein đã là một điều
kiện tiên quyết cần thiết cho nhiều tiến bộ trong công nghệ sinh học (Harikrishna et
al., 2002; Costa et al., 2009). Sắc ký lỏng (LC) là một kỹ thuật thường được sử dụng
làm sạch protein. Tuy nhiên, kỹ thuật phân tích khác cũng có thể được sử dụng như
chiết lỏng-lỏng bởi hệ thống hai pha nước (Babu et al., 2008), đảo ngược các hệ thống
micellar. và tách biệt bởi màng tế bào và có mưa (Doko et al, 2005. Silveste et al.,

2012). Trong sắc ký lỏng, ủng hộ teins trong dung dịch (pha động) đang bị cô lập và


tinh khiết qua tương tác của họ với một pha tĩnh (Cao, 2005). Nói chung, các sản
phẩm thu được bằng cách lọc LC là rất tốn kém và có giá trị gia tăng cao do chi phí
của các vật liệu được sử dụng trong quá trình sản xuất. Sự phát triển của thanh lọc
LC-chi phí thấp phương pháp đã được thử thách (Costa et al., 2009). Enzyme phân
hủy protein, hoặc protease, là một lớp học của thủy phân các enzyme có khả năng
tách cầu nối peptide của chuỗi protein và rất cần thiết trong quá trình sinh lý. Ngoài
ra, thân chọc là một trong những enzyme có liên quan nhất từ một công nghiệp quan
điểm vì sự tham gia của họ trong một số công nghệ ứng dụng (Bon et al., 2008).
Bromelain là một enzyme phân giải protein thuộc cysteine gia đình peptidase. Loại
enzyme này có thể được tìm thấy trong các mô của nhà máy của gia đình
Bromeliaceae, và dứa (Ananas comosus var. comosus) là nguồn chính của nó (Rowan
và cộng sự, 1990;.. Hebbar et al, 2008). Bromelain có một số ứng dụng công nghệ
sinh học, đặc biệt là trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm các ngành công
nghiệp, như cũng như một số ứng dụng lâm sàng, chẳng hạn như một tác nhân chống
ung thư, điều biến đáp ứng miễn dịch và tăng cường tác dụng kháng sinh và hành
động mucolytic và tiêu hóa (Maurer, 2001;. Bala và cộng sự,
2012). Hơn nữa, các enzyme có tác dụng trên tim mạch và các bệnh tuần hoàn và có
thể có tiềm năng sử dụng trong phẫu thuật thủ tục và chăm sóc vết thương (Costa et
al., 2009). Các ứng dụng trên toàn thế giới của bromelain làm tăng tầm quan-tầm xác
định một phương pháp khai thác và tinh chế khả thi cho enzyme này. Như một
phương pháp có thể giúp giảm thiểu thiệt hại trong các doanh nghiệp nông nghiệp dứa
vì nông nghiệp và công nghiệp chất thải dứa (thân cây, lá và thân răng) rất giàu này
enzyme. Thông thường, dư lượng này không được sử dụng và không có điểm đến
appropri-ăn (Bardiya et al, 1996;.. Costa và cộng sự, 2009). Do đó,
nghiên cứu này trình bày một phương pháp khả thi mới cho purifi-cation của
bromelain từ thân cây dứa sử dụng LC là chính mình kỹ thuật
2. Phương pháp

2.1. Vật chất
2.1.1. Chất thải quả dứa
Chất thải quả dứa từ cv. Vitória thu được từ
Incaper Sooretama Nông trại Thí nghiệm, tại Sooretama-ES, Braxin.
2.1.2. Hoá chất


