NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG CENLLULOSE VI KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHÍNH RƯỢU VANG NHO

Luận văn tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin cảm ơn thầy cô trường Đại học Bách Khoa
Tp.HCM đã tận tình dạy bảo, xây dựng những kiến thức cơ bản cần thiết
cho em trong quá trình học tập tại trường.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt và
thầy Lê Văn Việt Mẫn vì sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình mà thầy cô đã
dành cho em trong suốt quá trình làm luận văn.
Mặc dù gặp nhiều khó khăn trong thời gian vừa qua nhưng sự động
viên, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình đã giúp em đã hoàn
thành tốt nhiệm vụ được giao. Em xin chân thành cám ơn tất cả những
người đã giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 1/2008
Nguyễn Đức Ninh


Luận văn tốt nghiệp

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................

....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
Tp.Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2008


Luận văn tốt nghiệp

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
Tp.Hồ Chí Minh, Ngày tháng

năm 2008

Luận văn tốt nghiệp

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Trong công nghệ sản xuất rượu vang, việc ứng dụng nấm men cố đònh vào quá trình
lên men chính đã được nghiên cứu khá phổ biến trên thế giới. Nhiều loại chất mang đã
được nghiên cứu để ứng dụng vào quá trình cố đònh nấm men. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tìm hiểu về quá trình cố đònh nấm men trên chất mang Cellulose vi khuẩn (BC)
và ứng dụng nấm men cố đònh trên chất mang này vào quá trình lên men chính rượu vang
nho.
Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm sau:
 Tối ưu hóa các thông số kó thuật của quá trình cố đònh nấm men trên chất mang
BC theo phương pháp hấp phụ.
 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men cố đònh trên chất mang BC trong
thời gian ủ sau khi cố đònh nấm men bằng phương pháp hấp phụ.
 So sánh hiệu quả lên men giữa nấm men cố đònh trên chất mang BC và nấm
men tự do trong quá trình lên men chính rượu vang nho.
Kết quả chúng tôi thu được như sau:
 Hiệu suất cố đònh nấm men trên chất mang BC theo phương pháp hấp phụ đạt
được sau khi tối ưu là 62,61%.
 Sau thời gian ủ, mật độ tế bào cố đònh đạt giá trò cực đại sau hai ngày ủ là
14,0x108 tế bào/g chất mang, gấp 2,4 lần mật độ tế bào cố đònh trên chất mang trước khi ủ.
 Nấm men cố đònh trên BC khi ứng dụng vào quá trình lên men chính rượu vang
nho cho hiệu quả lên men cao hơn hẳn nấm men tự do: thời gian lên men ngắn hơn, hàm
lượng acid tổng và acid dễ bay hơi sinh tổng hợp thấp hơn hẳn so với trường hợp sử dụng
nấm men tự do.

MỤC LỤC
i

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: GIỚI THIỆU.............................................................................................1
Chương 2: TỔNG QUAN............................................................................................3
2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN
XUẤT RƯU VANG............................................................................................................3
2.1.1 Nho............................................................................................................................3
Đường................................................................................................................................4
Nitơ....................................................................................................................................4
Acid hữu cơ........................................................................................................................5
SO2....................................................................................................................................5
Tannin................................................................................................................................5
2.1.2 Rượu vang.................................................................................................................6
2.1.3 Nấm men...................................................................................................................6
2.2 TỔNG QUAN VỀ CỐ ĐỊNH NẤM MEN VÀ CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRÊN CHẤT
MANG CELLULOSE VI KHUẨN.......................................................................................8
2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố đònh tế bào..................................................8
2.2.2 Điều kiện cố đònh vi sinh vật.................................................................................14
2.2.3 Cố đònh nấm men trên Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose- BC)................15
2.2.4 Ảnh hưởng của việc cố đònh nấm men..................................................................26
2.2.5 Thuận lợi và khó khăn của tế bào cố đònh so với tế bào tự do............................29
2.3 ỨNG DỤNG KĨ THUẬT CỐ ĐỊNH TRÊN CELLULOSE VI KHUẨN TRONG
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN...............................................................................30
2.3.1 Ứng dụng cố đònh tế bào trên BC để loại acid trong rượu vang bằng quá trình
lên men malolactic...........................................................................................................30
2.3.2 Một số ứng dụng khác của việc cố đònh tế bào trên chất mang BC....................32

Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................35

3.1 NGUYÊN LIỆU.............................................................................................................35

3.1.1 Nho..........................................................................................................................35
3.1.2 Nấm men.................................................................................................................36
3.1.3 Bacterial Cellulose (BC)........................................................................................36
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................................37
3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu..........................................................................37
3.2.2 Các quy trình cố đònh nấm men trên BC...............................................................37
3.2.3 Khảo sát tối ưu hóa quá trình cố đònh nấm men trên chất mang BC theo phương
pháp hấp phụ....................................................................................................................40
3.2.4 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men trong quá trình ủ- giai đoạn hai
của quá trình cố đònh theo phương pháp hấp phụ- ủ......................................................42
3.2.5 So sánh động học quá trình sử dụng cơ chất trong thời gian lên men giữa phương
pháp hấp phụ và hấp phụ- ủ............................................................................................42
3.2.6 So sánh tính chất sản phẩm lên men giữa hai phương pháp hấp phụ và hấp phụủ........................................................................................................................................43
3.3 XỬ LÝ KẾT QUẢ.........................................................................................................43

ii


Luận văn tốt nghiệp
3.3.1 Xác đònh phương trình hôì quy bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực
giao có tâm cấp hai..........................................................................................................43
3.3.2 Xác đònh tốc độ sử dụng đường.............................................................................45
3.3.3 Xác đònh tốc độ sinh tổng hợp cồn........................................................................45
3.3.4 Xác đònh hiệu suất cố đònh.....................................................................................45
3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH......................................................................................45
3.4.1 Mật độ tế bào..........................................................................................................45
3.4.2 pH............................................................................................................................47
3.4.3 Nồng độ chất khô....................................................................................................47
3.4.4 Hàm lượng đường khử [13]....................................................................................47
Xử lý mẫu........................................................................................................................47

Dựng đường chuẩn..........................................................................................................47
Xác đònh hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm................................................48
3.4.5 Hàm lượng ethanol [13]..........................................................................................48
Chuẩn bò bình tỷ trọng....................................................................................................48
Xác đònh khối lượng bình và nước cất...........................................................................48
Xác đònh khối lượng bình và rượu..................................................................................49
3.4.6 Hàm lượng acid tổng [13].......................................................................................49
3.4.7 Hàm lượng acid dễ bay hơi....................................................................................50

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................................................51
4.1 TỐI ƯU HOÁ QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG BC THEO
PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ................................................................................................51
4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình cố đònh nấm men
trên BC.............................................................................................................................51
4.1.2 Tối ưu hoá bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm quá trình cố đònh nấm
men trên BC bằng phương pháp hấp phụ.......................................................................62
4.2 KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN
CHẤT MANG BC TRONG THỜI GIAN Ủ TẠO CHẾ PHẨM.......................................65
4.3 KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHÍNH SỬ DỤNG NẤM
MEN TỰ DO VÀ NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN BC Ở CÁC NGÀY Ủ KHÁC NHAU. 68
4.3.1 Động học quá trình sử dụng cơ chất......................................................................68
4.3.2 So sánh tính chất các sản phẩm lên men...............................................................72
4.3.3 Kết luận chung........................................................................................................79
4.4 KHẢO SÁT MẬT ĐỘ TẾ BÀO NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG SAU QUÁ
TRÌNH LÊN MEN CHÍNH.................................................................................................79

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................82

5.1 KẾT LUẬN....................................................................................................................82
5.2 KIẾN NGHỊ\..................................................................................................................82

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................84

iii


Luận văn tốt nghiệp

Danh mục các bảng
Chương 2:

TỔNG QUAN..........................

iv

Error: Reference source not found


Luận văn tốt nghiệp

Danh mục các hình vẽ
Chương 2:

TỔNG QUAN............................. Error: Reference source not found

v


Luận văn tốt nghiệp

Danh mục một số thuật ngữ và chữ viết tắt
 BC: Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose)
 SEM

:Kính hiển vi điện tử quét (Scan Electronic Microscope)

 CD

: Nấm men cố đònh

 DCM

: Delignified Cellulosic Material

 DEAE-cellulose : Diethylaminoethyl- Cellulose
 TD: Nấm men tự do
 τ : Tổng thời gian lên men, được xác đònh từ độ lên men. Đơn vò: h
 KS : Tốc độ sử dụng đường trung bình, là hàm lượng đường trung bình được nấm men
sử dụng trong một đơn vò thời gian lên men. Đơn vò: g/L/h
 KP : Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình, là hàm lượng cồn trung bình được nấm men
sinh tổng hợp trong một đơn vò thời gian lên men. Đơn vò: g/L/h
 η : Hiệu suất sinh tổng hợp cồn, là số mol ethanol được tạo thành từ một mol glucose
được nấm men sử dụng. Đơn vò: mol ethanol/ mol glucose.

vi


Chương 1: Giới thiệu

Chương 1: GIỚI THIỆU

Rượu vang là một trong những sản phẩm lên men có lòch sử lâu đời nhất. Cho đến nay,
rượu vang đã phổ biến rộng rãi trên thế giới với nhiều chủng loại và thương hiệu phong
phú. Nó được ưa thích tại nhiều nơi trên thế giới bởi hương vò hết sức đặc trưng, đem lại
cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho người sử dụng.
Trong những giai đoạn phát triển đầu tiên, rượu vang được sản xuất theo con đường
lên men tự nhiên. Song, với việc khoa học kó thuật ngày càng phát triển mạnh, dần dần
người ta đã phân lập được chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae phù hợp cho việc sản
xuất và nâng cao chất lượng rượu vang. Vài thập kỉ gần đây, nhiều nhà khoa học đã ứng
dụng kó thuật cố đònh nấm men để lên men rượu vang nhằm khắc phục những nhược điểm
của lên men tự do như thời gian lên men dài, năng suất thấp, tốn nhiều năng lượng, khả
năng tái sử dụng thấp và khó tự động hoá.Hàng loạt các nghiên cứu ứng dụng cố đònh
nấm men đã chứng minh được tính năng ưu việt của nó: tăng khả năng sử dụng cơ chất,
rút ngắn thời gian lên men, ổn đònh hoạt tính nấm men, dễ thu hồi sản phẩm, tăng khả
năng tái sử dụng và tự động hóa…
Nhiều loại chất mang đã được nghiên cứu ứng dụng, từ các chất mang có khả năng
hấp phụ nấm men lên bề mặt, các miếng trái cây, các loại cellulose, màng vi bao… Các
chất mang hấp phụ thường được cho là có hiệu suất cố đònh thấp, thời gian chuẩn bò cố
đònh dài và khả năng tái sử dụng chưa được hiệu quả. Cho đến nay, loại chất mang thường
sử dụng để nghiên cứu cố đònh nấm men nhiều nhất là gel alginate, một polysaccharide
thu được từ rong mơ. Song chúng cũng có những nhược điểm là giá thành khá cao và quá
trình tái sử dụng sẽ bò hạn chế vì sau một vài chu kỳ, số hạt alginate bể vỡ khá nhiều.
Một vài năm gần đây, một số kết quả nghiên cứu cho thấy việc lên men rượu vang sử
dụng nấm men cố đònh trên bề mặt chất mang sẽ thu được sản phẩm có chất lượng cảm
quan tốt hơn những phương pháp khác. Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học ở châu Á đã đưa
một loại chế phẩm sinh học là Cellulose vi khuẩn (BC) vào ứng dụng để cố đònh tế bào vi
sinh vật, song việc nghiên cứu cố đònh nấm men trên Cellulose vi khuẩn trên thế giới là
còn khá hạn chế. Cellulose vi khuẩn là loại chất mang cố đònh tế bào theo phương pháp
hấp phụ, song nó cũng đóng vai trò là giá thể để tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh trưởng
bên trong lòng cấu trúc của nó. Ưu điểm chính của chất mang này so với alginate là giá
thành rẻ hơn nhiều, cấu trúc chắc chắn và ít hỏng vỡ, tạo điều kiện cho việc tái sử dụng

