Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài thuộc chi trung quân (ancistrocladus) ở việt nam

Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

PHẠM THỊ THANH HƯƠNG

NGHI N C U A DẠNG DI TRU ỀN M T S
O I THU C
CHI TRUNG QUÂN (ANCISTROCLADUS) Ở VI T NAM.
UẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2016

1


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

PHẠM THỊ THANH HƯƠNG

NGHI N C U A DẠNG DI TRU ỀN M T S

O I
THU C CHI TRUNG QU N ANCISTROCLADUS) Ở VI T NAM.
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121
UẬN VĂN THẠC S KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. ê Quỳnh iên
PGS.TS. N uy n Thị Hồn V n

Hà Nội, 2016

2


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên (Viện Hóa
sinh biển, Viện HLKHCNVN) và PGS.TS. Nguy n Th H ng Vân ( ộ m n
i truy n học, Trường Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN) đã tận tình
hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đ tài.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn ThS. Nguy n Chi Mai (Viện Hóa sinh
biển, Viện HLKHCNVN) đã gi p đ em trong suốt qu trình em làm đ tài.
Em xin chân thành cảm ơn đến c TS. Lê Th Thu Hi n (Viện nghiên
cứu hệ gen, Viện Hàn lâm khoa học c ng nghệ Việt Nam) đã gi p đ em
trong qu trình thực hiện đ tài.
Em xin trân trọng cảm ơn của mình đến c n bộ giảng viên ộ m n Sinh
học-Học viện Y

ư c học c truy n Việt Nam đã tạo đi u kiện gi p đ em

trong suốt qu trình học tập, hoàn thiện luận văn này.
Cảm ơn thầy c , anh ch Phòng c ng nghệ Y-Sinh (Trung tâm Ph t triển
c ng nghệ cao, Viện HLKHCNVN) đã tận tình gi p đ và tạo đi u kiện cho
em hoàn thành đ tài
Cuối c ng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn b đã lu n ủng hộ và
gi p đ em trong qu trình em làm đ tài này.

Hà Nội, th ng 05 năm 2016
Học viên

Ph

3

Thị Th nh H

n


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC ỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
MỞ ẦU ............................................................................................................ 1

1. Lí do chọn đ tài ............................................................................................ 1
2. Mục tiêu ......................................................................................................... 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI I U
1.1. Chi Trung quân Ancistrocladus .................................................................. 3
1.1.1. Phân loại học ........................................................................................... 3
1.1.2. Sơ lư c v chi Trung Quân. .................................................................... 3
1.2. Đa dạng di truy n chi Trung Quân ............................................................. 6
1.3.Tình hình nghiên cứu chi Trung Quân ở Việt Nam. ...................................7
1.4. Đ nh gi đa dạng di truy n bằng phương ph p sinh học phân tử ..............8
1.5. Các chỉ th

NA trong đ nh gi đa dạng di truy n. ................................... 8

1.5.1. Chỉ th đa hình trình tự đoạn DNA. .........................................................8
1.5.2. Chỉ th đa hình trình tự DNA.................................................................11
1.5.3. T ng quan hệ gen: ................................................................................. 12
1.5.4. T ng quan v chỉ th ITS và MatK trong đ tài: ................................... 14
1.5.5. Phương ph p xây dựng cây ph t sinh chủng loại trong nghiên cứu: .... 17
CHƯƠNG 2: VẬT LI U V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U.
2.1. Vật liệu nghiên cứu. ................................................................................. 18
2.2. Hóa chất, thiết b ...................................................................................... 19
2.3. Phương ph p nghiên cứu .......................................................................... 19
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu......................................................19
2.3.2. Phương ph p t ch NA t ng số từ lá ...................................................19

4


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

2.3.3. Phương ph p nhân đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR.......................... 20
2.3.4. Tinh sạch sản ph m PCR……………………………………………...23
2.3.5. Gắn sản ph m PCR vào vector t ch dòng pT257 R/T ......................... 23
2.3.6. iến nạp NA plasmid vào tế bào E. coli H5α ................................. 24
2.3.6. T ch chiết NA plasmid ....................................................................... 25
2.3.7. Phương ph p điện di kiểm tra kết quả .................................................. 26
2.3.8. Phương ph p phân tích trình tự nucleotide và phân tích cây phát sinh
chủng loại ........................................................................................................ 26
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
3.1. Kết quả tách DNA t ng số ....................................................................... 28
3.2. Kết quả nhân c c đoạn chỉ th bằng phương ph p PCR........................... 29
3.3. Kết quả gắn sản ph m PCR vào vector tách dòng pTZ57 R/T ................ 30
3.4. Kết quả x c đ nh trình tự .......................................................................... 34
3.5. Kết quả phân tích đa dạng di truy n của Trung quân nghiên cứu ........... 34
3.6 Thảo luận ................................................................................................... 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận: ......................................................................................................... 52
Kiến ngh : ........................................................................................................ 52
TÀI LI U THAM KHẢO
PHỤ LỤC

5


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ANH S CH C C CH

VI T T T

Amp

Ampicillin

bp

base pair

CTAB

Cetyl Trimethyl Amoni Bromid

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

ETDA

Ethylenediamine tetra acetic acid

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactoside

ITS

Internal Transcribed Spacer

ISSR

Inter Simple Sequence Repeat

LB

Luria and Bertani

MatK

Maturase K

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

rpm

Revolutions per minute

RNase

RiboNuclease

SDS

Natri Dodecyl Sulfat

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

Tm

Melting temperatures (Nhiệt độ nóng chảy)

Kb

Kilobase

6


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

UV

Ultraviolet

VNTR

Variable Number Tandem Repeat (Đoạn lặp lại kế tiếp)

X- gal

5-bromo-4chloro-3indolyl-β-D-glactopyranoside

7


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DANH SÁCH CÁC H NH
Tên hình

Trang

Hình 1.1. Cây Trung quân A. conchinchinensis Gagnep ............................................4
Hình 1.2. Cây Trung quân A. tectorius (Lour.)Merr ................................................... 4
Hình 1.3. Cây Trung quân A. wallichii Planch ........................................................... 5
Hình 1.4. Cây Trung quân A. scanders Planch ........................................................... 5
Hình 2.1. Cấu trúc vector tách dòng pTZ57 R/T ...................................................... 24
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA t ng số các mẫu Trung quân ........................................28
Hình 3.2. Ảnh điện di sản ph m PCR mẫu Trung quân bằng m i MatKF-MatKR ..29
Hình 3.3. Ảnh điện di sản ph m PCR mẫu Trung quân bằng m i ITS1-ITS4.. .......30
Hình 3.4. Đĩa nu i cấy xuất hiện khu n lạc xanh (không khoanh tròn) và trắng
(khoanh tròn) trên m i trường có kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG.. .................. 31
Hình 3.5. Kết quả điện di sản ph m PCR bằng m i M13F/R của trình tự đoạn ITS
đã đư c gắn vào vector tách dòng pTZ57 R/T .......................................................... 32
Hình 3.6. Kết quả điện di sản ph m PCR bằng m i M13F/R của trình tự đoạn MatK
đã đư c gắn vào vector tách dòng pTZ57 R/T .......................................................... 33

Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại thiết lập dựa trên trình tự đoạn ITS của 12 mẫu
Trung quân nghiên cứu cùng 40 mẫu Trung quân tham khảo trên ngân hàng
GenBank .................................................................................................................... 36
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại thiết lập dựa trên trình tự đoạn gen MatK của 12
mẫu Trung quân nghiên cứu cùng 32 mẫu Trung quân tham khảo trên ngân hàng
GenBank .................................................................................................................... 37
Hình 3.9. Trình tự đoạn ITS mẫu Trung quân .......................................................... 44
Hình 3.10. Trình tự đoạn gen MatK mẫu Trung quân ............................................. 46

8


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DANH MỤC BẢNG
Tên bản

Trang

Bảng 2.1. Danh sách mẫu Trung quân ............................................................ 18
Bảng 2.2. Các m i đư c sử dụng trong các phản ứng .................................... 21
Bảng 2.3. Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl .......................... 21
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn gen MatK .............. 22
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân trình tự đoạn ITS ........... 22
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp m i M13F/R....... 22
Bảng 2.7. Thành phần cho phản ứng lai ghép ................................................. 24
Bảng 3.1. Bảng thống kê các trình tự trên ngân hàng Genbank có tỷ lệ tương
đ ng lớn nhất với các trình tự phân tích ......................................................... 40

Bảng 3.2. Độ tương đ ng v trình tự nucleotide của đoạn gen MatK giữa các
mẫu Trung quân nghiên cứu ........................................................................... 41
Bảng 3.3. Độ tương đ ng v trình tự nucleotide của đoạn ITS giữa các mẫu
Trung quân nghiên cứu ................................................................................... 41

9


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỞ ẦU
1. Lí do chọn đề tài
Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú với ước đo n khoảng 12.000
loài, trong đó số loài đã đư c ghi nhận là 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch
(Viện

ư c liệu, 2004). Sự đa dạng v số lư ng và chủng loại c ng đi u kiện sinh

trưởng của ch ng đã làm giàu ngu n tài nguyên cây làm thuốc tại Việt Nam với
khoảng 30% t ng số loài thực vật đư c sử dụng trong các bài thuốc truy n thống.
Kết quả đi u tra ngu n tài nguyên dư c liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001– 2005 của
Viện dư c liệu (2006) cho biết Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và
nấm đư c dùng làm thuốc; trong đó, nhóm thực vật bậc cao có mạch có 3.870 loài
(Viện

ư c liệu, 2006). Đây là ngu n tài nguyên thiên nhiên to lớn đối với con

người đặc biệt là trong y học, đư c d ng để chăm sóc và chữa bệnh cho mọi người

nhất là nước ta có truy n thống lâu đời d ng cây con làm thuốc. Tuy nhiên, trước
tình hình khai thác và tận thu quá mức, nhi u loại cây dư c liệu b thu hẹp khu vực
phân bố và đứng trước nguy cơ biến mất trong tự nhiên. Do vậy, nghiên cứu đa
dạng sinh học của các cây dư c liệu là hết sức cần thiết, nhằm tạo cơ sở để đ nh giá
ti m năng của ch ng cũng như có phương án bảo t n, quản lý và khai thác h p lý.
Từ trước đến nay, các nghiên cứu đa dạng sinh học các loài thực vật Việt Nam chỉ
tập trung nghiên cứu v hình thái. Tuy nhiên, số lư ng loài thực vật tại Việt Nam
phong phú, nhi u loài có hình th i tương đối giống nhau gây khó khăn cho phân
loại thực vật.

o đó, đánh giá đa dạng v di truy n sẽ là một công cụ b sung hữu

hiệu cho hướng nghiên cứu này.
Chi Trung quân (Ancistrocladus) phân bố ph biến tại Châu Phi, Ấn Độ và
v ng Đ ng Nam , là loại thực vật có chứa nhi u h p chất alkaloid gi tr v y học,
trong đó h p chất dimeric naphthylisoquinon alkaloids hay còn gọi là michellamnes
có khả năng ức chế sự sinh trưởng của virus gây suy giảm mi n d ch ở người HIV
ở mức độ in vivo (McMahon et al., 1997). Ngoài ra, nhi u h p chất kh c t ch từ chi
Trung quân có ti m năng kh ng khu n, chống oxy hóa và ức chế sinh trưởng của tế
bào u tủy ( ringmann et al., 2012). Nhi u nghiên cứu cho thấy c c loài Trung quân

10


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

kh c nhau có thành phần c c chất hóa học kh c nhau, đặc biệt là nhóm alkaloid có
ti m năng y - dư c (Meimberg et al., 2010). Hơn nữa, ph alkaloid thu đư c từ loài

A. conchinchinesis ở Việt Nam kh kh c biệt so với ph c ng loài đã c ng bố trên
thế giới (Nguy n et al., 1996; 1997). Trên thực tế, những nghiên cứu đa dạng di
truy n chi Trung quân trên thế giới và tại Việt Nam còn rất ít. Nhằm tạo cơ sở cho
những nghiên cứu v khả năng sử dụng của c c loài thuộc chi Trung quân, chúng
t i đ xuất đ tài “N hiên cứu đ d n di truyền
quân (Ancistrocladus) ở Việt N

ột số

ài thuộc chi Trun

”

2. Mục tiêu
Đ nh gi đa dạng di truy n và đ nh loài dựa trên đoạn trình tự ITS (r NA) và
đoạn gen MatK (cp NA) của c c mẫu Trung quân thu đư c từ ba mi n ắc-TrungNam.

11


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Ch

n 1. TỔNG QUAN T I I U

1.1. Chi Trung quân (Ancistrocladus)
1.1.1. Ph n

i học

Chi Trung quân (danh pháp khoa học: Ancistrocladus) đư c xếp vào giới
Plantae (thực vật), ngành Magnoliophyta (thực vật có hoa), lớp Magnoliopsida
(thực vật hai l mầm). Trong hệ thống phân loại APG II (Angiosperm Phylogeny
Group II) 1998 cũng xếp chi Trung quân trong bộ C m chướng (Caryophyllales) và
họ Ancistrocladaceae (Philippe Cuennoud et al., 2002)
1.1.2. S

ợc về chi Trung quân (Ancistrocladus)

Ancistrocladus thuộc họ Ancistrocladaceae, phân bố chủ yếu tại c c quốc gia
thuộc khu vực nhiệt đới, chủ yếu thuộc châu Phi, Tây Ấn, Srilanka và Đ ng Nam .
Tất cả c c loài thuộc chi Trung quân đ u là dạng dây leo, cành có móc. L mọc
sole, hình ngọn gi o, mép l nguyên. Hoa lư ng tính, xếp thành cụm hoa ch y. L
đài 5, khi kết quả thì ph t triển thành c nh k m theo quả. C nh hoa 5, xếp vặn. Nh
5-10 trong đó có 5 nh ngắn hơn. ầu có 1 , 1 noãn mọc ở gốc. Quả kh ng mở, có
c nh, hạt gần tròn (Gereau, 1997). Danh lục c c loài thực vật Việt Nam (tr. 440) mô
tả 3 loài trong chi Trung quân g m A. conchinchinensis Gagnep., A. tectorius
(Lour.) Merr., và A. wallichii Planch Merr (Nguy n Tiến

ân chủ biên, NX

Đại

học Quốc gia). Trong danh lục cây cỏ Việt Nam, A. scanders (Lour.) Merr là loài
thứ tư đư c t c giả Phạm Hoàng Hộ đã m tả (tr. 339-340). C c loài này mọc hoang
dã và phân bố rải r c ở c c v ng n i Việt Nam tập trung ở khu vực Tây Nguyên,
Đ ng Nai, Kiên Giang (Phạm Hoàng Hộ, 2003).

12


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hình 1.1. Ancistrocladus conchinchinensis Gagnep
(Ngu n: )

Hình 1.2. Ancistrocladus tectorius (Lour.) Merr
(Ngu n: />
13


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hình 1.3. Ancistrocladus Wallichii Planch
(Ngu n: )

Hình 1.4. Ancistrocladus scandens (Lour.) Merr
(Nguồn: )

14


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đã từ lâu, l và thân Trung quân đư c nhi u cộng đ ng v ng Châu Phi và
Đ ng Nam

sử dụng trong những bài thuốc tr bệnh như trong bài thuốc chữa sốt

rét và kiết lỵ ở Th i Lan (Ruangrungsi et al., 1985); chữa c c bệnh gan ở Malaysia
(Ong et al., 2012) hay chữa đau nhức xương và b i b sức khỏe đặc biệt là cho phụ
nữ sau sinh ở Việt Nam (Đỗ Tất L i, 2005). Tại Ghana và Cameron, cây Trung
quân có t c dụng tr sốt, đau răng hay bệnh sởi (Elujoba et al., 2005). Gần đây, các
nhà khoa học đã t ch đư c nhi u h p chất quý từ cây Trung quân, đi u này đã phần
nào giải thích tính đa c ng dụng của chi này ( ringmann et al., 2012).
Ngoài ra, Trung quân còn có t c dụng bảo vệ rừng đặc biệt là l . L cây Trung
quân rất xanh tươi và đặc biệt là khó cháy; do đó còn đư c sử dụng như ngu n
nguyên liệu l p nhà trong thời kỳ chiến tranh bom đạn c liệt mà người dân Việt
Nam kh ng bao giờ quên.
1.2.

d n di truyền củ chi Trun qu n

Mặc d có chung cấu tạo l với c c móc câu, hình dạng l c c c thể trong chi
Trung quân rất đa dạng nên việc đ nh loài dựa vào hình th i gặp nhi u hạn chế (Van
Steenis, 1948). Việc x c đ nh loài trong chi Trung quân, đặc biệt là khu vực Đ ng
Nam

còn nhi u bàn cãi. Gereau (1997) đã m tả hình th i của 25 loài trong chi

Ancistrocladus Wallichii, trong đó 9 loài đư c tìm thấy tại v ng khí hậu nhiệt đới ở
châu . Tới nay, khoảng 30 loài thuộc chi Ancistrocladus đã đư c m tả trong danh

lục, trong đó có 14 loài tìm thấy ở Châu

. Khu vực Đ ng Nam

đư c cho là có

mức đa dạng loài Trung quân cao. Tuy nhiên, do những nhận đ nh đầu tiên của Van
Steenis (1948) v một loài Trung quân A. tectorius (Lour) Merr duy nhất ở Đ ng
Nam

và việc nghiên cứu đa dạng hình th i và di truy n trên đối tư ng thực vật

này không đư c ch trọng, nên hầu như những mẫu Trung quân thu đư c tại khu
vực Đ ng Nam

đ u cho là thuộc loài A. tectorius. Trên thực tế, Taylor (2005) đã

m tả thêm 2 loài mới trong “A. tectorius complex” trước đây nâng t ng số loài
trong complex này lên tới 6 g m là A. extensus Wall. ex Planch., A. pinangianus
Wall. ex Planch., A. conchinchinensis Gagnep., A. harmandii Gagnep., A.
hainanensis Hayata Icon., và A. carallioides Craib

15

ull với đi u kiện sinh trưởng


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

rất đa dạng. Nghiên cứu đa dạng di truy n và đa dạng hóa học cho thấy có mối liên
quan giữa v ng đ a lý và thành phần h p chất naphthylisoquinoline alkaloid giữa
c c loài Trung quân. Ví dụ như trong mẫu Trung quân thu đư c tại phía Nam
Malaysia, isoquinon kh ng liên kết với naphthalene. Cấu tr c này kh c biệt so với
c c isoquinon phân t ch từ loài tương tự tại khu vực kh c thuộc Đ ng Nam
nhưng lại giống cấu tr c của h p chất isoquinon thu đư c từ loài A. korupensis tại
Châu Phi. Ph của c c h p chất alkaloid thu từ c c mẫu Trung quân tại Việt nam
cũng có nhi u điểm kh c so với ph

alkaloid trong c c nghiên cứu trước đó

(Nguyen et al., 1996: 1997). Khi so s nh trình tự một số gen lục lạp như trnK hay
sử dụng c c phương ph p đ nh gi

đa hình di truy n gen nhân như interal

transcribed spacers (ITS) và trình tự inter- simple sequence repeat (ISSR) ba nhóm
mẫu Trung quân thu đư c tại 3 v ng đ a lý kh c biệt tại Đ ng Nam

, Ấn Độ và

Tây Phi cho thấy độ đa dạng di truy n cao. Trên cây phát sinh chủng loại, mẫu tại 3
v ng đ a lý trên tạo thành 3 nhóm riêng biệt. Tuy nhiên độ đa dạng dựa trên chỉ th
phân tử trnK intron hay ITS trong từng nhóm lại tương đương với hai nhóm còn lại;
riêng độ đa dạng dựa trên chỉ th ISSR của nhóm Trung quân Đ ng Nam

, di

truy n phân tử ISSR cho thấy c c loài Trung quân phía ắc và phía Nam tạo thành

những tập h p kh c nhau. Hệ số x c đ nh (coefficient of determination: R2) của
từng chỉ th phân tử trnK, ISSR và ITS tương ứng là 0.499, 0.372 và 0.212; cho
thấy mức đa dạng di truy n của chi Trung quân tại Đ ng Nam

là rất cao

(Meimberg et al., 2010).
1.3. Tình hình nghiên cứu chi Trung quân t i Việt Nam
Cây Trung quân đư c nhân dân biết đến như những v thuốc chữa đau nhức
xương và b i b sức khỏe đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh ở Việt Nam (Đỗ Tất L i,
2005). Trong nghiên cứu phối h p giữa Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam) và Đại học Halle (CHL

Đức) các h p chất thuộc nhóm

alkaloid g m 6-O-methylhamateine, hamatinine, 6-O-methylhamatinine,6-Odemethy-7-epi-ancistrobrevineD, 7-epi-ancistrobrevine D và 6-O-demethyl-8-Omethyl-7-epi-ancistrobrevine D từ loài A. cochinchinensis đã đư c công bố tách

16


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

chiết thành công tại Việt Nam. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu tại khoa
trường Đại học Y –

ư c thuộc

ư c Thành phố H Chí Minh g m Phạm Đ ng Phương, Trần

Hùng đã có những nghiên cứu v khảo s t t c động độc tính tế bào của các thành
phần alcaloid và naphthoquinon trong 3 loài Ancistrocladus ở Việt Nam. Đến nay,
tại Việt Nam rất ít đ tài nghiên cứu v sự đa dạng di truy n của chi Trung quân và
đ tài này cũng góp phần cho khai thác và sử dụng b n vững ngu n tài nguyên thực
vật này ở nước ta.
1.4. ánh iá đ d ng di truyền bằn ph

n pháp sinh học phân tử

Đa dạng di truy n là những kh c nhau v mặt di truy n giữa c c quần thể thực
vật nói chung và cây tr ng nói riêng. Sự đa dạng xảy ra ở ba mức độ: đa dạng di
truy n (là những thay đ i gen và kiểu gen), đa dạng loài (là sự phong ph của loài)
và đa dạng sinh th i (là tất cả c c loài và m i trường sống của ch ng) (Nguy n Đức
Thành, 2016).
C c chỉ th v hình th i như: màu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh trưởng, sự
biến đ i sắc tố rất hữu ích cho c c nhà chọn giống. Ưu điểm của chỉ th này là
kh ng tốn kém và đ ng trội. Tuy nhiên, như c điểm của của chỉ th này hạn chế v
số lư ng, b ảnh hưởng bởi yếu tố m i trường và giai đoạn ph t triển (Nguy n Đức
Thành, 2016). Với sự ph t triển của c c kỹ thuật sinh học phân tử, c c chỉ th

NA

đang đư c sử dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truy n ở tất cả c c loài từ vi
sinh vật tới con người.

NA t n tại trong mọi tế bào sinh vật, có thể nghiên cứu

trực tiếp hệ gen của sinh vật kh ng b ảnh hưởng bởi yếu tố m i trường và giai đoạn
ph t triển của cây. Sử dụng chỉ th

NA có thể truy đư c ngu n gốc c c dạng sinh

vật sống và kể cả đã chết. Có hai loại chỉ th
dạng di truy n: chỉ th v đa hình đoạn

NA đư c d ng trong đ nh gi đa

NA (ví dụ như chỉ th ISSR, RFLP) và chỉ

th v đa hình trình tự NA.
1.5. Các chỉ thị DNA tr n đánh iá đ d n di truyền
1.5.1. Chỉ thị đ hình trình tự đ
Chỉ th đa hình chi u dài đoạn

n DNA

NA chủ yếu dựa vào c c đột biến thêm đoạn

hoặc mất đoạn trên đoạn đích của genome ở v ng biểu hiện kiểu hình (exon) và cả

17


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

v ng kh ng biểu hiện kiểu hình (intron) của c c loài động, thực vật. Trong chỉ th
này, số lư ng và kích thước c c băng vạch NA đư c nhân lên bằng PCR hay đư c

phân cắt bởi c c enzyme cắt sẽ là cơ sở để đ nh gi mức độ đa dạng của đối tư ng
nghiên cứu. C c kĩ thuật ph biến để đ nh gi đa dạng di truy n dựa trên chỉ th này
có thể kể đến như: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP
(Amplified

Fragment

Length

Polymorphism),

RAPD

(Radom

Amplified

Polymorphic DNA), SSR (Simple sequence repeat).
1.5.1.1. Kĩ thuật RFLP
Kỹ thuật RFLP nghiên cứu tính đa hình chi u dài của c c phân đoạn đư c cắt
bởi các enzyme giới hạn (Nguy n Nghĩa Thìn, 2008). Kỹ thuật này dựa trên đặc
điểm của các enzyme giới hạn khác nhau nên khi thực hiện phản ứng cắt DNA các
đi u kiện thích h p phân biệt trên điện di đ . C c đoạn cắt còn đư c gọi là “dấu vân
tay” đặc trưng cho từng phân tử DNA.
RFLP có ưu điểm là chỉ th đ ng trội cho phép phân biệt đư c c thể đ ng h p
và d h p.

ản đ di truy n sử dụng chỉ th RFLP có tính chính x c cao, thường

đư c sử dụng trong nghiên cứu sự kh c biệt trong cấu tr c bộ gen của c c c thể,

các loài. Kh ng chỉ có ứng dụng trong nghiên cứu NA genome mà RFLP còn giúp
cho sự ph t hiện ra c c biến d của NA lục lạp một c ch d dàng hơn. evos et al.
(2003) đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truy n loài Dactylohira (Orchidaeace) ở
Châu Âu bằng chỉ th RFLP, kết quả cho thấy có biến d cao ở hệ gen lục lạp. Tuy
nhiên như c điểm của phương ph p này là qui trình thực hiện phức tạp, tốn thời
gian, và yêu cầu có DNA lớn, c ng việc phân tích cần đến đ nh dấu phóng xạ đã
làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này (Nguy n Nghĩa Thìn, 2008).
1.5.1.2. Kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) đư c hiểu là sự
đa dạng của c c đoạn

NA đư c nhân lên có đ nh hướng sau khi b cắt bởi hai

enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn
đại PCR.

18

NA làm khu n cho phản ứng khuếch


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Ưu điểm của phương ph p trên là khuếch đại có chọn lọc một lư ng lớn các
đoạn

NA đa hình trong một phản ứng PCR, phù h p cho việc phân tích đa dạng

giữa các quần thể có quan hệ gần nhau và kh ng cần biết trước trình tự

NA của

gen cần nghiên cứu. Cũng dựa vào chỉ th AFLP, Nguy n Th Kim Liên và cs,
(2009) phát triển chỉ th STS dựa trên phân đoạn AFLP liên kết với một số tính
trạng hình thái r trong chọn dòng lúa ch u hạn. Aggarwal et al. (1999) đã sử dụng
chỉ th AFLP để nghiên cứu phát sinh chủng loại ở lúa. Tuy nhiên như c điểm là
quy trình dài, phức tạp, tốn nhi u thời gian thực hiện (Nguy n Nghĩa Thìn, 2008).
1.5.1.3. Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAP

dựa trên kỹ thuật PCR, bằng c ch sử dụng những m i ngắn

(khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những
đoạn

NA có trình tự b

sung với trình tự của c c primer. C c đoạn m i

oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khu n
NA trong khoảng c ch có thể khuếch đại đư c (dưới 3000bp) sẽ cho ra những
đoạn

NA có kích thước kh c nhau sau khi khuếch đại. Sự có mặt của c c sản

ph m

NA kh c nhau chứng tỏ đã có một sự tương đ ng hoàn toàn hay một phần

giữa

NA bộ gen và m i. C c m i d ng trong RAP

thường ngắn vì vậy d dàng

tìm đư c c c đoạn tương đ ng trên mạch đơn NA bộ gen.
Ưu điểm kỹ thuật trên là đ nh gi toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lại tính đa
hình cao do vậy có thể phát hiện nhanh tính đa dạng di truy n. (Nguy n Nghĩa Thìn,
2008). Nguy n Đức Thành và cs, (2009) sử dụng chỉ th RAP đ nh gi đa dạng di
truy n loài Sao mạng (Hopea reticulate Tardicu) dựa trên phân tích một số chuỗi
DNA lục lạp. Tuy nhiên, như c điểm do m i sử dụng trong kỹ thuật RAPD không
đặc hiệu nên có rất nhi u băng khó phân tích, khó lặp lại ở các phòng thí nghiệm
khác nhau. Ngoài ra, kỹ thuật này tạo ra các chỉ th trội do đó kh ng phân biệt đư c
các cá thể d h p tử với các cá thể đ ng h p tử (Nguy n Đức Thành, 2016)
1.5.1.4. Kỹ thuật SSR
Kỹ thuật SSR hay còn gọi là Microsatellites, nghiên cứu sự đa dạng những
đoạn DNA ngắn có trình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide. C c đoạn này có

19


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

khuynh hướng chiếm các vùng DNA không mang mã (vùng d nhi m sắc như: tâm
động hoặc đầu mút nhi m sắc thể), một vài đơn v SSR (như CA) có thể đư c lặp
lại bốn lần, một số đơn v khác lại đư c lặp lại từ hai đến ba mươi lần. Các trình tự

lặp lại đơn giản rất ph biến ở hệ gen động và thực vật, mật độ các trình tự dao
động rất lớn. Ch ng đư c phân bố trong hệ gen và có tính đặc trưng cho từng loài.
Ưu điểm của phương ph p này cho tính đa hình cao, có thể phân biệt đư c sự
sai khác mà kh ng x c đ nh đư c bằng các chỉ th kh c như RA P và RFLP. Hơn
nữa, phản ứng trùng h p chuỗi PCR d thực hiện và sử dụng các m i SSR có trình
tự đặc trưng vì thế đ ng tin cậy khi phát hiện cùng một locus đặc trưng, nên cung
cấp nhi u thông tin rất có ích cho việc phát hiện sự thay đ i của các trình tự hiếm.
Nguy n Th Minh Nguyệt và cs, (2013) cũng đã sử dụng chỉ th SSR để đ nh gi đa
dạng di truy n tập đoàn l a chụi hạn của Việt Nam. Sử dụng chỉ th SSR, Nguy n
Th Phương Đoài và cs, (2010) nghiên cứu đa dạng di truy n tập đoàn l a nương
bản đ a Việt Nam. Tuy nhiên như c điểm là mỗi loại m i chỉ đặc trưng cho mỗi
locus đa hình. Hơn nữa, để xây dựng các cặp m i SSR đặc hiệu cần tách dòng và
đọc trình tự một số lư ng lớn c c đoạn DNA genome có chứa các trình tự lặp lại
này. Kỹ thuật này tạo ra chỉ th trội, không phân biệt đư c đ ng h p tử và d h p tử
(Nguy n Đức Thành, 2016)
1.5.2. Chỉ thị đ hình trình tự DNA
Chỉ th đa hình trình tự nucleotide chủ yếu dựa vào những đột biến điểm tại v
trí nhất đ nh của các gen ở trong nhân hay trong tế bào chất của sinh vật. Loại chỉ
th này đư c chứng minh là có đa hình cao hơn nhi u so với các loại chỉ th dựa vào
đa hình chi u dài sản ph m PCR (Kwok et al, 1996; Kruglyak, 1997; Cho et al,
1999). Đối với những chỉ th này, sự thay đ i v trình tự nucleotide sẽ là cơ sở đ nh
giá quan hệ di truy n giữa các cá thể hay nhóm cá thể trong loài và quần thể. Để xác
đ nh các chỉ th này, cặp m i nhân đư c thiết kế từ 2 đầu trên đoạn gen đích của các
cá thể trong quần thể hoặc các cá thể giữa các quần thể. Đa hình trình tự nucleotide
của đoạn trên gen đích là cơ sở để đ nh gi đa dạng di truy n, khác biệt di truy n,
quan hệ chủng loại của c c loài. C c gen đích đư c sử dụng để nghiên cứu quan hệ

20

Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

di truy n của các loài hoặc trong loài thường là barcoding gen trong nhân cũng như
ở c c cơ quan tử như lục lạp hoặc ty thể. Trần Mỹ Linh và cs, (2014) cũng nghiên
cứu trình tự đoạn DNA chỉ th trên gen ribosome 18S của một số loài Hải Miên
(Porifera: Demospongiae) tại khu bảo t n biển đảo C n Cỏ, tỉnh Quảng Tr . Cũng
dựa vào đa hình trình tự, Nguy n Phương Thảo và cs, (2015) nghiên cứu đa dạng di
truy n tập đoàn c c giống sắn (Manihot esculenta CrantZ) dựa vào đa hình trình tự
gen GBSSS1. Tuy nhiên, hạn chế của loại chỉ th này là phải biết trước đư c trình
tự của gen đích của chính đối tư ng nghiên cứu hoặc các loài có quan hệ chủng loại
gần với đối tư ng nghiên cứu. Từ trình tự gen đích, c c cặp m i đư c thiết kế để
nhân bản bằng PCR. Ngoài ra, thời gian và chi phí để đọc trình tự các sản ph m
PCR cũng là hạn chế lớn của loại chỉ th này.
Tóm lại, mỗi loại chỉ th và mỗi phương ph p để tìm ra các chỉ th đó đ u có
những ưu điểm và như c điểm nhất đ nh. Tùy mục đích nghiên cứu cụ thể và trên
những đối tư ng nhất đ nh người ta có thể sử dụng phương ph p và chọn chỉ th
thích h p. Để nghiên cứu quan hệ di truy n trong loài, giữa các loài hay trong quần
thể và giữa các quần thể, c c phương ph p dựa vào nhân bản PCR như RAP ,
ISSR…hoặc phân tích đa hình trình tự DNA của một hay một số gen đích đang
đư c áp dụng rộng rãi trên nhi u đối tư ng khác nhau. Tuy nhiên, kết h p 2-3 loại
chỉ th phân tử để giải quyết quan hệ di truy n của đối tư ng nghiên cứu sẽ đảm bảo
kết quả chính x c hơn.
1.5.3. Tổng quan về hệ gen
Hệ gen (genome) là tập h p chứa toàn bộ thông tin di truy n đảm bảo hoạt
động sống của tế bào, cơ thể đư c mã hóa trong DNA (ở một số virus có thể là
RNA). Hệ gen bao g m những vùng chứa gen lẫn những đoạn không phiên mã (ở vi
khu n và virus hệ gen g m những vùng chứa gen). Đa số, hệ gen vi khu n phân bố
trên một NST dạng vòng khép kín và có kích thước nhỏ. Đối với sinh vật nhân thực,

99% hệ gen nằm trong nhân tế bào và phần còn lại nằm trong một số bào quan như
ty thể, lục lạp (Võ Th Thương Lan, 2008). Hệ gen của sinh vật nhân thực
(Eukaryotae) bao g m: hệ gen nhân (Nuclear genome), hệ gen ty thể (Mitochondrial

21


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

genome), hệ gen lục lạp (Chloroplast genome). Nhi u nghiên cứu cho thấy, các
đoạn trình tự DNA trong hệ gen ở sinh vật nhân thực phân thành trình tự DNA duy
nhất, trình tự DNA lặp lại trung bình và trình tự DNA lặp lại cao. Trình tự duy nhất
là đoạn trình tự chỉ có một bản sao trong hệ gen, trình tự lặp lại trung bình có
khoảng 1000 đến 100000 bản sao, còn trình tự lặp lại cao có khoảng từ hơn 100000
đến 10 triệu bản sao (Đỗ Lê Thăng, 2011).
1.5.3.1.Hệ gen nhân
Hệ gen trong nhân tế bào nhân thực thường rất lớn và phân bố trên các nhi m
sắc thể dạng thẳng (Võ Th Thương Lan, 2008). Đa phần DNA trong tế bào sinh vật
nhân thực đư c t chức thành nhi u nhi m sắc thể trong nhân tế bào. Các nghiên
cứu cho thấy, mỗi nhi m sắc thể chứa một phân tử DNA thẳng mạch kép. Các
nhi m sắc thể có số lư ng và hình dạng đặc trưng cho tế bào của mỗi loài sinh vật.
Các nhi m sắc thể của sinh vật nhân thực có t chức phức tạp g m DNA và nhi u
loại protein gắn vào. Trong số đó, histone là giữ vai trò cốt lõi trong việc đi u hòa
hoạt tính của DNA (Phạm Thành H , 2004).
1.5.3.2. Hệ gen lạp thể
Lạp thể chỉ có trong các tế bào thực vật, có loại lạp thể không màu, có loại lạp
thể có màu. Lục lạp là lạp thể có màu chứa chất diệp lục có ở lá cây xanh tham gia
vào quá trình quang h p. Trung bình mỗi lá của thực vật bậc cao chứa khoảng 4050 lục lạp (Lê Đình Lương-Phan Cự Nhân, 2009). Hệ gen lạp thể cũng là một

nhi m sắc thể mạch vòng. Nhi m sắc thể lạp thể bằng khoảng 8-10 lần nhi m sắc
thể ty thể, có kích thước khoảng 130-150kb. Lạp thể có nhi u gen hơn ty thể,
khoảng 110 gen. 50 gen trong số đó sinh ra c c sản ph m tham gia vào quá trình
quang h p. Đặc điểm của hệ gen lạp thể là chứa nhi u vùng lặp lại và có nhi u bản
sao của các gen. Tái t h p ở vùng lặp lại dẫn đến nhi m sắc thể lạp thể có cấu trúc
đa dạng. Số lư ng lạp thể khác nhau ở các loài khác nhau và ở các mô khác nhau
của cùng một loài (Đỗ Lê Thăng, 2011).

22


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

1.5.3.3. Hệ gen ty thể
Hệ gen ty thể là một nhi m sắc thể mạch vòng, rất giống với nhi m sắc vi
khu n. Kích thước nhi m sắc thể này khác nhau ở các loài khác nhau, song n đ nh
ở một loài. DNA của nhi m sắc thể ty thể động vật g m khảng 13000-18000 cặp
bazơ (13-18kb), của nấm khoảng 75kb còn của thực vật bậc cao khoảng 300-500kb.
Hệ gen ty thể chứa rất ít gen (Đỗ Lê Thăng, 2011).
1.5.4. Tổng quan về chỉ thị ITS và MatK tr n đề tài nghiên cứu
Trong đ tài này chúng tôi sử dụng hai chỉ th đó là chỉ th gen nhân (trình tự
đoạn ITS) và một chỉ th gen lục lạp (trình tự gen MatK).
1.5.5.1. Giới thiệu về chỉ thị ITS
Các gen RNA ribosome (hay ribosome DNA-rDNA) là các phần của c c đơn
v lặp lại đư c sắp xếp theo thứ tự. Hơn nữa r NA đư c quan tâm nghiên cứu vì nó
là một gen có nhi u bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Ch ng đư c
tìm thấy ở các v trí nhi m sắc thể đư c đư c gọi là các vùng t chức nhân
(nucleolar organizing regions – NORs). DNA ribosome nhân có hai vùng sao mã:

ITS1 nằm giữa tiểu phần nhỏ (16S-18S) và 5,8S của gen và ITS2 nằm giữa 5,8S và
tiểu phần lớn (23S-28S) của gen. Hai vùng này và tiểu phần 5,8S đư c gọi chung là
vùng sao mã giữa hay sao mã trong (ITS).

Hình 1.4. S đồ rDNA có hai vùng sao mã ITS1 và ITS2
N uồn: />Vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) là một vùng mã hóa cho một đoạn
ARN kh ng đóng vai trò chức năng nằm trong vùng mã hóa cho các ARN ribosome
nhân. Vùng ITS dài khoảng 655bp g m ba phần: vùng ITS1 nằm giữa vùng 16S và
5,8S có kích thước khoảng 255-261 bp, vùng 5,8S dài khoảng 164 bp và vùng ITS2
nằm giữa vùng 5,8S và 28S khoảng 216-233bp. Trong quá trình chế biến rARN
thành dạng trưởng thành, các vùng ITS1 và ITS2 sẽ b cắt bỏ khỏi ARN và nhanh

23


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

chóng b phá hủy. Do thiết kế cặp m i nhân v ng gen này, ch ng t i thu đư c trình
tự dài khoảng 750bp g m một phần trình tự của vùng cuối 18S và đầu 26S.
C c v ng ITS có độ dài 600 đến 700bp là các vùng tiến hóa nhanh nên có thể
thay đ i v trình tự cũng như độ dài. Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo thủ nên
đư c sử dụng để thiết kế các m i chung cho nhân bản vùng ITS.
Số bản sao c c đoạn lặp lại của rDNA lên tới 30.000 trong một tế bào. Đi u
này làm cho ITS trở thành đối tư ng lý thú cho nghiên cứu tiến hóa, phát sinh loài
( andwin et al., 1995) và đa dạng di truy n (Petersen and Seberg, 1996). ITS là kỹ
thuật nhân quan trọng cho phân loại phân tử các nhóm phân loại (taxon) có mối liên
kết gần, bởi vì ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đ i ở các loài khác
nhau (Brun et al., 1991). Các nghiên cứu v phát sinh loài dựa vào các chuỗi ITS

cho phép hiểu sâu v tiến hóa và sự lai tạo ở các loài thực vật khác nhau.
Nghiên cứu đa dạng di truy n sử dụng ITS có thể tiến hành bằng việc giải
trình tự trực tiếp vùng quan tâm từ các cá thể kh c nhau sau đó tiến hành xây dựng
cây phân loại dựa vào số liệu so sánh các trình tự (Nguy n Đức Thành, 2016)
Do sự bảo thủ trong cấu trúc bậc hai, ITS đư c xem như c ng cụ sắc bén cho
việc so sánh tiến hóa của cơ thể nhân thực (Tippery and Les, 2008). Sở dĩ vậy là do
vùng ITS bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đ i ở c c loài kh c nhau. Đối với
nhi u cơ thể, ITS2 trong rRNA đư c t chức xung quanh trung tâm bảo thủ chung
của cấu trúc bậc hai từ đó bốn vòng xoắn đư c tạo ra. Cơ sở dữ liệu v cấu trúc của
ITS2 chứa hơn 288.000 cấu tr c tiên đo n cho c c chuỗi ITS2 đã biết hiện nay. Các
trình tự này của ITS2 mở ra một khả năng mới là kết h p các thông tin v cấu trúc
trong nghiên cứu tiến hóa (Nguy n Đức Thành, 2016)
Vùng ITS là vùng có rất nhi u biến đ i ở các loài. ITS đư c sử dụng trong
nghiên cứu quan hệ di truy n và phân loại (Ritland et al., 1993; Zhang et al., 2001),
trong x c đ nh con lai (Raucher et al., 2002; Wang et al., 2007), trong nghiên cứu
ngu n gốc, phát sinh loài (Kim et al., 1999) và trong nghiên cứu mã vạch thực vật
(Yao et al., 2010)
1.5.5.2. Giới thiệu về chỉ thị MatK

24


Luận văn thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Ngoài chỉ th DNA nhân, chỉ th lục lạp (cp NA) cũng đư c sử dụng nhi u
trong nghiên cứu đa dạng di truy n ở thực vật. Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và
tần số đột biến thấp hơn hệ gen nhân, vì vậy chỉ th DNA lục lạp đư c sử dụng
nhi u trong nghiên cứu đa dạng di truy n và phát sinh loài ở thực vật. Hơn nữa,

phân tích trình tự cp NA có ưu điểm là cần rất ít cpDNA khuôn (Nguy n Đức
Thành, 2016). Đã có những nghiên cứu sử dụng gen MatK cho phân loại và tiến hóa
loài (Kocyan et al., 2004). Trình tự vùng MatK cũng đư c dùng cho nghiên cứu mã
vạch (barcode) ở các loại Lan (Kim et al., 2014). Để phân tích trình tự cpDNA,
cũng giống như phân tích trình tự

NA nói chung, trước hết là nhân các gen, vùng

đệm các gen lục lạp bằng m i đặc hiệu, sau đó có thể nhân dòng trước khi đọc trình
tự hoặc đọc trình tự trực tiếp sản ph m PCR. Chỉ th lục lạp mà trong đ tài này
chúng tôi sử dụng đó chính là trình tự gen MatK. MatK (MaturaseK) là một gen
nằm trong lục lạp của nhi u thực vật quang h p, có kích thước khoảng 1500bp, nằm
bên trong gen trnK lục lạp. Gen này mã hóa cho một protein giống maturase-protein
tham gia vào cắt nối intron-exon (Selvaraj et al., 2008). MatK đư c sử dụng ph
biến để đ nh gi đa dạng di truy n cũng như làm chỉ th DNA barcoding (mã vạch
NA) trong đ nh loại thực vật (Turmel et al., 2006; Barthet and Hilu, 2007; Yu et
al., 2011)
1.5.5.3. Chỉ thị ITS và MatK trong nghiên cứu đa dạng di truyền của Trung
quân trên thế giới.
Meimberg et al. (2010) sử dụng chỉ th ITS và gen trnK trên lục lạp đã phân
tích sự đa dạng phong phú trong quần thể Trung quân tại Đ ng Nam
Đ ng Nam

. Cũng tại

khi sử dụng chỉ th ITS và MatK trong quần thể Trung quân cho 24 và

14 điểm khác biệt (Meimberg et al., 2010). Tại Châu Phi khi sử dụng chỉ th ITS và
MatK đối với quần thể Trung quân cũng cho 26 và 21 điểm khác biệt (Meimberg et
al., 2010). o đó, trong đ tài này chúng tôi sử dụng hai chỉ th ITS và MatK nghiên

cứu sự đa dạng di truy n của một số loài thuộc chi Trung quân ở Việt Nam.

25