Tất cả sản phẩm hoá chất dùng trong nghiên cứu này đã được mua từ
Xíchma, Merck hoặc GE ( USA ). Sản phẩm hoá chất lớp HPLC đã được mua từ Tedia
Brazil.
2.2. Trích đoạn thô sơ
Số lượng biết ( 450 g ) của chất thải ( thân của cv quả dứa. Vitória ) ngỡ ngàng trong năm
phút cùng với 600 mL của giải pháp extrac - tor ( 0.4 M H2SO4 / 2 mm Na2SO4pH 4.5
lúc 4 giờ ◦ C ). Trích đoạn sau đó đã được lọc và centrifuged tại 14,750 × g cho 20 tối
thiểu lúc 4 giờ ◦ C, và supernatant ( trích đoạn en - zim thô sơ ) đạt được dùng cho exper
- iments sau. Trích đoạn thô sơ đã được lưu trữ đông cứng tại - 20 ◦ c.
2.3. xác định protein
Nồng độ protein từ các giải pháp enzym là
xác định theo phương pháp mô tả bởi Bradford (1976)
sử dụng albumin huyết thanh bò như là tiêu chuẩn.
2.4. Hoạt động Bromelain
Hoạt động bromelain đã được quyết định theo đơn vị tiêu hoá casein ( CDU ) phương
pháp, sử dụng casein như chất nền với sự có mặt của cysteine và EDTA. Xét nghiệm dựa
vào thuỷ phân phân giải prô - tê - in của chất nền casein.
Độ hấp thu của nước lọc rõ ràng ( làm hòa tan casein ) là mea - sured tại 280 nm sử dụng
máy trắc quang. (Một đơn vị hoạt động bromelain đã được định rõ) Một đơn vị hoạt động
bromelain được định nghĩa là 1G tyrosine phát hành trong 1 phút mỗi ml mẫu khi casein
đã được thủy phân theo các điều kiện tiêu chuẩn của 37◦C và độ pH 7.0 trong 10 phút.
Các phân tích mẫu được thực hiện đối với mình các giải pháp để trống. Các bài đọc nồng
độ protein được thực hiện trong ba lần, và giá trị trung bình được sử dụng cho việc tính

toán hiệu quả khai thác. Các hoạt động cụ thể, phục hồi hoạt động (%) và thanh lọc lần
được ước lượng bằng các phương trình sau đây:
Hoạt động cụ thể =
hoạt động phân giải protein (U / ml) /hàm lượng protein (mg / ml)
(1)


Phục hồi Bromelain (%) = hoạt động bromelain sau khi lọc bromelain/ hoạt động của
chiết xuất dầu thô × 100 (2)
Thanh lọc lần = hoạt động cụ thể sau khi làm sạch /hoạt động cụ thể của dịch chiết thô
(3)
2.5. Sắc ký trao đổi ion
Một kính 25 mm cột ID, 110 mm dài được đóng gói với caboxymethy-celullose và cân
bằng với bốn khối lượng cột 5 × 10 mũ -3M Đệm acetate. Sau đó 10 ml dung dịch chiết
xuất dầu thô nộp và vẫn tiếp xúc với nhựa trong một giờ. Sau đó, mẫu được tách rửa bằng
1 M dung dịch đệm acetate pH 4,5 ở tỷ lệ 0,5 ml / phút chảy. Sau đó các phần được thu
thập trong 4 mL phần phân ước. Sự hiện diện của protein đã được theo dõi bằng cách sử
dụng ghi âm quang phổ ở 280 nm. sử dụng bộ đệm acetate pH. 4,5 là trống. Các thủ tục
cho việc ước lượng hàm lượng protein và hoạt động của enzyme được mô tả dưới đây.
Cuối cùng, cột sau đó đã được rửa sạch bằng 2 giải pháp M NaCl cho đến khi không có
thêm protein tách rửa. Tất cả các thủ tục đã được thực hiện trong một môi trường lạnh tại
4◦C. Enzyme tinh khiết đã được lưu trữ trong đông lạnh ở -20◦C
2.6. Sắc ký lọc gel
Phần phân ước từ sắc ký trao đổi ion được thu thập và trình sắc ký lọc gel. Một cột thủy
tinh với một 17,5 mm ID và dài 200 mm đã được đóng gói với Sephadex G-50® và cân
bằng với một nửa khối lượng cột của bộ đệm acetate. Các mẫu đã được áp dụng và để
tiếp xúc với nhựa cho một giờ. Các mẫu sau đó được tách rửa với 1 M dung dịch đệm
acetate pH 4,5 ở tốc độ dòng chảy 0,7 ml / phút, và rửa giải được thu thập như được mô
tả trước viously. Cột sau đó được rửa sạch với 5 × 10 -3M acetate pH đệm 4,5 giải pháp
cho đến khi không có thêm protein tách rửa. tất cả thủ tục được tiến hành trong một môi

trường lạnh tại 4◦C Enzyme tinh khiết đã được lưu trữ trong đông lạnh tại -20◦C. (Cabral
et al, 2000. Hernández et al., 2005 với những thay đổi).
2.7. SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp Laemmli (1970) sử dụng 15% (w / v) gel
polyacrylamide. Nhuộm của gel được thực hiện bằng Coomassie Brilliant Blue G-250.
Đo Chromatog-raphy và SDS-PAGE được thực hiện trong ba lần.
2.8. HPLC


A 20? L dịch chất của mẫu thu được từ việc trao đổi ion và sắc ký lọc gel đã bị phân tích
cao sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC) thực hiện trên một Prominence Shi-madzu (Kyoto,
Nhật Bản) với một bộ máy UV / vis LC-20A phát hiện. Các phần được tách rửa bằng một
Shimadzu Shim Gói CLC (M) C18 (dài 4,6 mm ID × 250 mm) cột sử dụng một gradient
tuyến tính giữa TFA / H2O (1: 1000, v / v) và TFA / axetonitril (1: 1000, v / v) trên 80
phút ở tốc độ dòng chảy 0,5 ml / phút, và độ hấp thụ là đọc ở 280 nm (Hernandez et al.,
2005 với những thay đổi)
2.9. Khối phổ
Các điểm protein quan tâm đã được cắt ra khỏi gel (Shevchenko et al., 1996). Các vị trí
đã được rửa ba lần với một dung dịch rửa (1: 1, v / v 25 mM amoni cacbonat-acetonitrile)
25 ◦ C trong 2 giờ. Các giải pháp giặt là sau đó lấy ra và tại chỗ được che phủ bằng
acetonitrile giờ cho 20 phút ở 25 ◦ C. Cuối cùng, acetonitrile đã được gỡ bỏ và dư thừa
bốc hơi, do đó cung cấp, sấy khô ngay tại chỗ. các mất nước hạt gel sau đó được hydrat
trong 10 phút với 10 L tiêu hóa? bộ đệm (25 mM amoni cacbonat) có chứa 20 ng trypsin
(trình tự cấp đổi porcin trypsin, Promega, Madison, WI, Hoa Kỳ). Sau, 20? L tiêu hóa
đệm đã được thêm vào, và mẫu được ủ trong 20 giờ ở 37 ◦ C. Kết quả là peptide tryptic là
hai lần chiết xuất với 50? L 0,1% axit trifluoroacetic (TFA) trong 50% (v / v) acetonitrile
với 20 phút siêu âm. Các sản phẩm từ hai chiết xuất được kết hợp, máy hút khô và sau đó
hòa tan trong 0,1% TFA 50% (v / v) acetonitrile. Ma trận (10 mg / ml CHCA (? -cyano4-hydroxycinnamic acid) trong 0,1% TFA và 50%, v / v acetonitrile) và mẫu (1: 1, v / v)
đã được phát hiện và cocrystallised trên một tấm mục tiêu. Matrix hỗ trợ tia laser giải hấp
ion hóa thời gian của chuyến bay / thời gian của chuyến bay hàng loạt spec-trometry

(MALDI-TOF / TOF MS, mô hình 4700 Explorer Proteomics Phân tích, Biosystem Ứng
dụng ® , Hoa Kỳ) đã được áp dụng để Peptide . Khối lượng vân tay (PMF) và trình tự
peptide. Đối với MALDI-MS / MS đo lường, N2 được sử dụng như khí va chạm trong tế
bào va chạm 2,8 × 10 -6 Torr. Peptide autolysis trypsin của khối lượng và 842,5 2211,1
và hiệu chuẩn hỗn hợp 1 và 2 (Sequazyme Peptide Thánh Lễ Bộ tiêu chuẩn, hệ thống
sinh học PerSeptive ® , Thành phố Foster, CA, USA) đã sử dụng, tương ứng, như các
tiêu chuẩn nội bộ và bên ngoài về cả MALDI MS và MALDI MS / MS thủ tục. Đối với
cơ sở dữ liệu tìm kiếm, các file PPW đã được trình lên Công cụ tìm kiếm linh vật sử dụng
Daemon 2.1.0 (Matrix Khoa học: ) trên máy chủ phiên bản
Mascot 2.2.1. Các dữ liệu được tìm kiếm với phiên bản mới nhất của công chúng


cơ sở dữ liệu protein không dự phòng của Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ
sinh học-thuật điều khiển (NCBI), tải về vào tháng 8 năm 2008, với một độ chính xác
khối lượng của 15 ppm đối với ion mẹ (MS) và 0,2 Đà cho ion mảnh (MALDI MS / MS).
Việc tìm kiếm được hạn chế đến peptide tryptic với tối đa một tách bỏ lỡ. Các
carbamidomethylation của cysteine là được coi là một thay đổi cố định, trong khi quá
trình oxy hóa của methio chín dư lượng được coi là một sự thay đổi biến. một ban đầu
danh sách các protein được tạo ra và hình thành cơ sở để biết thêm phân tích. Một "danh
sách tích cực" được tạo ra bởi chỉ có những người xem xét protein có chứa ít nhất một
peptide duy nhất (tối thiểu 10 aa) với số điểm trên 67 Mascot (giá trị p <0,05). HPLC và
MS thí nghiệm đã được thực hiện thành hai bản (Rodrigues et al., 2011)
3. Kết quả và thảo luận
Chiết xuất dầu thô được thu thập với 1.77 mg / ml tổng lượng protein, U 40,84 mL-1
hoạt động phân giải protein và 23,07 mg U-1 của cụ thể hoạt động (Bảng 1). Sau khi các
bước tinh chế, chiết xuất dầu thô áp dụng cho các phương pháp sắc ký trao đổi ion.
3.1. Sắc ký trao đổi ion
Lọc Bromelain có carboxymethylcellulose (CMC) trưng bày một yếu tố thanh lọc 3.01,
với 93% hồi phục của hoạt động phân giải protein. Không có hoạt động đã được phát
hiện sau khi rửa chảy. Các phương pháp sắc ký trao đổi ion của bromelain dẫn

đỉnh điểm nổi bật trong phần thứ sáu (Hình. 1). Các cụ activi-mối quan hệ của các chiết
xuất dầu thô áp dụng và phần thứ sáu tách rửa được 23.07 và 69.50 U / mg protein, tương
ứng.
Chúng tôi quan sát thấy một hoạt động bromelain cao hơn so với báo cáo cho các phương
pháp hiện có của sắc ký trao đổi ion. Điều này hoạt động là do việc sử dụng 1 M dung
dịch đệm acetate pH 4,5 trong này bước. Costa (2010), so với bộ đệm khác nhau để duy
trì của bromelain, và lưu ý rằng bộ đệm này ở pH 4,5 đóng góp để hoạt động bromelain.
Hơn nữa, các công trình trước đây đã chỉ ra những khác biệt về nhựa sắc ký ion quan
trọng đối với hoạt động bromelain (Devakate et al, 2009;. Costa, 2010)
3.2. Sắc ký lọc gel
Các phần phân đoạn thu được bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion là gộp (phân số 322) và bị loại trừ phân tử Chro-matography sử dụng Sephadex G-50 nhựa, và tổng cộng
51 phân được thu thập (Hình. 2). Các hoạt động cụ thể của bromelain là 390,75 U / mg,


trong khi đó các hoạt động phân giải protein là 89% phục hồi với một yếu tố thanh lọc
16.93. Sự kết hợp của nhựa CMC với Sephadex ® G-50 là một loại nhựa phương pháp
sắc ký mạnh mẽ để có được Bromelain trong tinh khiết của nó hình thức. Suh et al.
(1992) bromelain tinh chế từ quả dứa và thân cây cho đến khi đồng nhất bằng sắc ký lọc
gel, có được một năng suất chỉ có 23% hoạt động. Hernández et al. (2005) báo cáo một
phương pháp thanh lọc cho bromelain tương tự như nghiên cứu của chúng tôi. Các tác giả
đã tiến hành Bromelain Tuy nhiên thanh lọc sử dụng điều trị ngược lại: họ thực hiện
lọc gel tiếp theo phương pháp sắc ký trao đổi ion. Nhựa gel lọc được sử dụng là
Sephadex ® G-100, năng suất hoạt động 87,81%. Các bước làm sạch thứ hai được sử
dụng CMC, trong đó sản lượng hoạt động bromelain giảm xuống còn 41,15%. các
Sephadex ® G-50 là rẻ hơn so với Sephadex ® G-100 (reduc-tion 50% chi phí), trở thành
quá trình thanh lọc của bromelain hiệu quả kinh tế. Ngoài ra, các phương pháp làm sạch
phát triển thể hiện một năng suất cao hơn của hoạt động phân giải protein.
Bảng 1
Năng suất trong tổng số protein, hoạt động phân giải protein, hoạt động cụ thể và yếu tố
thanh lọc cho mỗi bước thanh lọc bromelain.

Phân tích bước (ml) Tổng protein (mg / ml) hoạt động phân giải protein (U / ml) hoạt
động cụ thể (U / mg) PF một
Chiết xuất dầu thô 8 1,77 40,84 23,07 1
CMC 50 0.20 13.90 69.50 3.01
Sephadex 5 0,093 36,34 390,75 16,93
PF: yếu tố thanh lọc.
Hình. 2 cho thấy các phần phân đoạn có hoạt động phân giải protein (phần
2-45). Sau phần 51th hoạt động không phân giải protein được quan sát
tương ứng với các mục tiêu phi protein.
3.3. SDS-PAGE
Trong phân tích SDS-PAGE, trọng lượng phân tử của bromelain được ước tính là 30
kDa, và dự đoán của Gautam et al. (2010) và các nghiên cứu khác trước đây. Bromelain
có thể không hoàn toàn tinh khiết khi chiết xuất được tách rửa chỉ có trao đổi ion, theo đề
nghị của ban nhạc đôi gel trong 30 khu vực kDa (Ngõ 1 -. Hình 3). kết quả của thanh lọc


lọc gel của bromelain được xác nhận bởi SDS-PAGE kết quả, trong đó chỉ có một ban
nhạc có thể được quan sát thấy trong 30 kDa khu vực (ngõ 2 -. Hình 3).
3.4. HPLC
Phần phân ước từ các phần phân đoạn được sử dụng cho việc chuẩn bị SDS-PAGE gel
sau đó đã được chuẩn bị cho HPLC. HPLC hậu môn-ysis chứng thực với SDS-PAGE kết
quả. Giai đoạn đảo ngược sắc ký xác nhận sự hiện diện của hai đỉnh trong ion ngoại sắc
(Hình 4a.) và chỉ có một protein (Peak 1) trong sắc ký lọc gel, được tách rửa trong lần
đầu tiên 10 phút (Hình. 4b). Bromelain là một protein với các đặc tính cực, như được chỉ
ra bởi đỉnh cao xuất hiện trong vài phút đầu tiên khi nước dung môi chính trong cột
không phân cực (C-18), làm cho nó được nhanh chóng tách rửa. Napper et al. (1994),
trong một so sánh của dứa protease, gán cho sự phân cực của bromelain chủ yếu là nội
dung của nó các axit amin lysine và arginine, được hiện diện trong lớn hơn số tiền so với
protease khác.
Hình. Phân tích 3 SDS-PAGE trao đổi ion (Ngõ 1) và lọc gel (ngõ 2) Chro-matography.

(M - Trọng lượng phân tử Marker).
3.5. Khối phổ
Các SDS-PAGE trước đó hiển thị (Hình. 3, ngõ 2) đã được cắt và trypsinised để có được
một PMF. Các MALDI-TOF MS khẳng định độ tinh khiết của bromelain (Hình 5a.) từ
xác định hơn 10 peptide phong phú với giá trị m / z của 951,44, 963,44, 1000,49,
1016,48, 1032,48, 1068,52, 1103,52, 1526,70, 1566,73 và 1584,75. Trong số các tín hiệu
xác định, các ion của m / z 951 và năm 1584 là trình MALDI-MS / MS thí nghiệm để xác
định hồ sơ cá nhân Frag-bổ và trình tự (Hình 5b. và c). các Mascot chương trình đã được
sử dụng cho các dữ liệu MALDI-MS / MS, do đó provid-ing, trình tự rất có thể cho các
peptide của m / z 951 (hình dự kiến trình tự: WGEAGYIR) và 1584 (chuỗi kiến:
TNGVPN-SAYITGYAR). NCBI () phân tích cơ sở dữ liệu
của hai peptide được xác định là tiền thân FBSB [Ananas comosus] với mã truy cập
gi2463584, trong đó có một bản sắc 95-100% với brome-lain. Ngoài ra, SwissProt
() cơ sở dữ liệu cũng được sử dụng, một lần nữa khẳng định
độ tinh khiết của bromelain là một bản sắc của 95-100% giữa bromelain và một peptide
với mã truy cập BROM2 Anaco. Cơ sở dữ liệu MSDB cũng được sử dụng để phân tích
hai peptide. Các peptide với m / z 951 cho thấy tương đồng cao với ananain, xác định là
một tiền thân AN8


Hình. 4. sắc ký đồ HPLC thu được từ phần với các hoạt động PROTEO-đông miên cao
nhất trong cột C18 sử dụng một gradient 0-80% nước acetonitrile tại một dòng chảy 0,5
ml / phút cho 80 phút (a) trao đổi ion sắc và (b) lọc gel sắc ký đồ.
Hình. 5 (a) phổ MALDI-TOF MS từ bromelain tinh khiết, (b) MALDI TOF MS / MS từ
peptide m / z 951 và (c) MALDI TOF MS / MS từ peptide m / z 1584
Rowan et al. (1990) mô tả sự hiện diện của bốn chính protease trong dứa (Ananas
comosus): bromelain trái cây, gốc bromelain, ananain và comosain. Ananain cho thấy
một acid amin sắc tự 77% với brome-lain (Lee et al., 1997). Peptide này (m / z 951) có
mặt tại Khu vực N-ga cuối của bromelain, mà là một phần giống hệt với cysteine
proteases khác, vì nó bao gồm chủ yếu là khu vực các trang web xúc tác. Nếu chúng ta

gắn kết chỉ có một mảnh của hai loại protein (bromelain và ananain - xem dưới đây), các
peptide khác nhau chỉ một amino acid: bromelain có alanine (A), trong khi ananain có
glycine (G). Stem bromelain WGEAGYIR Ananain WGEGGYIR Peptide m / z 951
WGEAGYIR. Như protease của cùng một gia đình, các protein được dự kiến để chia sẻ
một số khu vực giống hệt nhau trong chuỗi chính của họ, và một số peptide sẽ có một bản
sắc cao với ananain hoặc khác protease. Trình tự rất có thể xác định cho khối lượng
peptide của m / z 951 là bromelain. Hơn nữa, Larocca et al. (2010) cũng xác nhận danh
tính hóa học của peptide của m / z 951 bằng MALDI-TOF MS.
3.6. Quá trình thanh lọc
Phương pháp làm sạch bromelain sử dụng carboxymethylcellu-mất đã có thể làm sạch
các hợp chất khoảng 3,01 lần mức độ trong dịch chiết thô và Sephadex ® cột tinh chế các
hợp chất khoảng 16,93 lần (Bảng 1). Kết quả cho thấy, tùy thuộc vào địa điểm của
bromelain, quá trình này có thể được dừng lại sau khi thanh lọc đầu tiên bước bằng sắc
ký trao đổi ion. Phương pháp này có thể bởi vì các hợp chất tinh khiết CMC 3,01 lần so
với mức trong chiết xuất dầu thô (Bảng 1), với kết quả này được xác nhận bởi SDSPAGE và HPLC kết quả.
Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng thương mại của bromelain trong thực phẩm, mỹ
phẩm, và các ngành công nghiệp-phát dẻo dai dinh dưỡng, y học và dược lý (Ketnawa et
al., 2012) không yêu cầu cao độ tinh khiết chuẩn bị enzym bromelain. Quá trình được mô
tả trong nghiên cứu này cho phép các nhà sản xuất lựa chọn mức độ mong muốn độ tinh
khiết bromelain, do đó làm giảm hơn nữa chi phí của quá trình ủng hộ sự sản xuất.


Hoạt động phân giải protein là thông số chính để kiểm soát chất lượng, và bromelain tinh
chế bằng quá trình thể hiện trong nghiên cứu hiện nay đã có một năng suất hoạt động
phân giải protein là 89%, cao hơn thu được từ quá trình làm sạch hiện tại.
Cuối cùng, người ta ước tính rằng từ 1 kg dứa gốc, đó là có thể thu được khoảng 267 mg
trước tinh khiết bromelain và 124 mg bromelain tinh khiết.
4 Kết luận
Phương pháp làm sạch bromelain của nghiên cứu này sử dụng hai bước LC: trao đổi sắc
ký ion (xe boxymethylcellulose), tiếp theo là sắc ký lọc gel (Sephadex ® G-50). Các

bromelain tinh khiết có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa và độ tinh khiết cao, và
phương pháp purifica-tion mang lại một giá trị hoạt động phân giải protein cao (89%) tại
một chi phí thấp hơn so với các phương pháp hiện có. Vì vậy, phương pháp này chứng
minh trong nghiên cứu này có thể được sử dụng để chuyển đổi chất thải nông nghiệp và
công nghiệp của cây trồng dứa thành một sản phẩm với giá trị gia tăng cao và công nghệ
sinh học quan tâm đáng kể.