tốt hơn [4,6].
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu quá trình cố đònh nấm
men trên chất mang Cellulose vi khuẩn và ứng dụng vào quá trình lên men chính rượu
vang nho”. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tối ưu hoá quá trình cố đònh với hàm mục tiêu
hiệu suất cố đònh, tối ưu thời gian ủ chất mang sau giai đoạn cố đònh bề mặt và tiến hành
so sánh kết quả lên men của các mẫu thí nghiệm ở các thời gian ủ khác nhau.

Trang 1


Chương 1: Giới thiệu
Do quỹ thời gian hạn hẹp nên chúng tôi chỉ khảo sát động học quá trình sử dụng cơ
chất, sự thay đổi pH và một số kết quả lên men như hàm lượng cồn, acid tổng, acid dễ bay
hơi, mật độ tế bào cố đònh sau lên men mà chưa đề cập đến việc ảnh hưởng của một số
yếu tố công nghệ đến động học quá trình lên men cũng như khảo sát các hợp chất tạo
hương cho sản phẩm.

Trang 2


Chương 2: Tổng quan

Chương 2: TỔNG QUAN
2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG
TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG

2.1.1

Nho

Trong số các loại quả, nho là nguyên liệu lý tưởng nhất để sản xuất rượu vang. Nho ưa
đất ít chua và khí hậu khô, nhiều nắng. Vùng đất Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận là
những vùng nho mới và đang phát triển. [10]
Với rượu vang, nho là nguyên liệu thích hợp nhất vì [10,104]:
• Từ nho cho rượu vang chất lượng tốt nhất, hương vò êm dòu, hài hòa
• Thành phần dòch quả nho rất thích hợp cho lên men và thành phần rượu thành
phẩm nhiều chất dinh dưỡng.
Bảng 2.1: Thành phần của dòch nho và rượu vang thông thường [90]
Hợp chất
Nước
Đường
(fructose, glucose và một ít saccharose)
Alcohols
(ethanol và hàm lượng vết của terpenes, glycerols
và rượu bậc cao)
Acid hữu cơ
(tartaric, malic và một ít lactic, succinic, oxalic,…)
Khoáng
(potassium, calcium và một ít sodium, magnesium,
iron,…)
Phenols
(các flavonoid như là các chất màu cùng với các
nonflavonoid như là cinnamic acid và vanillin)
Các hợp chất chứa nitơ
(protein, amino acid, humin, amide, ammonia,…)
Các hợp chất hương
(các ester như là ethyl caproate, ethyl butyrate,…)
TỔNG

2.1.1.1

% trong dòch % trong
nho
vang
75,0
86,0
22,0
0,3
0,1

11,2

0,9

0,6

0,5

0,5

0,3

0,3

0,2

0,1

Vết

Vết

100,0

100,0

rượu

Phân loại

Nho thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Vitales, họ
Vitaceae, chi Vitis. Trong đó, theo nghiên cứu và thực tế sản xuất, loài Vitis vnifera được

Trang 3


Chương 2: Tổng quan
cho là thích hợp nhất để sản xuất rượu vang vì: nó chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao
cho sự phát triển của nấm men, chứa hàm lượng acid đủ cao để ức chế các vi sinh vật dại,
hàm lượng đường thích hợp cho lên men, và cuối cùng là có thể tạo hương vò phù hợp
[98,99]
Nho có hai loại: nho đỏ để sản xuất rượu vang đỏ và nho xanh để sản xuất rượu vang
trắng.[1,10]
• Nho trắng: trái nho khi chín vỏ không có màu hoặc màu vàng lục nhạt.
•

Nho đỏ: trái nho khi chín vỏ có màu đỏ – tím ở những mức độ khác nhau

a)
b)

Hình 2.1: Nho xanh (a) và nho đỏ (b)

2.1.1.2

Thành phần hóa học chính

• Đường
Thông thường dòch nho để sản xuất rượu vang chứa 16 – 26% (w/v) đường. Trong nho
khô và trong nho thu hoạch trễ, hàm lượng đường có thể lên tới trên 30% (w/v). Dòch nho
cô đặc với hàm lượng đường 35oBx được sử dụng để sản xuất rượu vang có hàm lượng cồn
cao. Hàm lượng đường cao có thể ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men [58].
Dòch nho trước khi lên men thường chứa tỷ lệ cân bằng của glucose và fructose. Trong
suốt quá trình lên men, tất cả các chủng Saccharomyces cerevisiae đều ưu tiên sử dụng
glucose hơn là fructose. Hàm lượng ethanol cao có tác động ức chế mạnh sự sử dụng
fructose hơn là glucose. Trong khi đó, bổ sung nitơ vào dòch nho sẽ kích thích sự sử dụng
fructose hơn là glucose [23,28,78].
•

Nitơ

Các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm men. Trong số
các chất dinh dưỡng mà nấm men có thể sử dụng được trong suốt quá trình lên men dòch
nho, về số lượng, nitơ là thành phần quan trọng thứ hai sau các hợp chất carbon. Có nhiều
hợp chất chứa nitơ có mặt trong dòch nho, với hàm lượng thay đổi từ 60 – 2400mg/L [41].
Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để phát
triển, nhưng không phải tất cả các nguồn nitơ đều hỗ trợ phát triển tốt như nhau. Các
nguồn nitơ tốt là ammonium, glutamine và asparagine, trong khi đó proline và urea được
xem như là những nguồn nitơ kém chất lượng [41].

Trang 4

Chương 2: Tổng quan
•

Acid hữu cơ

Trong nho và rượu vang, 6 acid chiếm thành phần chính là acid tartaric, acid malic,
acid citric, acid lactic, acid succinic và acid acetic. Trong đó, acid acetic là hợp chất dễ
bay hơi còn các acid khác là acid không bay hơi.
Độ phân ly của các acid này giảm theo thứ tự sau: acid citric, acid tartaric, acid malic,
acid succinic, acid lactic, và acid acetic.
Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dòch nho đỏ và rượu vang đỏ
[79]
Acid hữu cơ
Acid citric
Acid tartaric
Acid malic
Acid succinic
Acid lactic
Acid acetic
•

Dòch nho đỏ
0,25 – 0,35g/L
4,07 – 7,65g/L
1,99 – 2,91g/L
Rất ít
Rất ít
Rất ít

Rượu vang đỏ
0,17 – 0,40g/L
2,60` – 5,7g/L
0,06 – 3,13g/L
0,48 – 1,22g/L
0,07 – 4,89g/L
0,30 – 1,44g/L

SO2

Sulfur dioxide được sử dụng rộng rãi trong rượu vang như là một chất chống oxy hóa,
tác nhân kháng khuẩn và đồng thời cũng là tác nhân cho việc chọn lọc các loài hoặc
chủng có thể phát triển và đóng góp vào quá trình lên men. Trong rượu vang, SO 2 tồn tại
ở 2 dạng: tự do và liên kết. Nhưng chỉ SO 2 tự do mới có tính khử và diệt khuẩn. Mặc dù
vậy, một vài dạng SO2 liên kết có thể chuyển hóa thành SO 2 tự do và có thể bù lại cho
lượng SO2 bò giảm trong quá trình lên men. Vì thế, SO 2 là một thông số quan trọng ảnh
hưởng đến động học quá trình lên men và chất lượng rượu vang [14,24]. Bên cạnh đó, SO2
còn có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men rượu vang: dẫn tới kéo dài thời gian lên men
hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn cao, và ảnh hưởng đến tính
chất cảm quan của rượu vang [40,62].
•

Tannin

Tannin có ở 2 dạng là tannin ngưng tụ và tannin thủy phân [99]
Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acid ellagic.
Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin và gallocatechin) và
flavan-3,4-diol.
Tannin có ở trong nho và rượu vang chủ yếu là các tannin ngưng tụ [99].

Tannin có thể được thêm vào rượu vang dưới dạng acid tannic để phản ứng và kết tủa
với protein và để cải thiện độ trong của rượu vang. Trong suốt quá trình ủ, sự thay đổi
hàm lượng tannin ngưng tụ sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và tính chất cảm quan của rượu
vang, và khi đó, khối lượng phân tử của tannin có thể tăng lên [99].

Trang 5


Chương 2: Tổng quan

2.1.2

Rượu vang

Rượu vang nho là sản phẩm thu được bằng con đường lên men cồn từ dòch nho. Rượu
vang nho có thể được sản xuất từ một giống nho riêng biệt, hoặc từ hỗn hợp hai hay ba
giống nho khác nhau. Vì vậy sản phẩm vang nho có số lượng và chủng loại rất phong phú,
đa dạng. Về mặt công nghệ, sản phẩm vang nho được chia ra thành hai nhóm lớn [1]:
•

Nhóm rượu vang không có gas

•

Nhóm rượu vang có gas

Do quá trình lên men, thành phần của rượu vang khác với thành phần của dòch nho
ban đầu (bảng 2.1) [90].

2.1.3

Nấm men

Nấm men là vi sinh vật quan trọng, kiểm soát quá trình lên men cồn trong sản xuất
rượu vang. Nấm men trong quá trình lên men rượu vang có thể có từ 3 nguồn gốc khác
nhau: bề mặt trái nho, bề mặt thiết bò và từ canh trường được cấy vào. Thành phần và chất
lượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến nấm men. Trong quá trình lên men, bên
cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO 2, nấm men tạo thành nhiều sản phẩm phụ, ví
dụ như glycerol, acid acetic, acid succinic và đặc biệt là các hợp chất hương, góp phần
đáng kể vào chất lượng của rượu vang [15, 42, 44, 72, 76].

2.1.3.1

Đặc điểm của nấm men vang

Các loài nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang trước đây có thể là: S. vini, S.
oviformis, S. bayanus, S. ellipsoideus, S. cerevisiae. Từ năm 1984, nhà phân loại học người
Hà Lan Kreger-Van-Rij đã đề nghò một khóa phân loại mới cho nấm men. Theo ông, loài
S. cerevisiae bao gồm các chủng nấm men được sử dụng trong sản xuất ethanol, rượu
vang, bia, bánh mì, và một số loại thức uống lên men khác [51].
Nấm men S. cerevisiae là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm Eucaryote. Chúng có hình
cầu, kích thước thay đổi trong khoảng 2,5÷10μm x 4,5÷21μm, sinh sản chủ yếu bằng
phương pháp nẩy chồi.[Hình 2.2] Cấu tạo tế bào nấm men phức tạp bao gồm màng tế
bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân, không bào, các hạt dự trữ (glycogen,
voluten,...), ribosome (nơi tổng hợp protein) và ty thể (nơi xảy ra các quá trình oxy hóa
khử cung cấp nguồn năng lượng cho tế bào) [2].
S. cerevisiae là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Trong môi trường có oxy, S. cerevisiae tổng
hợp năng lượng theo con đường hô hấp hiếu khí, chuyển đường glucose thành nước và
CO2, sinh khối phát triển mạnh mẽ. Trong môi trường không có oxy, S. cerevisiae tổng hợp
năng lượng bằng quá trình lên men ethanol. Năng lượng nấm men tạo ra thấp, chỉ đủ để

nấm men duy trì sự sống, sinh khối phát triển rất yếu.
Saccharomyces có khả năng chòu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng
độ ethanol và acid hữu cơ tăng và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng. Như vậy, mặc dù có nhiều
giống và loài nấm men trong dòch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài
Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trình chuyển hóa

Trang 6


Chương 2: Tổng quan
sinh học quan trọng trong lên men vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được
gọi là “nấm men vang” [33, 41, 44, 70, 77, 90].

(a)

(b)

(c)

Hình 2.2: Quá trình nảy chồi của nấm men.
(a): Hình dáng tế bào nấm men nảy chồi ; (b): tiến trình sinh sản bằng nảy chồi ở nấm
men ; (c): vết sẹo sau khi nảy chồi

Hình 2.3: Tế bào nấm men S. cerevisiae chụp trên mặt phẳng và không gian

2.1.3.2

Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang

Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việc chuyển hóa hoàn toàn và

có hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vò không mong muốn thì ngày
nay, do yêu cầu ngày càng cao, canh trường Saccharomyces cerevisiae cần phải có nhiều
đặc tính khác như sau: [10,41].

Trang 7


Chương 2: Tổng quan
• Thích nghi nhanh với môi trường lên men, tốc độ sử dụng cơ chất và tạo thành
sản phẩm cao, sử dụng đường cho lên men gần như là hoàn toàn, kết lắng tốt, làm trong
dòch rượu nhanh, chòu được độ rượu cao và độ acid của môi trường, cũng như các chất sát
trùng, chòu áp suất thẩm thấu tốt, sinh khối tạo thành vừa phải, tạo cho rượu vò thơm ngon
thanh khiết.
• Tạo thành ít sulphite, thiol, ít acid dễ bay hơi và rượu bậc cao, hoạt tính
esterrase thấp
• Có tính ổn đònh cao về mặt di truyền, khả năng chòu sulphite cao, ít liên kết với
sulphite, ít tạo bọt, có khả năng kết bông, kết lắng cặn nhanh, nhu cầu nitơ thấp
Tuy nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả các chỉ tiêu này thì tốn rất nhiều thời gian.
Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ra một phương pháp đơn giản và hiệu quả để chọn lựa
nấm men vang dùng trong sản xuất công nghiệp dựa trên các tính chất công nghệ của nấm
men vang. Phương pháp này chỉ bao gồm 2 bước [77]:
• Bước thứ nhất: chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chòu đựng đối với SO 2, các
loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp.
• Bước thứ hai: chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và
ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang.

2.2 TỔNG QUAN VỀ CỐ ĐỊNH NẤM MEN VÀ CỐ ĐỊNH NẤM
MEN TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN

2.2.1

Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố đònh tế bào

2.2.1.1

Khái niệm

Thuật ngữ cố đònh tế bào (cell immobilization) được hiểu là việc “giam” các tế bào
vi sinh vật vào trong một vùng nhất đònh song vẫn giữ được các hoạt tính sinh học mong
muốn của chúng. Rộng hơn nữa, khái niệm “cố đònh” này không chỉ áp dụng cho tế bào
mà còn có thể áp dụng cho enzyme đơn lẻ, hệ đa enzyme cũng như các tổ chức tế bào, có
nghóa là có thể áp dụng cho mọi dạng xúc tác sinh học. [8, 47, 67]
Theo đònh nghóa của Hội nghò Công nghệ Enzyme lần thứ nhất năm 1971, cố đònh
tế bào có nghóa là các tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay đònh vò lại trong một khu vực
không gian nhất đònh sao cho các tế bào đó giữ được các tính chất xúc tác sinh học của
chúng hoặc nếu có thể thậm chí là bắt buộc giữ được khả năng sống của chúng và các tế
bào đó có thể được sử dụng lại, liên tục. [8]
Hiện nay, thuật ngữ cố đònh tế bào có thể được hiểu đơn giản hơn. Đó là công việc
đưa các tế bào vào những pha riêng lẻ, những pha này được tách biệt với pha dung dòch tự
do. Các tế bào cố đònh có thể được sử dụng trong bình lên men liên tục hoặc được sử dụng
nhiều lần trong bình lên men gián đoạn. [8]

2.2.1.2

Các kỹ thuật cố đònh tế bào

Việc ứng dụng các tế bào cố đònh đã đem lại rất nhiều thuận lợi, vì vậy khá nhiều
phương pháp cố đònh tế bào đã được nghiên cứu và đề xuất. Dựa vào các phương pháp và

Trang 8

Chương 2: Tổng quan
cơ chế cố đònh, kó thuật cố đònh tế bào được chia thành bốn nhóm chính như trong Hình
2.4.

Hình 2.4: Các kỹ thuật cơ bản để cố đònh tế bào [48]
a. Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn
 Nguyên tắc:

• Bản chất của phương pháp chính là tương tác vật lý không đặc trưng xảy
ra giữa màng tế bào vi sinh vật và bề mặt chất mang. Tương tác này xuất hiện khi tiến
hành trộn lẫn huyền phù tế bào vi sinh vật vào dung dòch chất mang đó. [82]
• Kó thuật cố đònh tế bào trên bề mặt chất mang rắn được thực hiện nhờ vào
lực hấp phụ, liên kết tónh điện hoặc liên kết cộng hóa trò giữa màng tế bào và bề mặt chất
mang rắn. [47, 48, 25,82]

Trang 9


Chương 2: Tổng quan

• Yêu cầu cơ bản đối với các chất mang dùng để cố đònh tế bào vi sinh vật
bằng phương pháp hấp phụ phải là những chất với bề mặt có cấu trúc xốp hoặc có chứa
nhiều nhóm chức hoá học khác nhau [48].
 Các chất mang điển hình: vật liệu cellulose (DEAE- cellulose, gỗ, mùn cưa…),
vật liệu vô cơ (sứ xốp, thủy tinh xốp, một số oxide kim loại như oxide kẽm, titan)… Các
vật liệu như cellulose và thủy tinh có thể được tiền xử lý với polycation, chitosan… để tăng
cường khả năng hấp phụ [48].
 Phương pháp cố đònh: thực hiện 1 trong 3 cách: [82]

• Phương pháp cổ điển: ngâm chất mang trong dung dòch huyền phù vi sinh
vật. Vi sinh vật sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất
mang đó.
• Phương pháp cổ điển có cải tiến bằng cách sử dụng cánh khuấy: tế bào vi
sinh vật và chất mang phân bố đều khắp trong dung dòch. Diện tích tiếp xúc giữa chất
mang và vi sinh vật là cực đại, do đó hiệu suất gắn được cải thiện đáng kể.
• Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang: cần có
hồi lưu dòng canh trường để nâng cao hiệu suất gắn tế bào vào chất mang.
 Những chất vừa kể trên có thể được chia làm hai loại dựa vào cấu trúc đặc trưng,
đó là chất mang có cấu trúc vi xốp (trong cấu trúc có nhiều lỗ mao quản) và chất mang có
cấu trúc không vi xốp. Có thể xảy ra ba trường hợp [48,66]:

• Trường hợp chất mang không có cấu trúc lỗ xốp như thuỷ tinh, tế bào vi
sinh vật sẽ được gắn vào chất mang theo từng lớp trên bề mặt.
• Trường hợp chất mang có cấu trúc lỗ xốp như than hoạt tính, tế bào vi
sinh vật sẽ thâm nhập vào những lỗ xốp này và được giữ cố đònh trong đó.
• Nếu chất mang có tích điện như nhựa trao đổi ion, tế bào vi sinh vật và bề
mặt chất mang sẽ hình thành các liên kết ion, từ đó mà tế bào vi sinh vật được giữ chặt
trên bề mặt chất mang.
 Ưu điểm:

• Dễ thực hiện, giá thành thấp, điều kiện ôn hòa [9].
• Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố đònh và chất mang lớn hơn so với các kỹ
thuật khác [65].
 Nhược điểm [48,82]:

• Cường độ liên kiết giữa tế bào và bề mặt cố đònh cũng như bề dày của lớp
liên kết thay đổi trong một khoảng rộng và rất khó xác đònh .
• Không có lớp ngăn cách giữa các tế bào và môi trường dung dòch nên

việc các tế bào bò tách ra và phân bố trở lại môi trường là điều không thể tránh khỏi . Vì
vậy, sẽ tồn tại một hệ cân bằng giữa các tế bào hấp phụ và tự do.
• Quá trình khó điều khiển nên hiệu suất thường không cao.

Trang 10


Chương 2: Tổng quan
b. Nhốt trong khung mạng xốp
 Nguyên tắc: Các tế bào được đưa vào bên trong một khung mạng xốp để ngăn
cản tế bào khuếch tán vào môi trường xung quanh mà vẫn cho phép sự vận chuyển các
chất dinh dưỡng và quá trình trao đổi chất diễn ra [48].
 Các loại cấu trúc chất mang: Các dạng cấu trúc gel polymer cơ bản thường được
tạo ra để cố đònh tế bào vi sinh vật theo phương pháp này là [31, 69, 75]:

• Ion gel: hình thành khung gel bằng cách tạo liên kết ion giữa chất mang
đa điện tích và dung dòch đa điện trái dấu.
• Covalent gel: có cấu trúc mạng lưới dày khít trong lòng chất mang. Mạng
lưới này được hình thành bằng cách tạo liên kết cộng hoá trò giữa các phân tử polymer.
• Non – covalent gel: khung gel trong lòng chất mang được hình thành bằng
cách tạo những loại liên kết khác liên kết cộng hoá trò giữa các phân tử polymer.
độ rất thấp.

• Cryogel: khung gel để giữ các tế bào vi sinh vật được hình thành ở nhiệt

Để quá trình cố đònh tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel đạt được hiệu quả cao,
người ta cần phải nâng cao những hiểu biết về phương pháp hình thành và tính chất của
từng loại cấu trúc gel trên.
 Các chất mang điển hình: gel aginates, κ -carrageenan, agar, chitosan,
polygalaturonic acid, hoặc các mạng polymer khác như gelatin, collagen, polyvinyl

alcohol, polyacrylamide … [48]
 Đặc điểm của phương pháp:

• Gel polymer chứa những tế bào vi sinh vật cố đònh có thể thay đổi kích
thước bằng cách nghiền nhỏ, đồng hoá hoặc ép qua rây có lỗ nhỏ rồi đem sấy khô ở nhiệt
độ thấp [31, 69, 75].
• Khả năng sinh trưởng của tế bào cố đònh phụ thuộc vào sự phân bố và độ
xốp của vật liệu và lượng sinh khối tích lũy [48].
• Sự phân bố tế bào không đồng nhất dẫn đến các tế bào ở gần bề mặt sẽ
có tính chất khác với các tế bào nằm sâu bên trong [48].
• Một vấn đề của kó thuật này là tồn tại một số tế bào trên bề mặt hạt gel
sinh trưởng và thoát khỏi môi trường cố đònh và hoạt động như các tế bào tự do. Để khắc
phục tình trạng này, gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu tìm ra loại màng kép với
nhân bên trong chứa các tế bào cố đònh và lớp màng ngoài để tránh sự khuếch tán các tế
bào ra môi trường [9, 48].
 Ưu điểm:

• Hiệu suất cố đònh và mật độ tế bào trong màng chắn cao hơn hẳn các
phương pháp khác [8, 12, 31].
• Không kén chọn loại tế bào vi sinh vật được cố đònh [12, 31].

Trang 11


Chương 2: Tổng quan

• Các màng chắn như các loại polymer và các loại gel thường trơ về hóa
học, có thể ứng dụng trong nhiều môi trường khác nhau [48].
• Kích thước lỗ xốp, cấu trúc bên trong của chất mang dễ điều chỉnh, hạn
chế được lượng tế bào khuếch tán ra ngoài [24].

 Nhược điểm:

• Trong một số điều kiện, hoạt động sinh trưởng của tế bào có khả năng
phá hủy hệ thống màng chắn bao bọc [12].
• Các tế bào vi sinh vật phân bố không đều, chỉ các tế bào nằm gần bề mặt
màng chắn mới có khả năng tiếp xúc tốt với cơ chất [25].
• Các chất có phân tử lượng thấp mới có thể khuếch tán nhanh chóng đến
các tế bào vi sinh vật, nên phương pháp này không thích hợp với môi trường có các cơ
chất có phân tử lượng lớn [12, 31].
c. Cố đònh nhờ vào keo tụ tế bào
 Nguyên tắc

• Làm gia tăng kích thước của khối tế bào để dễ dàng sử dụng trong các
bình phản ứng. Có thể là keo tụ tự nhiên hoặc là keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các
liên kết ngang [48].
• Sự keo tụ tế bào là việc các tế bào kết chùm lại với nhau thành những
đơn vò lớn hơn hoặc các tế bào keo tụ nhân tạo với nhau nhờ các liên kết ngang. Kiểu cố
đònh này thường ứng dụng cho các tế bào thực vật, nấm mốc…
 Ưu điểm [48]:

• Đơn giản, dễ thực hiện.
• Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối.
 Nhược điểm [48]:

• Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào
dễ bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch.
d. Nhốt tế bào bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn
 Nguyên tắc: Kó thuật này thường sử dụng loại màng lọc membrane dạng vi xốp
hoặc cố đònh bằng kó thuật vi bao.
 Ưu điểm [48]:

• Canh trường lên men không bò lẫn các tế bào, sản phẩm không cần lọc
 Nhược điểm [48]:

• Hiệu quả truyền khối kém.
• Màng có thể bò bẩn do cơ chất hấp phụ lên bề mặt màng
• Màng có thể bò hỏng khi sinh khối tăng quá nhiều.

Trang 12


Chương 2: Tổng quan

2.2.1.3

Chất mang trong cố đònh tế bào

Trong kỹ thuật cố đònh tế bào vi sinh vật, một yếu tố quan trọng quyết đònh đến việc
lựa chọn phương pháp và tính hiệu quả của quá trình cố đònh chính là vật liệu cố đònh hay
còn gọi là chất mang.
Cùng với sự phát triển của nhiều ngành khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều loại
vật liệu polymer (tự nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp) được đưa vào nghiên cứu và ứng dụng
trong kỹ thuật cố đònh tế bào vi sinh vật. Do đó, việc lựa chọn loại chất mang thích hợp
với điều kiện cố đònh cũng như với tế bào vi sinh vật cần cố đònh có thể được thực hiện dễ
dàng hơn. [48]
Vật liệu dùng làm chất mang khi lựa chọn cần thỏa mãn những yêu cầu [24]

• Phù hợp với hình dạng của thiết bò phản ứng sinh học.
• Có độ bền lý, hoá và sinh học cao.
• Giá thành của chất mang thấp.

• Quá trình cố đònh tế bào dễ tiến hành và điều khiển, mức độ tạp nhiễm thấp.
• Đảm bảo năng suất sản xuất của tế bào cố đònh cao trong thời gian dài.
• Có thể tái sử dụng chất mang.
• Chất mang dùng để cố đònh phải an toàn cho con người và cho môi trường.
Trong những năm đầu nghiên cứu, người ta thường sử dụng các chất mang trao đổi
ion như carboxyl methyl (CM –) cellulose, diethyl aminoethyl (DEAE –) cellulose,
sephadex… Đến những năm 70 – 80, khuynh hướng sử dụng các chất mang polymer tổng
hợp như polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene, polyhydroxylethyl, … được phát
triển rộng rãi. Trong những năm gần đây, người ta lại tỏ ra quan tâm nhiều hơn đến những
chất mang polymer sinh học tự nhiên như alginate, chitosan, … [24,48]
Thành tựu đạt được sau quá trình nghiên cứu và phát triển không ngừng ấy là kỹ
thuật cố đònh tế bào vi sinh vật ngày nay được trợ giúp bằng một hệ thống các chất mang
đa dạng. Có thể kể đến một số loại chất mang thường được sử dụng trong kỹ thuật cố đònh
tế bào vi sinh vật như bảng 2.3 [69].
Mỗi loại chất mang đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất đònh. Ứng với từng
phương pháp cố đònh tế bào vi sinh vật, sử dụng các loại chất mang khác nhau sẽ mang lại
những hiệu quả cố đònh khác nhau. Chính vì thế mà ngày nay, các nhà khoa học vẫn luôn
cố gắng tạo ra những loại chất mang mới, thích hợp cho từng phương pháp cố đònh tế bào
vi sinh vật cũng như những chất xúc tác sinh học khác.

Trang 13


Chương 2: Tổng quan
Bảng 2.3: Một số loại chất mang trong kỹ thuật cố đònh tế bào [69]
Dạng vật liệu
Vô cơ tự nhiên
Vô cơ tổng hợp
Hữu cơ tự nhiên
Polymer tổng hợp

Dạng hỗn hợp

Chất mang điển hình
Cát, kizelghur, kaolin, bentonit, than hoạt tính, …
Silicat, silicagel, thuỷ tinh (sợi, hạt, bản…), oxyde và
hydroxyde titan, nhôm, sắt, …
Chitin, chitosan, cellulose, dextran, collagen, …
DEAE – cellulose, CM – cellulose, cellofan, DEAE –
sephadex, polyetylen, polypropylen, polyvinyl alcohol,
polyvinyl chloride, polysterol, dẫn xuất của acid poly
acrylic, …
Polyetylen – albumin, polyetylen – collagen, cellulose
– polyetylenimin, polysterol – albumin, …

Bảng 2.4: Ưu – nhược điểm của một số loại chất mang [69]
Nhóm chất mang

Ưu điểm
Nhược điểm
Bền cơ học, độ trương
Giá thành cao, không
Polymer tổng hợp
cao và có khả năng cố đònh tương hợp sinh học và có
(polyacrylamide,
tế bào tốt.
nguy cơ huỷ hoại môi
polyvinyl alcohol )
trường.
Là sản phẩm của tự

Kém bền cơ lý, độ trương
Polymer sinh học nhiên, phong phú, rẻ tiền, thấp, không đồng nhất.
(alginate, chitosan)
dễ kiếm, có khả năng phân
huỷ sinh học.
Độ bền cơ lý cao, khả
Không tương hợp sinh
Chất mang vô cơ
năng tái sử dụng tốt, phong học.
(than
hoạt
tính,
phú, rẻ tiền, trơ về mặt hoá
silicagel)
học.

2.2.2

Điều kiện cố đònh vi sinh vật

2.2.2.1 Lựa chọn tế bào và giai đoạn sinh trưởng để cố đònh
Trong công nghệ cố đònh tế bào, có một câu hỏi được đặt ra là nên sử dụng tế
bào ở giai đoạn nào trong chu trình sinh trưởng của chúng để đem đi cố đònh? Nếu tế bào
sử dụng đang ở giai đoạn tăng trưởng, được cung cấp đầy đủ và cân đối các thành phần
dinh dưỡng cũng như sử dụng đúng chức năng sinh học của nó thì sẽ mang nhiều thuận lợi.
Chúng sẽ là các chất xúc tác sinh học có khả năng tự tái tạo, tự hình thành và hoạt tính
xúc tác của tế bào trong giai đoạn này sẽ được duy trì lâu dài để phục vụ cho các quá trình

Trang 14

Chương 2: Tổng quan
hoạt động liên tục hay lặp đi lặp lại của tế bào. Dù vậy, việc sử dụng tế bào ở giai đoạn
tăng trưởng cũng có những hạn chế sau [69]:

• Để duy trì hoạt động của tế bào ở giai đoạn sinh trưởng, như đã nói cần
phải luôn có nguồn năng lượng và dinh dưỡng thích hợp. Từ mục đích đó, tế bào có thể sử
dụng nguồn dinh dưỡng được cung cấp từ sản phẩm hoặc cơ chất. Điều này dẫn đến việc
làm giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm.
• Trong một số trường hợp, khi sự phát triển quá cao, dẫn đến việc trội về
số lượng làm cho tế bào có thể thoát khỏi chất mang, gây ô nhiễm sản phẩm.
Tóm lại, dù vẫn còn tồn tại nhiều hạn chế, cho đến nay, công nghệ cố đònh tế
bào vẫn được xem là giữ vai trò then chốt trong việc mang lại hiệu quả cao cho các quá
trình sinh học.

2.2.2.2 Điều kiện cố đònh
Để quá trình cố đònh đạt hiệu quả cao, ta cần phải đáp ứng được một số điều kiện cơ
bản như sau [48]:
• Chất mang có diện tích bề mặt đủ lớn và có các gốc thích hợp để tế bào tạo
các liên kết.
• Chất mang dễ sử dụng và tái tạo.
• Các tế bào cố đònh phải có khả năng sống sót cao và hoạt tính sinh học ổn
đònh và lâu dài.
• Quá trình thực hiện cố đònh không gây ảnh hưởng bất lợi đến hoạt tính sinh
học của tế bào.
• Chất mang phải có độ xốp đồng đều và dễ điều khiển, và phải cho phép cơ
chất, sản phẩm, cofactor và khí vận chuyển một cách tự do.
• Chất mang phải có độ bền nhiệt,sinh học, hóa học, cơ học và bền trước các
tác động của dung môi, áp suất, enzyme và lực cắt, kéo từ môi trường.
• Quá trình cố đònh phải dễ thực hiện, chi phí phù hợp và có thể ứng dụng với

quy mô lớn.

2.2.3 Cố đònh nấm men trên Cellulose vi khuẩn (Bacterial
Cellulose- BC)
2.2.3.1

Cấu trúc Cellulose vi khuẩn

Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, nó tạo thành cấu trúc cơ
bản của vách tế bào hầu hết các loài thực vật, nấm và một số loài tảo. Cellulose vi khuẩn
được đònh nghóa là cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn [6, 44, 46].
Ngày nay, cấu trúc của BC đã được xác đònh nhờ vào các kó thuật về công nghệ
hiện đại, như kó thuật nhiễu xạ tia X giúp xác đònh kích thước và phân biệt cấu trúc BC.
Các kó thuật khác như phổ Raman, phân tích phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân
giúp xác đònh các dạng kết tinh của cellulose [6, 43, 60].
BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β -1,4
glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại tạo thành thớ sợi thứ cấp

Trang 15


Chương 2: Tổng quan
(subfibrils), có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với
sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp
(subfibrils) kết lại thành những vi sợi (microfibrils), những vi sợi tạo thành bó (bundles),
những bó tạo thành dải (ribbons). Dải có chiều dày 3-4 nm và chiều rộng 70-80 nm. Các
dải siêu mòn của BC có chiều dài từ 1 đến 9 µ m tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được
ổn đònh nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (pellicles). [6, 7, 43, 60, 95, 97]

Hình 2.5: Cấu trúc BC [43]

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, β -1,4
glucans, nhưng mức độ polymer khác nhau, thực vật từ khoảng 13000-14000, và BC
khoảng 2000-6000, trong vài trường hợp lên đến 16000-20000. Ngoài ra BC còn có chỉ số
kết tinh cao (trên 60%). Đường kính của BC chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của
cellulose thực vật [7, 43].

Hình 2.6: a. Cellulose vi khuẩn (2 µ m)

Trang 16