Sáp nhập và mua lại Ngân hàng thương mại tại Việt Nam

LỜI CAM ĐOAN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và

-------------------

kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình
nghiên cứu khác.

Tác giả luận văn

NGUYỄN THỊ HIỀN

Nguyễn Thị Hiền

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN
TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Hà Nội, 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1

Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3

học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn,

1.1.

tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis ..................................... 3

thành luận văn tốt nghiệp.

1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt........................................................................... 6

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận
tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những
người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi
học tập và hoàn thành luận văn của mình.

Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis ......................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá....................................................................................... 8
1.1.4. Đặc điểm phân loại ..................................................................................... 8
1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ........................ 9
1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis ............................................... 11
1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể ..................................................... 13
1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng ................................. 14

Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012

1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam ................................................... 15

Học viên

1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc .......... 16
1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai ............. 18
1.2.

Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy ..................................................... 19

1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy .............................................................................. 19

Nguyễn Thị Hiền

1.2.2. Côn trùng thử nghiệm ............................................................................... 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24
2.1.

Vật liệu ..................................................................................................... 24

2.1.1. Sinh phẩm .................................................................................................. 24
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 24
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 26

2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh ................................ 26
2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt ........................................................................ 27
2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm .................................................. 27
2.2.4 Tách chiết DNA plasmid ............................................................................ 28
2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR ...................................... 29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 30

BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

2.2.7 Xác định trình tự nucleotide...................................................................... 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 33
STT

Viết tắt

có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ ................................................... 33

1

Amp

Ampicillin

3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu ..................... 33

2

Bp

Base pair

3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu ............. 36

3

Bt

Bacillus thuringiensis

Nồng độ bào tử .................................................................................................... 36

4

Bta

Bacillus thuringiensis subspecies aizawai

5

dH2O

Nước khử ion

6

DNA

Deoxyribonucleotide acid

7

E. coli

Escherichia coli

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 46

8

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 47

9

OD

Optical density

10

PCR

Polymerase chain reaction

11

SDS

Sodium dodecyl sulphate

12

Sol

Solution

13

TE

Tris EDTA

14

X-gal

3.1

Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C

Viết đầy đủ

3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh.................................................................. 35

Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ .................................. 37
3.2

Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C ........................................... 39

3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR............................. 39
3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 40
3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C ........................................................... 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5- Bromo- 4 Chloro- 3 indolyl β- D- galactoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU
Trang

1. Đặt vấn đề

Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt………………………………………… .............. 10

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều

Bảng 3.1. Sự đa dạng hình thái tinh thể của các chủng Bt…......................................... 34

kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng

Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm . 37

bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên

Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm. ................... 38

180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt

DANH MỤC HÌNH

hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà.

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của B. thuringiensis ……………………..…. ................... 7
Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis ....................................... .................... 8
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac ................14
Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B. thuringiensis …… ………….. .................. 15
Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….……... ........... 21
Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại …………… ……………………………... ............... 21

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa
học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Trung bình
mỗi hectar cây trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn
lan các loại hóa chất diệt côn trùng đã để lại dư lượng thuốc trong nông phẩm,
gây độc hại đối với sức khỏe người sử dụng và gây ô nhiễm môi trường. Thay

Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng …………… ………...……………. ........... 23

vào các biện pháp hóa học thì các biện pháp sinh học được khuyến khích sử

Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC...........33

dụng. Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm hơn

Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần . ............................ 34

90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới và hoàn toàn không độc với

Hình 3.3. Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển

con người, động vật và môi trường [24].

vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………….... ................... 36
Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu............................. 37
Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu………………... .......... 38
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu………… .................... 39
Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua

Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) được nghiên cứu
nhiều nhất trong 82 dưới loài của Bacillus thuringiensis. Bacillus thurigiensis
subsp. aizawai có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng
bộ cánh vảy (Lepidoptera), trong đó có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh

đêm………………………………………………………………………………. ....... 41

(Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) và một số côn

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… ........... 42

trùng bộ 2 cánh (Diptera). Cry1C là một loại protein thể độc do Bta sinh ra trong

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên

quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ cánh vảy rất mạnh.

agarose 1%.......................................................................................................... .......... 43

Vì vậy, để có thể sản xuất được thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng

Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp….…44

cánh vảy hoặc chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng bộ cánh vảy
vào cây trồng, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh
protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.1.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

Mục tiêu

1.1.

- Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) có hoạt
tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis
 Trên thế giới

- Tách dòng và đọc trình tự được gene cry1C của các chủng Bta đã sàng lọc
có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.
1.2.

Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis

B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học
Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu,

Nội dung

đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi

- Thu thập các chủng B. thuringiensis phân lập tại một số địa điểm ở Thái

Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8].

Nguyên.

Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây

- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương
pháp huyết thanh học.

bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã
đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8].

- Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được.
- Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn
trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR.

Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục
thân ở Châu Âu.
Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa

- Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy.
- Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình

mì tại Pháp.

tự gene trên Gene Bank.

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể
có bản chất là protein [8].
Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với
khối lượng lớn từ chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki. Năm 1956, Angus đã
chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [33].
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại
mới cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết
thanh.
Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra
chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt var.
israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã chứng
tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà
còn với cả bộ hai cánh (Diptera) [14].

Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng
để sản xuất có tính thương mại cao.
 Ở Việt Nam

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam

Năm 1981, Schnepf và Whiteley lần đầu tiên đã phân lập và tách dòng
gene độc tố mã hóa diệt sâu của chủng Bt subsp. kurstaki HD-1 gọi là gene cry1
và cho biểu hiện gene này ở E. coli. Từ đó một số lượng lớn các gene đã được
tách dòng và nghiên cứu đặc tính.

được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác
giả như Nguyễn Công Bì nh , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu
tiên mở đường nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam [10].
Thời kỳ mở đầu nghiên cứu

Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự
phát hiện ra dưới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera).
Chủng này được phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar. Sau đó, công ty

Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự Bt subsp. morrisoni đặt tên là Bt
subsp. Sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gene độc tố của chúng [14].
Năm 1985, gene cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm
1995 các cây chuyển gene đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng.
Từ năm 1987 -1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt
giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ
Hymenoptera. Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu về các
đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính thương
mại cao [10, 13, 25].

Các công bố khoa học về nghiên cứu B. thuringiensis ở thời kỳ này còn rất
ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B. thuringiensis
bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng
các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var.
thuringiensis, B. thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm B. thuringiensis này đã
được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả
tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis đã
bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có chất lượng
không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [8,10].
Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)
Ở thời kỳ này, các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất theo phương pháp
dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá

Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản

thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các

xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp –

trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm B. thuringiensis theo phương

cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gene [2].

pháp lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [10].

Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có khả
năng diệt tế bào ung thư.

Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay)
Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm B. thuringiensis kém chất

Năm 2005, Ohba và N.D. Binh đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt

lượng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng B. thuringiensis bước vào thời

phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung

kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục

ở người [10,13].

vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

học đã chuyển việc nghiên cứu B. thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn

các chủng B. thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục

lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn

hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis và ứng dụng công nghệ

lạc dạng trơn nhẵn.

chuyển gene B. thuringiensis phục vụ sản xuất [10].

Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc

Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng B.

bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng. Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc

thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [6]. Năm

hình trứng, kích thước 1,6-2m. Bào tử được hình thành trong điều kiện môi

2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen e

trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Khi gặp

của Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được 22

điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27].

dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [7, 11].
Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng B.
thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu
hiện gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli
thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng
[5,12].
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng
vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt
đầu từ cuối thế kỷ 20. Có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu
vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21]

Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng

giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. [9,13].

hợp. Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể là

Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua

hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu). Tinh thể có thể chiếm tới 30%

phương pháp sử dụng súng bắn gen. Năm 2005, gene kháng sâu trên được

trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và

chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [14].

quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn

1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt

bào tử thì bắt màu hồng nhạt [27].

Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh
vật gây bệnh cho côn trùng. Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que,
kích thước 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp hiếu khí
không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc
trên bề mặt tế bào [26,27,28].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn
chế.
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại
mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính có
hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh
động vật, động vật chân khớp. Phương pháp phân loại theo type huyết thanh H

được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phương pháp phân
loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi
Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng. Số lượng các type huyết thanh và các
chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá
Bt không lên men sinh axid trong môi trường chứa arrabinorase, xylose,
manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose. Có khả năng thủy phân tinh
bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001%
lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Bt không có
khả năng khử amine ủa phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử muối

được. Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao
gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B. thuringiensis. Theo hệ thống phân loại
thì B. thuringiensis subsp. aizawai thuộc type huyết thanh số 7 (Theo Bonnefoi
& de Barjac 1963) [5].
Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B.
thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các

sulfate (www.phenyl alanine tailieu.vn).
Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15-450C.

phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H.
1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Nhiệt độ tối ưu là 28- 32οC.
Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH= 7. Bt

Kích thước hệ gene của B. thuringiensis vào khoảng 2,4- 5,7 triệu bp. Thể

có khả năng oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu cơ và dioxide carbon theo chu

nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa có hình

trình Embden- Meyerhoff- Panas [6, 7, 8].

dạng nhất định và được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng Feulgen
có thể thấy nhân hiện màu tím. Trong vùng nhân có một NST duy nhất dạng

1.1.4. Đặc điểm phân loại

vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của Bt.

Có rất nhiều phương pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau: Phân loại

Hầu hết các chủng B. thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài

Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus,

nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không

1958).Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên - H. Phân loại bằng thực

đóng vòng. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gene tự nhiên

khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác

cho một số chủng B. thuringiensis.

nhau.Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể.Phân loại theo loại
hình enzym lipase.Phân loại theo nguồn bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Năm 1982, Held và cộng sự đã sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ
chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu. Các



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố chính là Cry, Cyt, Vip do các gene cry,

Gene cyt bao gồm 45 gene thuộc 3 lớp cyt1, cyt2 và cyt3 mã hóa protein
gây độc với côn trùng và động vật không xương sống. Nhóm gene cyt mã hóa

cyt, vip mã hóa [21,25].

protein 27 kDa và chiếm khoảng 40-50% tinh thể, protein này có tác dụng gây

1.1.5.1. Gene cry
Gene cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau. Đây là gene độc tố quan
trọng nhất của Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc do gene cry

độc với côn trùng bộ hai cánh và giun tròn.
Gene vip

mã hóa. Các gene cry thường nằm trên các plasmid có hệ số copy thấp. Những

Gene vip mã hóa cho các độc tố Vip (vegetative insecticidal protein). Độc

nghiên cứu của Carlton và Gonzalez trên 21 loài phụ Bt đã cho thấy số lượng

tố Vip được Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996, bao gồm

plasmid dao động từ 2- 12 trong các chủng nghiên cứu [11,20].

Vip3A và Vip3B [8].

Theo công bố mới nhất trên website

Độc tố Vip đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do

đã

hiện được côn trùng kháng độc tố này. Các nhà khoa học đã phát hiện được 85

phát hiện tới hơn 600 gene thuộc 70 họ gene cry của Bt.
Sau đây là các họ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt một số bộ côn
trùng gây hại phổ biến ở Việt Nam:

Hình dạng tinh
thể

gene vip thuộc 4 nhóm khác nhau, trong đó đáng chú ý là gene vip3A mã hóa
protein 88 kDa có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon,

Spodoptera fugipera, Spodoptera exigua. Khi côn trùng ăn phải độc tố, Vip3A

Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt
Gen

khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chưa phát

Khối lƣợng phân tử
protein (kDa)
130 – 138

là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa.
Hoạt tính diệt côn
trùng

1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố:

cry1A- cry1L

Lưỡng tháp

cry2A- cry2C

Cầu

69 – 71

Cánh vảy, hai cánh

Ngoại độc tố  ( - exotoxin), ngoại độc tố  (-exotoxin), ngoại độc tố  ( -

cry3A- cry3C

Lập phương

73 – 74

Cánh cứng

exotoxin), nội độc tố  (-endotoxin). Trong đó nội độc tố  có tác dụng diệt côn

cry4A- cry4D

Cầu

73 – 74

Hai cánh

trùng mạnh nhất.

cry5

Lưỡng tháp

81

Tuyến trùng

Ngoại độc tố 

cry8

Lập phương

130

Cánh cứng

Các gene cry còn lại

Đa dạng

35 – 129

Cánh vảy

Đa dạng

Gene cyt

Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong nước,
tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và được giải phóng ra môi trường
khi tế bào tan rã. Ngoại độc tố  có bản chất là một enzyme gọi là phospholipase

Gene cyt mã hóa cho các độc tố Cyt cũng có bản chất protein và hình

hoặc leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá đặc biệt là ong

thành thể vùi như độc tố Cry, nhưng tính tương đồng amino acid giữa 2 độc tố là

Tenthre dineda. Tác dụng độc của ngoại độc tố  có liên quan tới sự phân huỷ

không đáng kể [34].

phospholipid ở mô của côn trùng (nghiên cứu này được phát hiện bởi
Toumanoff - năm 1953) [8, 11].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Ngoại độc tố α có tác dụng tiêu diệt Galleria mellonella. Ngoài ra còn có

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: carbohydrate,

hiệu lực với các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng.

tuy nhiên cũng có thể carbohydrate chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong

Ngoại độc tố 

quá trình hình thành bào tử. Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố  chứa chủ

Độc tố này được Halt và Arkawwa (1959) tìm ra khi nuôi ấu trùng ruồi
nhà bằng thức ăn có chứa B. thuringiensis. Độc tố  có khối lượng phân tử cao
707- 850 kDa, bền nhiệt, tan trong nước. Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm
nuclease và RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA. Ngoại độc tố
 có phổ hoạt tính rộng, kháng côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ
cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh [8,12].

yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng
nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn. Nguyên tố P hầu như không có.
Nội độc tố : có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ
tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi đun ở
650C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 100 0C trong 30-40
phút thì tinh thể bị mất tính độc. Mặc dù tinh thể độc có thể tan ở pH kiềm,
nhưng không phải pH kiềm nào cũng thích hợp. Qua nghiên cứu các nhà khoa

Ngoại độc tố β rất có hiệu quả trong việc chống sâu non của côn trùng

học nhận thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hưởng tới độc tính

mẫn cảm, gây trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác và có tác động đối với sâu

của tinh thể. Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hòa tan trong pH

trưởng thành phát triển từ các ấu trùng đã ăn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết.

rất kiềm. Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần như đồng thời trong

Qua nghiên cứu Federici và Wu cho thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử
dụng ngoại độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ
sung thêm nội độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%.

Ngoại độc tố 

khoảng 3 giờ sau pha cân bằng [8, 11, 16].
1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể
Năm 1991, Li và cs đã công bố cấu trúc của nội độc tố  của protein tinh
thể diệt sâu Cry3A, từ đó đã mở rộng ra cho các độc tố khác. Các protein tinh

Có khối lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không

thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng riêng biệt:

khí, có khả năng tan trong nước. Độc tố này thuộc nhóm phospholipase, có tác

Vùng 1: là một chuỗi polypeptide gồm 290 amino acid, đây là vùng đầu

dụng lên phospholipid và giải phóng ra acid béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở

N. Vùng này gồm 7 chuỗi xoắn , 6 trong 7 chuỗi này được sắp xếp thành hình

0

nhiệt độ từ 60 C trở lên trong vòng từ 10- 15 phút đã bị vô hoạt.

thứ nhất và thứ 7 là các amino acid kị nước và nó nằm liền kề với vùng 2.

Nội độc tố 
Có bản chất là một protein gồm 1180 gốc amino acid, các amino acid chủ
yếu là glutamic và aspartic acid, chiếm trên 20% tổng số amino acid trong phân
tử protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp. Lượng
cysteine nhỏ hơn 20% tổng axit amin quy định sự không hoà tan của tinh thể,

ngoài ra còn có các amino acid: arginine, threonine, leucine, isoleucine [14].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6 cạnh bao bọc xung quanh chuỗi xoắn thứ 5 kị nước. Mặt bên của chuỗi xoắn



Vùng 2: bắt đầu từ amino acid 291 đến amino acid 500. Vùng này gồm 3
tấm  có cấu trúc tương đồng, song song và xếp ngược chiều nhau, trong đó tấm
1 và tấm 2 có tính tương đồng cao hơn. Mỗi tấm bao gồm 4 mảnh  không song
song, có cấu trúc chung. Hai mảnh  ở phía trong tạo thành một dải  kéo dài ra
tận phía 2 mảnh  ở phía ngoài. Tấm 3 có 3 mảnh  và 1 chuỗi xoắn  có chức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




năng duy trì cấu trúc cơ bản của tấm 1 và 2. Vùng 2 là vùng không bền vững của
độc tố [20].
Vùng 3: chứa những tấm  dạng bánh kẹp Sandwich. Vùng này chứa đầu
nhóm carboxyl và có cấu trúc bền vững [8].

Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam
Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac

1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng
Cơ chế hoạt động của protein tinh thể của B. thuringiensis liên quan tới
sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng. Khi sâu ăn phải protein tinh
thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có tính kiềm
(pH>10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối
lượng phân tử 60–65 kDa được hình thành và hoạt hóa. Độc tố đã hoạt hóa bám
vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu.
Sự gắn kết này ở ruột sâu làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành các lỗ rò
(kênh ion). Do đó phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào, làm cho

Bảo vệ Thực vật năm 1971. Nguyễn Văn Cảm và CS đã khảo nghiệm 5 loại
thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô vàTrung Quốc đã cho kết quả rất
khả quan. Tuy nhiên, những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu tiên được
Nguyễn Công Bình và CS thực hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại Viện Sinh vật
nay là Viện Công nghệ sinh học. Cho đến nay Bt đã được nghiên cứu rộng rãi ở
nhiều cơ sở tại Việt Nam như Viện Công nghiệp Thực phẩm, Viện Bảo vệ Thực
vật, Viện Công nghệ sinh học [13].
Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng
Bt phân lập tại Việt Nam. Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng gene và biểu hiện
gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C, Cry1D diệt sâu khoang từ các chủng Bt
subsp. aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh. Protein tái tổ

tế bào phồng lên, bị phân hủy dẫn đến sâu chết [8, 26].

hợp có hoạt tính diệt sâu cao hơn so với các chủng đối chứng [12].
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng
vào cây trồng để tạo ra cây có khả năng kháng sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ
thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu
vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như cây đậu xanh, cây bông. Năm

gây ảnh hưởng tới sự hình thành tinh thể độc. Tuy nhiên sự thay đổi lớn yếu tố

2003, Phan Đình Pháp và CS đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua

pH lại làm thay đổi số lượng bào tử. Thường thì Bt phát triển tối ưu ở pH=7 [9].

phương pháp sử dụng súng bắn gene, đến năm 2005, gene kháng sâu trên được
chuyển vào cây cà tím thông qua Agrobacterium [12].

Oxy: Bt là vi khuẩn hô hấp hiếu khí cho nên oxy là yếu tố không thể thiếu
trong quá trình sinh trưởng Bt. Tùy từng giai đoạn sinh trưởng mà hàm lượng

Những nghiên cứu trên đã tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong

oxy cần cung cấp khác nhau. Ở các giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng, Bt

việc ứng dụng các gene quý của Bt để tạo ra các cây trồng mới kháng được sâu

cần nhiều không khí, do vậy không khí được cấp càng nhiều thì lượng sinh khối

bệnh cũng như sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt.

càng tăng và số lượng bào tử sẽ tăng. Tuy nhiên, ở các giai đoạn sau (giai đoạn

1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử và tinh thể độc,
đóng một vai trò vô cùng quan trọng và có tác động mạnh tới hiệu quả của quá
trình lên men sản xuất chế phẩm Bt. Nhiều nhà nghiên cứu đã nhận thấy rằng
các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng phát triển của Bt đều ảnh hưởng

tác động lên quá trình sống của tế bào làm tế bào sớm tự phân giải, dẫn tới số
lượng tinh thể độc giảm [8].
Các nguồn dinh dưỡng: Bulla và Arcas và cộng sự đã nghiên cứu và
nhận thấy rằng các hợp chất amonium vô cơ như (NH4)2SO4 không có hiệu quả
trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Bt. Trong khi đó các nguồn nitơ

tới quá trình sinh tổng hợp độc tố.
Nhiệt độ: Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20400C. Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng Bt là 28- 320C. Nếu nhiệt độ
dưới 200C và trên 320C đều có ảnh hưởng lên quá trình hình thành bào tử. Nếu
nuôi cấy ở 200C thì chu kì phát triển cần 64 giờ, trong khi đó nuôi cấy ở 350C thì
thời gian cần cho chu kì phát triển giảm xuống còn 27 giờ và số bào tử tăng lên.
Khi nuôi cấy Bt trên môi trường thạch ở nhiệt độ trên 400C thì Bt vẫn có khả
năng phát triển nhưng bào tử lại không được hình thành. Thêm vào đó nhiệt độ
cũng có ảnh hưởng lớn tới quá trình hình thành tinh thể độc, ở nhiệt độ dưới
140C sau 360 giờ nuôi cấy không quá 10% tinh thể được hình thành, nhưng ở
0

nhiệt độ 16 C sau 168 giờ nuôi cấy lượng tinh thể tăng lên đạt tới 15% [8].
pH: pH là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng
Bt, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, ảnh hưởng đến điện tích màng tế bào

và sự hấp thu chất dinh dưỡng, ảnh hưởng tới khả năng cho nhận chất dinh
dưỡng trong môi trường và tính độc của các vật chất có hại. Do đó pH quá cao
hoặc quá thấp đều có hại tới Bt. Với pH dao động trong khoảng 5,8- 8,5 không
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

logarit cho đến trở về sau) nếu cứ tiếp tục tăng hàm lượng không khí thì nó sẽ



hữu cơ như cao thịt, bột cá, bột đâụ tương, là yếu tố thúc đẩy quá trình sinh
trưởng. Các chủng Bt khác nhau cần các amino acid khác nhau. Các nghiên cứu
cũng chỉ ra rằng nguồn nitơ có ảnh hưởng rất lớn tới sinh khối Bt và các protein
tinh thể độc. Ngoài ra các ion khoáng như Ca, Mg, K, cũng được coi là nguồn
dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng Bt.
Amino acid: một số amino acid như leucine, isoleucine có tác dụng ức
chế sự sinh trưởng của Bt cũng như sự hình thành tinh thể độc, nhưng khi cho
thêm axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi. Ngoài ra, nếu bổ sung riêng rẽ
threonine hoặc serine vào trong môi trường nuôi cấy Bt thì gây ức chế sự hình
thành tinh thể độc nhưng nếu đưa cả hai loại đó vào trong môi trường thì sự ức
chế bị mất. Tác dụng ức chế của amino acid serine cũng bị mất đi nếu như có
mặt axit amin methionine. Acid  – picoline và acid flucoacetate cũng ức chế
việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể độc. Chất kháng sinh erythromycine
ở nồng độ thấp không đủ để ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể
độc [8].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.11. Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai

1.2.

Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy

Gene cry1C

1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy

Gene cry1C có kích thước khoảng 3 kb trong đó đoạn bảo thủ mã hóa độc

Bộ cánh vảy(Lepidoptera) là một bộ lớn trong côn trùng học, bao gồm

tố có kích thước 288bp. Gene cry1C mã hóa protein tinh thể độc tố có khối

bướm và bướm đêm. Bộ cánh vảy gồm hơn 180.000 loài trong 128 ngành và 47

lượng phân tử khoảng 130kDa. Nhóm dưới loài B.thuringiensis subsp. aizawai

họ. Trong số hơn 180.000 loài được mô tả cho đến nay có thể tìm thấy hầu như

có khả năng sinh tinh thể hình thoi chứa gene cry1C. Cho đến thời điểm hiện

ở khắp mọi nơi. Khoảng 11.300 loài được tìm thấy từ Bắc Mỹ và 10.000 loài tìm

nay đã có trên 16 gene thuộc phân nhóm cy1C được tách dòng và công bố trên

thấy ở Úc. Bộ cánh vảy được tìm thấy phần lớn ở hầu hết các môi trường sống,

cơ sở dữ liệu của Crichmore, trong đó mới nhất là gene cry1CAa14.

nhưng hầu như chúng luôn luôn sống ở các vùng thực vật bậc cao, đặc biệt là

Trong nghiên cứu khả năng tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn
trùng thì vùng 2 của độc tố Cry1C có khả năng liên kết cả 3 loại thụ thể có khối
lượng phân tử khác nhau.

thực vật hạt kín [3].
Cũng như tất cả các côn trùng, loài cánh vảy có một bộ xương ngoài và
tách ra thành ba phần : phần đầu, phần ngực, phần bụng. Chúng có 3 cặp chân ở
ngực, hai mắt kép lớn và một thuôn dài trên miệng được gọi là vòi. Còn ấu trùng

Dưới loài Bta
Bta là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B. thuringiensis, thuộc typ
huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de. Barjac, 1963. Trong số
các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam thì có tới 15% số chủng là Bta
[5,10].

thì cơ thể mềm, phần đầu phát triển và có đến 11 cặp chân (thông thường là 8
cặp). Chúng thường đẻ trứng trên các loài cây chủ, số lượng trứng là khác nhau
từ một vài cho đến một vài nghìn. Trứng sau khi nở thành ấu trùng, các ấu trùng
ăn tất cả các phần của cây. Ấu trùng phát triển nhanh với nhiều thế hệ trong một
năm, tuy nhiên một số loài thời kỳ phát triển mất đến 3 năm. Bộ cánh vảy gây

Bta hình thành tinh thể diệt sâu trong chu kì phát triển ở pha ổn định. Tinh

hại nghiêm trọng cho nông nghiệp, chủ yếu là khi tuổi ấu trùng, chúng đục thân,

thể có dạng hình thoi là chủ yếu. Dưới loài Bta mang gene mã hóa nhiều loại

ăn lá làm tổn hại đến cây dẫn đến cây chết: sâu hại bắp ngô, sâu tơ hại rau, sâu

protein tinh thể của nhóm Cry 1 như Cry 1C, Cry 1D, Cry 1Aa, Cry 1Ab. Vì thế

đục quả đậu rau.

Bta là một trong những dưới loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế
phẩm từ Bt. Bta có khả năng diệt nhiều loài sâu hại quan trọng như: sâu tơ
(Plutella Xylustella), CL, ICW, sâu xanh da láng, sâu quả cà chua, sâu khoang.
Bta vẫn có hiệu quả diệt sâu trên những vùng đã có biểu hiện kháng độc tố Btk

1.2.2. Côn trùng thử nghiệm
Sâu tơ
Sâu tơ (Plutella xylostella) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài rau
(Plutellidae) hay còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù.

[38].
Trên thị trường hiện nay, chế phẩm XenTari sản xuất từ Bta được sử dụng

Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương. Chúng

rộng rãi và có hoạt tính diệt các loại sâu hại quan trọng mà đã kháng lại thuốc

được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc trong

trừ sâu hóa học như: sâu khoang, sâu xanh [10].

nhiều nghiên cứu. Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới 128 nước
và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này. Sâu tơ sinh sản cao,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh. Thiệt hại hàng năm do sâu tơ gây ra

mặt của lá. Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt

khoảng 30- 50% năng suất, chi phí phòng trừ chiếm 20-40% tổng chi phí đầu tư

dưới của lá [3].

nhất là trên bắp cải [3].
Đặc tính sinh học và hình thái của sâu tơ
Tùy theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng khác nhau, ở nhiệt độ
20 -300C thì vòng đời của chúng là 20 -30 ngày, ở nhiệt độ 15–200C thì vòng đời
là 40 ngày. Đây là loài biến thái qua 4 pha: Trứng – sâu non – nhộng – trưởng
thành (Hình 1.5).
Thời trứng 2-3 ngày, hình bầu dục, màu vàng nhạt dài 4- 5mm, đường
kính 0,3-0,5mm.Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở trong vòng
3–4 ngày.Thời kỳ sâu non 8-10 ngày, hình ống, màu xanh nhạt, dài 8- 10mm,
Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ [3]

đầu có màu nâu nhạt, trên các đốt có lông tơ. Sâu non phát triển qua 4 tuổi.Tuổi

1: Thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ

Đặc điểm gây hại

1,2-1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2-4 ngày.Tuổi 2: Mình sâu bắt đầu chuyển sang

Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải. Sâu non ăn lá,

màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục. Sâu dài từ 1,5-3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển

khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương mất khả

trong thời gian từ 1-3 ngày.Tuổi 3: Mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5-5,5 mm

năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết. Sâu tơ phá hoại toàn

và phát triển từ 1- 3 ngày.Tuổi 4: Sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể

bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu

từ 5,5-9 mm, phát triển từ 1-4 ngày. Giai đoạn này sâu có màu xanh nhạt, hình

non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì phiến lá sẽ bị thủng

ống với nhiều đốt, mỗi đốt đều có nhiều lông nhỏ. Đầu màu nâu vàng có các

lỗ chỗ. Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại nhiều nhất là vào vụ Đông xuân.

phiến cứng, trên đó có các chấm mầu nâu nhạt. Trên mảnh cứng của lưng ngực
có những chấm xếp thành hình chữ U.

Thời kỳ nhộng 3- 4 ngày, nhộng có màu xanh hoặc vàng nhạt, dài 6-7mm
được bao bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá.
Thời kỳ trưởng thành 5-7 ngày, sâu trưởng thành (bướm) thân dài 610mm, sải cánh trung bình 15mm, cánh màu nâu xám, mép cánh trước có ba dấu
hình tam giác màu nâu nhạt ngả trắng và có lông nhỏ dài mịn, khi đậu cánh sát
thân. Bướm ít bay mà thường di chuyển theo gió, hoạt động nhiều từ chập tối

Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại [3]

đến nửa đêm, mỗi con cái đẻ từ 50-400 trứng. Trứng được đẻ riêng rẽ trên bề
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâu tơ là loại sâu hại nghiêm trọng có khả

Từ tuổi 2, màu sắc trên mình sâu bắt dầu thể hiện rõ dần. Bụng màu vàng

năng kháng thuốc cao. Trong cơ thể sâu tơ có loại men có thể phân giải thuốc

xanh, các đốt trên thân phân biệt rõ dần. Mình sâu có 3 sọc màu trắng mờ, một

thành chất không độc, đó là hệ men vi thể (microsonal enzyme system). Khi cơ

sọc giữa lưng và 2 sọc ở hai bên thân, cả 3 sọc trên chạy từ đốt thứ nhất đến đốt

thể sâu tiếp xúc với hóa chất độc, hệ men vi thể được kích thích hoạt động tăng

cuối của bụng. Ở tuổi này sâu có kích thước cơ thể trung bình là 0,45x3,7mm.

100- 200 lần [3].

Thời gian phát triển của sâu tuổi 2 từ 2-4 ngày.

Sâu xanh da láng

xanh lá cây. Đầu màu vàng nhạt, bóng; vẫn còn mang nhiều lông. Các chấm trên

Sang tuổi 3, lúc mới lột xác sâu có màu vàng xanh, sau chuyển sang màu
Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)có tên khoa học là Spodoptera
exigua Hubner, thuộc họ Noctuidae (Ngài Đêm), Lepidoptera (bộ Cánh Vảy).

mình sâu nhỏ dần, lông ngắn hơn. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-3
ngày.

Ở Việt Nam, nhất là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, từ năm 1981 sâu

Sau khi nở sâu sống tập trung quanh ổ trứng, ăn phần diệp lục của lá

là đối tượng gây hại chính trên đậu nành, đậu xanh, hành, ớt và một số loại hoa

thành những lổ nhỏ, chừa lại lớp biểu bì trắng. Cuối tuổi 1 sâu bắt đầu phân tán

màu ngắn ngày khác.Vòng đời của sâu khoảng 30 đến 40 ngày, chia thành 3 giai

sang các lá lân cận. Ấu trùng tuổi 2 ăn lủng lá thành những lổ nhỏ và có tập

đoạn:

quán nhả tơ buông mình xuống đất khi bị động. Ở tuổi 3 sâu ăn phá mạnh nhất,
Giai đoạn trưởng thành: Bướm là loại bướm đêm, màu trắng xám,

cắn lá thành những lổ to; sâu còn đeo trên các chùm hoa của cây đậu nành và ăn

chiều dài thân từ 7-10 mm, sải cánh rộng từ 20-25 mm. Đầu màu xám, mang

các cánh hoa vừa mới nhú. Ở những ruộng có mật số cao sâu ăn lá còn trơ gân

nhiều lông, hai mắt kép to, màu đen, râu đầu hình sợi chỉ, dài từ 5-6 mm. Ngực

chính và cuống và cả trái non [3].

màu nâu đỏ, được phủ kín bởi một lớp phấn màu xám tro có ánh kim. Cánh
trước màu xám hơi ngả nâu, thon dài, hình tam giác, góc cánh hơi bầu, có nhiều

Giai đoạn nhộng: Kéo dài từ 7–10 ngày, sâu thường hóa nhộng trong đất
hoặc lùm cỏ khô.

vân. Thời gian sống của bướm từ 5-10 ngày và một bướm cái có thể đẻ từ 300400 trứng trong vòng từ 3-5 ngày.
Trứng có hình cầu, đường kính từ 0,4-0,5mm, mới đẻ màu xanh đến vàng
nhạt, sau chuyển sang màu trắng đục, sắp nở có một chấm đen trên vỏ trứng, đó
là mắt của sâu. Trứng được đẻ thành từng ổ, trên phủ lớp lông màu trắng ngà.
Thời gian ủ trứng từ 2-4 ngày.
Giai đoạn sâu non: Sâu có từ 5-6 tuổi, phát triển trong thời gian từ 10-19
ngày. Mặt lưng của sâu màu xanh và trơn láng nên còn có tên là "Sâu xanh da
láng" để phân biệt với sâu xanh (Heliothis armigera). Chi tiết trong từng tuổi

sâu như sau:

Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng [3]

Tuổi 1: thân sâu có màu xanh lá cây hay vàng xanh, đầu đen bóng, mang
nhiều lông, bụng màu vàng nhạt, cơ thể có chiều dài từ 1,2-1,5mm, thường phần
đầu có chiều ngang lớn hơn chiều ngang thân mình và các sọc trên cơ thể chưa
rõ ràng. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-5 ngày.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

- Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, Taq polymease, đệm, nước
khử ion…

Vật liệu

Thiết bị:

2.1.1. Sinh phẩm
150 chủng Bt phân lập từ mẫu đất ở Thái Nguyên, chưa qua phân loại và
xác định hình dạng tinh thể, do Phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp.

E. coli DH5α được nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh, Viện Công nghệ
Sinh học.

Các thiết bị nghiên cứu gồm: Máy li tâm (Fresco, Đức), máy PCR (PTC100, Mỹ), máy vortex (IKA, Đức), máy lắc (Gerharat, Đức), máy soi gel (Vilber
Lourmat, Đức), máy chụp gel (Gen Doc), kính hiển vi (Olympus, Nhật), tủ lạnh
sâu (Frigo, Đan Mạch)
Ngoài ra chúng tôi cũng sử dụng một số dụng cụ khác phục vụ cho quá

Sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) tuổi 2
do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp.

trình nghiên cứu như: đĩa petri, bình tam giác, pipet
Môi trƣờng:

Các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gene cry1C do phòng Di truyền
vi sinh vật cung cấp.

Các loại môi trường đã sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm:
 Môi trƣờng MPA- MT1 (g/l)

- Cặp mồi đặc hiệu gene cry1C

TYIC 5’ – CAACCTCTATTTGGTGCAGGTTC 3’
TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’
- Cặp mồi M13

Agar: 20g

Pepton: 10g

Nước cất: 1l

NaCl: 5g

Cao thịt: 4g

pH: 7

 Môi trƣờng MPB- MT2 (g/l)
Pepton: 10g
NaCl: 5g

Reverse M13: 5’- CAGGAAACAGCTATG – 3’

Nước cất: 1l

pH: 7

Cao thịt: 4g

 Môi trƣờng Craige- MT3 (g/l)

Forward M13: 3’- GTAAAACGACGGCCA – 5 ’

Bacto agar: 8g

Pepton: 10g

Nước cất: 1l

Vector tách dòng plasmid: pGEM-T Easy

NaCl: 5g

Cao thịt: 4g

pH: 7

Taq polymerase, enzyme giới hạn (EcoRI), ligase…của hãng Invitrogen,
Fermentas.

 Môi trƣờng LB- MT4 (g/l)
Trypton: 10g
NaCl: 5g

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

Nước cất: 1l

pH: 7

Cao men: 4g

 Môi trƣờng LBA- MT5 (g/l)

Hóa chất:
- Hóa chất sử dụng trong phân lập và nuôi cấy Bt: agar, cao thịt, cao nấm men,
peptone, NaCl….

Agar: 20g

Trypton: 10g

Nước: 1l

NaCl: 5g

Cao men: 4g

pH: 7

Các loại dung dịch:
 Các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid

- Hóa chất sử dụng nhuộm bào tử và tinh thể: fuchsin base

 Dung dịch Sol 1:

Tris HCl, pH = 8.0: 20mM.

- Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris-base, TAE.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

 Dung dịch Sol II:

EDTA, pH = 8.0: 10mM

có khả năng chuyển động. Do vậy, trước khi tiến hành phương pháp này, chúng

Glucose: 50mM

tôi tiến hành kiểm tra khả năng chuyển động của các chủng nghiên cứu trên môi

NaOH: 20mM.

trường MT3 [30].
Cách tiến hành: các chủng Bt được cấy vào trong ống Craige (là ống thủy

SDS: 1%
 Dung dịch Sol III:

CH3COOK: 60ml
CH3COOH: 11,5ml

to), nuôi ở 37ºC trong 24-28 giờ. Khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động

H2O: 28,5ml

sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trường, giữa ống Craige và ống nghiệm.

 Các dung dịch dung trong điện di trên gel agarose
 Dung dịch TE:

tinh nhỏ, được cắm thẳng đứng vào môi trường Craige chứa trong ống nghiệm

Tris HCl 10mM, pH= 8.0

Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi
trường MT2, lắc ở 70–75 vòng/phút trong khoảng thời gian 12-15 giờ [30].
Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên

EDTA 1mM, pH= 8.0
 Dung dịch đệm điện di TAE 50X:

kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng

Tris base 121g

chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng)

Acid acetic 5M: 28.6 ml

và quan sát dưới kính hiển vi.

EDTA 0.5M pH=8.0: 50ml

2.2.2

Nước khử ion đủ 500ml
 Dung dịch đệm tra mẫu DNA (loading buffer) 5X:
Tris HCl 1M pH= 8.0: 1ml
EDTA 0.5M pH=8.0: 2ml

Cấy các chủng Bt ra từng đĩa môi trường MPA riêng rẽ, nuôi ở 28ºC sau 3
ngày để thu sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được xử lý ở 70ºC trong 10 phút, sau
đó pha loãng đến nồng độ 10-8 lấy 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng 10-7 và
10-8 cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trường MPA. Nuôi ở 28ºC trong 24h, đếm

Glycerol: 2ml

số khuẩn lạc mọc trên đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ nhất. Số lượng bào tử được

Bromphenol blue 1%: 2ml

tính theo công thức:

 Gel điện di agarose 1%: agarose 1g, TAE 1X: 100ml
2.2.

Xác định mật độ bào tử Bt

Phƣơng pháp nghiên cứu

CFU: số lượng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy.

2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh
Phương pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh dựa trên đặc tính
huyết thanh học của chủng Bt, nghĩa là dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và
được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với kháng huyết
thanh tương ứng. Phương pháp này cho phép xác định dưới loài Bt, tạo điều kiện
thuận lợi cho việc lựa chọn các chủng Bt có hoạt tính cao với các bộ côn trùng.
Các chủng Bt tham gia vào phản ứng ngưng kết huyết thanh phải là các chủng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CFU = n . a . 10



n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng
a: nồng độ pha loãng.
2.2.3

Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm
Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng

nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu xanh da láng
(Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) theo phương pháp của Thiery
và Frachon ở nồng độ 107 và 109 bào tử/ml đối với sâu xanh da láng và nồng độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




105 và 107 bào tử/ml đối với sâu tơ 105. Mỗi nồng độ thử nghiệm với 3 đĩa petri

- Đẩy nước lên tới 500µl.

và mỗi đĩa 10 con sâu tơ và 3 con sâu đối với sâu xanh da láng [34].

- Bổ sung chloroform: isoamylalcohol (24:1); tỷ lệ 1: 1, đảo bằng tay.

Chuẩn bị:

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi
0

Các chủng Bt được cấy thảm trên môi trường MPA, nuôi ở 28 C trong 72
giờ. Sau đó, sinh khối được thu vào ống eppendorf chứa 1ml nước cất vô trùng.
5

7

Pha loãng mật độ bào tử ở nồng độ 10 đến 10 bào tử/ml để thử hoạt tính.
Lá cải xanh hoặc lá bắp cải sạch (không phun thuốc trừ sâu, không sâu

- Bổ sung NaOAC/KOAC, tỷ lệ 1: 10.
- Bổ sung cồn tuyệt đối, tỷ lệ 2,5: 1.
- Ủ ở -20ºC trong ít nhất 4h.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, thu tủa.

bệnh) rửa sạch và tráng qua bằng nước cất, để khô tự nhiên, cắt lá với diện tích

- Rửa tủa bằng 200µl cồn 70º.

đều nhau sao cho vừa đĩa petri. Nhúng lá vừa cắt vào dịch Bt đã pha loãng và để

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, thu tủa.

10 phút cho hai mặt lá được ngấm hết dịch Bt, lấy ra để khô ở nhiệt độ phòng.

- Làm khô, hòa tủa trong 35µl dH2O.

Sau đó cho lá đã khô dịch vào các đĩa petri, mỗi đĩa thử 10 con hoặc 3 con sâu

- Bảo quản ở - 20ºC .

xanh da láng. Nuôi ở nhiệt độ phòng và nơi thoáng mát và theo dõi tỉ lệ sâu chết
trong 3 ngày.

2.2.5

Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR
Phương pháp PCR do Karl Mulis và cộng sự phát hiện năm 1985. Nhờ

Tỉ lệ sâu chết được tính theo công thức Abbott:

enzym DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các

A = (C – T)/C. 100

mạch đơn mới. Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn

A: % sâu chết

cho quá trình tổng hợp mạch mới ở chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn

C: số sâu sống ở mẫu đối chứng

DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3’-OH tự do. Các

T: số sâu sống ở mẫu thí nghiệm.

nucleotide được gắn ở vị trí nhóm OH tự do tạo thành mạch đơn mới.

2.2.4 Tách chiết DNA plasmid
- Nuôi vi khuẩn trong môi trường MPB ở 28°C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm.

Thành phần 1 phản ứng PCR:

- Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn.

dNTPs

- Bổ sung 150µl dung dịch sol I, vortex.

2µl
2+

Đệm (có Mg )

2µl

- Bổ sung 150µl dung dịch sol III, lắc mạnh cho tủa hòa tan.

Mồi

1C F

1µl

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi.

Mồi

1R

1µl

- Bổ sung 150µl dung dich sol II, đảo nhẹ bằng tay.

- Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối

Taq polymease

0,2µl

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.

DNA Temp

2µl

- Làm khô tự nhiên.

dH2O

11,8µl

- Hòa tủa trong 35µl RNase, ủ ở 37°C trong 1h.

Thể tích/phản ứng:

20µl

- Tủa ở - 20°C trong 4 giờ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, hòa tế bào trong 60µl CaCl2
100 mM, bổ sung 15% glycerol.

2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C
Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối

- Bảo quản tế bào ở - 80ºC
+ Biến nạp:
- Lấy tế bào khả biến từ - 80ºC để vào đá 30 phút.
- Hút 5µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gene vào dung dịch tế bào khả

T4- DNA ligase.
Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng:
Đệm

5µl

Vector

1µl

T4-DNA ligase

1µl

Sản phẩm PCR

3µl

biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất
định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).
- Sốc nhiệt ở 42ºC trong 60-90 giây sau đó giữ trong đá 2 phút.
- Bổ sung 200-300µl môi trường LB và lắc ở 37ºC, 200 vòng/phút trong 11,5 giờ.
- Trải 150µl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường LBA bổ sung ampicilin

Phản ứng ghép nối được tiến hành 14 - 16h ở 4ºC.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α

+ X- gal, nuôi ở 37ºC từ 14-16h.
Sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR colony

 Nguyên tắc: Dưới tác dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng

Các thành phần PCR colony tương tự như phản ứng khuếch đại gene cry1C

trở nên xốp tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi

với mồi đặc hiệu, chỉ khác ở chỗ khuôn DNA được thay thế bằng một lượng nhỏ

sốc nhiệt.

sinh khối từ các khuẩn lạc trắng và sử dụng cặp mồi M13.



Quy trình gồm 2 bước

Tách DNA plasmid từ E. coli DH5α

+ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm.
- Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB.
- Lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 37ºC. Đo OD600 đạt 0,5-0,6 thì hút lấy mẫu
vào ống eppendorf đặt trên đá 1h. Sau bước này mọi thao tác luôn phải được
thực hiện ở 4ºC.

Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng)
cấy vào 2ml môi trường LB chứa ampicillin, lắc qua đêm 200 vòng/phút ở 37ºC.
Qui trình tách tương tự như quy trình tách DNA plasmid của Bt
Xử lý DNA plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI
Để xác định chính xác vector tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn

- Mẫu sau đặt đá 1h được ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch
nổi. Hòa tế bào thu được trong 1-1,5ml CaCl2 100mM vô trùng, vortex và ly tâm
thu tủa ở 6000 vòng/phút trong 10 phút.

hay không, cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng EcoRI.
Trình tự cắt của EcoRI:

- Hòa tan lại tủa trong 1,5ml CaCl2 100mM, vortex, ủ mẫu trên đá trong 2h,
cứ 15 phút đảo 1 lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C
có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ
Thành phần của phản ứng cắt:
Thành phần

3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu
Thể tích (µl)

Từ 150 chủng vi sinh vật thu nhận được sau 3 ngày nuôi cấy ở 28 0C, trên
đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên nhiều loại khuẩn lạc B. thurigiensis

DNA plasmid

6µl

Buffer

1µl

EcoRI

0,5µl

dH2O

2.5µl

Tổng thể tích

10µl

hình tròn, có màu trắng sữa và mép nhăn hoặc không (Hình 3.1).

Phản ứng cắt được tiến hành ở 37ºC trong 4h.
2.2.7

Xác định trình tự nucleotide
Tiến hành theo phương pháp tổng hợp của Sanger và CS. Thực hiện phản

ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung 4 loại
dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, dd TTP) và được đánh dấu bằng
thuốc nhuộm huỳnh quang [23].
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide bổ sung urea để tăng độ
phân giải của gel. Sử dụng tia lase quét phát hiện dideoxynucleotide đã đánh

dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó so sánh trình tự gene đã

Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trƣờng MPA
sau khi nuôi ở 28ºC sau 72h (1: Khuẩn lạc Bt)

Từ mỗi đĩa nuôi cấy chúng tôi tách lấy một khuẩn lạc riêng rẽ làm tiêu
bản với thuốc nhuộm fuchsin base sau đó quan sát trên kính hiển vi quang học ở
độ phóng đại 1000X (vật kính dầu). Kết quả cho thấy trong 150 chủng vi khuẩn
thuộc nhóm Bacillus cereus đã thu thập, có 54 chủng sinh tinh thể. Kết quả này
được thể hiện trong Hình 3.2, Bảng 3.1.

tách dòng với các trình tự đã công bố trong GenBank.
2.3 Địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện tại phòng Di truyền vi sinh vật, Phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ Gen, Viện CNSH, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




dạng tinh thể là do thành phần protein cấu tạo tinh thể tạo nên. Sự phong phú về

Bảng 3.1. Sự đa dạng hình thái tinh thể của các chủng Bt

Hình dạng tinh thể

STT

Số chủng

Tỷ lệ %

hình dạng tinh thể là cơ sở tạo nên phổ diệt côn trùng rộng từ cánh vảy, bộ hai
cánh đến bộ cánh cứng tới giun tròn thực vật.

1

Lưỡng tháp

21

39

2

Cầu

4

7

gene cry1 trong đó có gene cry1C có khả năng mã hóa protein tinh thể hình

3

Lưỡng tháp và cầu

26

48

lưỡng tháp và hình cầu có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy với hoạt lực cao.

4

Lập phương

1

2

5

Cầu và lập phương

1

2

cánh vảy với sâu tơ.

6

Không xác định

1

2

3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh

54

100

Tổng số

Theo nhiều tài liệu đã công bố, dưới loài Bta mang nhiều gene trong họ

Vì vậy, các chủng Bt phân lập được phân loại bằng huyết thanh để xác định dưới
loài của chúng nhằm tìm ra các chủng Bta và thử hoạt tính diệt côn trùng bộ

Phân loại dưới loài theo phương pháp phân loại huyết thanh của de Barjac
và Bonefoi đối với các chủng nghiên cứu. Bt được chia làm rất nhiều dưới loài
khác nhau, mỗi dưới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Dưới loài Bta có khả
năng diệt côn trùng bộ cánh vảy thuộc type huyết thanh H7. Để tìm được các
chủng Bta chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt phân lập bằng cách sử dụng
typ huyết thanh H7 để phân loại.
Với 26 chủng nghiên cứu mang tinh thể hình lưỡng tháp và hình cầu,
chúng tôi đã xác định được 10 chủng có phản ứng dương tính với typ huyết
thanh H7 chiếm 38% số chủng được phân loại (Hình 3.3).
Như vậy có thể bước đầu kết luận rằng có 10 chủng nghiên cứu có khả

Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần

năng thuộc dưới loài Bta.

dƣới kính hiển vi quang học (1: tinh thể, 2: bào tử)

54 chủng B. thuringiensis sinh tổng hợp các lọai protein tinh thể rất đa
dạng. Trong đó, protein tinh thể hình lưỡng tháp và hình cầu chiếm tỷ lệ cao
nhất 48%, sau đó là protein tinh thể lưỡng thấp chiếm 39%. Các chủng sinh tinh
thể hình cầu, lập phương và đồng thời 2 loại tinh thể này chiếm tỷ lệ tương đối
thấp, từ 2% đến 7%. Điều này thể hiện tính đa dạng về hình dạng tinh thể của
các chủng B. thuringiensis đã phân lập. Sự khác nhau về cấu trúc cũng như hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ


Hoạt tính diệt sâu da láng
Bảy chủng Bta đươc pha loãng tới nồng độ 107 và 109 bào tử/ml bằng

nước cất vô trùng. Tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu xanh da láng theo
công thức của Abbott. Tỷ lệ sâu chết được tính sau 3 ngày thử nghiệm. Kết quả
thử nghiệm được trình bày ở Hình 3.4 và Bảng 3.2.
A

B

Hình 3.3. Sản phẩm ngƣng kết huyết thanh của chủng TN 6.12 phân lập với typ huyết
thanh dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần
A: Trước khi nhỏ huyết thanh miễn dịch
B: Sau khi nhỏ huyết thanh miễn dịch

3.1.3

Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu tơ
Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu

Nồng độ bào tử

Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta
sau 3 ngày thử nghiệm

Bt trong giai đoạn tạo bào tử đồng thời sinh tổng hợp các tinh thể độc.
Thông qua nồng độ bào tử có thể gián tiếp ước lượng nồng độ tinh thể của
các chủng nghiên cứu. Do đó chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bào tử

STT

Tên chủng

Tỷ lệ sâu chết (%)
7

ở nồng độ 10 bào tử/ml

ở nồng độ 109 bào tử/ml

của 7 chủng Bta nghiên cứu cùng với chủng Bta chuẩn 4J4 làm đối chứng

1

ĐC âm

0

0

dương.

2

ĐC dương (4J4)

33

78

Nồng độ bào tử của các chủng Bta dao động từ 2,5109 đến 5109 bào tử/ml.

3

TN 1.12

22

56

Chúng tôi đã chọn ra 7 chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12,

4

TN 3.4

11

22

TN 28.6 và TN 36.3 có nồng độ bào tử cao để xác định hoạt tính diệt côn

5

TN 4.4

11

33

trùng thử nghiệm.

6

TN 5.3

11

44

7

TN 6.12

22

56

8

TN 28.6

22

67

9

TN 36.3

22

55

Sinh khối của 7 chủng Bta được pha loãng nhiều lần, chúng tôi sử dụng
nồng độ 105 và 107 bào tử/ml để thử hoạt tính diệt sâu tơ và nồng độ 107 và
109 bào tử/ml diệt sâu xanh da láng.

Bảng 3.2 cho thấy 7 chủng Bta đều có hoạt tính diệt sâu xanh da láng. Sau 3
ngày thử nghiệm, 4 chủng TN1.12, TN6.12, TN28.6 và TN 36.3 có hoạt tính
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




diệt sâu xanh da láng trên 50% ở nồng độ 109 bào tử/ml. Các kết quả thử hoạt
tính diệt sâu này là cơ sở để chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.


Qua kết quả thử hoạt tính của các chủng Bta diệt 2 loại côn trùng thử
nghiệm có thể kết luận như sau:
- 7 chủng Bta nghiên cứu đều có hoạt tính diệt cả 2 loại côn trùng thử

Hoạt tính diệt sâu tơ
Với 7 chủng Bta đã lựa chọn được, chúng tôi thử nghiệm diệt sâu tơ, tỷ lệ

sâu chết được theo dõi trong 3 ngày và tính toán theo công thức Abbott. Kết quả
thử nghiệm được trình bày trong Hình 3.5 và Bảng 3.3.

nghiệm.
- Các chủng TN28.6,TN1.12, TN6.12, và TN36.3 đều có hoạt tính diệt cao
đối với cả 2 loại côn trùng thử nghiệm.
Các kết quả thử hoạt tính diệt sâu nói trên là cơ sở để chúng tôi tiến hành

các nghiên cứu tiếp theo về gene mã hóa độc tố tinh thể.
3.2 Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C
3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR
Nhóm gene cry1C mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng bộ
cánh vảy. Để phát hiện gene độc tố này chúng tôi sử dụng phương pháp PCR
nhằm khuếch đại một đoạn của gene cry1C của 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu

Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu

với cặp mồi đặc hiệu. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm đoạn gene cry1C với
cặp mồi đặc hiệu có kích thước 288 bp.

1

Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt
sau 3 ngày thử nghiệm
Tỷ lệ sâu chết (%)
Tên chủng
Ở nồng độ 105
Ở nồng độ 107
bào tử/ml
bào tử/ml
ĐC âm
0
0

2

ĐC dương (4J4)

77

93

3

TN 1.12

53

80

4

TN 3.4

63

83

5

TN 4.4

50

77

6

TN 5.3

53

80

7

TN 6.12

57

80

8

TN 28.6

60

87

9

TN 36.3

53

83

STT

Bảng 3.3 cho thấy tất cả các chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3,
TN 6.12, TN 28.6 và TN 36.3 đã lựa chọn đều có hoạt tính diệt sâu tơ tương đối
cao. Sau 3 ngày thử hoạt tính đa số các chủng đều cho tỷ lệ sâu chết lớn hơn
50%, ở cả hai nồng độ pha loãng. Đặc biệt tất cả các chủng trừ TN 4.4 khi thử ở

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.6).

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu
Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN 5.3,
TN 6.12, TN 28.6, TN 36.3, ĐC dương
M: DNA Marker

nồng độ 107 bào tử/ml đều có tỷ lệ sâu chết lên tới hơn 80%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Hình 3.6 cho thấy sản phẩm PCR có duy nhất một băng với kích thước
khoảng 300 bp. Như vậy các chủng thuộc dưới loài Bta nghiên cứu đều có thể
mang gene cry1C.
Để khẳng định các chủng này chắc chắn mang gene cry1C hay không,
chúng tôi chọn 2 chủng TN 6.12 và TN 28.6 để tách dòng đoạn gene cry1C và
xác định trình tự của chúng.

3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C
Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
Vector pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tự do đều thừa

Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA

ra 1 nucleotide T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A

sau khi nuôi cấy qua đêm. (1: Khuẩn lạc trắng, 2: khuẩn lạc xanh)

của sản phẩm PCR (Taq polymerase có hoạt tính gắn thêm 1 adenine vào đầu 3’

Các dòng vi khuẩn mọc được trên môi trường chứa ampicillin là các dòng

khi kết thúc PCR) vì thế chúng tôi chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách

đã được biến nạp vector pGEM-T Easy có gene kháng kháng sinh.

dòng.
Đoạn gene tính toán theo lý thuyết 288 bp thu được từ sản phẩm PCR của

Khuẩn lạc xanh xuất hiện là do promoter của lac - operon trên vectơ

2 chủng TN 6.12 và chủng TN 28.6 được gắn trực tiếp vào vector pGEM-T

pGEM-T Easy vẫn hoạt động bình thường nên β- galactosidase vẫn được tổng

Easy. Sản phẩm là vector tái tổ hợp pGEM-T Easy- cry1C-TN 6.12 và pGEM-

hợp và có khả năng chuyển hóa X-gal từ không màu sang màu xanh chàm.

Khuẩn lạc trắng xuất hiện là do hai nguyên nhân sau: nguyên nhân thứ

T Easy-cry1C-TN 28.6.

nhất có thể là do tế bào vi khuẩn nhận được vector tái tổ hợp mang đoạn DNA

Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α
Tiến hành biến nạp 2 vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E.coli
DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt như đã trình bày trong phần phương pháp.
Sau khi biến nạp, chủng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM-T Easycry1C được nuôi cấy trên môi trường LB + ampicillin + X-gal ở 37ºC qua đêm
thấy xuất hiện những khuẩn lạc màu xanh và trắng trên mặt thạch (Hình 3.7).

chèn vào giữa gene cấu trúc lacZ làm hỏng promoter của gene lac-operon trong
vector pGEM–T Easy nên trong quá trình sống nó không tạo ra β- galactosidase,
không có khả năng chuyển hoá được cơ chất X- gal có trong môi trường nuôi
cấy vi khuẩn vì vậy mà không có màu xanh. Nguyên nhân thứ hai có thể là do
promoter điều khiển hoạt động của gene mã hoá cho β - galactosidase bị hỏng,
dẫn đến không tổng hợp được β- galactosidase do đó mà vi khuẩn E. coli không
chuyển hoá được X-gal có trong môi trường nên tạo thành các khuẩn lạc màu
trắng.
Để biết các khuẩn lạc trắng có mang gene mong muốn hay không, kiểm
tra bằng cách cắt DNA plasmid và tinh sạch. Các dòng khuẩn lạc trắng được cấy
vào môi trường LB bổ sung ampicillin nuôi lắc qua đêm để tách plasmid.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Do có tới hai khả năng dẫn đến việc khuẩn lạc có màu trắng mà chúng tôi
phải tiến hành PCR colony với mồi đặc hiệu vector M13 để chọn ra các dòng

để kiểm tra sự có mặt của gene cry1C. Sản phẩm cắt được điện di trên gel
agarose (Hình 3.9).

khuẩn lạc mang vector có đoạn gene cry1C được chèn vào.

Hình 3.9. Điện di đồ phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc
Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13
1, 3: Sản phẩm PCR các dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 –p3, TN 6.12 –p7
2: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc trắng TN 6.12 –p5

Giếng 1,3. Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng của các plasmid tái tổ
hợp pGEM-T Easy– cry1C – TN28.6- p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7
Giếng 2. DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh (ĐC)
M:Thanh DNA chuẩn

M: Thang DNA chuẩn

Điện di đồ sản phẩm PCR cho thấy DNA của các khuẩn lạc trắng TN 28.6

Kết quả cho thấy DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi

–p3, TN 6.12–p7 có kích thước khoảng 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết

cắt bằng EcoRI tạo ra hai băng, băng lớn là vectơ tách dòng pGEM-T Easy

(là kích thước của đoạn gene cry1C cộng với kích thước của sản phẩm PCR của

có kích thước 3000 bp, băng nhỏ có kích thước gần 300 bp tương ứng với

vector bằng mồi M13). Trong khi đó ở khuẩn lạc trắng TN 6.12–p5 chỉ tổng hợp

sản phẩm PCR của đoạn gene cry1C. Trong khi đó, plasmid của khuẩn lạc

được đoạn gene có kích thước khoảng 300 bp (là kích thước của sản phẩm PCR

xanh sau phản ứng cắt chỉ cho 1 băng có kích thước khoảng 3000 bp (tương

của vector bằng mồi M13). Điều đó chứng tỏ các khuẩn lạc trắng TN 28.6–p3 và

ứng với kích thước của vector tách dòng).

TN 6.12–p7 đã được biến nạp vector mang gene cry1C.

Để xác định chắc chắn sự có mặt của gene cry1C trong các khuẩn lạc

Chúng tôi lấy các khuẩn lạc trắng đã sàng lọc bằng PCR colony và 1
khuẩn lạc xanh của từng chủng lần lượt cấy vào các lọ penicillin chứa 2ml môi

trắng chúng tôi khuếch đại đoạn gene cry1C từ khuôn là plasmid thu được với
cặp mồi đặc hiệu TYIC và TYIUNI (Hình 3.10).

0

trường LB bổ sung Amp (nồng độ 50 µg/ml) nuôi lắc ở 37 C qua đêm để tách

plasmid. DNA plasmid được kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Do trong vùng
MCS (multi cloning site) của vector pGEM–T Easy có chứa vị trí cắt của EcoRI
nằm ở 2 đầu đoạn DNA insert nên chúng tôi cắt DNA plasmid bằng enzyme này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên