SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN DLOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
-------- --------

BÙI THỊ KIỀU VÂN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
-------- --------

BÙI THỊ KIỀU VÂN

SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ
VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI,
GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN
SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ
VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI,
GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng

THÁI NGUYÊN - 2008

THÁI NGUYÊN - 2008

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tới

MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1

PGS.TS. Nguyễn Trọng Lạng, giảng viên khoa sinh - KTNN trường Đại học

1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1

Sư phạm Thái Nguyên, PGS.TS. Nông Văn Hải, Phó Viện trưởng, Viện Công

2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2

nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy đã

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2

tận tình dìu dắt và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.

Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3

Trong thời gian hoc tập và nghiên cứu vừa qua, tôi đón nhận được sự

1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM .......................................................................... 3

giúp đỡ hết lòng, chỉ bảo tận tình và sâu sắc của CN. Địch Thị Kim Hương,

1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU....4

ThS.NCS. Nguyễn Đăng Tôn cùng tập thể các cô, chú, anh, chị cán bộ

1.2.1. Gà Ri ................................................................................................... 4

nghiên cứu Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam những người đã tạo nhiều điều kiện thuận
lợi và nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi rất cảm ơn sự
giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và các thầy, cô giáo, kỹ
thuật viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã ủng
hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn tới Ths. Ngôn Thị Hoán, giảng viên
chính khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi trong việc nghiên cứu thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ tình cảm của mình bằng lời cảm ơn chân thành

1.2.2. Gà Mông ............................................................................................. 4
1.2.3. Gà Sao ................................................................................................ 5
1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI ......................................................... 6
1.3.1. Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng ............................. .6
1.3.2. Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể ........................ .8
1.3.2.1. Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể......................................... .8
1.3.2.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà ............................................ .9
1.3.2.3. Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà ........ 12
1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới ..................... 12
13.2.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ........................ 15

đến gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn dành cho tôi những

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 17

tình cảm nồng ấm, thân thương nhất trong suốt thời gian học tập và nghiên

2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................... 17

cứu.

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................................... 17
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008

2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 17

BÙI THỊ KIỀU VÂN

2.1.2. Thiết bị .............................................................................................. 18
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 19
2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh ................................................................ 19
2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ .................. 19
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng vật chất khô ......................... 19


2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số ............................................................ 19
2.3.1.4. Định lượng Protein. .................................................................... 20
2.3.1.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................ 21
2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ................................................... 22
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật ............. 22
2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose ...................................... 23
2.3.2.3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR .................... 24

2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen ............................................................... 26

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Amp

Ampicilline

bp

Base pair (cặp bazơ)

ddNTP

Dideoxynucleotide triphosphate

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

DNA

Deoxyribo Nucleic Axit

D-loop

Displacement loop

E.coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

Epp

Eppenđorf

EtBr

Ethidium Bromide

EtOH

Ethanol (cồn)

IPTG

Isopropyl thio-β-D- galactoside

3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số ............................................................... 32

kb

Kilo base

3.2 . ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ..... 34

LB

Luria - Bertani

3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà.............................. 34

mtDNA

DNA ty thể (mitochondrial DNA)

3.2.2. Nhân đoạn trình tự của vùng D-loop của DNA ty thể ...................... 36

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

3.2.3. Tách dòng và xác định trình tự vùng D- loop của DNA ty thể ......... 39

PBS

Phosphate - buffer saline

3.2.3.1. Tách dòng vùng D-loop ............................................................. 39

PCR

Polymerase Chain Reaction

3.3.2.2. Xác định trình tự vùng D-loop của DNA ty thể ......................... 44

RNA

Ribonucleaxit

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 51

RNase

Ribonuclease

Kết luận. ......................................................................................................... 51

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

Đề nghị ......................................................................................................52

TAE

Tris-Acetate-EDTA

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................. 52

TE

Tris EDTA

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 53

Tm

Melting Temperature (nhiệt độ nóng chảy)

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 57

v/p

vòng/phút

2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA ........................................ 28

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

.................................. 29

3.1. SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ ...... 29
3.1.1. Tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ tƣơi...................................................... 29
3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô ................................................................... 30
3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số ..................................................................... 31


1

MỞ ĐẦU

Danh môc c¸c b¶ng
Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể .........11

1. Tính cấp thiết của đề tài

Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong đề tài ....................................................18

Trong những năm gần đây ngành chăn nuôi gia cầm nước ta phát triển

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen ...........................................25

nhanh, đạt được những tiến bộ rõ rệt, số lượng đầu gia cầm cũng như sản lượng

Bảng 3.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tƣơi .................................................29

thịt, trứng của ngành tăng hàng năm. Theo Hoàng Kim Giao và Nguyễn Thanh

Bảng 3.2. Hàm lƣợng vật chất khô trong trứng gà ..................................30

Sơn (Cục chăn nuôi - Bộ nông nghiệp: Thông tin Hiệp hội chăn nuôi gia cầm

Bảng 3.3. Hàm lƣợng lipid tổng số ở thịt gà thí nghiệm ..............................31

Việt Nam - 2005) trong những năm gần đây tốc độ tăng đầu con của đàn gia

Bảng 3.4. Hàm lƣợng protein thô trong trứng gà thí nghiệm ...................... 33

cầm từ năm 1990 đến năm 2000 là 5%/năm, năm 2002 là 6,69%, năm 2003 là

Bảng 3.5. Thống kê các điểm đa hình ở 2 mẫu nghiên cứu so với trình tự
tham khảo mã số AB268515 ..........................................................................49
Bảng 3.6. So sánh tỷ lệ sai khác trình tự nucleotide của một số giống gà .....50

Danh môc c¸c h×nh

8,9%. Tổng đàn gia cầm trong cả nước 254,057 triệu con năm 2003, sản lượng
trứng 4,85 tỷ quả năm 2003.
Bên cạnh việc phát triển các giống gà nhập nội có năng suất cao như gà
Lergho, Lương Phượng, Lương Phượng Sasso, gà Brow nick, Tam hoàng... thì
việc bảo tồn và phát triển các giống gà nội có khả năng thích ứng tốt với điều

Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà..................................................10

kiện chăn nuôi của địa phương, chất lượng thịt, trứng tốt như gà Đông Tảo, gà

Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt ..............................................26

Ác, gà Tè, gà Ri, gà Mông, gà Mía, gà Tre, gà Hồ, gà Tàu vàng, gà Móng, gà

Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà ..............29

Chọi... cũng đang được quan tâm. Gần đây việc nhập nội các giống gà có năng

Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng vật chất khô của trứng gà ..............30

suất cao, chất lượng thịt, trứng tốt, có khả năng thích ứng cao với điều kiện

Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng lipid tổng số ở trứng gà thí nghiệm ....32

chăn nuôi ở địa phương như gà Sao, gà Ai cập cũng đã và đang thu hút sự chú

Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng protein thô trong thịt gà thí nghiệm .....33

ý của người nông dân.

Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di DNA tổng số ..................................................36

Việc đánh giá chất lượng trứng, thịt cũng như tìm hiểu sự đa dạng di truyền

Hình 3.6. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR ...............................................39

ở mức phân tử của các giống gà trên là cần thiết cho ngành chọn giống gia cầm.

Hình 3.7. Ảnh điện di một số DNA plasmid trên gel agarose 0,8% .............42

Hiện nay đã có các công trình nghiên cứu về thành phần hóa sinh trứng gà

Hình 3.8. Ảnh kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI.........44
Hình 3.9. So sánh trình tự D-loop của hai mẫu nghiên cứu Ri (Rhy), Mông

Ri, gà Ác, Lergho... [5], [9], [10], [27], [32], [36].
Xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên

(Mna) với trình tự tham khảo mã số AB268515 ........................................48

cứu vùng điều khiển D-loop ty thể trên thế giới được chú ý từ những năm

Hình 3.10. Quan hệ di truyền của một số giống gà........................................50

1990 và đang phát triển rộng rãi. Ở Việt Nam các xác định đa dạng di truyền ở
mức phân tử ở gà qua các nghiên cứu liên quan đến vùng điều khiển D-loop
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2

3

mới bắt đầu từ những năm 1999 trên đối tượng gà lôi [4]. Đến nay việc giải

Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

trình tự nucleotide vùng D-loop để đánh giá mức đa dạng di truyền đang được

1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM

quan tâm. Hiện nay TS. Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết

đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội" trong

luận rằng: Gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà

đó có giống gà Mông và gà Ri.

rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ

Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn này chúng tôi lựa chọn đề tài: " So

sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về mặt hình

sánh thành phần hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của

thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập tính

ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi tại Thái Nguyên".

hoạt động.

2. Mục tiêu của đề tài

Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu: Kiểu Bakira (gà nguyên

- So sánh chất lượng trứng của ba giống gà.

thuỷ): nhiều lông, ức nở, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn. Kiểu

- So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà.

Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, mắt lõm vào

- Xác định mối quan hệ di truyền của một số giống gà.

hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ. Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái

3. Nội dung nghiên cứu

tai vừa, tai nhỏ màu đỏ, mỏ tương đối ngắn. Từ 3 loại hình trên, người ta chọn

- Xác định các chỉ tiêu hóa sinh trứng: Hàm lượng vật chất khô; tỷ lệ lòng

lọc, dần dần hình thành nên các giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm

trắng; lòng đỏ; hàm lượng lipit; protein.

dụng ngày nay.
Theo Nguyễn Ân (1983) [1] và nhiều tác giả đã sắp xếp vị trí của gà

- Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên.
- Nhân toàn bộ vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR.

nhà trong hệ thống giới động vật như sau: Giới động vật (Animal); Ngành

- Tạo dòng phân tử vùng D-loop.

