Sinh học Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium Lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne SP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Ngô Thị Thu Hà

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM
LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU
RỄ MELOIDOGYNE SP.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Ngô Thị Thu Hà

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM
LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU
RỄ MELOIDOGYNE SP.

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS NGUYỄN HỮU PHÚC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2015

Thành phố Hồ Chí Minh - 2015

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Phúc, Th.s Dương Đức Hiếu,

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 1

những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình làm luận

MỤC LỤC .................................................................................................................... 2

văn này. Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn vi sinh đã giảng dạy, chỉ dẫn cho em trong suốt

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT ..................................................................................... 5

quá trình học tập.

MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 6

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị làm việc tạiviện Sinh học Nhiệt
Đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài.
Con xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã xin ra con nuôi nấng, dạy dỗ và luôn
động viên con trong những lúc con gặp khó khăn.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khoá vi sinh vật 22 đã cùng em
chia sẽ những khó khăn trong quá trình học tập.

1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................ 6
2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................... 6

3. Nhiệm vụ ......................................................................................................................... 7
4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................... 7
5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 7
6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7
7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 8
1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum ............................................... 8
1.1.1 Vị trí phân loại..........................................................................................................8
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu ..................................................................................................9
1.1.3. Đặc điểm sinh học ...................................................................................................9
1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum ..................................................................10
1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng
ở Việt Nam và trên thế giới .............................................................................................12
1.2. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ..................................................................... 13
1.2.1. Đặc trưng sinh học ................................................................................................13
1.2.2. Các loài quan trọng ...............................................................................................15
1.2.3. Cơ sở phòng trừ tuyến trùng .................................................................................15
1. 3. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi ............................ 22
1.3.1. Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi .....................................................................22
1.3.2. Môi trường nuôi cấy ..............................................................................................24
1.3.3. Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon ...................................................................24
1.3.4. Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen .................................................................24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 25
2. 1. Vật liệu ...................................................................................................................... 25
2. 2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................. 25
2. 3. Hóa chất .................................................................................................................... 25
1

2


2. 4. Môi trường ................................................................................................................ 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 60

2.4.1. Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường
potato glucose agar-PGA ) ..............................................................................................26

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 64

2.4.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh
khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth) 26
2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA) .26
2. 5. Các phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 26
2.5.1. Phương pháp phân lập ...........................................................................................26
2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng .........................................................27
2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi .........................................28
2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử ......................................28
2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng ..................................................................29
2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng .............................................................................29
2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái ............................................30
2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium
lilacinum trong điêù kiện in vitro ..................................................................................31
2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số
lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ...........................................................32
2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov ...................................................33
2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật.............................................33
2.5.11. Các phương pháp khác ........................................................................................33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 34
3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng ....................... 34
3.1.1. Phân lập .................................................................................................................34
3.1.2. Định danh ..............................................................................................................34
3.2. Kết quả định danh tuyến trùng .............................................................................. 38
3.3. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. trong diều
kiện in vitro ....................................................................................................................... 40
3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái loài Meloidogyne sp. trong
điều kiện in vitro..............................................................................................................40
3.3.2 Kết quả thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến trùng
Meloidogyne sp. trên cây chuối ......................................................................................42
3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh khối và số
lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ......................................................... 45
3.4.1 Ảnh hưởng của pH .................................................................................................45
3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ và nguồn Cacbon .......................................................49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 59
3

4


BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

C: cacbon

Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp lâu đời. Hàng năm chúng ta cung ứng rất

N: nitơ

nhiều mặt hàng nông sản cho nhu cầu thương mại trong nước và còn xuất khẩu sang các

PGA: potato glucose agar

nước. Các mặt hàng nông sản xuất khẩu tiêu biểu như: gạo, cà phê, cao su hay những mặt
hàng nông sản trái cây với sản lượng lớn góp phần làm giàu cho nền kinh tế đất nước.
Tuy nhiên, sản lượng nông sản thu hoạch hàng năm không ổn định có khi thất thoát.
Nguyên nhân gây ra thực trạng trên có thể là do ảnh hưởng của khí hậu, thiên tai và đặc biệt
là dịch bệnh.
Dịch bệnh ở cây trồng do các tác nhân sinh học gây ra như: virut, nấm, tuyến
trùng...thì trong số các đối tượng đó vấn đề bệnh do tuyến trùng gây ra chưa được nghiên
cứu nhiều dẫn đến việc phòng bệnh gặp nhiều khó khăn.
Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ, tuy nhiên khi mật độ
ký sinh lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng có thể gây chết thực vật.
Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5 % sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng
ký sinh đối với cây trồng nông nghiệp ước tính là hàng trăm tỷ USD mỗi năm.
Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật đang phát triển,
hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tiểu
biểu như nhóm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. ký sinh ở rễ một số cây như cà phê,
hồ tiêu, cà chua, cà rốt... gây ra những tổn thất đáng kể đặc biệt là những mặt hàng nông sản
thế mạnh như cà phê, hồ tiêu.
Để phòng trừ bệnh tuyến trùng rễ trên các đối tượng cây trồng trên có các biện pháp
như: dùng các tác nhân cơ học, hoá học, sinh học...Trong số các biện pháp trên thì biện pháp
phòng trừ tuyến trùng bằng các tác nhân sinh học như dùng các loại vi khuẩn Pasteuria
penetrans, nấm (Nematoctonus concurrens và N. haptocladus, Purpureocillium lilacinum...)
đang rất được quan tâm.

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân
lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Góp phần nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.bởi các
tác nhân sinh học là nấm Purpureocillium lilacinum.
5

6


3. Nhiệm vụ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Phân lập nấm Purpureocillium lilacinum từ côn trùng bị bệnh.
- Phân loại đến loài chủng nấm Purpureocillium lilacinum.
- Phân loại đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp.
- Thử nghiệm in vitro khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm
Purpureocillium lilacinum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển sinh khối và hình
thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum.
4. Đối tượng nghiên cứu

1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum
1.1.1 Vị trí phân loại
− Giới (Kingdom) : Nấm
− Ngành (Division): Ascomycota
− Lớp (Class): Sordariomycetes
− Bộ (Order): Hypocreales
− Họ (Family): Ophiocordycipitaceae

- Chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ côn trùng bị bệnh.
- Tuyến trùng Meloidogyne sp. phân lập từ đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng.

− Chi (Genus) : Purpureocillium (theo Luangsa-ard, Hywel-Jones, Houbraken & Samson
(2011))
− Loài: Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Hou- braken, Hywel-Jones &

5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: Công ty TNHH Gia Tường, chi nhánh số 7 đại lộ Độc Lập, khu công nghiệp
Sóng Thần 1, huyện Dĩ An , tỉnh Bình Dương.
Viện sinh học nhiệt đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP. 6, P. Linh Trung, Quận Thủ Đức,

Samson (2011)
Tên đồng nghĩa: Paecillium Luangsa-ard, Hywel-Jones & Samson (2007); Penicillium
lilacinum Thom (1910); Penicillium amethystinum Wehmer (1923)

TP.HCM.
Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2012 đến tháng 9/2013
6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu

Spicaria rubidopurpurea Aoki (1941) Purpureocillium lilacinum (Thom) Samson (1974).
Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi đơn loài có

Góp phần tìm hiểu về đặc điểm sinh học,điều kiện nuôi cấy và khả năng diệt tuyến
trùng bướu rễ Meloidogyne sp. của Purpureocillium lilacinum.

chứa loài duy nhất là Purpureocillium lilacinum, là loài nấm sợi hoại sinh phổ biến. Nó
đựơc phân lập từ một loạt các môi trưòng sống bao gồm đất trồng và đất bỏ hoang, rừng,
đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông, bùn cặn nứơc thải và côn trùng. Nó cũng đã đựơc tìm

7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu
Trên cơ sở những kết quả thu được trong quá trình khảo sát khả năng phòng trừ tuyến
trùng bướu rễ chủng vi sinh Purpureocillium lilacinum từ đó ứng dụng vào sản xuất các chế
phẩm đặc trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. cho cây trồng.

thấy trong trứng giun tròn, tuyến trùng nang. Ngoài ra nó còn đựơc phát hiện thường xuyên
trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng. Chúng có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng từ
8-38 oC, và nhiệt độ sinh trưỏng tối ưu trong khoảng 26-30 oC. Nó cũng có khả năng chịu
đựng pH rộng 2-10 và có thể phát triển trên nhiều loại bề mặt khác nhau.
Purpureocillium lilacinum đựơc cho là có tiềm năng sử dụng để kiểm soát sự phát
triển của tuyến trùng rễ [16],[19].

7

8


1.1.2. Lịch sử nghiên cứu

Hình 1.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên trái), cấu tạo vi thể nấm

Các loài đựơc mô tả bởi nhà nấm học người Mỹ Charles Thom vào năm 1910 với tên
gọi Penicillium lilacinum.

Purpureocillium lilacinum (hình bên phải) [36]
1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum
a. Tác nhân kiểm soát tuyến trùng

Vào năm 1974 Charles Thom chuyển các loài này thành Paecilomyces. Những ấn

phẩm trong thập niên 20 chỉ ra chi Paecilomyces không phải là đơn ngành mà có quan hệ
mật thiết với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis and Nomuraea atypicola.

Purpureocillium lilacinum là một loài nấm bông phổ biến với phạm vi phân bố rộng
trên toàn thế giới (Samson, 1974) và đã được thử nghiệm rộng rãi nhất cho sự kiểm soát của
bệnh sần rễ và u nang tuyến trùng.

Chi mới Purpureocillium được tạo ra để tổ chức các đơn vị phân loại. Tên gọi chung
này đề cập đến các bào tử tím được tạo ra bởi nấm này.

Purpureocillium lilacinum sử dụng chủ yếu trong điều kiện nhiệt đới, ví dụ như, ở
Philippines (Jatala, 1986) và Cộng hòa Nam Phi (Neethling, 2002). Loài này có hiệu quả
chống lại các loài tuyến trùng khác nhau gây bệnh thực vật, và chủ yếu lây nhiễm trứng và

1.1.3. Đặc điểm sinh học

con cái tuyến trùng (Amancho và Sasser năm 1995; Borisov năm 1998; Pandey và Trivedi,

Purpureocillium lilacinum tạo thành một sợi nấm dầy đặc làm phát sinh cành bào tử phân
sinh. Phần cuối của thể bình mang những bào tử được xếp thành chuỗi. Bào tử nảy mầm khi

1990; Silva và cộng sự, 1992;. Sosnowska năm 2001; Zaki, 1994). Wang và cộng sự.
(2001).
Quan sát một số nhiễm trùng giai đoạn ấu trùng ở Đông Trung Quốc có

có độ ẩm và chất dinh dưỡng thích hợp.

sự khác biệt lớn trong khả năng gây bệnh giữa các chủng Purpureocillium lilacinum
Khuẩn lạc trong môi trường thạch Malt phát triển nhanh, đạt đuờng kính 5-7cm trong
vòng 14 ngày ở 15oC, bao gồm những sợi nấm khí sinh ban đầu có màu trắng nhưng khi

(Rodriguez- Kabana et al., 1984). Ở Ba Lan, một dòng nội địa của loại nấm này loài được
nghiên cứu như một tác nhân sinh học tiềm năng chống lại

hình thành bào tử thì có sự thay đổi sắc thái thành màu đỏ rượu vang.
Sợi dinh dưỡng có thành bao trơn, trong suốt, kích thứơc 2.5-4 mm. Cuống sinh bào tử
phát sinh từ sợi ký sinh hoặc phát sinh từ sợi nấm khí sinh. Cuống sinh bào tử dài khoảng
400-600 μm.

tuyến trùng sần rễ trong nhà kính (Sosnowska, 2003).
Hiện nay, Purpureocillium lilacinum là loài nấm chỉ có mục đích thương mại để
kiểm soát tuyến trùng, sâu bệnh ở châu Âu, và chủng nấm 251 thương mại được đăng ký để
bán ở một số nước (Atkins et al., 2005). Bởi vì nó được phân loại như

một

microbiopesticide [23].

Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu giống như một cái cổ. Bào tử
trong chuỗi có nhiều hình dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn đến hơi nhám.

Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng:
Trứơc khi xâm nhiễm vào trứng tuyến trùng, Purpureocillium lilacinum áp sát vào

Không có bào tử chống chịu [19].

bề mặt trứng và trở nên sát gần với trứng. Purpureocillium lilacinum sản xuất những tế bào
chuyên biệt điển hình để lây nhiễm ở khắp nơi trên bề mặt trứng của tuyến trùng. Những tế
bào chuyên biệt tương tự như những mấu lồi ở phần cuối của một sợi nấm giúp áp sát vỏ
trứng. Sau khi sợi nấm xâm nhập vào vỏ trứng chúng nhanh chóng phá huỷ ấu trùng bên

trong sau đó sợi nấm tạo thành cuống sinh bào tử ra phía ngoài xâm nhiễm các trứng liền kề
[19].
9

10


1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến
trùng ở Việt Nam và trên thế giới
a. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thế giới
Một số chế phẩm diệt tuyến trùng được sản xuất từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị
trường thế giới
Hình 1.2: Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bởi nấm
Purpureocillium lilacinum [42]

Hình 1.3: Trứng của tuyến trùng Meloidogyne javanica bị nhấn chìm bởi sợi nấm
Purpureocillium lilacinum
Hình 1.4: Một số chế phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị
trường thế giới [40]

b. Sản xuất một số enzym
Nhiều enzym đựơc sản xuất bởi Purpureocillium lilacinum đã đựơc nghiên cứu như: serine
protease một loại enzym chống lại trứng của tuyến trùng Meloidogyne hapurpureocillium
lilacinuma: protease và chitinase có thể làm suy yếu vỏ trứng của tuyến trùng [16],[19].

b. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum ở Việt Nam
+ Tuyến trùng: Sử dụng nấm đối kháng Paecilomyces (Palila 500 WP) liều lượng theo
khuyến cáo, hoạt chất Cytokinin (Sincosin + Agrispon) 0,2%; Etobon 0,56 SL, tưới gốc

c. Kháng khuẩn

nồng độ: 0,125 ml/lít nước; 3.000-5.000 lít nước/ha, Vimoca 10G rải quanh gốc (30g/gốc
Purpureocillium lilacinum khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách

tưới đẫm nước).

được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins. Leucinostatins là một peptide trung tính
với cấu trúc gồm: α-aminoisobutyric acid, L-leucine, β-alanine và theo sau bởi 3 acid amin
bất thường (L-threo- β-hydroxy leucine, 2-amino-2-hydroxy-4-methyl-8 oxodecanoicacid và
cis-4-methyl-L-proline (theo Mori et al. 1982).Leucinostatins có 6 loại đã được môt tả là A,
B, C, D, E, F. Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và

PALILA : ( Purpureocillium lilacinum 500 triệu bào tử/g)
Sản phẩm đặc trị tuyến trùng, ngăn ngừa bênh chết nhanh chết chậm trên tiêu và nhiều loại
cây trồng khác, làm khoẻ lại bộ rễ và hút dinh dưỡng tốt hơn.

nhiều loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến

Đặc biệt thử nghiệm hiệu quả trên cao su, cà phê, hồ tiêu, đã khảo nghiệm và chất lượng

trùng không có sự tham gia của loại độc tố này [9].

đuợc khẳng đinh tại Đơn Dương- Đức Trọng, Chư sê, Daksong….

11

12


Trên cây trồng: cải bắp ( sú) , hồ tiêu, cà phê…. [40].

nan điểm xâm nhập cho các IJ2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi IJ2 tiếp xúc
với bề mặt rễ chúng thường dùng kim hút châm chích và xâm nhập ngay vào trong rễ. Sự

1.2. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.

xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ. Sau khi xâm nhập vào trong rễ

Tuyến trùng sần rễ (root-knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan
trọng nhất. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp thế giới và ký sinh ở hầu hết các cây
trồng quan trọng ở các vùng khí hậu khác nhau. Chúng gây nên giảm sản lượng thu hoạch
cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Hiện nay đã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh
thuộc chi này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M.
arenaria, M. javanica và M. hapurpureocillium lilacinuma. Đây là các loài phân bố rộng và
gây hại lớn ở các vùng nông nghiệp trên thế giới. Ngoài ra một số loài khác mặc dù cũng
gây hại quan trọng nhưng chúng chỉ gây hại ở 1-2 cây trồng và phân bố hẹp [18].
1.2.1. Đặc trưng sinh học

tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến
trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ và bắt đầu quá trình dinh dưỡng. Khi dinh
dưỡng tuyến trùng cắm phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho
quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến
trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tạo thành trong vùng
nhu mô hoặc vùng mô phloem, nơi đầu tuyến trùng. Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao
của tế bào, chúng được tạo ra và duy trì bằng tuyến trùng ký sinh. Cùng với sự hình thành tế
bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần
rễ (gall hoặc root-knot). Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến
trùng xâm nhập. Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng IJ2 xâm nhập và

Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (còn

loài tuyến trùng ký sinh [5].

gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng có thể nằm bên
trong nốt sần. Sau quá trình phát triển phôi thai, trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1 ngay
bên trong trứng. Lần lột xác thứ nhất xảy ra trong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2.
Trứng nở ra ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (infective juvenile = IJ2) không cần có sự kích
thích của rễ thực vật.

Hình 1. 6: Chu kỳ sống của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.
/>Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau khi xâm nhập vào rễ cũng bắt đầu một cách
nhanh chóng quá trình thay đổi về hình thái: cơ thể chúng phình ra và các nội quan cũng dần
được phát triển. Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ IJ2 trải qua 3 lần lột xác và
Hình 1.5: Tuyến trùng cái Meloidogyne sp. và khối trứng

đạt đến trưởng thành. Lần lột xác cuối cùng là sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng

/>
cuộn gấp khúc trong IJ4 chúng được nở ra và có dạng hình giun, trong khi đó con cái có

Chuẩn bị xâm nhập vào rễ IJ2 tập trung dọc theo các tế bào non ngay tại phía sau

dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh. Tuyến trùng Meloidogyne spp. sinh sản bằng 2

vùng đỉnh rễ. IJ2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các rễ bên mọc ra tạo

cách: một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài

13

14


sinh sản lưỡng tính (parthenogenessis) không cần con đực. Đối với các loài hữu tính thì con
đực cặp đôi ngay với con cái sau lần lột xác cuối cùng.
Tuyến trùng sần rễ có quan hệ mật thiết với các điều kiện môi trường trong đó cây
chủ, nhiệt độ và các yếu tố sinh thái đất như độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, độ kiềm...
Có thể phân biệt 2 nhóm sinh thái liên quan đến nhiệt độ là nhóm ưa nóng (các loài điển
hình như M. incognita, M. javanica, M. exigua) và nhóm ưa lạnh (các loài điển hình như M.
hapla, M. chitwooodi và có thể cả M. naasi) liên quan đến pha chuyển hóa lipid của tuyến
trùng xảy ra ở 10 °C. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với cây trồng thường có liên quan
đến loại đất kiềm, là môi trường tạo ra các sốc bất lợi (stress) cho thực vật.

Nội dung phòng trừ tuyến trùng bao gồm: i) Giết tuyến trùng bằng làm mất nguồn
dinh dưỡng để tuyến trùng chết đói; ii) Giết trực tiếp tuyến trùng bằng hóa chất hoặc bất kỳ
một kỹ thuật khác được áp dụng trước khi gieo trồng; iii) Sử dụng các hóa chất một cách
hợp lý để chống lại tuyến trùng trên đồng ruộng có cây trồng [18].
a. Ngăn ngừa
Ngăn ngừa hoặc phòng ngừa là giải pháp đầu tiên quan trọng nhất trong quản lý
tuyến trùng, vì nó là biện pháp đơn giản để giải quyết tuyến trùng trước khi chúng trở thành
vật hại được xác định trên đồng ruộng.
Ngăn ngừa sự phát tán của tuyến trùng có thể cần được xem xét ở các mức độ khác

1.2.2. Các loài quan trọng

nhau: trang trại (như một đơn vị sản xuất), quốc gia và quốc tế. Ở quy mô quốc tế, các vấn

M. incognita: là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau và phân

đề kiểm dịch thực vật quan trọng được quản lý bằng các công ước kiểm dịch thực vật [18].

bố trên một vùng địa lý rộng từ 40 vĩ độ bắc đến 33 vĩ độ nam trên phạm vi toàn thế giới.
Đây cũng là loài ký sinh gây hại phổ biến nhất trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng ký

b. Luân canh

sinh gây hại phổ biến nhất ở: tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ Cà, họ Đậu,

Luân canh được coi là biện pháp quản lý tuyến trùng đơn giản. Tuyến trùng thực vật

chuối..

là những ký sinh bắt buộc, chúng cần một vật chủ cho sự phát triển và nhân nuôi số lượng.

M. javanica: là loài phổ biến thứ 2 sau loài trên và có dải phân bố tương tự. Đây là loài có
khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3-6 tháng. Ở Việt Nam, loài này ký
sinh tương đối phổ biến sau loài M. incognita, gây hại chính cho các cây đậu phộng, chuối.

Mỗi loài tuyến trùng thực vật có một phổ vật chủ, phổ này dù có thể là rộng nhất nhưng
không bao gồm tất cả các loài cây trồng. Mật độ tuyến trùng tăng ở các cây chủ thích hợp và
suy giảm ở cây chủ không thích hợp. Trong luân canh cây trồng để quản lý các cây trồng
mẫn cảm với một loài tuyến trùng đã được trồng luân canh với các cây kháng hoặc miễn

M. arenaria: là loài phổ biến thứ 3 sau, phân bố khắp thế giới như các loài M. incognita và

nhiễm tuyến trùng. Thường các cây trồng kinh tế là các cây mẫn cảm với tuyến trùng và các

M. javanica. Đây cũng là loài ký sinh gây hại tương đối phổ biến ở Việt Nam trên các cây

cây trồng luân canh là các cây kém kinh tế hơn. Sự luân canh cần phải trồng như thế nào để

họ đậu.

mật độ quần thể tuyến trùng ở mức thấp nhất khi trồng cây trồng chính. Các cây luân canh

M. graminicola: ký sinh gây hại chính cho lúa cạn ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Đông
Nam Á, Nam Phi, Mỹ). Ở ta loài này ký sinh tương đối phổ biến trên lúa cạn (giai đoạn lúa
non, khi chưa ngập nước) ở đồng bằng sông Cửu Long [18].

là cây miễn nhiễm hoặc có khả năng chống chịu cao với một hoặc một vài loại tuyến trùng
nào đó. Khả năng miễn nhiễm của chúng có thể là miễn nhiễm tự nhiên [18].
c. Biện pháp canh tác
Tùy từng loại tuyến trùng ký sinh và loại cây trồng mà có thể lựa chọn, điều chỉnh

1.2.3. Cơ sở phòng trừ tuyến trùng
Mục tiêu phòng trừ là: giảm mật độ quần thể tuyến trùng ban đầu và giảm số cây

một số biện pháp canh tác như: gieo trồng sớm, làm khô ruộng, làm ngập nước, bón chất
hữu cơ... cũng có thể giảm mật độ tuyến trùng và tránh một số tác hại gây ra do tuyến trùng.

trồng bị nhiễm tuyến trùng.
15

16


Làm ngập nước: nồng độ O2 giảm, CO2 tăng do sự giảm vi khuẩn hiếu khí, đồng thời
trong đất ngập nước cũng xảy ra các phản ứng như: phản ứng nitrat, tích luỹ chất amoni,

nhiệt vi sóng, đốt đồng sau khi thu hoạch, khử trùng nguyên liệu gieo trồng bằng nhiệt,

chiếu xạ... [18].

giảm sắt, mangan và sunfat, tăng các loại acid hữu cơ, methane hydrosulfite.
e. Chọn giống kháng và giống chống chịu bệnh
Bón phân hữu cơ: sự phân huỷ chất hữu cơ sẽ giải phóng các hợp chất gây độc cho
tuyến trùng ký sinh. Đặc biệt, sự phân giải các chất phế thải thực vật sẽ giải phóng các acid
hữu cơ như: acid acetic, propionic, butyric. Nồng độ các chất này có thể lưu giữ một vài
tuần trong đất và có thể giết chết một vài loại tuyến trùng ký sinh, nhưng không độc đến các
nhóm tuyến trùng sống tự do trong đất. Phân từ động vật nuôi, bùn cống rãnh, chất thải
thành phố, rơm rạ và các phế thải sau khi thu hoạch đều có thể sử dụng làm chất bổ sung

- Trồng các cây chống chịu tuyến trùng ký sinh có thể đáp ứng cho một phương pháp lý
tưởng là duy trì mật độ quần thể tuyến trùng dưới ngưỡng gây hại. Các cây trồng kháng
tuyến trùng có một số ưu điểm vượt trội hơn các phương pháp khác cho mục tiêu quản lý
tuyến trùng hại: (a) có thể hoàn toàn ngăn ngừa sự sinh sản của tuyến trùng, không giống
một vài phương pháp khác như phòng trừ hóa học; (b) sự áp dụng chúng cần ít hoặc không
cần công nghệ và hiệu quả kinh tế; (c) cho phép luân canh trong thời gian ngắn; (d) không

vào đất để tăng hàm lượng chất hữu cơ.

để lại dư lượng độc.

Ở Nigieria, bón vỏ khô của quả ca cao và vỏ gọt sắn cho phòng trừ tuyến trùng gây

- Ngoài tính kháng (resistance) với tuyến trùng ký sinh, cây kháng cũng cần phải chống

bướu rễ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với sử dụng thuốc hoá học hoặc bón 3 loại

chịu (tolerance); những cây không chống chịu sẽ phải chịu thiệt hại nặng nề nếu trồng trên

phân hoá học NPK ở liều lượng cao. Ở xí nghiệp Liên hiệp hồ tiêu Tân Lâm Quảng Trị, bón

đất nhiễm tuyến trùng nặng. Các cây chống chịu mà không kháng có xu hướng tăng mật độ

20 kg phân chuồng ủ hoai mục/ gốc tiêu làm giảm 45-60% tuyến trùng bướu rễ

quần thể tuyến trùng đến số lượng tuyến trùng cao có thể dẫn đến gây hại [18].

Meloidogyne incognita so với đối chứng [5].
f. Biện pháp hóa học
Một số cây trồng và cây hoang dại cũng đã và đang được dùng làm thuốc thảo mộc
phòng trừ tuyến trùng như cây xoan Ấn Độ, hạt cây củ đậu, rễ cây ruốc cá, hạt và lá cây sầu
đâu rừng ở Việt Nam do chúng chứa các hợp chất như phenolic, glucid hoặc các alkaloid…
có tác dụng gây độc tuyến trùng và một số sâu hại khác.Ở Tân Lâm Quảng Trị với liều dùng
40-60g HBJ hoặc LBJ ( chế phẩm dạng bột chế biến từ quả hoặc lá sầu đâu rừng)/m2 diệt
75-98% tuyến trùng ký sinh (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh, 1993; Nguyễn Thị
Yến , 1997) [5].

Từ những năm 1950 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử dụng
rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật. Tuy nhiên, ngoài những mặt có lợi
không thể chối cãi trong việc phòng trừ sâu bệnh hại tăng sản lượng cây trồng, việc sử dụng
không hợp lý các chất hóa học cũng gây những hậu quả xấu đối với môi trường và sức khỏe
cộng đồng. Đặc biệt, thuốc hóa học cũng làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng
thuốc. Mặc dù hiện nay đã sản xuất được nhiều loại thuốc có hiệu quả tốt hơn, chuyên hóa
hơn đối với việc phòng trừ tuyến trùng và cũng ít độc hại hơn đối với môi trường. Tuy nhiên
cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong những trường hợp cần thiết được khuyến cáo dưới

d. Các biện pháp vật lý
Lợi ích lớn của biện pháp vật lý phòng trừ tuyến trùng là không để lại dư lượng, độc
tố như thuốc hóa học. Bản chất của các biện pháp vật lý là phòng trừ tuyến trùng bằng xử lý

nhiệt. Tuyến trùng nhìn chung rất mẫn cảm với nhiệt. Hầu hết tuyến trùng chết ở nhiệt độ
cao trên 60 °C. Phương pháp vật lý được áp dụng rộng rãi bằng nhiều biện pháp khác nhau
như: xử lý khói, dùng hơi nước nóng xử lý đất, phơi nắng, khử trùng bằng nhiệt điện, bằng

17

đây và đặc biệt phải sử dụng chúng một cách hợp lý [18].
g. Biện pháp sinh học
Tuyến trùng ký sinh thực vật cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất
như virus, vi khuẩn, nấm, Ricketuyến trùngsia, đơn bào, Tardigrade, Tuberlaria,
Enchytraeid, ve bét, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch
18


của tuyến trùng có tầm quan trọng rất lớn trong việc làm giảm mật độ quần thể để hạn chế
tác hại do tuyến trùng ký sinh gây ra cho cây trồng.
Có 2 dạng phòng trừ sinh học (PTSH): PTSH nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác
nhân sinh học để đưa ra đồng ruộng và PTSH tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch
sẵn có trong tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng. Hiện tại, biện pháp phòng trừ sinh học
chưa thay thế thuốc hóa học do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và
không đáp ứng đầy đủ nhu cầu sản xuất. Tuy nhiên, PTSH rất phù hợp trong hệ thống quản
lý tổng hợp tuyến trùng.
Các tác nhân sinh học sử dụng trong phòng trừ sinh học
Hiện nay, kiểm soát sinh học đựơc xem như là một phưong pháp thích hợp nhất cho

Hình 1.7: A. Nội bào tử của vi khuẩn Pasteuria penetrans, B và C: Cơ chế tiệu diệt

việc kiểm soát tuyến trùng rễ. Một số tác nhân kiểm soát sinh học tối ưu như nấm bông
trong đất đựơc cho là hứa hẹn.

tuyến trùng của vi khuẩn Pasteuria penetrans [43]
Nấm bẫy tuyến trùng: đây là các loài nấm có khả năng tạo ra những mạng bẫy dạng lưới

Vi khuẩn Pasteuria penetrans: là loại vi khuẩn ký sinh bắt buộc ở một số tuyến trùng ký

dính để bắt giữ và ăn thịt tuyến trùng. Hầu hết các loại nấm bẫy được xem như không có

sinh thực vật như các loại ấu trùng của Melodogyne spp., Pratylenchus spp. Tuyến trùng dễ

khả năng tạo khuẩn lạc nhanh, khả năng cạnh tranh thấp trong môi trường hoại sinh và

dàng bị nhiễm với vi khuẩn này ở trong đất khi chúng tiếp xúc với nội bào tử. Vi khuẩn

không sẵn sàng ổn định khi bổ sung vào trong đất. Tuy nhiên, khi bổ sung một nguồn

Pasteuria penetrans rất độc và có thể giảm mật độ quần thể tuyến trùng Melodogyne trong

carbohydrate vào đất thay cho tuyến trùng sẽ giúp nấm mọc nhanh hơn. Các loài nấm bẫy

chậu đến 99 % trong vòng 3 tuần. Vi khuẩn Pasteuria penetrans có thể tồn tại một số năm

khác nhau có khả năng bắt tuyến trùng khác nhau, nhưng hấu hết chúng đều ít chuyên hóa

trong đất được làm khô bằng khí mà không hề suy giảm khả năng sống và bị ảnh hưởng rất

đối với đối tượng loài tuyến trùng mồi, và thông thường một khi các bẫy được tạo ra hầu hết

ít bởi các điều kiện đất hoặc thuốc phòng trừ tuyến trùng.

các dạng tuyến trùng đều bị bắt bẫy. Do hoạt động bẫy hạn chế và ít chuyên hóa trong tự

nhiên nên những loại nấm này khó khăn để xác lập vai trò của một tác nhân phòng trừ sinh

Vi khuẩn Pasteuria penetrans ký sinh bắt buộc với một số nhóm tuyến trùng ký sinh

học.

thực vật. Chúng bám dính trên bề mặt vỏ cutin khi tuyến trùng ở trong đất. Khi tuyến trùng
xâm nhiễm vào cây để dinh dưỡng, bào tử của Pastueria penetrans nảy mầm xâm nhập qua
vỏ cutin giải phóng khuẩn lạc sinh sôi nảy nở khắp cơ thể tuyến trùng. Khi bổ sung đất đã
nhiễm bào tử Pasteuria penetrans vào đất chứa Pratylenchus scribneri làm giảm 53% tuyến
trùng trong đất và 63% tuyến trùng rễ đậu [18].

19

20


Hình 1.9: Nấm nội ký sinh tuyến trùng Nematoctonus sp. [34]
•

Nấm nội ký sinh trứng tuyến trùng có khả năng ký sinh tuyến trùng cái và trứng của một

Hình 1.8: Nấm bẫy tuyến trùng

số tuyến trùng bào nang và tuyến trùng sần rễ trước khi ấu trùng nở ra. Tuy nhiên, những

Nấm nội ký sinh tuyến trùng: đây là các loài nấm có khả năng dính và xâm nhập vào cơ

nấm này không có khả năng giết ấu trùng dạng hoạt động trong đất. Hầu hết trứng tuyến

thể tuyến trùng để ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng. Một số loài nấm như Nematoctonus

trùng đều mẫn cảm hơn với sự xâm nhập của nấm trước khi phát triển ấu trùng tuổi 2.

spp., Meria coniospora đã được thử nghiệm và cho kết quả nhất định. Có thể phân biệt 2

Nếu con cái bị nấm ký sinh thì khả năng sinh sản của chúng sẽ bị giảm. Vì vậy, những

nhóm nấm nội ký sinh là:

nấm này rất hiệu quả nếu chúng có khả năng ký sinh con cái và khối trứng sớm sau khi
chúng được nở ra trong rễ. Các nấm ký sinh trứng là ký sinh tạm thời nan chúng có thể

•

Nấm nội ký sinh cơ thể tuyến trùng sản xuất ra các bào tử nhỏ các bào tử này cũng chứa

được nhân nuôi in vitro và sự tồn tại của chúng trong đất có thể không phụ thuộc vào sự

các năng lượng nhỏ để bắt đầu quá trình khuẩn lạc trong đất. Từ đây các bào tử duy trì

hiện diện của truyến trùng [18].

sự ưu thế cho đến khi chúng dính bám vào tuyến trùng đi qua. Sau đó bào tử nảy mầm
và xâm nhập qua vỏ cutin tạo khuẩn lạc trong cơ thể vật chủ tuyến trùng. Loài
Nematoctonus concurrens và N. haptocladus thuộc nhóm nấm này nhưng có hiệu lực
không lớn đối với tuyến trùng. Loài Hirsutella rhossiliensis cũng có liên quan với tuyến
trùng Criconemella xenopurpureocillium lilacinumax. Tuy nhiên, hiện tại rất ít kết quả
áp dụng thực tế.

1. 3. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi
1.3.1. Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi
− Lên men bề mặt là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc
môi trường bán rắn.
Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường dịch thể (dùng cho vi sinh vật hiếu khí): môi
trường ở đây có thể là những nguồn dinh dưỡng khác nhau như nước đường hoá, nước bã
rượu, dịch kiềm sunfit được pha loãng theo những tỷ lệ cần thiết, sau đó bổ sung thêm
nguồn nitrogen, nguồn khoáng… khi cho môi trường vào thiết bị lên men phải bảo đảm cột
môi trường có chiều cao tử 3-5cm, bề mặt thoáng, rộng.
Phương pháp lên men này yêu cầu thiết bị đơn giản, nhưng đòi hỏi diện tích sử dụng lớn,
khó tự động hoá quy trình sản xuất.

21

22


Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường bán rắn hay lên men bán rắn (có thể sử dụng cho vi

1.3.2. Môi trường nuôi cấy

sinh vật hiếu khí và kị khí)
Ở phương pháp này nguyên liệu thường dùng là:

Trong quá trinh nuôi cấy nhân giống vi sinh vật môi trường nuôi cấy cần các nguyên
tố đa lượng (C, H, O, N, S, P, Mg) và một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng (Mn, Bo, Co,

• Các loại hạt: thóc, gạo nếp, đậu tương…

Cu…).

• Các loại manh: mảnh sắn, mảnh bắp…

Trong số các nguyên tố đa lượng thì C và N có ảnh hưởng rất lớn đến sinh khối và số lượng

• Các loại phế liệu: bã mía, bã thơm, trấu, cọng rơm, ra…

bào tử của nấm sợi [7]

• Ngoài các nguyên liệu nói trên, để làm môi trường lên men người ta cần trộn các chất
dinh dưỡng khác (các hợp chất có N, khoáng hoà tan trong nước). Nguyên liệu sau
xử lý đảm bảo độ ẩm 60-75% sẽ được tãi ra nia, khay có độ dày 2-3cm (đối với vi
sinh vật hiếu khí hay ủ đống, ủ kín (dùng cho vi sinh vật kị khí).
Đối với các vi sinh vật hiếu khí cần có hệ thống quạt thổi khí vô trùng.
Trong lên men bán rắn, ngoài yêu cầu nguyên liệu môi trường có độ ẩm 60-75%, cần
phải đảm bảo lên men trong điều kiện bầu không khí có độ ẩm 95-100%.
− Lên men chìm
• Lên men chìm (dùng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí). Khi lên men chìm vi sinh
vật được nuôi cấy ở môi trường dịch thể, chúng phát triển theo chiều đứng của cột
môi trường.

1.3.3. Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon
Cacbon tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào, từ tế bào chất đến thành tế bào,
từ phân tử enzyme đến acid nucleic. Vì vậy hợp chất carbohydrat có ý nghĩa hàng đầu đối
với sự sống của tế bào vi sinh vật.
Nguồn carbohydrat vi sinh vật sử dụng được rất phong phú. Từ dạng tinh khiết
(glucose, saccharose…) đến dạng tạp chất (rĩ đường, dịch kiềm sunfite…). Một số nhóm vi
sinh vật sử dụng được cả khí thiên nhiên, hydrocacbon (methane, alkan…).
1.3.4. Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen
Nitrogen tham gia vào các thành phần cấu trúc nên tế bào vi sinh vật, giúp tế bào

hoàn thiện được mọi chức năng của hoạt động sống. Nguồn nitrogen là nguồn dinh dưỡng

• Trong quá trình lên men này cần liên tục theo dõi và thực hiện một số công việc sau:
• Thực hiên quá trình khuấy đảo và sục khí: nhằm đảm bảo cung cấp O 2 đầy đủ theo

quan trọng không kém gì nguồn cacnon.
Nitrogen được cung cấp cho tế bào dưới nhiều dạng khác nhau:
Dưới dạng các hợp chất vô cơ và hữu cơ khá thuần khiết như: NH4+, NO3-, pepton các loại,

nhu cầu của từng loại vi sinh vật.
• Điều chỉnh pH của môi trường lên men: mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giá trị
pH nhất định của môi trường nuôi cấy.
• Tuy nhiên trong quá trình lên men vi sinh vật lại tạo ra một số chất có tính acid hay
kiềm khiến pH của môi trường không còn thích hợp cho hoạt động sống của vi sinh

các amino acid.
Trong lên men công nghiệp người ta thường sử dụng nguồn nitrogen dưới dạng sản
phẩm thô gọi là nguồn nitrogen kĩ thuật bao gồm các loại sau: dịch thuỷ phân nấm men, bột
đậu nành, cao ngô, khô lạc hay bánh dầu phông, nước mắm, nước tương [7].

vật. Do đó phải điều chỉnh pH bằng các dung dịch như NaOH, HCl, NH4OH, urê
…hay hay bổ sung dung dịch đệm để ổn định pH của môi trường.
• Theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ của môi trường lên men: cũng như độ pH của môi
trường, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh
vật và hiệu quả lên men [7].

23

24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 4. Môi trường
2.4.1. Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường

2. 1. Vật liệu

potato glucose agar-PGA )

- Côn trùng bị nhiễm nấm trên lá cây chanh, bưởi, sung.
- Đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng nốt sưng.
2. 2. Thiết bị và dụng cụ
Tủ cấy vô trùng

Khoai tây

200g

Glucose

20g

Agar

20g

Nước cất

1000 ml

Nồi hấp vô trùng

Cân phân tích Metuyến trùngler AE 260

Kính hiển vi quang học Leca

Tủ sấy

sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox

Kính lúp soi nổi Nikon SMZ 800

Bếp gas

Broth)

Máy chụp hình

Máy đo pH Thermo

Lò vi sóng National
Dụng cụ
- Ống nghiệm, bình erlen, lam và lamen, đĩa Petri, đũa thủy tinh, bình đựng mức, cốc
đong, que trans.

2.4.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến

Cao nấm men

20 g

K2HPO4

0.5 g

KH2PO4

0.05 g
0.5 g

- Que cấy đầu vuông, kim mũi mác.

MgSO4.7H20

- Pipet, vải muslin 2 lớp, giấy thấm.

NaCl vài mg

- Rây lọc có khích thước lỗ khác nhau: 0.5mm, 15 μm.

Nước cất

- Que gắp tuyến trùng, các giếng, đĩa đếm tuyến trùng, bình hút ẩm.

3g

Glucose

1000ml

2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường
YEA)

2. 3. Hóa chất
− Glycerol

Methyl blue

− Agar

Cao nấm men

− Glucose

NaNO3

− KNO3

Ethanol 96

− (NH4)2SO4

NaClO

− MgSO4.7H2O

NaCl

− Ampicilline

K2HPO4

− KH2PO4

Huyền phù tinh bột

− Saccharose

Formaldehyt 40%

Glucose
Cao nấm men
Agar
Nước cất

20g
4g
20g
1000ml

2. 5. Các phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp phân lập
a. Phương pháp thu mẫu
Thu thập những xác côn trùng vào buổi sáng. Nếu cơ thể chúng mềm và bẩn, chúng
có thể bị nhiễm vi khuẩn hoặc virus. Nếu cơ thể chúng cứng, điều đó chứng tỏ sự nhiễm
nấm.
Tiến hành thu mẫu ở 3 khu vực khác nhau trên 3 đối tượng cây trồng là: chanh, bưởi,
sung. Mỗi khu vực thu thập 10 mẫu. Vì số lượng côn trùng bị bệnh thu được rất ít nên chúng

25

26


tôi tiến hành phối trộn chung hết tất cảc các mẫu thu được. Sau đó tiến hành các phương
pháp phân lập [6].

2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi
a. Quan sát đại thể

b. Phương pháp phân lập

Cấy nấm sợi vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5ml nước cất vô trùng vào ống.

Tiến hành khử trùng mẫu xác côn trùng bằng HgCl2 0.1%. Sau đó rửa sạch lại bằng
nước cất vô trùng nhiều lần.

Dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử nấm sợi trong ống giống, sau đó lăn nhẹ ngón tay để
tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy nhẹ

Dùng đũa thuỷ tinh vô trùng nghiền mẫu với 10ml nước cất vô trùng.

1 điểm vào đĩa Petri có chứa môi trường PGA. Quan sát từng ngày khuẩn lạc về các đặc

Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.

điểm sau:

Dùng pipet vô trùng hút 0.1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi

- Tốc độ phát triển của khuẩn lạc.
- Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc.

đĩa trên môi trường PGA [6].
c. Phương pháp làm thuần (Phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng nấm)
Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm là quá trình cấy truyền đỉnh sinh trưởng của một sợi
nấm để tạo một mẫu nấm thuần
- Đổ môi trường PGA vào đĩa Petri để nghiêng sao cho phần thạch ở một phía của đĩa

- Hình dạng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc và sợi nấm.
- Giọt tiết.
- Sắc tố tiết vào môi trường.
b. Quan sát vi thể (tiêu bản phòng ẩm)
− Chuẩn bị các đĩa Petri vô trùng chứa lam, lamen và một miếng giấy lọc.

nông.
- Cấy truyền một miếng nhỏ nấm từ đĩa phân lập vào một bên đĩa nơi thạch sâu hơn.

− Chuẩn bị một đĩa Petri môi trường PGA với độ dày môi trường thật mỏng.

- Đặt đĩa dưới kính lúp soi nổi và điều chỉnh tiêu điểm sợi nấm ở rìa tản nấm (Các sợi nấm

− Dùng kim mũi mác vô trùng cắt lấy một miếng thạch từ đĩa Petri môi trường PGA

sẽ mọc rất thưa ở phần nông của thạch)

(kích thước miếng thạch 1x1cm) dặt lên lam chứa trong đĩa Petri vô trùng được

- Điều chỉnh nguồn sáng (gương) nhằm đạt độ tương phản tốt giữa môi trường và sợi nấm.

- Dùng que cấy dẹp đã khử trùng cấy một miếng thạch nhỏ chứa đỉnh sinh trưởng của một
sợi nấm sang một đĩa môi trường thích hợp.
2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng
− Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PGA tiến hành hấp khử trùng. Sau khi hấp
xong để nghiêng một góc 45 ° C các ống thạch này trên giá gỗ.
− Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng. Sau đó bảo quản các
ống giống này trong điều kiện lạnh (3-5 ° C)
− Thời gian cấy truyền lại đối với nấm mốc là 3-6 tháng [8].

chuẩn bị ở trên.
− Dùng que cấy đầu vuông lấy một ít bào tử nấm Purpureocillium lilacinum từ các
ống giống chấm vào 2 điểm đối diện của miếng thạch PGA trên lam. Sau đó đậy
lamen lên và dùng nước cất vô trùng làm ướt miếng giấy lọc trong đĩa Petri.
− Sau 3 ngày nuôi cấy lấy tiêu bản phòng ẩm ra và nhuộm bằng xanh metylen loffer.
Quan sát tiêu bản phòng ẩm dưới kính hiển vi về các đặc điểm: cấu trúc hệ sợi nấm
(có hay không có vách ngăn), cấu trúc cuống sinh bào tử, thể bình, hình dạng và cách
sắp xếp bào tử [3].
2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử
− Thu nhận DNA
• Phá màng tế bào và màng nhân bằng proteinase đặc hiệu để giải phóng DNA, đồng
thời phân huỷ các protein liên kết với DNA.

27

28


• Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và
chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có

2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái

chứa DNA.
• Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu các acid

a. Phương pháp xử lý, làm tiêu bản tuyến trùng theo De Grisse (1969)
− Ngày thứ nhất: nhặt tuyến trùng chuyển vào giếng có chứa 0.5ml dung dịch I (99ml

nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.

Formalin 40% + 1 ml glycerine). Với mỗi mẫu nhặt khoảng 200 con để định loại, với

− Chạy PCR
• Biến tính: trong một hỗn hợp đầy đủ các thành phần cho sự sao chép, DNA được

mẫu có ít tiến hành định loại toàn bộ mẫu. Đặt giếng có tuyến trùng (có đậy lam kính)

biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử (khoảng 94°-95° C), trong 30 giây-1

vào bình hút ẩm chứa 1/10 thể tích ethanol 96 %. Để bình hút ẩm trong tủ ấm ở nhiệt độ

phút.

40 °C ít nhất 12 giờ.

• Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động
khoảng từ 40°-70° C và kéo dài trong vòng 30 giây- 1 phút.

− Ngày thứ 2: lấy giếng ra khỏi bình hút ẩm, nhỏ vài giọt dung dịch II ( 95ml ethanol 96%
+ 5 ml glycerine) vào giếng, đậy lam kính lên giếng để ethanol bay hơi chậm và đặt

• Tổng hợp: nhiệt độ tăng lên đến 72° C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời

trong tủ ấm. Cứ sau 2 giờ thì nhỏ 2 giọt dung dịch II, thực hiện 4 lần. Quá trình này

gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30

nhằm làm mất nước tuyến trùng. Để giếng trongâm1 qua đêm, bổ sung vài giọt dung

giây- vài phút.

dịch III (50ml ethanol 96%+ 50ml glycerine) giúp làm mất nước và làm trong tuyến
trùng.

− Giải trình tự DNA [3].
2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng
Rây lọc được xếp một lớp giấy lên trên và đặt vào đĩa Petri, sau đó lấy rễ cho vào rây
lọc, điều chỉnh lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp và đặt yên tĩnh trong 48h ở nhiệt
độ phòng. Tuyến trùng sống chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa Petri.
Nhấc rây ra khỏi đĩa Petri thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa Petri [2].

− Ngày thứ 3: tuyến trùng đã được sử lý làm mất nước, làm trong nằm trong dung dịch

glycerine tinh khiết được sử dụng để lên tiêu bản định loại [1].
b. Phương pháp lên tiêu bản tuyến trùng theo Maeseneer (1963)
− Hơ nóng ống đồng và cắm vào đĩa paraffin. Sau đó chấm ống đồng lên lam để tạo thành
vòng paraffin .
− Nhỏ một giọt glycerine thuần khiết vào giữa vòng paraffin. Dùng que gắp tuyến trùng đã

2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng

Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi.
Nếu mẫu có ít tuyến trùng:
• Đổ dung dịch tuyến trùng vào đĩa đếm. sau đó lắc nhẹ cho dung dịch tuyến
trùng dàn đều.
• Đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hay đếm đại diện một
số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa.
Nếu mẫu quá nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30ml,
sau đó lấy 1ml để đếm, lặp lại 5 lần như vây, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1ml

được xử lý trong các giếng vào giọt glycerine (khỏang 5-10 tuyến trùng, chú ý các con
tuyến trùng phải xếp cùng chiều và không chồng lên nhau).
− Đặt khoảng 3 viên paraffin xung quanh vòng paraffin sau đó đậy lamen lên. Đặt lam và

lamen có tuyến trùng lên thanh sắt nóng cho paraffin chảy ra [1].
c. Phương pháp định danh tuyến trùng
− Quan sát dưới kính hiển vi quan học lần lượt ở các vật kính 10X, 20X, 40X, 100X. Phác
hoạ sơ bộ hình thái tuyến trùng như: kích thước, có kim hút hay không có kim hút, hình
dạng vùng môi, cơ quan sinh dục…

rồi nhân với 30 [2].

29

30


− Dựa vào đặc điểm hình thái đặc trưng cho từng nhóm tuyến trùng như: lớp cutin,
amphid, vùng môi, buồng trứng, kim hút để định loại. sử dụng khoá phân loại theo tài
liệu của Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000) [1].
2.5.8.

Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm

Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro
a. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng tuyến trùng
Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum
Cách tiến hành:

b. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp.
bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điều kiện in vitro
− Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (105 bào tử/ml)
trên các đĩa Petri môi trường PGA.
− Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trên môi trường PGA tiến hành
cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (5 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PGA) vào mép khuẩn
lạc nấm Purpureocillium lilacinum. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày.
− Sau mỗi ngày thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các
đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm nấm

− Chuẩn bị huyền phù trứng tuyến trùng:
• Dùng kim mũi mác tách lấy khối trứng tuyến trùng cho vào ống nghiệm chứa
nước cất. Cho thêm 4-5 ml NaClO 1,05% vào lắc trong vòng 5 phút. Sau đó để
yên cho các mãnh vở lắng xuống trong 30 giây.
• Dùng pipet hút phần trong ở phía trên của ống nghiệm chuyển lên ray lọc kích
thước 15 μm. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa sạch NaClO.
• Chuyển ray lọc chứa trứng tuyến trùng vào đĩa Petri chứa dung dịch ampicilline
0.1% để khử trùng trong 10 phút. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa lại [14].
Bố trí thí nghiệm: lô thí nghiệm: 1ml huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum
(105 bào tử/ml) + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng 100 trứng/ 0.5ml) cho vào

Purpureocillium lilacinum trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với

xanh metylen loffer và soi dưới kính hiển vi [10].
2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối
và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử
Tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trong các bình tam giác 250ml
chứa môi trường Czapek-Dox Broth (100 ml/ bình) với các giá trị pH khác nhau: 6, 6.5, 7,
7.5. Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.
Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử bằng cách cho dịch nuôi cấy

ống nghiệm.

lọc qua giấy lọc kích thước 15-20 μm thu lấy sinh khối trên giấy lọc và dịch lọc chứa bào

− Lô đối chứng: 1ml nước cất vô trùng + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng

tử. Việc thu sinh khối và dịch bào tử được tiến hành trong tủ cấy vô trùng [17].

100 trứng/ 0.5ml). Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 1 tuần.
− Thu kết quả: quan sát và đếm số lượng trứng không nở, IJ2 chết, IJ2 sống trong các
đĩa đếm tuyến trùng dưới kính lúp sôi nổi. Đối với trứng tuyến trùng bị ký sinh bởi
nấm Purpureocillium lilacinum dùng kim tiêm 500cc thu ngẫu nhiên 100 trứng tuyến
trùng chuyển lên lam nhuộm bằng xanhmethylen loffer và quan sát bằng kính hiển vi
[10], [14].

b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ và Cacbon đến sinh khối và số lượng
bào tử
Tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường Czapek-Dox Broth nhưng thay thế nguồn
nitơ cao nấm men bằng nguồn nitơ khác nhau như: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3. Đặt các bình
này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.
- Sau 14 ngày nuôi cấy trong các bình tam giác tiến hành thu sinh khối và bào tử. Cách

− Cách đánh giá kết quả:
Tỉ lệ trứng không nở= số trứng không nở/ (trứng + IJ2)X 100
Tỉ lệ IJ2 chết= IJ2 chết/ tổng IJ2x100

thu sinh khối và bào tử tiến hành tương tự như ở mục 2.5.9.1
- Tương tự ảnh hưởng của nguồn cacbon cũng tiến hành nuôi cấy trong môi trường
Czapek- Dox Broth nhưng thay thế glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau như: huyền
phù tinh bột, saccharose. Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử.

31

32


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov
- Sinh khối nấm sợi được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối.
- Lọc dịch lên men qua giấy lọc, rửa sạch sinh khối nấm sợi bằng HCl 1N và nước cất.
Sấy khô tờ giấy lọc có sinh khối nấm sợi ở 80- 105 °C đến trọng lượng không đổi. Sinh khối
đựơc tính theo sự chênh lệch trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và tờ giấy lọc khô đã cân

3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng
3.1.1. Phân lập
Chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm từ các mẫu xác côn trùng bị nhiễm nấm theo
mục 2.5.1. Tiến hành định danh sơ bộ bằng các phương pháp ở mục 2.5.3 và căn cứ vào đặc

trước đó [3].
2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc chúng tôi phân lập được 1 chủng nấm.

Nguyên tắc:
- Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa
Petri.
- Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì
mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào.
Cách lấy mẫu
- Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4, 10-5 để cấy mẫu.
- Ghi vào nắp hộp Petri có mội trường thạch các thông tin:
- Nồng độ pha loãng.

Hình 3.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum
3.1.2. Định danh

- Ngày cấy.
- Dùng pipet đã vô trùng lấy 0.1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch.

Sau khi phân lập và làm thuần, tiến hành định danh sơ bộ nấm bằng cách nuôi chủng

- Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào.

nấm này trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày. Tiến hành quan sát hình

- Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa Petri và lấy kết quả trung bình.

dạng, màu sắc của khuẩn lạc. Làm tiêu bản phòng ẩm quan sát cấu trúc hệ sợi (sự phân

- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp [8].

nhánh, vách ngăn của sợi nấm), màu sắc sợi nấm, hình dạng và cấu trúc cơ quan sinh sản
(cuống sinh bào tử, thể bình, bào tử).

- Cách đếm
n

Số tế bào/g mẫu = M.a.10 .N

Kết quả định danh sơ bộ
Quan sát đại thể

M: số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa.
A: số giọt trong 1ml dịch mãu.
n: hệ số pha loãng.
2.5.11. Các phương pháp khác
Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphic plus 5 [5].
Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Excel [4].

33

34


Hình 3.2: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum ( PGA, 7 ngày, 28 °C)
Quan sát vi thể

Hình 3. 3: Cấu trúc hệ sợi nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN TRÁI)

và cơ

quan sinh sản của nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN PHẢI)

Hình 3.4: Cấu trúc thể bình và cách sắp xếp bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (
400)
So sánh giữa kết quả quan sát được với khoá phân loại của R.A. Samson (1974)
Đặc điểm phân loại chủng nấm
Đặc điểm chủng nấm A

Đặc điểm phân loại chi Paecilomyces

− Bề mặt khuẩn lạc nhẵn, mịn như − Khuẩn lạc của Paecilomyces mọc
nhung. Khuẩn lạc ban đầu có màu
trắng sau chuyển thành màu tím.

ngày. Màu sắc khuẩn lạc thì bắt đầu

− Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh

từ màu trắng trở nên vàng, vàng
xanh, vàng nâu, nâu olive, cuối cùng

và trong suốt không màu.
− Cuống sinh bào tử phân nhánh thẳng
đứng.

có màu hồng hoặc tím phụ thuộc tuỳ
loài.

36

35

nhanh và trưởng thành trong vòng 3


− Thể bình phình ở phần gốc dần dần − Thể bình có cấu trúc phình ở phần
thuôn nhọn kéo dài thành một cái

gốc và dần dần hẹp kéo dài thành cái

cổ. Thể bình phân chia thành thể

cổ.

3.2. Kết quả định danh tuyến trùng
Sử dụng phương pháp định danh bằng hình thái và đối chiếu với khoá phân loại tuyến
trùng ký sinh thực vật của tác giả Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000).

− Bào tử được sắp xếp trong chuỗi từ

bình cấp 1 hoặc cấp 2…
− Bào tử hình elip đến hình trụ, không

đầu mút của thể bình, chuỗi bào tử

màu. Bào tử xếp thành chuỗi dài và

không phân nhánh. Bào tử không

không phân nhánh.

màu hoặc sáng màu.

So sánh kết quả quan sát được và đặc điểm mô tả trong khoá phân loại của R.A. Samson
(1974) chúng tôi kết luận chủng nấm A thuộc chi Paecilomyces.
Sau đó chúng tôi gửi chủng nấm Paecilomyces A đến công ty xét nghiệm Nam Khoa để
định danh bằng cách giải trình tự ribosome 28S và so sánh với ngân hàng gen NCBI.

Hình 3.5: Hình thái toàn bộ cơ thể tuyến trùng (bên trái 400), đầu tuyến trùng (bên phải
1000)

Kết quả giải trình tự gen 28S
•

TTTAAGTCCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG
GCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCAACTACCACTCAG
GGCCGGAAAGCTCTCCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAAC
AAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTC
CCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCC

Hình 3.6: Hình thái phần thân tuyến trùng (1000)

GCCTGCCCCCGCGCCGGCGCCGGACCCAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAA
ACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAG
CAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATC
GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT
GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCA
TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGT
TGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCA

Hình 3.7: Hình thái cơ quan sinh sản của tuyến trùng (1000)

GCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGGC
So sánh kết quả với ngân hàng gen cho thấy chủng Paecilomyces A có độ tương đồng với loài
nấm Purpureocillium lilacinum là 99%.

37

38


Hình 3.8: Hình thái phần đuôi tuyến trùng (1000)

− Ấu trùng (IJ2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0.4-0.5mm. Stylet và vùng đầu kitin
hoá yếu. Đuôi hình chóp, phần cuối của đuôi thừơng là khoảng trong với chiều dài khác

So sánh với khoá phân loại của hai tác giả trên chúng tôi thu được loài tuyến trùng thuộc giống

nhau [1].

Meloidogyne sp. với các đặc điểm sau:

3.3. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. trong diều kiện in

Thuộc bộ Tylenchida:

vitro

− Có phasmid. Vỏ cutin luôn luôn phân đốt.

3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái loài Meloidogyne sp.

− Không có tơ cứng trên bề mặt cutin.
− Có stylet (kim hút). Thực quản có diều giữa dạng cơ và diều sau dạng tuyến.
− Vùng môi thường kitin hoá mạnh. Kim hút rất phát triển. Lỗ đổ của tuyến thực quản lưng
không đổ vào diều giữa mà đổ sau stylet một khoảng cách.
Thuộc họ Heteroderidae:
− Cutin phân đốt nhỏ đến trung bình. Vùng đầu phát triển và kitin hoá ở mức độ khác nhau.

trong điều kiện in vitro
Tiến hành khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. ký sinh trên rễ
cây chuối theo phương pháp nêu ở mục 2.5.8.2 trong thời gian 4 ngày trong môi trừơng thạch
đĩa PGA với nấm Purpureocillium lilacinum 5 ngày tuổi. Tiến hành thu kết quả sau từng ngày
lây nhiễm.

Diều giữa tách biệt con cái có 2 hoặc 1 buồng trứng, nếu một thì có túi sau vulva. Con đực
có cánh đuôi hoặc không.
− Stylet khoẻ. Diều giữa của con cái phát triển dạng tròn hoặc ovan, phần diều tuyến dạng quả
lê hoặc dạng thuỳ kéo dài. Con cái có 2 hoặc 1 buồng trứng. Đuôi từ tròn, tù, hình trụ đến
hình chóp.
− Thực quản tuyến ở dạng thuỳ, không tạo thành hành thực quản, bao phủ phần đầu của ruột
về phía lưng hoặc phía bụng. Stylet trung bình nhưng khoẻ.

Hình 3.9: Tiêu bản tuyến trúng cái Meloidogyne sp. trên cây chuối bị nhiễm nấm
Purpureocillium lilacinum (400)

− Con cái hình tròn hoặc hình quả lê. Con đực với đuôi ngắn, tròn, không có cánh đuôi.
Giống Meloidogyne:
− Dị hình sinh dục. con cái trưởng thành hình quả lê hoặc hình cầu, nằm sâu trong mô rễ.

Đường kính cơ thể 0.5-0.7mm với cổ cân đối. Vulva ở phía sau gần hậu môn. Vỏ cutin màu
trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Stylet ngắn, kitin hoá trung bình.Vùng đầu kitin hoá không
mạnh. Lỗ bài tiết nằm ở phía trước đến van diều giữa và thường gần gốc stylet. Hai nhánh
sinh dục được cuộn gấp lại. Trứng được đẻ bên ngoài cơ thể vào khối gelatin.
− Con đực hình giun sống tự do trong đất; dài 1-2mm. Vùng đầu kitin hoá mạnh. Đuôi ngắn,
hình cầu. Gai giao cấu phát triển mạnh, không có cánh đuôi.

Hình 3.10: Tiêu bản nhuộm xanh metylen loffer tuyến trùng cái Meloidogyne sp. trên cây
chuối bị nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum (400)
Qua kết quả quan sát sự lây nhiễm của tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bởi nấm
Purpureocillium lilacinum cho thấy sợi nấm Purpureocillium lilacinum ký sinh bao phủ các
khắp các phần cơ thể tuyến trùng cái. Sự xâm nhập của nấm Purpureocillium lilacinum đã được

39

40


ghi nhận trong bài báo của tác giả Morgan-Jone et.al (1984), nấm Purpureocillium lilacinum

Hình 3.11: Đồ thị khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng cái Meloidogyne sp. của nấm

tấn công tuyến trùng cái qua các phần bị trầy xướt, qua hậu môn hoặc âm đạo của tuyến trùng

Purpureocillium lilacinum

cái. Tuy nhiên một số tác giả khác như Jatala (1986) lại giải thích rằng nấm Purpureocillium

Kết quả bảng số liệu 3.1 và đồ thị 3.1cho ta thấy tỉ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị

lilacinum tấn công cơ thể tuyến trùng cái Meloidogyne javanica chỉ qua những chổ mở của cơ

lây nhiễm bởi nấm Purpureocillium lilacinum thấp. Kết quả này khá tương đồng với kết quả

thể.

nghiên cứu trong bài báo của tác giả Chan Guan Pau (với tỉ lệ lây nhiễm sau 1 ngày là 10% của

Kết quả thu được như sau:

nấm Purpureocillium lilacinum B) và thấp hơn so với các chủng nấm khác như

Bảng 3.1: Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng cái Meloidogyne sp. của nấm
Purpureocillium lilacinum

Purpureocillium lilacinum A, Purpureocillium lilacinum M (với tỉ lệ lây nhiễm sau 1 ngày

Tỷ lệ
trung
bình
sau 3
lần thí
nghiệm

năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. thấp nguyên nhân có thể là do chủng thu được

Thời gian lây
nhiễm nấm

Purpureocillium

lilacinum

Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị lây nhiễm nấm

Purpureocillium lilacinum
Lần thí nghiệm thứ
1

Lần thí nghiệm
thứ 2

Lần thí nghiệm
thứ 3

>50%). Điều này cho thấy rằng chủng nấm Purpureocillium lilacinum của chúng tôi có khả
từ tự nhiên với tốc độ mọc chậm.
3.3.2 Kết quả thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến
trùng Meloidogyne sp. trên cây chuối
Tiến hành thí nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến trùng
Meloidogyne sp. theo phương pháp nêu trong mục 2.5.8.2 . Sau 7 ngày lây nhiễm trứng tuyến

1 ngày

40%

0%

0%

2 ngày

40%

20%

60%

3 ngày

60%

40%

40%

20%

Tỉ lệ (%)

4 ngày

40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%

60%

40%

0%
20
%
40
%
20
%

20
%
20
%
40
%
20
%

20
%
20
%
0%
20
%

20
%
20
%
60
%
40
%

0%
20
%
20
%
40
%

0
%
0
%
20
%
20
%

11%

trùng Meloidogyne sp. với bào tử nấm Purpureocillium lilacinum kết quả thu được:

24%
36%
31%

36%
31%
24%

Tỷ lệ trung
bình sau 3 lần
thí nghiệm

11%

1
ngày

2 ngày 3 ngày 4 ngày

Thời gian lây nhiễm (ngày)

41

Hình 3.12: Tiêu bản nhuộm xanhmetylen loffer trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. bị
nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum
( bên trái 400), (bên phải
1000)
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi sự lây nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum của
trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. cho thấy mạng lưới sợi nấm phân nhánh đến nhiều trứng.

42


Phần cuối của hệ sợi có 1 cấu trúc sợi sắt nhọn được xem như là giác bám giúp bám vào vỏ
Đồ thị khảo sát khả năng kiểm soát trứng
tuyến trùng ở điều kiện invitro

trứng tuyến trùng.
Những trứng bị nấm Purpureocillium lilacinum tấn công có biểu hiện bất thường là bị
teo lại (do bị áp lực của mạng lưới sợi nấm). Đây là phương pháp xâm nhập vật chủ bằng cơ

90%

81%

80%
70%

67%

70%

học ( theo giải thích của tác giả Holland et. al, 1999).
Theo Lopez-Llorea et. al, 2002 cũng lý giải về cơ chế tấn công trứng tuyến trùng bởi

60%

53%

50%

lô thí nghiệm

nấm Purpureocillium lilacinum tương tự. Khi sợi nấm chạm vào bề mặt trứng nó phản ứng tiếp

40%

lô đối chứng

xúc bằng cách hình thành những giác bám. Sau đó dùng chất dính kết giúp cho việc kết nối

20%

25%

30%

10%

nấm và vật chủ (trứng tuyến trùng).
Và từ những giác bám này tiết ra enzym và chất hoá học làm phương tiện xâm nhập vật

0%

0%
tỉ lệ trứng
không nở

tỉ lệ trứng bị tỉ lệ IJ2 chết
kí sinh

chủ (theo giải thích của tác giả Morgan-Jones et. al, 1984; Huang et. al, 2004; Gortari và
Houra, 2008; Lopez-Llorea et. al, 2008).

Hình 3.13: Đồ thị khảo sát khả năng kiểm soát trứng tuyến trùng

Bảng 3.2: Bảng số liệu khảo sát khả năng kiểm soát trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.

Lần thí nghiệm
Lần thí nghiệm
1
Lần thí nghiệm
2
Lần thí nghiệm
3
Tỉ lệ trung
bình

Tỉ lệ trứng không nở

Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điều kiện in vitro

Tỉ lệ trứng bị ký
Tỉ lệ IJ2 chết
sinh
lô thí
lô đối
lô thí
lô đối
nghiệm chứng nghiệm chứng

lô thí
nghiệm

lô đối
chứng

83%

54%

28%

0%

71%

41%

61%

55%

14%

0%

88%

78%

66%

51%

34%

0%

84%

81%

70%

53%

25%

0%

81%

67%

43

44

Kết quả trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.13 cho thấy nấm Purpureocillium lilacinum có
khả năng kiểm soát sự nở của trứng tuyến trùng là 70% cao hơn so với lô đối chứng. Tuy nhiên
tỉ lệ trứng bị ký sinh bởi nấm Purpureocillium lilacinum là rất thấp 25% so với chủng nấm
Purpureocillium lilacinum A (78.5%), Purpureocillium lilacinum B (66%), Purpureocillium
lilacinum M (73.4%) trong bài báo của tác giả Chen Guan Pau. Tỉ lệ ký sinh của chủng nấm
Purpureocillium lilacinum của chúng tôi khá thấp có thể là do chủng này có hoạt tính thấp, thời
gian sinh trưởng chậm.
Tỉ lệ trứng không nở trong lô đối chứng cũng khá cao 53% nguyên nhân có thể là do điều
nhiệt độ thí nghiệm không thích hợp vì thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng
có khi lên đến 30-32º C không thuận lợi cho sự nở của trứng tuyến trùng (27-28 ºC).
3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh khối và số lượng
bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum
3.4.1 Ảnh hưởng của pH

Hình 3.15: Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH lên sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum
Sinh khối nấm
Sinh khối nấm
Sinh khối nấm
Sinh khối nấm
Bình
Purpureocillium Purpureocillium Purpureocillium Purpureocillium
lilacinum ở pH 6 lilacinum ở pH lilacinum ở pH 7 lilacinum ở pH
(g)

Nấm Purpureocillium lilacinum được tiến hành nuôi cấy tĩnh trên môi trường lỏng
Czapek-Dox Broth trong các bình tam giác 250ml (100ml môi trường/bình) với các giá trị pH
môi trường lần lượt là: 6, 6.5, 7, 7.5, đặt trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng. Sau thời gian 14
ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử nấm Purpureocillium lilacinum.

1
2
3
4
5
6
7
8
9

pH7
pH 6.5
pH6
pH7.5

0.9622
1.1441
1.1130
1.2776
0.8679
1.2953
0.7486
0.8679
0.8023
Số
Trung
mẫu
bình
9
0.836711

9
0.993356
9
1.00877
9
1.04954

6.5 (g)

1.0789
0.9070
1.2245
0.6969
0.9338
0.8353
0.7545
0.5573
0.5422
Sự khác biệt

0.204854
0.31488
0.227628
0.37276

X
X
X
X

Hình 3.14: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sinh khối và số lượng bào tử nấm
Purpureocillium lilacinum

45

(g)

1.2615
1.3374
1.4560
1.2045
0.7842
0.8034
0.6690
0.6891
0.7351
Sai số

46

7.5 (g)

1.6044
1.4516
0.7594
1.3082
1.3335
0.8635
0.8202
0.7156

0.5895


Sinh khối (g)

Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH lên sự hình thành số lượng bào tử nấm Purpureocillium
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

1.009

0.993

lilacinum

1.050
0.837

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum
Đĩa

pH 6

pH 6.5

pH 7

pH 7.5

pH

Hình 3.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của pH lên sinh khối nấm Purpureocillium
lilacinum
Bảng số liệu 3.3 và hình 3.16 cho thấy giá trị sinh khối của nấm Purpureocillium lilacinum
đạt cao nhất tại pH 7.5 là (1.050 g/100ml) và đạt giá trị thấp nhất tại pH 7 là (0.837g/100ml).
Tuy nhiên sự thay đổi giá trị pH này không có ảnh hưởng đến sinh khối nấm Purpureocillium
lilacinum vì qua phân tích bằng phần mềm sử lý Stargraphic cho thấy sinh khối nấm
Purpureocillium lilacinum không có khác biệt giữa các nhóm giá trị pH.
Sự thay đổi pH của môi trường không có ảnh hưởng đến sinh khối nấm Purpureocillium
lilacinum có thể là do nấm Purpureocillium lilacinum có khả năng phát triển trong khoảng pH
rộng (cả trong điều kiện pH kiềm lẫn axit ) đều có thể phát triển. Và sự thay đổi giá trị pH này
cũng không tỷ lệ thuận với sự phát triển sinh khối của nấm Purpureocillium lilacinum ( theo đồ
thị 3.3 ) cho ta thấy ở pH 6 sinh khối là 1.009 g/100ml đến pH 6.5 sinh khối giảm xuống còn
0.993g/100ml rồi pH 7 sinh khối đạt 0.837g/100ml và tại pH 7.5 sinh khối lại tăng lên
1.050g/100ml.

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

Số lượng bào Số lượng bào tử Số lượng bào Số lượng bào
tử (pH 6)
(pH 6.5) (bào
tử (pH 7) (bào tử (pH 7.5)
(bào tử/ ml)
tử/ ml)
tử/ ml)
(bào tử/ ml)
51600000
23400000
46000000

30800000
50000000
26600000
34000000
33200000
49800000
26400000
34000000
30600000
14400000
23000000
22000000
25200000
14000000
24600000
32000000
27000000
14400000
25600000
24000000
14000000
25400000
13600000
11000000
30000000
25000000
17400000
7400000
40000000
29000000

11200000
13200000
38000000
9400000
10400000
10000000
3800000
9800000
6400000
17400000
6600000
10000000
4800000
7600000
5400000
5000000
7000000
6600000
5200000
5400000
7400000
7800000
2800000
3200000
5400000
10200000
3200000
3200000
5000000
9800000

4600000
6600000
3800000
6000000
5200000
3200000
4400000
4000000
2800000
3200000
2800000
5800000
3600000
6800000
6200000
1000000
2800000
6000000
5400000
800000
1800000
5600000
6600000
1200000
2800000
5200000
4000000
800000
5200000
6000000

4200000
4600000
3000000
2000000
2600000
2800000
3800000
2600000
4000000
6400000
3200000
2000000
6000000
1600000
1000000

pH
Số lượng bào
tử pH 6.5
Số lượng bào
tử pH 7
Số lượng bào
tử pH 7.5

47

Số mẫu
27

Trung bình (bào tử)

1.06741E7

Sự khác biệt
X

27

1.21481E7

X

27

1.24296E7

X

48