động vật có xương sống (Chordata); Lớp chim (Aves); Bộ gà (Galliformes);

- Phân tích, so sánh trình tự vùng D-loop gen ty thể với trình tự đã được công

Họ Trĩ (Fasia nidea); Chủng Gallus; Loài Gallus gallus.
Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba

bố trong ngân hàng genbank.
- Vẽ cây phát sinh về mối quan hệ di truyền của một số giống gà.

Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của
châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước
Anh, sau đó là nước Mỹ, các giống gà được lai tạo thành nhiều giống gà có
năng suất cao hơn. Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở
vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của
gà Ri hiện nay nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri,
gà Tre, gà Đông Tảo, gà Vàng….

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




4

5

1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BA GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU

gà trống đạp mái lúc 157,20 ngày tuổi; gà mái đẻ trứng lúc 177,65 ngày tuổi.

1.2.1. Gà Ri

Gà mái đẻ ít và thưa, số trứng/mái/lứa là 13,65 quả, khoảng cách giữa 2 lứa

Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta, chiếm 70% tổng số gà trong

đẻ là 19,88 ngày. Trứng gà Mông có khối lượng ở mức trung bình với 44,04g,

cả nước, nguồn gốc từ nhóm gà rừng Gallus bankiva hay Gallus gallus. Ngoại

chỉ số hình thái là 76,23%, chỉ số Haugh 105,90. Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ

hình thon, nhỏ; mỏ nhỏ; mào cờ có răng cưa mào đỏ tươi rất phát triển ở con

trứng là 50,56%, ở lòng trắng là 12,41. Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng

trống; tích và dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng; cổ thanh, dài vừa phải ngực lép

trắng 11,01%, lòng đỏ trứng có tỷ lệ lipit khá cao 26,94% ,[17].

bụng thon, mềm; chân có hai hàng vải màu vàng, có khi xen lẫn màu đỏ tươi.

1.2.3. Gà Sao

Bàn chân có bốn ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống. Màu lông rất khác nhau

Gà Sao có nguồn gốc từ gà rừng, thuộc lớp: Aves, Bộ: Galliformes, Họ:

phổ biến ở con mái có màu vàng rơm, vàng đất, nâu nhạt và đốm. Con trống

Phasianidae. Tháng 4 năm 2002, trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy

màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh và lông đuôi có màu đen ánh xanh, lông

Phương đã nhập 3 dòng gà Sao từ Viện nghiên cứu tiểu gia súc Godollo

bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất. Ngoài ra còn màu lông khác như trắng, hoa mơ,

(Hungari). Kết quả nghiên cứu khẳng định gà Sao hoàn toàn có khả năng

đốm trắng... [1]. Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc lông nhanh hơn gà Mía,

thích ứng tốt với điều kiện sinh thái Việt Nam [14].

Đông Tảo nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết

Ở 1 ngày tuổi, gà Sao có bộ lông màu cánh sẻ, có những đường kẻ sọc

lạnh, gà Ri đẻ trứng sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi và đạt tỷ lệ đẻ 5% lúc

chạy dài từ đầu đến cuối thân. Mỏ và chân màu hồng, chân có 4 ngón và có 2

127 ngày tuổi. Sản lượng trứng 90 - 115 quả/năm, con trống nặng 1,5 đến

hàng vẩy. Giai đoạn trưởng thành gà Sao có bộ lông màu xám đen, trên phiến

2kg, con mái nặng 1,1 đến 1,6 kg. Gà Ri ham ấp bóng đẻ được 10 - 15 quả lại

lông điểm nhiều những nốt chấm trắng tròn nhỏ. Thân hình thoi, lưng hơi gù,

đòi ấp, khối lượng trung bình 36 – 45g/quả gà có chất lượng trứng, thịt tốt.

đuôi cúp. Đầu không có mào mà thay vào đó là mấu song cao khoảng 1,5 - 2

1.2.2. Gà Mông

cm. Mào tích của gà Sao màu trắng hồng và có 2 loại: một loại hình lá dẹt áp

Theo Nguyễn Văn Trụ, 2000 [12] cho biết gà Mông phân bố ở vùng núi

sát vào cổ, còn một loại hình lá hoa đá rủ xuống. Da mặt và cổ của gà Sao

phía Bắc với số lượng không nhiều và đang có nguy cơ bị lai tạp, mất dần. Từ

không có lông, lớp da trần này có màu xanh da trời, dưới cổ có yếm thịt

năm 1999 đề án “Bảo tồn quỹ gen Việt Nam 1999 - 2002” và dự án “Bảo tồn

mỏng. Chân khô, đặc biệt con trống không có cựa.

các giống vật nuôi có gen quý hiếm 2000 - 2001” đã đưa giống gà này vào

Gà Sao thuộc loài nhút nhát, cảnh giác, bay giỏi như chim, rất ít mổ,

bảo tồn tại Sơn La và Hà Nội. Gà Mông trưởng thành có hình dạng cân đối,

cắn nhau, thích mổ những vật lạ. Đặc biệt là có tập tính bày đàn cao; không

vững chắc, nhanh nhẹn, chân cao màu đen. Màu sắc lông đa dạng, màu da

bộc lộ tập tính sinh dục rõ ràng, gà Sao mái đẻ trứng tập trung. Gà bắt đầu đẻ

đen, thịt đen chiếm 90%, sức kháng bệnh cao, khả năng sinh sản thấp. Năng

vào tuần tuổi thứ 27 và đạt tỷ lệ đẻ 5% ở tuần tuổi thứ 30 khi cơ thể đạt khối

suất trứng thấp, chất lượng trứng tốt, thơm ngon được nhiều người ưa thích.

lượng khoảng 2,2-2,3 kg. Tuổi đẻ đạt đỉnh cao là 34-40 tuần tuổi. Năng suất

Gà Mông nuôi tại huyện Trạm Tấu tỉnh Yên Bái có tuổi thành thục muộn,

trứng/mái/23 tuần đẻ là 85-100 quả.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






6

7

1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

Thành phần hóa học của trứng

1.3.1. Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng

Trứng gia cầm nói chung và trứng gà nói riêng là một loại thực phẩm rất

Theo H. Brandsch và H. Bichel một số tính trạng thuộc về đặc điểm sinh

giàu dinh dưỡng, đặc biệt là lòng đỏ cung cấp khoảng 50% protein. Thành

học như màu lông, màu sắc vỏ trứng, hình dáng cơ thể, thành phần các loại

phần dinh dưỡng của trứng các loại gia cầm khác nhau thì khác nhau. Protein

protein, lipit trong trứng, thịt thuộc các tính trạng chất lượng.

trong trứng thường là những protein dễ tiêu hóa. Hàm lượng mỡ trong trứng ở

Chất lượng lòng trắng

dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng acid béo không no rất cao,

Tỷ lệ lòng trắng chiếm 55 - 60% khối lượng trứng nếu nhìn bằng mắt

hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt và phospho. Thành phần

thường những trứng tươi sẽ có lòng trắng màu hơi vàng, những trứng để lâu

khoáng trong trứng có thể thay đổi thông qua khẩu phần ăn của gia cầm đẻ

màu lòng trắng sáng hơn.

Rose [27]. Theo Gilbert [16] trong một lòng đỏ trứng có khối lượng 19g có

Theo Rose [27]; Krax [34] và Pingel [35] cấu trúc lòng trắng được chia ra

chứa: 10,5mg natrium; 17,9mg kalium; 25,7mg calcium; 2,6mg magecium;

làm 3 lớp đó là: Lớp lòng trắng loãng bên ngoài 23%, Lớp lòng trắng đặc ở

1,5mg sắt; 29,8mg lưu huỳnh; 24,7mg clo; 98,4mg phospho. Hàm lượng

giữa 57%, Lớp lòng trắng loãng trong cùng 20%.

vitamin trong trứng cao: 200-800UI vitamin A; 20UI vitamin D; 49µg vitamin B1;

Độ quánh của lòng trắng đặc (chủ yếu là sợi mucin) giảm đi theo tuổi gia

84µg vitaminB2; 30µg acid nicotinic; 58 µg vitaminB6; 580µg acid pantothenic;

cầm. Tỷ lệ lòng trắng đặc và lòng trắng loãng ở trứng gà tươi là 2:1, tỷ lệ này

10µg biotin; 4,5µg acid folic; 0,3µg vitamin B12; 150µg vitamin E; 25µg vitamin

giảm dần theo thời gian bảo quản có khi xuống tới tỷ lệ 1: 1. Lòng trắng trứng

K1.

có tác dụng hấp thụ cũng như cung cấp các chất dinh dưỡng cho phôi. Chiều
cao lòng trắng đặc là một chỉ tiêu đánh giá chất lượng bên trong của trứng.

* Thành phần hóa học của lòng trắng
Lòng trắng là nơi dự trữ khoảng 88% nước của trứng Rose [27]; Vogt [36]
phần còn lại là protein như globulin, ovomucin và albumin. Ovomucin chiếm

Chất lượng lòng đỏ
Lòng đỏ trứng là một tế bào khổng lồ được bao bọc bởi một lớp màng, đây

75% tổng protein trong lòng trắng. Globulin chiếm khoảng 20%. Thành phần

cũng là nguồn dinh dưỡng dự trữ của phôi. Tỷ lệ lòng đỏ chiếm 30 đến 33%

hóa học lòng trắng trứng ở tất cả các loại trứng gia cầm đều giống nhau. Lòng

khối lượng trứng và có đường kính khoảng 30 đến 35mm. Lòng đỏ trứng có cấu

trắng đặc có hàm lượng ovomucin gấp 4 lần lòng trắng loãng, đây chính là

tạo như sau: Lớp màng dày dày 6 - 11 µm; đĩa phôi màu trắng sáng có đường

nguyên nhân tạo nên cấu trúc keo của lòng trắng. Độ pH của lòng trắng trứng

kính 3mm. Để đánh giá chất lượng lòng đỏ người ta dùng chỉ số lòng đỏ. Chỉ số

gà tươi là 7,6; sau 14 ngày bảo quản chúng có thể tăng lên 9,2 Rose [27] Và

này được xác định bằng tỷ lệ giữa chiều cao lòng đỏ so với đường kính lòng đỏ.

Hartfiel [33].

Kết quả nghiên cứu trên gà Ri của Nguyễn Hoài Tao và cs [10], Nguyễn Văn
Thạch [11] cho biết chỉ số lòng đỏ trứng là 0,43. Chỉ số lòng đỏ ở gà xương đen

mỡ trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron. Hàm

Thái Hòa Trung Quốc là 0,46 Vũ Quang Ninh [7].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

*Thành phần hóa học của lòng đỏ
Lòng đỏ trứng gà có chứa 49% nước, 16% protein và 33% mỡ. Hai phần ba

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




8

9

lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50% tùy thuộc vào thời gian

mã gọi là vùng điều khiển (Displacement loop hay D-loop), trên đó có các

và điều kiện bảo quản. Hàm lượng mỡ trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi

promotor của quá trình sao chép và phiên mã của mtDNA. Phân tử mtDNA

theo khẩu phần ăn, chỉ riêng thành phần acid béo không no như palmitin và

có các đặc điểm đáng chú ý sau:

acid stearic là không thay đổi. Hàm lượng acid béo này duy trì ở mức 30-38%
trong tổng số chất béo. Nếu khẩu phần ăn chứa nhiều acid béo không no mạch
đa (PolyUnsaturated Fatty Acid - PUFA) hàm lượng acid béo không no mạch

- Tốc độ tiến hóa phân tử của mtDNA nhanh gấp 5-10 lần so với các gen
trong nhân.
- Phân tử mtDNA là đơn bội, không tái tổ hợp.

đa trong mỡ trứng cũng tăng lên Rose [27]. Theo Creger [32] trong một trứng

Các kiểu đơn bội (halotype) khác nhau của mtDNA có thể được sử dụng

gà nặng 54g có chứa các acid béo không no là: 2,1g acid béo olêic; 1,2g

làm các dấu hiệu chỉ thị trong việc phát hiện sự khác biệt di truyền theo dòng

linoleic; 0,16g linolenic; 0,13g arachidonic và các acid béo no là: 1,3g

mẹ của các quần thể nuôi nhốt và các quần thể hoang dại.

palmitinic; 0,4g stearic; ngoài ra còn có khoảng 0,2g lipoid khác. Do vậy tổng

Vùng điều khiển là vùng tiến hóa nhanh nhất của mtDNA, nó tích lũy các

acid béo lên tới 5,5g. Thông thường tỷ lệ acid béo không no và no là 2:1.

đột biến cùng với sự thêm đoạn, mất đoạn với tỷ lệ cao gấp 5-10 lần so với

1.3.2. Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể

các gen của ty thể. Vì thế, việc xác định trình tự nucleotide đoạn điều khiển

1.3.2.1. Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể

mtDNA là công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân

Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí. Ty thể là
trạm chuyển hóa năng lượng từ các phân tử hữu cơ thành dạng năng lượng

tích lũy trong phân tử ATP. Ty thể có chứa DNA ty thể nó là một hệ di truyền
độc lập với hệ di truyền của nhân tế bào.

nhánh tiến hóa bên trong và giữa các quần thể trong cùng một loài.
1.3.2.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà
Toàn bộ 16.775 bp trong genome ty thể của gà Leghorn đã được xác định
trình tự, chúng mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA. Một số gen mã

DNA ty thể (mtDNA) là sợi kép với cấu trúc vòng, có chiều dài khoảng

hoá protein hoặc tRNA là các gen nằm gối lên nhau (overlapping genes) [15].

5µm, chiếm từ 1- 5% DNA của tế bào. Phân tử mtDNA tự tái bản theo kiểu

Các protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoryl hoá

bán bảo toàn nhờ hệ enzyme DNA polymerase có trong chất nền của ty thể

trong ty thể. Các gen mã hóa cho các protein này đều được dịch mã bởi cùng

và xảy ra ở gian kỳ của chu kỳ phân chia tế bào. Khác với DNA của nhân,

một bộ mã di truyền. Genome ty thể gà có ba đặc điểm riêng, khác lớp thú và

mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tương tự

lưỡng cư:

với DNA của vi khuẩn, mtDNA là một trong các nhân tố quyết định tính di

- Theo chiều 5‟- 3‟ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 đến vùng D-loop là các

truyền tế bào chất. Các gen nằm trên mtDNA mã hóa cho nhiều

gen cytochrome b, tRNA(Thr), tRNA (Pro), ND6 và tRNA (Glu); trong khi ở

protein/enzyme và RNA của ty thể.

các động vật khác, gen cytochrome b lại nằm gần vùng điều khiển hơn. Trật

Ở phần lớn các động vật có xương sống, mtDNA có chiều dài khoảng

tự này được bảo toàn trong các loài thuộc bộ gà (Galliformes) [24].

16,8 kb. Trên mtDNA, ngoài các gen cấu trúc còn có một vùng không mang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




10

11

- Một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự

DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp. Tốc

nằm giữa hai gen tRNA(Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả các động vật có

độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể

xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà không có đặc

là do ty thể thiếu hụt các cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến

điểm này [24].

nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn xảy ra ngay cả

- COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì ATG. Toàn
bộ genome ty thể gà (Gallus gallus) được tổ chức như sơ đồ trong hình 1.1.

trong cùng một loài.
Số lượng ty thể có biến đổi về mặt di truyền trong tế bào tùy thuộc không
những vào số ty thể nó được thừa hưởng từ mẹ mà còn vào các yếu tố gây đột
biến trong môi trường. Những biến dị ở genome ngoài nhân không giống
nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau. Đây
là một trong số các ví dụ cho thấy rằng có rất nhiều biến dị trong mã di
truyền của ty thể nhưng không có hại đối với cơ thể mang đột biến.
Trong hầu hết các trường hợp, mã di truyền là phổ biến. Tuy thế, vẫn
có một số ngoại lệ trong di truyền học ty thể. Dưới đây là một số trường hợp
mà người ta đã biết.
Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể

Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà

Đặc điểm di truyền
Di truyền ty thể là di truyền theo dòng mẹ. Trong thực tế, có đến 99%
ty thể của tế bào con thừa hưởng từ mẹ do bào quan này nằm trong tế bào
chất của tế bào trứng. So với trứng, tinh trùng có một số lượng các ty thể chỉ
bằng 0,1% - 1,5%, số lượng này đảm bảo năng lượng giúp tinh trùng vận
động trong quá trình thụ tinh. Khi tham gia thụ tinh, ty thể của tinh trùng bị
loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc ubiquitin. Đôi khi cơ chế này
diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt của hai dòng ty thể của cả bố lẫn
mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này được gọi là dị tế bào chất

Bộ ba

Mã của gen nhân

Mã của gen ty thể

AUA, AUU

Ile

Met

UGA

Stop

Trp

AGA, AGG

Arg

Stop

DNA ty thể và vai trò của vùng D-loop trong vấn đề định loại gà
Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn
theo Baker và Marshall (1997), bao gồm các đoạn I, II và III. Trong đó đoạn
II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp
của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ. Thông thường, vùng
biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III [20]. Đoạn này bắt đầu với cụm
trình tự bảo thủ 1 (Conserved Sequence Block 1- CSB-1). Yếu tố phiên mã

(heteroplasmy).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




12

13

của ty thể (mtTFA) có thể bám vào trình tự này và chuyển DNA ty thể từ quá

Năm 1990, Desjadins và Morais đã công bố toàn bộ trình tự mtDNA của

trình phiên mã sang quá trình sao chép khi một yếu tố khác kết hợp vào phức

gà nhà (Gallus gallus) với tổng chiều dài 16775bp. Với trình tự này, các nhà

hệ mtTFA - CSB - 1.

khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa

Vùng điều khiển của DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần

các đối tượng thuộc bộ gà [15].

với các gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ

Năm 1994 - 1995, Fuhimito và cộng sự [23] đã nghiên cứu mối quan hệ

rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài

chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, chim cun cút... dựa trên các phân

và giữa các quần thể cùng loài. Chính vì thế mà các gen trong genome ty thể

tích đoạn điều khiển ty thể. Kết quả phân tích tính đa hình chiều dài các đoạn

và vùng D-loop đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu

giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra

thuộc lĩnh vực phân loại học phân tử. Như vậy, DNA ty thể có thể được coi là

một sơ đồ phân loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định được trình tự

một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng

của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA. Kết quả nhận được đã chỉ ra

loại hay sự tiến hóa của các quần thể.

sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm

1.3.2.3. Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà

đặc trưng của giống Gallus.

Phân loại học cổ điển trên các đối tượng thuộc bộ gà chủ yếu dựa vào các

Randi và cộng sự [16]; Scott [20] phân tích trình tự của một phần đoạn

đặc điểm bộ lông bên ngoài của con trống, đó là những đặc điểm sinh dục thứ

điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ

cấp. Những đặc điểm này mang một tiềm năng biến đổi nhanh chóng qua các

ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này.

thế hệ nên không được coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa

Năm 1999, Kimball và cộng sự [18] cũng dựa trên sự phân tích trình tự

giữa các loài. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có

đầy đủ của gen cytochrom b (1143bp) và đoạn siêu biến 1(350bp) của vùng

thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa

điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài trĩ và

và phát sinh chủng loại ở các loài. Khi đó, mtDNA với những ưu điểm nổi bật

gà gô. Hai cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên

đã được chọn làm đối tượng để nghiên cứu.

hai đoạn gen cho thấy sự khác nhau là rất ít. Như vậy chỉ với việc phân tích

1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới
Trong hơn 30 năm qua, việc nghiên cứu DNA ty thể đã và đang được
phát triển tương đối rộng rãi. Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên

một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết
quả phân tích trên toàn bộ gen cytochromb, điều này cho thấy trình tự vùng
điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại.

cứu ở mức độ phân tử trên các đối tượng vi sinh vật, côn trùng, cá, chim, thú,

- Zhang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nuleotide đầu tiên trong

các loài thực vật và con người với nhiều mục đích khác nhau. Dưới đây là

vùng D-loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và

một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà (Galliformes):

so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus
sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố trong Ngân hàng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




14

15

Gen Quốc tế. Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa

Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á. Như vậy có thể thấy trình tự nucleotide

trên trình tự vùng D-loop. Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có rất

của vùng D-Loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di

nhiều điểm khác nhau. G. g. domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất với

truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý.

G. gallus của Thái Lan và các vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu đã giả thiết

1.3.2.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G. gallus ở các nơi này
và hai loài phụ G. g. gallus, G. g. spadiceus có thể thuộc một loài phụ do
tính tương đồng cao giữa chúng [22], [30].

Ở gà Ri và gà Mông đã có một số công trình nghiên cứu được công bố về
năng suất phẩm chất, thành phần hóa sinh trứng [5].
Ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về gà Sao mới chỉ tập vào các lĩnh

- Pereira và cộng sự đã tìm được ít nhất 13 gen giả (pseudogene hay

vực khả năng sinh trưởng, năng suất, phẩm chất thịt, thành phần hóa sinh thịt,

Numt) trong genome của G. gallus với kích thước dao động từ 131 đến 1733

khả năng sinh sản, năng suất trứng... Hiện nay, chưa có công bố nào nghiên

nuleotide. Đây là các đoạn DNA ty thể được tìm thấy trong hệ gen nhân của

cứu về thành phần hóa sinh trứng gà Sao.

sinh vật nhân thật. Một số trong chúng có nhiều điểm tương đồng với các

Cho đến nay ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử

đoạn trong ty thể. Do đó, chúng có thể được dùng trong các nghiên cứu mối

trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng

quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm đối tượng

sự [14] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên

nghiên cứu. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa xác định được tần số bắt gặp của

vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi lam đuôi trắng

Numt cũng như đóng góp của nó đối với genome trong nhân [24].

(L. hatinhensis), trĩ bạc (L. nycthemera) và gà lôi hông tía (L. diardi). Từ đó

Komiyama T và đồng tác giả [19] đã tiến hành phân tích trình tự vùng

xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển mtDNA của 3 loài

D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà

gà lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn đề này cần phải xác

địa phương của Nhật bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà

định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà lôi nói trên.

Lông đỏ (Jungle Fowl) đã được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế

Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [2] đã tạo dòng phân tử đoạn gen

EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup). Trên cơ sở đó họ đã lập

điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector

cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ

pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide

gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có

vùng D-Loop.

chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau. Hơn

Năm 2006 Địch Thị Kim Hương và cộng sự [3] đã xác định được trình tự

thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn

vùng D-Loop gồm 1227 nucloetide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lương

có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với

Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucloetide giữa hai đại diện.

Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đế giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật

Năm 2007 Lê Đức Long và cộng sự [4] đã giải trình tự và so sánh trình tự

Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng

nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






16

17

Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm

2.1. VẬT LIỆU

1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác

Vật liệu nghiên cứu là mẫu trứng, máu của các giống gà:

biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

- Gà Ri Hưng Yên (Rhy): Lông vàng, da vàng, chân vàng.

Hiện nay TS. Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm đề tài
cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội" trong đó có
giống gà Mông và gà Ri.

- Gà Mông Nghệ An (Mna): Lông trắng, xương đen, thịt đen.
- Gà Sao dòng trung (Sdt): Lông xám đen điểm các đốm trắng tròn nhỏ.
Các giống gà trên được nuôi thử nghiệm trong trại giống gà của trường

Đến nay, chưa có công bố về trình tự vùng D-loop gà Ri và gà Sao. Trong

ĐHNL Thái Nguyên theo dự án gà sạch.

phạm vi đề tài, chúng tôi tiếp tục so sánh thành phần hóa sinh trứng qua hàm

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

lượng protein, lipit, vật chất khô và xác định trình tự vùng điều khiển D-loop

2.2.1. Hóa chất

ty thể của ba mẫu giống gà: gà Ri, gà Mông Nghệ An và gà Sao.

Petroleum ether, axít sunfuric đậm đặc 98%, NaOH 1N, H3BO3 4%, chỉ thị
Tasiro, H2O2 30%, dung dịch H2SO4 0,1N.
Dung dịch đệm phốt phat citrate, dung dịch đệm Tris tổng hợp (Tris

0,125M, SDS 2%, ß - rccapthanol) được pha theo tỷ lệ 3:1:1.
Dung dịch A Na2CO3 2% trong NaOH, dung dịch B CuSO4 0,5% trong
natricitrat 1%, dung dịch C hỗn hợp dung dịch A với B theo tỷ lệ 49:1 chỉ pha
trước khi dùng, thuốc thử folin, Ba(OH)2.
Proteinase K (20mg/ml); Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1);
Chlorofom: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0,8%; RNase (10mg/ml); Tris-HCl
(0,1M; pH7,5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium Bromide.
Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma.
Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2g;
Na2HPO4 1,44g; KH2PO4 0,24g. Dẫn nước đến 100ml.
Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8);
EDTA (10mM, pH8); NaCl 0,1M; SDS 2,1%.
Dung dịch đệm TAE dùng trong kỹ thuật điện di: Tris base; CH3OOH;
EDTA (0,5mM, pH8).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




18

19

Bộ hóa chất dùng cho PCR ( dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt,…).
Bộ hóa chất CloneJET

TM

PCR Cloning của hãng Fermentas

Bộ hóa chất BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing.
Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB đặc, LB lỏng, SOC.
- Các dung dịch tách chiết DNA plasmid: Dung dịch I (Sol I); Dung dịch II
(Sol II); Dung dịch III (Sol III).

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh
2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, tỷ lệ lòng đỏ
Sử dụng phương pháp cân bằng cân kỹ thuật có độ chính 10-4, xử lý số
liệu trên máy vi tính.
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng nước
Cân 3 mẫu trứng (lòng đỏ, lòng trắng, vỏ) của mỗi giống trên cân điện tử

2.1.2. Thiết bị
Các thiết bị và hóa chất được sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm
hóa sinh - ĐHSP Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và
Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học.

rồi cho vào tủ sấy ở 60oC trong 3 - 5 ngày, sau đó lấy mẫu ra cân lại cho tới
khi khối lượng không đổi.
Hàm lượng nước được tính theo công thức:

N=

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Pt

Pk
Pt

100 %

Trong đó: N: Hàm lượng nước (%)

Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Tủ lạnh sâu - 20ºC, - 84ºC

Sanyo, Nhật Bản

Pt: Khối lượng mẫu tươi (g)

Máy li tâm

Sorvall

Pk: Khối lượng mẫu khô (g)

Máy đo pH

Mettler, Anh

Lò vi sóng

Samsung, Hàn Quốc

Cân phân tích

Metter Toledo, Thụy Sỹ

Pipetman các loại

Gilson, Pháp

Nguyên tắc: Dựa vào tính hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ (ete,

Máy điện di

PowerPac 300, Mỹ

benzen, chloroform...) để chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu.

Máy PCR - PTC100

MJ Research, Mỹ

Máy làm khô chân không

Speed Vac Sc 110A-Savan, Mỹ

Máy chụp ảnh

Bio-Rad, Mỹ

Máy khuấy trộn

OSI, Rotolab

Máy xác

định trình

2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số
Định lượng lipid tổng số theo phương pháp chiết bằng petroleum ether và
cân trọng lượng đầu và cuối [13].

Tiến hành: Cân 0,05g mẫu đã sấy khô tuyệt đối nghiền nhỏ cho vào
tube, cho 1,5 ml petroleum ether vào ống đã chứa mẫu, lắc đều trên máy
Vortex 15 phút. Tiến hành chiết 3 lần.

tự tự động Applied Biosystems, Mỹ

ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyser
Máy Gene Amp PCR System 9700

Applied Biosystems, Mỹ

Bể ổn nhiệt

Tempette Junior Tech

Chiết lần 1: Mẫu cho vào 3 tube đổ dung môi hữu cơ theo mức quy định

để vào tủ lạnh nhiệt độ 4oC trong 24 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Chiết lần 2: Cho petroleum ether vào theo mức quy định, để vào tủ lạnh ở
nhiệt độ 4oC trong 12 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.

Máy quang phổ; Tủ cấy vô trùng; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng...
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




20

21

Chiết lần 3: Cho petroleum ether vào theo mức quy định để vào tủ lạnh

cường độ của phức chất với thuốc thử folin. Tuy nhiên phương pháp này

o

không dùng để định lượng các protein không chứa vòng thơm.

độ 4 C trong 8 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Lấy vài giọt dịch chiết lên lam kính hơ nhẹ cho petroleum ether bay hết,

Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch C và dịch chiết protein, cho vào mỗi

soi lên kính. Nếu thấy lam kính trong suốt chứng tỏ mỡ trong mẫu đã hết. Sấy

ống nghiệm 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml mẫu + 0,5ml folin để 30'

khô các tube đã chiết ở nhiệt độ 105oC, cân đến khối lượng không đổi.

đem đo trên máy quang phổ bước sóng 750nm.

Tính kết quả hàm lượng lipid được tính theo công thức:
L =

A

B
A

Ống đối chứng 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml folin
Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch

100 %

protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được

Trong đó: L: Hàm lượng lipid (%)

dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml.

A: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
B: Khối lượng mẫu sau khi chiết lipid (g)

2.3.1.4. Định lượng Protein (theo phương pháp Lowry)
Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và

Tính kết quả: Kết quả trên máy quang phổ xác định được khối lượng
protein trong 0,25ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml). Từ đó tính hàm
lượng protein trong nguyên liệu (%) theo công thức:
% protein =

protein (phản ứng Biure). Chất này tác động với thuốc thử folin cho màu đặc
trưng cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời
có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm.

a

P

Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ
P: hệ số pha loãng (200)

Thuốc thử folin có tác dụng với gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để
tạo nên phức chất màu. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên
trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol,
pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc các hợp chất chứa nhóm - SH, các

g: số mg mẫu cần phân tích
2.3.1.5 Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thu được theo phương pháp thông kê sinh học trên máy vi
tính bằng chương trình Excel [6] với các thông số:

axit tự do Tyr, Trp. Hoặc cường độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có

mặt của etanol, ete ở nồng độ cao hơn 5%; axeton; Ba(OH)2 ở nồng độ hơn

n

Giá trị trung bình X

Xi
X

1%, axit Cl3COOH, hay HClO4. Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác dung

i 1

n
n

Xi

dịch protein với thuốc thử folin phải được tinh sạch.
Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung

Độ lệch chuẩn SX

SX

i 1

SX

i 1

n

Xi

khá phổ biến với các mẫu đã loại bỏ các chất gây tác động tăng hoặc giảm



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

X

2

n

dịch chứa mẫu vài chục g protein. Vì vậy phương pháp này được áp dụng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

100%

g

n 1

X

(n

30)

(n

30)

2




22

mX

Sai số trung bình m X
mX

23

SX
n
SX

(n

30)

(n

30)

Bước 6: Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung
500 l cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC, bỏ dịch và thu cặn.

n 1

Bước 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hoà tan cặn trong 50 l H2O, búng nhẹ.
2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose

2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật

Nguyên tắc chung
Điện di là kỹ thuật dùng để tách và định lượng axit nucleic với các kích

Nguyên tắc chung
Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài
nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ
proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol. Cuối
cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.

thước và hàm lượng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của
axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO43- trên bề
mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng và hiệu
điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được sử
dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong thí

Quy trình kỹ thuật

Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia
máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA
tổng số theo phương pháp của Sambrook và Russell [28] các bước như sau:
Bước 1: Hoà tan 500 l máu với 500 l PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p,
15 phút, 4ºC, đổ dịch, thu cặn.
Bước 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 m proteinase K.
Mẫu được ủ ở 65ºC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống
Epp 500 l dịch.
Bước 3: Bổ sung một lượng tương đương Phenol:Chlorofom:Isoamyl
alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC.
Hút pha trên vào ống mới.
Bước 4: Thêm một thể tích tương đương Chloroform:Isoamyl alcohol
(24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15phút, 4ºC. Thu pha trên.
Bước 5: Thêm CH3COONa một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong

nghiệm này, chúng tôi đã dùng gel agrose 0,8 % bởi nồng độ này phù hợp với
kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1 - 20kb).
Quy trình kỹ thuật
Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agarose vào 100ml dung dich đệm TAE.
Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu được dung dịch trong suốt. Để nguội
đến khoảng 50 - 60ºC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lược.
Sau 30 phút gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di có
chứa dung dịch đệm TAE.
Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thích hợp (3 l) với đệm tra mẫu
(2,5 l), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có
hiệu điện thế 100V, dòng 60 - 80mA trong khoảng 30 phút.
Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch
EtBr nồng độ 0,5 l/ ml. Lấy bản gel ra sau 10 -15 phút và rửa trong nước sạch.
Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio-Rad.

ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20º trong 15h (qua đêm).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




24

25

2.3.2. 3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1998. Từ đó đến nay
Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã
có những đóng góp đáng kể cho những tiến bộ về sinh học phân tử [21].

- Cặp mồi H1255 - L16725 chuyên biệt. Ở đây, H (Heavy) và L (Light)
là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuleotide đầu 3‟ của
primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15].
- Bộ hóa chất: dung dịch đệm có chứa NH4+, dNTPs 10mM, MgCl2
10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas.

Nguyên tắc chung
Trong kỹ thuật PCR, người ta sử dụng enzym DNA Taq polymerase đã được
phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp DNA trong môi trường phản
ứng có chứa 4 loại deoxynuleotide (dNTPs) cùng các cặp mồi chuyên biệt. Mồi

được sử dụng ở đây là các oligonuleotide có khả năng kết cặp với một đầu của
DNA khuôn và là nơi bám của DNA polymerase, từ đó mạch tổng hợp được kéo

- Nước khử ion vô trùng.
Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể
tích 25 l như trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen

Nước

10,85 l

Buffer

2,5 l

MgCl2

4 l

dNTPs

2,5 l

Mồi H1255-F

0,5 l

xuống trong khoảng 30 - 60ºC để cho mồi kết hợp với sợi khuôn. Nhiệt độ và

Mồi L16725-R

0,5 l

thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự của mồi.

Taq DNA polymerase

0,15 l

dài. PCR là một quá trình lặp lại, mỗi chu kì gồm có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94 - 95ºC trong
khoảng 1 phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ
trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào.
- Giai đoạn gắn mồi: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của hỗn hợp được hạ

- Giai đoạn kéo dài mạch: Sau khi mồi đã kết hợp được với sợi khuôn,
nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC cho phép quá trình tổng hợp các sợi mới xảy

DNA temp

4 l

Tổng thể tích

25 l

ra. Bước này cần 2 - 5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại.
Sản phẩm cuối cùng của chu kì trước sẽ trở thành nguyên liệu cho chu kỳ
tiếp theo. Sau mỗi chu kì, số lượng DNA đích sẽ tăng lên gấp đôi. Sau một

thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân, nhờ đó người ta có đủ

Chu trình nhiệt
94ºC - 4 phút (94ºC - 1 phút; 50ºC- 1 phút; 72ºC- 1 phút 20 giây) x 30
chu kỳ; 72ºC -10 phút; giữ ở 4ºC.
Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%.

số lượng DNA phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen

Nguyên liệu

Kĩ thuật tách dòng gen bao gồm 4 bước sau:

- DNA khuôn (Template).

Phản ứng ghép nối đoạn AND vào vector đầu bằng pJET1/Blunt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




26

27

Phản ứng nối ghép được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của bộ hóa
chất Gene JET

TM

30 phút. Sốc nhiệt ở 42ºC trong 90 giây sau đó chuyển ngay vào đá và giữ

PCR Cloning Kit. Vector tách dòng trong bộ Kit này là

trong 5 phút. Bổ sung 300 l SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37ºC trong 1 giờ. Cấy

pJET1/Blunt chỉ ghép nối được với những đoạn DNA có đầu bằng hoặc đã

trải các tế bào này trên môi trường LB đặc có bổ sung thêm các thành phần

dược làm bằng hóa. Ngoài ra hãng sản xuất đã cung cấp kèm theo enzyme

như sau: Amp (50 l/ml) và nuôi ở 37ºC qua đêm.

AND blunting có tác dụng làm bằng hóa đầu của đoạn DNA cần ghép nối. Vì
vậy, bộ Kit này phù hợp cho việc tách dòng không chỉ những đoạn gen đầu
bằng mà cả những đoạn gen đầu dính (sản phẩm cắt enzyme giới hạn, sản
phẩm PCR).

*Thành phần các môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
- LB lỏng (môi trường Luria- Bertani): Bacto-Trypton 10g/l; cao nấm
men 5g/l; NaCl 10g/l; NaOH 2mM.
- LB đặc: gồm môi trường LB lỏng có bổ sung Agar - Agar 15g/l.

- Môi trường SOC: Trypton 5 %; cao nấm men 0,5 %; NaCl 10mM; KCl
2,5mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM; Glucose 20mM.
Tách DNA plasmid
Các khuẩn lạc trắng sau khi biến nạp được cấy chuyển, nuôi lắc với tốc
độ 200 v/p trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 37ºC,
15 giờ. Sau đó, lắc đều hỗn hợp nuôi cấy và đổ dịch vào trong ống eppendoft
loại 1,5 ml rồi tiến hành thu plasmid theo quy trình kỹ thuật sau:

Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt

Các sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme taq polymerase trước khi
tiến hành phản ứng ghép nối gen cần làm bằng hóa đầu 3‟ trong một hỗn hợp
phản ứng gồm có 5µl 2X Reaction Buffer; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O;
0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting
được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Phản ứng ghép nối gen được tiến
hành bằng cách bổ sung vào 0,5µl vector pJET1/Blunt Cloning vector
(50ng/µl) và 0,5µl enzyme nối T4 ligase (5u/µl). Hỗn hợp này được để ở
nhiệt độ phòng từ 5-30‟ sau đó dùng để biến nạp vào tế bào E. Coli.
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
Bổ sung 2 l sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả
biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -80oC, giữ trong đá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. Bỏ dịch, thấm khô.
Bổ sung 150 l sol I, vortex cho tan tủa.
Thêm 150 l sol II, đảo nhẹ, và giữ trong đá.
Thêm 150 l sol III, đảo nhẹ, giữ trong đá hoặc để trong tủ lạnh 0ºC trong 5'.
Ly tâm 12000 vòng, 15 phút, 4ºC. Hút dịch sang ống eppendoft mới.

Thêm 1 ml cồn 100%, đảo nhẹ và để lạnh ở -20ºC trong ít nhất là 3 giờ.
Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Thu cặn, rửa tủa bằng EtOH 70%, ly
tâm 12000 v/p trong 5 phút, 4ºC. Làm khô mẫu trong máy hút chân không.
Cho 30 l RNAse 10 g/ ml, búng đều và ủ mẫu ở bể ổn nhiệt ở 37ºC
trong 1 giờ. Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
*Thành phần của các dung dịch tách chiết plasmid:
- Dung dịch I (Sol I): Glucose, Tris- HCl (1M, pH8), EDTA (0,5M, pH 8).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




28

29

- Dung dịch II (Sol II): SDS 10 %, NaOH 0,2M. Pha mới trước khi sử
dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ

- Dung dịch III (Sol III): CH3COOK, CH3COOH (giữ ở tủ 4ºC).
Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn

3.1.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tƣơi
Đây là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng trứng, trứng nhiều lòng

Mục đích của bước này là kiểm tra xem đoạn DNA đích có được chèn
vào vector hay không.

đỏ được nhiều người ưa thích bởi lòng đỏ là nơi tập trung nhiều chất dinh
dưỡng, nhiều loại protein, lipit, các vitamin, axit béo no và không no bổ

Thành phần của phản ứng cắt bao gồm: Buffer Tango 1 l; enzyme
XbaI 0,2 l (10u/ l); DNA plasmid 3 l; H2O 5,6 l (tổng thể tích 10 l).

dưỡng, dễ tiêu... Vì vậy, chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến chỉ tiêu này, kết
quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1. và hình 3.1.

Hỗn hợp này sau đó đem ủ ở 37ºC trong ít nhất 3 giờ. Sau đó sản phẩm

Bảng 3.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tươi (n=30)

được điện di trên gel agarose 0,8%.
Trứng gà

2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA

Tỷ lệ lòng đỏ
(%) X mX

Tỷ lệ lòng trắng
(%) X mX

Tỷ lệ lòng đỏ/
lòng trắng

Vỏ( %)
X

mX

Nguyên tắc chung

Ri (Rhy)

32.7 ± 0,66

57.9± 0,81

0.56

9.4± 0,22

Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của

Mông (Mna)

34.82 ± 0,53

54.05± 0,77

0.65

11.13± 0,13

Sao (Sdt)

29.67± 0,84

54.5± 0,58

0.55

15.9± 0,26

phương pháp Sanger [3]: tạo ra các đoạn oliogonuleotide hơn kém nhau 1
nuleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra

60

các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR

50

sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các

40

hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như dNTPs,

30
20

ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản

10

phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được

0

thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác
nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi

%

Tỷ lệ lòng đỏ Tỷ lệ lòng trắng
Vỏ (%)
(%)
(%)
chỉ tiêu so sánh
Ri (Rhy )

Mông (Mna)

Sao (Sdt)

3,2pM, DNA plasmid 200ng BigDye và nước với tổng thể tích 15 l.
Chu trình nhiệt

Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà thí nghiệm

Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System

Theo kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 tỷ lệ lòng đỏ ở gà Mông cao nhất, thấp

9700 như sau: 94ºC- 1 phút; (96ºC-10 giây; 50ºC- 5 giây; 60ºC- 4 phút) x

nhất ở gà Ri, tỷ lệ lòng trắng gà Ri cao nhất, tỷ lệ vỏ cao nhất ở gà Sao. Tỷ lệ

25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4ºC.

này khá đồng đều ở các nhóm trứng nghiên cứu, đây đều là những giống gà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




30

31

có chất lượng trứng cao được ưa chuộng trên thị trường.

ở Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng

3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô

là 12,41. Ở trứng gà Ác hàm lượng nước lòng đỏ là 49,3% ± 1,9; hàm lượng

Tỉ lệ giữa hàm lượng nước và vật chất khô trong trứng gà là một chỉ tiêu

nước lòng trắng là 88,8% ± 0,4 [9]; Hàm lượng nước ở lòng đỏ trứng nói

quan trọng, rất có ý nghĩa trong việc đánh giá chất lượng của trứng gà. Sau

chung khoảng 49% , hàm lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50%

0

khi tiến hành cân, sấy mẫu trứng gà ở 60 C trong 3 ngày cho đến khi khối

tùy thuộc vào thời gian và điều kiện bảo quản. Như vậy kết quả nghiên cứu

lượng không thay đổi, kết quả được trình bày trong bảng 3.2. và hình 3.2.

phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước, hàm lượng nước và vật chất
khô là tính trạng số lượng, nó phụ thuộc vào giống, nguồn thức ăn và đặc biệt

Bảng 3.2. Hàm lượng vật chất khô trong trứng gà (n = 30)

Lòng đỏ

Trứng gà

X

mX

Lòng trắng
X mX

Vỏ

X

mX

Cả quả

còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản trứng như phần tổng quan đã đề cập.

X

3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số

mX

Ri (Rhy)

47,28± 0,96

13,52± 0,41

9,022± 0,09

50,34± 1,1

Mông (Mna)

50,76± 1,03

14,64± 0,39

9,105± 0,11

52,15± 1,4

lượng trứng. Lipid là một trong những chất dự trữ đem lại giá trị năng lượng

Sao (Sdt)

54,09± 1,17

15,98± 0,53

9,519± 0,25

55,09± 1,3

cao rất cần thiết cho cơ thể sinh vật nói chung và gà nói riêng. Hàm lượng

Hàm lượng lipid tổng số cũng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất

lipit tập trung chủ yếu ở lòng đỏ, lòng trắng hàm lượng lipit không đáng kể.
60

Do đó hàm lượng lipit liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ lòng đỏ/lòng trắng.

% 50

Kết quả đo chỉ tiêu hàm lượng lipid tổng số chiết bằng petroleum ether

40

được trình bày ở bảng 3.3. và hình 3.3.

30

Bảng 3.3. Hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm (n = 10)

20
10
0
Ri (Rhy)

Trứng gà
lòng đỏ

Lòng trắng

Mông ( Mna)

Sao (Sdt)

Vỏ

Cả quả
Chỉ tiêu so sánh

Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng vật chất khô trứng gà thí nghiệm

Hàm lượng nước lòng đỏ, lòng trắng, vỏ và cả quả đều cao nhất ở trứng gà

L.L đỏ (%)
X

mX

L.Ltrắng (%)
X

mX

11.33± 0,3

L. Lđỏ/ L. L tổng số (%)
X mX
Ltrắng
5.65
37.67± 0,58

Ri (Rhy)

64± 0,9

Mông (Mna)

63.33± 0,3

5.33± 0,8

11.88

34.33± 0,3

Sao (Sdt)

64.67± 0,8

6.67± 1.19

9.70

35.67± 0,65

Ri (Rhy): 52,72% ; 86,48% ; 9,78; 49,66 và thấp nhất ở gà Sao (Sdt): 45,91%;
84,02%; 4,81%; 44,91%. Tỷ lệ vật chất khô ở trứng gà Sao là cao nhất và ở
trứng gà Ri là thấp nhất. Tỷ lệ nước lòng đỏ và lòng trắng theo nghiên cứu của
Lê Viết Ly (2001) [5] ở gà Ri là 47,32%; ± 1,137; 87,925 ± 0,109 và vật chất
khô lòng đỏ là 52,616 ± 1,137 và lòng trắng là 12,075 ± 0,109. Còn gà Mông
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




32

33

Bảng 3.4. Hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm (n = 10)
%

70
60

Trứng gà

Pr-Lđỏ (%)
X mX

Pr-Ltrắng(%)
X mX

Pr-Lđỏ/ PrLtrắng

Pr tổng số %)
X mX

Ri (Rhy)

18.32± 0,64

12.86± 0,24

1.42

15.59± 0,42

Mông (Mna) 16.31± 0,51

12.94± 0,33

1.26

14.63± 0,39

14.2± 0,49

1.43

17.24± 0,51

50
40
30
20

Sao (Sdt)

10
0
L.Lòng đỏ (%)

Ri (Rhy)

L.Lòng trắng (%)

Mông (Mna)

L. Lđỏ/ L. Ltrắng

L tổng số (%)

%

Sao (Sdt) Chỉ tiêu so sánh

20.27± 0,82

25
20

Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm

15

Qua bảng 3.3. và hình 3.3. ta thấy hàm lượng lipid lòng đỏ cao nhất ở gà

10

Sao (Sdt) và thấp nhất ở gà Mông (Mna). Theo tác giả Rôse [27] thì hai phần

5

ba lipit trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron. Hàm

0
Pr-Lđỏ

lượng mỡ trong trứng ở dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng

Ri (Rhy)

acid béo không no rất cao, hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt
và phospho.Vì vậy lòng đỏ trứng được nhiều người ưa chuộng, hàm lượng mỡ
trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi theo khẩu phần ăn.
Lipit lòng trắng cao nhất ở gà Ri và thấp nhất ở gà Mông. Như vậy, ta thấy
rằng hàm lượng lipid tổng số cao nhất ở trứng gà Ri (37.76%) thấp nhất ở trứng
gà Mông Nghệ An (34.33%). Nếu so sánh với kết quả nghiên cứu trên trứng gà
công nghiệp của Rôse [27] thì hàm lượng lipit của các giống gà trên cao hơn
hẳn. Tỷ lệ lipit lòng đỏ/lòng trắng cao nhất ở gà Mông, thấp nhất ở gà Ri.
3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số
Hàm lượng protein là một chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá
giá trị dinh dưỡng của trứng gà. Bằng phương pháp Lowry với máy đo quang
phổ, chúng tôi đã thu được kết quả hàm lượng protein thô ở trứng gà của các
giống nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. và hình 3.4.

Pr-Ltrắng (%)

Mông (Mna)

Pr-Lđỏ/ PrLtrắng

Sao (Sdt)

Pr tổng số (%)
Chỉ tiêu so sánh

Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm

Qua bảng 3.4. và hình 3.4. ta thấy hàm lượng protein tổng số cao nhất ở
trứng gà Sao (17,24%) và thấp nhất ở trứng gà Mông (14,63%). Đặc biệt hàm
lượng protein lòng đỏ rất cao 20,27%. Gà sao là giống gà đẻ trứng tập trung 6
tháng liền từ tháng 3 đến tháng 9 (âm) sau đó người ta thu hoạch thịt gà
trưởng thành và nuôi lứa khác nên điều này rất có ý nghĩa kinh tế. Kết quả
nghiên cứu trên có thể đưa ra một định hướng về chăn nuôi gà Sao, một giống
gà rất có giá trị kinh tế, dễ nuôi.
Theo kết quả nghiên cứu trên lòng đỏ của trứng gà Ác [9] có hàm lượng
protein là 17,6% ± 0,5 thì hàm lượng protein lòng đỏ của trứng gà ri cao hơn.
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác [33].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu trên gà
Mông nuôi tại Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ protein lòng đỏ là 16.66%, lòng trắng
11,01%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




34

35

3.2. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ

môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt

Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống

động của các nuclease bị ức chế. Như vậy, cả SDS và EDTA đều tham gia

gà Ri, Mông, Sao chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng,

bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có

dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, tách dòng nhằm xác

trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. Hơn thế, pH

định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này để tìm ra sự khác biệt

kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định cấu trúc hơn do bản

giữa chúng.

chất tích điện âm của nó; đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA

3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà

với protein histon.

Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu nhận

Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp

và tinh sạch một lượng axit nucleic đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên

Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động

vẹn cho các thí nghiệm tiếp theo. Một trong những mối quan tâm hàng đầu

của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu

của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy

trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha

của chúng. Các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ

nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình

học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzym phân giải

tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm ba pha:

thoát ra môi trường khi các màng tế bào bị phá vỡ). Để đạt được hiệu suất và

pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, và

độ tinh sạch cao nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều

pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước

ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử

được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn

dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu, cho nên chúng tôi đã lựa chọn

hợp Chloroform:Isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong

phương pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russell để

dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần.

tách chiết DNA [28].

Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 l CH3COONa 3M, pH5,2

Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39ºC trong 1 giờ. Trong điều

và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử

kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ

DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp

được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein

với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nuleotide giảm,

như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng.

do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện - 20ºC trong 15 giờ thì DNA kết tủa

Sau khi rã đông, đem ly tâm dung dịch máu đã được hòa tan trong dung dịch

gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng EtOH 70%, làm khô và hòa tan tủa trong

đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu. Các tế bào

nước. Trong dung dịch lúc này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại

thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự

RNA bằng RNAse, ủ ở 37ºC trong 2-3 giờ. Hòa tan DNA tinh sạch trong

có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài

nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






36

37

Kết quả được thể hiện trên hình 3.5.

Sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 [3] để nhân vùng D-Loop từ mẫu
DNA tổng số đã thu được. Các thông tin về cặp mồi này như sau:
L16725 (Tm = 60ºC): 5‟-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3‟(19 nuleotide)
H1255 (Tm = 55ºC): 5‟-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3‟(21 nuleotide)
Cặp mồi H1255 - L16725 được lựa chọn bởi vì đây là cặp mồi “bảo thủ”,
nó có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ Gà
(Galliformes) [3]. Khi sử dụng cặp mồi này, chúng tôi dự tính sẽ nhân được
đoạn điều khiển có kích thước 1227 bp.
PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng

Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di DNA tổng số
M: Marker DNA lamda; 1. DNA tổng số của gà Ri;
2. DNA tổng số của gà Mông; 3. DNA tổng số của gà Sao

Kết quả điện di cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Mông,
Sao đều sáng tập trung và tương đối rõ nét, không có những “mảnh vụn” tạo
nên vệt sáng kéo dài phía dưới. Hai băng DNA thu được có kích thước tương
đương với vạch 21kb của marker DNA lamda Như vậy, có thể sơ bộ đánh
giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để dùng
cho các thí nghiệm tiếp theo.

Chu trình nhiệt của PCR
Điều quan trọng nhất là sự lựa chọn và tìm ra nhiệt độ gắn mồi thích hợp.
Nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn Tm của các cặp mồi được sử dụng từ 3 - 5ºC
để cho mồi có thể bắt cặp tốt với DNA khuôn. Tổng số chu kỳ chúng tôi tiến
hành là 30, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính như sau:
- Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thường khoảng
94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ được hoạt
tính. Thời gian biến tính tuỳ thuộc vào hàm lượng G - C và chiều dài của phân

3.2.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể
D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có
xương sống. Vùng này có chứa các điểm khởi đầu sao chép và các promoter
phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trưng tích lũy các đột biến cao gấp 5-10
lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA trong nhân, D-loop trở
thành vùng ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát
sinh chủng loại của sinh vật. Vì thế, để đánh giá tính đa dạng di truyền của
các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Mông, Sao, chúng tôi chọn trình tự nuleotide
của vùng D-loop như một công cụ để nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cũng như thành phần và nồng độ các chất tham gia.

tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94oC trong 1 phút. Trước khi
bước vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ được đặt 95 oC trong 3 phút để đảm bảo
phân tử DNA được biến tính hoàn toàn.
- Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là
55ºC nên nhiệt độ gắn mồi có thể từ 50 - 52ºC. Chúng tôi đã thử chạy phản
ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt
độ gắn mồi tối ưu trong thí nghiệm là 50ºC.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ tăng đến 72ºC để cho
enzym Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Tốc độ tổng hợp của phản ứng



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

38

39

khoảng 1000 nuleotide/phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước

bị cô lập, dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử

1227 bp nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi được lựa chọn là 1 phút 20 giây.

nghiệm, chúng tôi thấy, nồng độ của các dNTP 1mM là phù hợp.

Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, chúng tôi đặt nhiệt độ lên 72ºC trong 10 phút

- Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn được tinh sạch và ít bị

để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ ở

đứt gãy có chứa trình tự đích cần nhân lên. Thông thường, hàm lượng DNA

nhiệt độ 4ºC.

khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10-100ng/phản ứng. Sản phẩm PCR
được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và bảo quản ở 4ºC.

Thành phần và nồng độ các chất tham gia
Tham gia vào phản ứng này là 7 thành phần thiết yếu, đó là: Taq DNA
polymerase, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, các dNTP, DNA khuôn và nước.

Trong đó có 3 thành phần thường thay đổi trong từng phản ứng là: mồi,
MgCl2 và DNA khuôn.
- Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong một môi trường đệm phù hợp
với hoạt động của enzym có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, sau khi
khảo sát, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4+ của hãng Fermentas, nó
phù hợp với hoạt động của enzym Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng
về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lượng sản phẩm tốt
hơn so với loại đệm không có chứa NH4+.
- Mồi: là một yếu tố rất quan trọng trong PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ
gắn mồi và nồng độ của mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm thu được.
Nồng độ mồi xuôi và ngược sử dụng trong thí nghiệm này là 10 pmol/ l.
- MgCl2: Vai trò của ion Mg2+ là tạo phức với dNTP và gắn chúng với
enzym, kích hoạt và tăng cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg 2+
quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzym. Tuy nhiên, nếu nồng độ này quá
cao sẽ ức chế hoạt động của enzym. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ
Mg2+ là 10mM cho kết quả PCR tốt nhất.

M: Marker; 1: Mẫu gà Ri; 2. Mẫu gà Mông; 3. Mẫu gà Sao

Theo ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA nằm ở
vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thước chuẩn (marker); kích
thước phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán
theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung chứng tỏ sản phẩm PCR
đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng D-loop. Sản phẩm PCR đặc hiệu,
chương trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham gia phản ứng là phù hợp.
Các sản phẩm PCR được trực tiếp sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3 Tách dòng và xác định trình tự vùng D-Loop của DNA ty thể

- 4 loại dNTP: Nồng độ của mỗi loại dNTP đều phải bằng nhau và phụ
thuộc nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2.

Nồng độ của các dNTP lớn hơn 4 mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hình 3.6. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR



3.2.3.1. Tách dòng vùng D-Loop
Để tạo điều kiện cho việc xác định trình tự vùng D-loop, chúng tôi tiến
hành tách dòng phân tử đoạn này với kích thước 1,3 kb đã nhân được bằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




40

41

cặp mồi L16725- H1255. Chúng tôi đã sử dụng vector pJET1/Blunt để tách

như sau: 5µl đệm phản ứng 2X; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme

dòng vùng D-loop. Vector pJET1/Blunt có kích thước khoảng 3,1kb (3128

làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở

nucleotide), đây là vector tách dòng thế hệ mới của hãng Fermentas, mới

nhiệt độ 70oC trong 5‟. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng ghép nối sản

được sử dụng tại các phòng thí nghiệm. Nó có chứa điểm khởi đầu sao chép

phẩm PCR đã được làm bằng hóa vào 0,5µl vector pJET1 (50ng/µl) bằng

nên có khả năng sao chép độc lập với các gen của tế bào chủ E.coli. Trên

0,5µl enzyme T4 DNA ligase (5u/µl).

vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào mang

Lấy 3µl sản phẩm ghép nối này để biến nạp vào tế bào khả biến E.coli

vector này mới có thể sống dược trong môi trường có Amp. Đồng thời, trên

dòng DH5α. Các tế bào khả biến được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ

vector này còn có chứa gen gây chết Eco47IR, mã hóa cho enzyme nuclease

sung Amp (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều

phân hủy DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy, vector được gắn

khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các

thêm gen ngoại lai sẽ làm lệch khung đọc của gen Eco47IR khiến enzyme

plasmid này có thực sự đã mang đoạn gen đã nhân được bằng kỹ thuật PCR,

được tổng hợp không còn hoạt tính như trước nữa dẫn đến sự không phân hủy

chúng tôi tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.

được DNA nhân của tế bào chủ. Nhờ có Eco47IR mà quá trình lựa chọn

Tách chiết plasmid

khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Vùng P lacUV5 điều

Các tế bào sau khi nuôi cấy được thu nhận bằng ly tâm ở 6000 v/p, 6

khiển sự biểu hiện của gen Eco47IR một cách đầy đủ mà không cần đến chất

phút, 4ºC. DNA tồn tại trong tế bào vi khuẩn E. coli gồm hai dạng: DNA

cảm ứng IPTG.

nhiễm sắc thể có dạng mạch thẳng và DNA plasmid dạng mạch vòng. Để thu

Thêm vào đó, vùng MCS (Muntiple Cloning Site) của vector có điểm

nhận và tinh sạch DNA plasmid, chúng tôi tiến hành xử lý tế bào thu được

nhận biết của nhiều enzyme cắt hạn chế như Kpn2I, XhoI, XbaI… nhằm phục

sau khi nuôi cấy bằng các dung dịch I, II, III. Dung dịch I (sol I) có tác dụng

vụ cho việc cắt kiểm tra sau khi tách dòng. Ngoài ra, vector mang trình tự 2

rửa sạch tế bào và hòa tan tế bào. SDS trong sol II có tác dụng phá màng và

mồi PJET1 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho

cùng với EDTA trong sol I sẽ gắn chặt với Mg 2+ làm ức chế hoạt động của

phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ

các nuclease, nhờ đó DNA được bảo vệ. DNA nhiễm sắc thể có kích thước

cho việc giải trình tự gen.

lớn, liên kết chặt chẽ với protein tạo ra phức hệ nucleoprotein nên cấu trúc của

Như đã biết việc sử dụng Taq polymerase trong PCR sẽ tạo ra khoảng

chúng rất cồng kềnh, ngược lại với DNA plasmid có cấu trúc gọn nhẹ. Chính

70% - 90% sản phẩm PCR có thêm một nucleotide A ở đầu 3‟. Mặt khác,

vì thế, khi DNA plasmid đã được giải phóng ra môi trường thì DNA nhiễm sắc

pJET1/Blunt lại là vector tách dòng đầu bằng nên chỉ các sản phẩm PCR dầu

thể hầu như vẫn chưa kịp thoát ra ngoài. CH3COOK và CH3COOH trong sol

bằng hoặc đã được bằng hóa mới thực hiện được phản ứng ghép nối với

III có tác dụng làm giảm pH của dung dịch về gần với điểm đẳng điện của

vector này. Do đó, trước khi thực hiện phản ứng ghép nối,chúng tôi làm bằng

DNA và gây biến tính protein; cùng với sự có mặt của EtOH 100% ở nhiệt độ

hóa đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Thành phần của phản ứng làm bằng hóa đầu 3‟

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




42

43

thấp, DNA plasmid bị kết tủa và dễ dàng được tách ra nhờ ly tâm. Sản phẩm

mẫu Sdt đều có các dòng thứ 2, thứ 4, thứ 7 và thứ 9 (kí hiệu Rhy 2; Mna 4;

được điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.7.

Sdt 7; Sdt 9) cao hơn dòng đối chứng. Từ đây, có thể dự đoán các dòng này

Hỗn hợp DNA plasmid thu được sau khi tách chiết thường tồn tại 3 dạng

có thể chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. Để khẳng định được các dòng đã

cấu trúc: Dạng siêu xoắn, dạng vòng mở và dạng mạch thẳng. Dạng thứ nhất

chọn có mang đoạn DNA được nhân lên bằng PCR hay không, chúng tôi tiến

có cấu trúc không gian gọn nhẹ nhất, được hình thành do liên kết hidro hoặc

hành cắt kiểm tra các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9 bằng enzyme hạn chế.

liên kết tĩnh điện giữa các phần của phân tử plasmid với nhau. Dạng vòng mở

Kiểm tra plasmid bằng việc xử lý enzyme hạn chế

có một mạch đơn bị đứt gãy và dạng còn lại có cả hai mạch đều bị đứt gãy.

Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector,

Khi điện di, dạng nào càng có kích thước gọn nhẹ thì sự di chuyển của chúng

chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid kể trên bằng phương

càng nhanh, càng xa so với vị trí của giếng tra mẫu. Theo đó, dạng siêu xoắn

pháp cắt enzyme hạn chế. Vector pJET1/Blunt có chứa điểm nhận biết của

chạy nhanh nhất, tiếp đó là dạng vòng mở và cuối cùng là dạng mạch thẳng.

enzyme XhoI ở phía bên trái và chứa điểm nhận biết của enzyme XbaI ở phía
bên phải của vị trí ghép nối gen. Mặt khác, trình tự vùng D-Loop đã công bố
không chứa điểm nhận biết của 2 enzyme này. Do vậy khi phân tích vector tái
tổ hợp bằng XhoI và XbaI sẽ thu được các đoạn gen có kích thước gần đúng

với kích thước của vector nguyên bản và của đoạn gen đã được ghép nối vào
vector. Kết quả phân tích sản phẩm cắt enzyme trên hình 3.8 cho thấy các
DNA plasmid tái tổ hợp được cắt thành 2 băng: một băng có kích thước 3,1 kb
(tương ứng với kích thước của vector pJET1/Blunt); băng kia có kích thước

Hình 3.7. Ảnh điện di một số DNA plasmid trên gel agarose 0,8%
ĐC: DNA plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA)

khoảng 1,3 (tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR). Kết quả này chứng
tỏ sản phẩm PCR đã được ghép nối thành công vào vector. Những plasmid tái
tổ hợp này được tinh sạch để phục vụ cho việc xác định trình tự gen.

1- 3: DNA plasmid mẫu Ri (Rhy)
4 - 6: DNA plasmid mẫu Mông (Mna)

Kết quả của phản ứng cắt trên hình 3.8 cho thấy: trên 3 đường chạy (4, 5
và 6) xuất hiện hai băng: một băng có kích thước 3,1 kb (bằng kích thước của

7- 9: DNA plasmid mẫu Sao (Sdt)

Để tiện lợi cho việc lựa chọn các dòng plasmid được chèn thêm đoạn

vector pJET1/Blunt), băng khác có kích thước khoảng 1,3 kb (tương ứng với

DNA, khi tiến hành điện di kiểm tra, chúng tôi đã sử dụng một DNA plasmid

kích thước của sản phẩm PCR). Đường chạy 2 chỉ có một băng có kích thước

đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA). Do vậy, dựa vào độ cao thấp

3,1 kb. Như vậy, đã chọn được 3 dòng (1 dòng thuộc mẫu gà Ri (Rhy), 1dòng

của các băng so với băng đối chứng mà ta có thể dự đoán dòng nào đã được

thuộc mẫu gà Mông (Mna), 1 dòng thuộc mẫu gà Sao (Sdt)) chứa plasmid tái

chèn thêm đoạn DNA. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy: mẫu Rhy, mẫu Mna và

tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên