đề tài bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC

ĐỀ TÀI: BẢO TỒN NGUỒN GEN IN VITRO
TRONG THỜI GIAN DÀI

LÂM THỊ TUYẾT

Đà lạt, tháng 10 năm 2016


Mục lục
I. Sơ lược về bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................................................... 3
II. Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ........................................... 3
III. Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro trong thời gian dài ............................................ 3
III.1. Sự da dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh ........................ 4
III.2. Các bước tiến hành ........................................................................................................ 4
III.2.1. Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng ........................................... 5
III.2.2. Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh ............................................................. 5
III.2.3. Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp............................................................................. 6
III.2.4. Lưu trữ trong nito lỏng (-1960C)............................................................................. 7
III.2.5. Giải đông ................................................................................................................. 8
III.2.6. Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh .................................................................... 9
III.2.7. Xác định khả năng sống sót .................................................................................... 9
III.2.8. Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn
chỉnh .................................................................................................................................... 9
III.3. Một số phương pháp được sử dụng trong bảo quản đông lạnh...................................... 9
III.4. Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ) .............................................................. 14
III.5. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự hồi phục của tế bào đông lạnh .................................... 15
III.5.1. Độ tuổi, đặc tính và mật độ tế bào ........................................................................ 15
III.5.2. Các tác nhân bảo quản lạnh ................................................................................. 16

III.5.3. Tốc độ làm lạnh và phương pháp giải đông ......................................................... 16
III.5.4. Nhiệt độ lưu trữ ..................................................................................................... 16
IV. Ưu và nhược điểm của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................... 16
IV.1. Ưu điểm ....................................................................................................................... 16
IV.2. Nhược điểm ................................................................................................................. 17
V. Khả năng ứng dụng của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài...................... 17
VI. Kết luận .............................................................................................................................. 17
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 19
Tiếng Việt: ............................................................................................................................ 19
Tiếng Anh: ............................................................................................................................ 19
PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 20
Các chữ viết tắt: .................................................................................................................... 20
So sánh các phương pháp bảo tồn in vitro ............................................................................ 20
Khả năng làm sạch virus (Virus elimination) ....................................................................... 21

2


I. Sơ lược về bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài
Ngân hàng hạt

Bảo tồn

Tại chỗ

Ngân hàng DNA

Chuyển chỗ

Ngân hàng gen đồng ruộng

Trang trại

Bảo tồn in vitro

Bảo tồn ngắn hạn
Bảo tồn trung hạn
Bảo tồn dài hạn

Trong đó:
- Bảo tồn ngắn hạn: nuôi cấy in vitro dưới điều kiện sinh trưởng bình thường.
- Bảo tồn trung hạn: nuôi cấy in vitro trong điều kiện giảm cường độ ánh sáng,
nhiệt độ, thêm chất ức chế sinh trưởng,…
- Bảo tồn dài hạn: bảo tồn trong nito lỏng (-1960C), trên cơ sở này ngừng tất cả
các quá trình trao đổi chất và phân chia tế bào.
II. Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài
- Duy trì sự phong phú đa dạng di truyền.
- Là nguồn vật liệu cho chọn giống cây trồng, phục vụ khai thác, nghiên cứu sử
dụng cho hiện tại và tương lai.
- Bổ sung và thay thế để khắ c phu ̣c những ha ̣n chế của những phương pháp khác.
- Có thể duy trì được tính sạch bệnh trước khi bảo tồn, bảo tồn với số lượng lớn
trên một diện tích nhỏ. Điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động.
III. Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro trong thời gian dài
Sử dụng phương pháp ngừng sinh trưởng tạm thời (hay bảo quản đông lạnh trong
nito lỏng)
- Đặc điểm: Mẫu nuôi cấy được bảo quản trong nito lỏng và trong thời gian bảo
quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng.
- Thời gian bảo quản: 20 – 30 năm hoặc lâu hơn.
- Đối tượng: Mẫu đem bảo quản thường ở dạng phôi, mô sẹo, các mô nuôi cấy
(thường là mô phân sinh),… Trước khi đưa vào bảo quản mẫu cần được xử lý để

tránh tạo thành các tinh thể nước kết tinh gây chết mẫu.

3


III.1. Sự da dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh

Hình III.1. Sự đa dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh
Trong đó:
A: Làm đông ngoại bào trong các mô vỏ của cây Sambucus racemosa (cơm cháy).
B: Làm đông ngoài cơ quan trong nụ hoa cây Cornus officinalis (1) (sơn thù du),
Rhododendron Dauricum (2) (đỗ quyên) và nụ hoa của thông rụng lá (3), PL = lá
nguyên thủy, fl = Hoa con, scale = vảy.
C: Siêu lạnh sâu trong nhu mô xylem ray (R) của một cành táo.
III.2. Các bước tiến hành
- Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng
- Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh (cryoprotectant)
- Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp
- Lưu trữ tế bào trong nito lỏng (-1960C)
- Giải đông hoặc làm ấm nhanh tế bào
- Loại các tác nhân bảo quản đông lạnh bằng cách rửa nhiều lần
- Xác định khả năng sống sót
- Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo thành cây
hoàn chỉnh.
4


III.2.1. Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng
- Khử trùng bề mặt: bằng các loại chất khử trùng như NaOCl, HgCl, … sau đó
rửa nhiều lần bằng nước vô trùng trước khi cắt mẫu.

- Cắt mẫu: cắt bỏ các phần bị chất khử trùng làm cho hoại tử. Các mẫu thường
được nuôi cấy là chồi nách, lá non, đoạn thân non,…được cấy vào các môi trường
phù hợp.
- Tiến hành nuôi cấy vô trùng trên môi trường có Agar, có bổ sung các chất ĐHST
thích hợp để nhân nhanh số lượng mẫu cấy gồm sẹo, phôi hoặc mô phân sinh.
- Chuyển sang nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường có chứa nồng độ auxin và
Cytokinin thấp. Tùy theo kết cấu của mô sẹo, huyền phù tế bào đầu tiên sẽ được
tạo ra trong vòng 1 – 2 tuần. Ta có thể cấy chuyền định kì để nhân số lượng huyền
phù.
- Các mô nuôi cấy và huyền phù tế bào được tạo ra từ các mẫu cấy non đang tăng
trưởng mạnh.
III.2.2. Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh
- Các bình có chứa mẫu cấy được chuyển vào bể ủ nước đá, phần huyền phù bên
trong được để cho lắng và phần môi trường thừa bên trên được hút ra bằng pipet.
- Mỗi ml mẫu có chứa tế bào nuôi cấy mật độ cao được phân phối vào 1 ống nhựa
vô trùng và loại bỏ phần môi trường còn sót lại.
Bổ sung tác nhân bảo quản đông lạnh phù hợp (thường là DMSO 5 – 10%) được
bổ sung từ từ 1ml vào ống chia làm 4 lần, mỗi lần 0,25 ml trong thời gian 5 phút.
- Để yên khoảng 20 – 30 phút (trong bể nước đá). Sau khi bổ sung tác nhân bảo
quản lạnh, các ống nhựa được đặt ở nhiệt độ cực thấp và đông lạnh.
- Trong các tác nhân bảo quản đông lạnh thì DMSO được sử dụng rộng rãi và có
tính chất bảo quản lạnh rất tốt. Tuy nhiên phải sử dụng các tác nhân bảo quản ở
nồng độ tối ưu, tránh dùng ở nồng độ quá cao, vì nếu bổ sung đột ngột một lượng
lớn sẽ gây ra hiện tượng co nguyên sinh chất của tế bào.
- Yêu cầu của một chất bảo quản lạnh: Có khối lượng phân tử thấp, có thể trộn
lẫn dễ dàng với dung môi, không độc ngay cả khi ở nồng độ thấp, dễ dàng rửa đi
khỏi tế bào và trên hết là thấm nhanh vào trong tế bào.
- Cơ chế hoạt động của các tác nhân bảo quản (chỉ là giả thiết):
+ Chúng có thể làm giảm nồng độ muối nội bào và giảm hình thành tinh thể đá.
+ Sự khử nước tế bào mà theo sau là sự tổn thương do đông lạnh là sự hình thành

liên kết SS cảm ứng và các tác nhân bảo quản ngăn chặn hoặc ức chế hình thành
liên kết này.
5


+ Các tác nhân bảo quản tương tác trực tiếp hoặc gián tiếp với màng tế bào để cố
định các cấu trúc bậc 3 phức hợp nước – lipid – protein. Tại màng tế bào, sự đông
lạnh làm tổn thương tính toàn vẹn sinh học, tuy nhiên hoạt động sinh hóa của các
tác nhân bảo quản tại màng tế bào thì chưa rõ.
- Các tác nhân bảo quản ở nồng độ cao có tác hại:
Ở nồng độ cao nó có thể làm giảm hô hấp, ức chế RNA và ức chế sự tổng hợp
protein trong tế bào và mô thực vật bị cô lập, do đó phải sử dụng nó ở nồng độ tối
ưu (thường dùng 5 – 10%)
- Ngoài ra, nên sử dụng kết hợp 2 hay nhiều tác nhân bảo quản để cho hiệu quả
cao hơn (ví dụ như trường hợp của cây khoai sọ bên dưới)
- Các tác nhân bảo quản thường được sử dụng:
+ Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
+ Dimethyl Sulfone (DMSO2)
+ Hydroxy-ethyl-starch (HES)
+ Polyvinyl Pyrolidone (PVP)
+ Polyethylene Oxide (PEO)
+ Propylene Glycol
+ Ethylene Glycol
+ Glycerol
III.2.3. Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp
- Trải qua bước tiền đông lạnh: có liên quan đến làm lạnh theo 2 bước, làm lạnh
đến nhiệt độ đóng băng ổn định của tế bào (thường là -300C đến -400C tùy đối
tượng), sau đó đưa đến -1960C.
- Điều chỉnh tốc độ làm lạnh chậm: 1- 50C/phút tùy đối tượng.
Có thể kết hợp cả 2 phương pháp: Ví dụ, huyền phù tế bào của cây Sung dâu (Acer

psedoplatanus) sẽ được tiền đông lạnh dần dần (theo các khoảng thời gian 3 phút
ở -150C, -230C, -300C, -400C, -500C và -700C và đưa xuống -1960C sẽ có tỉ lệ sống
khoảng 30%.
+ Bước xử lý này sử dụng các loại máy đông lạnh: Biologicail Freezer-6, Biogical
Dry Freezer DPF 30, Mini – Freezer R 202,…
Bước tiền đông lạnh có hiệu quả trong việc ngăn chặn và giảm sự hình thành tinh
thể nước đá nội bào. Sẽ có một nhiệt độ xác định mà tại đó hầu hết lượng nước có
thể đông đá trong tế bào có thể bị loại ra khỏi tế bào nhờ sự đông lạnh ngoại bào,
6


tế bào và mô ở trạng thái này không bị tổn thương, thậm chí khi tiếp xúc với nhiệt
độ cực kì thấp. Nhiệt độ này dao động trong khoảng -300C đến -400C nhưng có
thể thay đổi theo mức độ chịu lạnh của thực vật. Ở nhiệt độ này, lượng nước dễ
đông lạnh hầu như được loại ra khỏi tế bào (khử nước một phần) nhờ hình thành
nước đá liên bào.

Hình III.2.3. Máy đông lạnh Biogical Dry Freezer DPF 30 (có thể đông lạnh đến
-1900C.
III.2.4. Lưu trữ trong nito lỏng (-1960C)
Mẫu cấy được lưu trữ trong nito lỏng với nhiều độ dài thời gian khác nhau, có thể
được lấy ra và giải đông bất cứ lúc nào.
Thời gian lưu trữ còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: phương thức xử lý mẫu,
loại mẫu, phương pháp làm lạnh,…và cần kiểm tra định kì.

7


Hình III.2.4a. một số dụng cụ chứa mẫu để lưu trữ trong nito lỏng

Hình III.2.4b. Cấc mẫu in vitro được lưu trữ trong nito lỏng
III.2.5. Giải đông
Nên làm ấm nhanh mẫu nuôi cấy trong bể ủ ấm ở 350C – 400C.
Ta không nên làm ấm dần dần vì sẽ làm tái tạo các tinh thể nước đá còn làm ấm
nhanh sẽ làm các tinh thể nước đá tan trước khi chúng có thể tái tạo tinh thể và
phát triển. Các nghiên cứu cho rằng việc các tế bào làm lạnh nhanh bị chết là do
sự phát triển của các tinh thể nước đá nội bào hơn là sự hình thành tinh thể ban
8


đầu. Sự tổn thương của các tế bào có thể là do áp lực tạo tinh thể nước đá gây ra
làm đứt gãy màng plasma của các bào quan.
Tốc độ làm ấm ảnh hưởng đáng kể lên LT50 của tế bào. Với tế bào động vật thì
làm ấm chậm tốt hơn còn tế bào thực vật thì ngược lại, có thể do vách tế bào dày,
tuy nhiên cũng tùy đối tượng. Vd: lá thông làm lạnh đến -450C sống sót khi giải
đông ở tốc độ 50C/giờ nhưng sẽ chết nếu tốc độ là 100C/giờ. Ngược lại, tế bào vỏ
cây dâu tằm được làm ấm ở 400C, sẽ chết nếu được làm ấm dần bằng cách đặt
trong không khí.
III.2.6. Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh
Mẫu nuôi cấy sau khi giải đông sẽ được mang đi li tâm, tác nhân bảo quản được
hút ra bằng pipet và tế bào được rửa ít nhất 3 lần với môi trường phù hợp để loại
bỏ các tác nhân bảo quản còn tồn đọng trong mẫu. Nếu không được loại bỏ các
tác nhân này có thể gây độc hoặc kìm hãm sự sinh trưởng của mẫu.
III.2.7. Xác định khả năng sống sót
Gồm các phương pháp:
- Nhuộm diacetate huỳnh quang: dựa trên hiện tượng tế bào sống khi nhuộm với
diacetate huỳnh quang sẽ phát tia huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím (UV), còn
tế bào chết thì không.
- Dùng triphenyl tetrazolium chlorur: trong phương pháp này, lượng tế bào sống
sót được tính bằng lượng formazan hình thành do giảm lượng triphenyl

tetrazolium chlorur (TTC) tạo ra màu hồng.
- Đo sự tăng trưởng: Bằng cách sử dụng các thông số khác nhau (chỉ số nguyên
phân, số lượng tế bào, thể tích nuôi cấy tế bào, trọng lượng khô và tươi,…), sự
tăng trưởng của mẫu nuôi cấy đông lạnh có thể được so sánh với đối chứng.
III.2.8. Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo
cây hoàn chỉnh
Các mẫu được nuôi cấy lỏng lắc hoặc trải trực tiếp lên môi trường Agar.
Điều chỉnh các điều kiện dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy với các chất ĐHST
thích hợp) và vật lý (cường độ ánh sáng, nhiệt độ, thời gian chiếu sáng,…) phù
hợp để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh. Không phải tất cả các đỉnh chồi còn
sống đều có thể tái sinh chồi, nếu bổ sung Pluronic F – 68 với nồng độ thấp
(0,0005%) sẽ cho tỉ lệ tái sinh chồi cao hơn. Hoặc chiếu sáng cường độ thấp trong
thời gian đầu (6 µmol) và cường độ cao hơn trong thời gian tiếp (40 µmol) cũng
có thể tăng tỉ lệ tái sinh.
III.3. Một số phương pháp được sử dụng trong bảo quản đông lạnh
- Phương pháp lạnh chậm truyền thống (Two – step Cooling) (0,50C –
20C/phút): Các mẫu cấy được xử lý với sự có mặt của dung dịch bảo vệ đông lạnh,
9


thường dùng DMSO nồng độ trung bình 5 – 15% hoặc glycerol, sucrose…, Sau
đó chúng được làm lạnh từ từ với tốc độ 0,2 – 0,3oC/phút cho đến -35oC, rồi ngâm
trong nito lỏng. Khả năng tái sinh dao động từ 4 – 85% tùy loài.
Nhìn chung, phương pháp bảo quản này khá phức tạp và tốn thời gian, cần các
thiết bị đặc biệt. Sau khi hạ nhiệt độ xuống -300C đến -40oC, dung dịch trong tế
bào đông kết dạng trong như kính khi nhúng trong nito lỏng. Phương pháp này
ngày nay sử dụng bảo tồn các mô không tổ chức như callus và dung dịch tế bào
huyền phù.
- Tạo hạt nhân tạo/khử nước (Encapsulatin/Dehydration): Các mô thực vật
được gói trong vỏ alginate (có chứa muối khoáng, chất hữu cơ). Những hạt này

sau đó được xử lý trong đường sucrose nồng độ cao, giảm độ ẩm xuống 20 – 30%
(bằng dòng không khí hoặc chất hút ẩm gel silica) và làm đông lạnh nhanh trong
nito lỏng. Thường thì ta có thể giảm độ ẩm nhờ loại bỏ phần nước tự do trong tế
bào, còn phần nước liên kết thì không thể loại bỏ. Các chất dinh dưỡng bao quanh
mô có thể kích thích mô tái sinh sau khi làm tan đóng băng có lợi cho sử dụng.
- Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification): Đây là phương pháp được sử dụng
phổ biến nhất. Quá trình thủy tinh hóa được mô tả như sự đông đặc của chất lỏng
nhưng không kết tinh. Khi các dung dịch trong tế bào trở thành dạng thủy tinh,
các tế bào đó đang ở trong một “trạng thái thủy tinh” và vô định hình. Chúng thiếu
các cấu trúc tổ chức nhưng có các đặc tính cơ học và vật lý của một chất rắn.
Kĩ thuật xử lý dung dịch đông lạnh đậm đặc lên mô thực vật (15 phút – 2giờ), sau
đó nhúng trong nito lỏng mà không có bước khử nước do đông lạnh cảm ứng (tế
bào và mô phân sinh được khử nước theo cách thẩm thấu trong dung dịch thủy
tinh hóa nồng độ cao). Khác với các phương pháp tiền đông lạnh truyền thống
(thủy tinh hóa một phần, chỉ có cytosol được thủy tinh hóa). Quá trình thủy tinh
hóa cần một dung dịch thủy tinh hóa nồng độ cao, có thể khử nước đầy đủ cytosol
mà không gây ra tổn thương do đó chúng chuyển thành dạng thủy tinh bền vững
khi được đưa vào nito lỏng. Kết quả là cả dung dịch đông lạnh và dung dịch trong
tế bào đều đông kết.
+ Dung dịch đông lạnh này gồm hỗn hợp chất bảo vệ đông lạnh thấm và không
thấm. Chất thông thường nhất gồm PVS2 (độc tính thấp): 30% glycol, 15%
DMSO và 0,4M sucrose, không thấm vào cytosol trong suốt quá trình khử nước.
Dung dịch này có thể dễ dàng hạ nhiệt độ xuống -1000C theo tốc độ làm lạnh thực
tế và cuối cùng hóa rắn ở -1150C.
+ Để cảm ứng khả năng chịu đựng sự khử nước, các chồi đỉnh được cắt từ cây
con in vitro được cấy vào môi trường nồng độ sucrose cao (0.3 – 0.6M) trong 16
giờ và sau đó xử lý với hỗn hợp glycerol 2M bổ sung sucrose 0.4M (dung dịch
LD) trong 20 phút trước khi khử nước với PVS2. Trong phương pháp này, các
ảnh hưởng gây tổn thương do quá trình khử nước được giảm hoặc loại bỏ bằng
10

cách tối ưu hóa thời gian tiếp xúc với PVS2 và bằng cách khử nước đỉnh chồi dần
trong 2 bước: dung dịch LD ở 250C, sau đó là dung dịch PVS2 ở 00C.
+ Vấn đề chủ yếu để lưu trữ lạnh thành công bằng phương pháp này là cảm ứng
sự chịu đựng của mẫu đối với sự khử nước với dung dịch thủy tinh hóa nồng độ
cao. Trong phương pháp thủy tinh hóa, tế bào mô phân sinh được cắt thường được
nuôi cấy trước trên môi trường giàu sucrose và sobitol trong 1 hoặc 2 ngày để cảm
ứng khả năng chịu đựng sự khử nước. Nồng độ đường hoặc sobitol tích lũy cao
trong suốt quá trình nuôi cấy trước khi bảo quản được cho là rất quan trọng trong
việc nâng cao khả năng sống sót của tế bào và mô phân sinh được trữ lạnh. Sự
tích lũy đường tăng độ ổn định của màng dưới điều kiện mất nước nghiêm trọng.
- Sarkar và Naik (1998) sử dụng phương pháp thủy tinh hóa đầu tiên cho giống
S. Tuberosum (cây nguyệt hạ dương) ‘Kufri Basha’, ‘Kufri Chandramukhi’,
‘Kufri Lalima’, ‘Kufri Lauvkar’ và ‘Kufri Sindhuri’. Trong phương pháp thủy
tinh hóa này, các đỉnh chồi có kích thước 0,5 – 0,7 mm lần đầu tiên được phân lập
từ cây con 30 ngày tuổi và tiền nuôi cấy trong 2 ngày trên cầu giấy lọc trên môi
trường ½ MS có bổ sung 8,7 mM GA3 và sự kết hợp các nồng độ khác nhau của
sucrose (0.3, 0.5 và 0.7M) và mannitol (0, 0.2 và 0.4M) trong 16h chiếu
sáng/ngày, cường độ ánh sáng khoảng 40 µmol m-2s-1, ở 240C. Các đỉnh chồi sau
đó được thả vào 20% PVS2 (30 phút, 240C), sau đó trong 60% PVS2 (15 phút,
ngâm trong nước đá) tiếp theo là 100% PVS2 đông lạnh (5 phút) hoặc trực tiếp
tại 100% PVS2 (5 phút).
- Năm đỉnh chồi được chuyển vào một cryovial đầy với 0,7 ml PVS2 và cuối cùng
cho vào nito lỏng. Sau khi làm ấm nhanh ở 350C trong một cốc nước trong 1 phút,
các cryovial đã được đổ vào môi trường pha loãng (MS với 1,2M sucrose) và ủ
trong 30 phút. Sau đó các đỉnh chồi được nuôi cấy trên môi trường tái sinh (MS
với 0.2M sucrose, 5.8 mM GA3, 1.0 mM BAP và 6 g/l agar Nobel (HiMedia, Ấn
Độ) và nuôi cấy dưới ánh sáng khuếch tán (khoảng 6 µmol m-2s-1, 16h chiếu sáng)
ở 240C trong 1 tuần.

Sau đó, các đỉnh chồi được chuyển vào môi trường chuẩn (MS với 0.09M sucrose,
2.9 mM GA3 và 6 g/l agar) trong điều kiện cường độ ánh sáng khoảng 40 µmol
m-2s-1, ở 240C, 16 giờ chiếu sáng.
- Để tái sinh thành công, tiền nuôi cấy với sự kết hợp giữa sucrose và mannitol là
cần thiết, nồng độ mannitol trên 0.2M là bất lợi. Các đáp ứng cao nhất được quan
sát ở cách áp dụng tiền nuôi cấy với 0.3M sucrose và 0.2 M mannitol sau thủy
tinh hóa tuần tự với tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất là 56%.
- Phương pháp DMSO giọt – giọt đóng băng (DMSO Droplet Method –
Droplet Freezing): Đây là phương pháp tối ưu hóa các phương pháp làm lạnh
cực nhanh. Từ “giọt” đề cập đến những giọt chất bảo vệ lạnh trên một lá nhôm,
11


trên đó, những đỉnh chồi được đặt để làm lạnh và tái làm ấm. Cũng như các giọt
agarose cùng với mỗi đỉnh chồi và môi trường lỏng đã được sử dụng để tái sinh.
Ý tưởng sáng tạo bằng nhôm lá bắt nguồn từ Kartha et al. (1982), người bảo quản
lạnh các đỉnh chồi sắn trên lá kim loại sử dụng phương pháp làm lạnh 2 bước.
Schäfer-Menuhr et al. (1994) đã thông qua ý tưởng về một phương pháp làm mát
nhanh cũng cho các đỉnh chồi của khoai. Các lá kim loại là một giá đỡ tốt trong
việc chuyển một số lượng lớn các đỉnh chồi cùng một lúc một cách nhanh chóng
vào và ra khỏi nito lỏng so với việc sử dụng kim tiêm, chỉ có một đỉnh chồi có thể
được chuyển tại một thời điểm. Hơn nữa, nhôm là một chất dẫn nhiệt rất tốt, điều
đó rất quan trọng trong việc làm lạnh nhanh và làm ấm lại mẫu cấy. SchäferMenuhr et al. (1994) đã sử dụng lá kim loại có kích thước 20 x 7 x 0.03 mm, vì
vậy mà hai lá rất vừa vặn trong một cryovial. Về tình trạng nước trong quá trình
làm lạnh, không có thông tin về trạng thái của nước (đóng băng hoặc thủy tinh)
trong các giọt này trong nghiên cứu. Tuy nhiên, theo quan sát của Benson et al.
(1992) khi sử dụng đối với sắn, nhiều khả năng là thủy tinh hóa có thể xảy ra
(Benson et al. 2006).
- Phương pháp giọt thủy tinh hóa (Droplet Vitrification)
- Đây là sự kết hợp các yếu tố của phương pháp giọt DMSO và phương pháp thủy

tinh hóa, là một phương pháp tương đối mới trong bảo quản lạnh. Trong phương
pháp giọt thủy tinh hóa, các đỉnh chồi được đặt trên các lá nhôm mỏng trong suốt
quá trình làm mát, như trong phương pháp giọt DMSO, nhưng các loại chất bảo
quản lạnh chẳng hạn như PVS2 được sử dụng. Việc sử dụng các lá nhôm làm cho
việc luân chuyển các đỉnh chồi vào và ra khỏi nito lỏng dễ dàng và nhanh hơn.
Điều này có thể rất quan trọng trong quá trình sử dụng PVS2, bởi vì thời gian ủ
dài hơn một chút có thể gây độc cho đỉnh chồi.
Sử dụng giọt thủy tinh hóa, kết quả thành công đầu tiên đã được trình bày bởi
Halmagyi et al. (2005) trong ba giống khoai tây (‘Desiree’, ‘Ostara’, và ‘sante’).
Các cây được nhân lên trên môi trường MS không chất ĐHST và duy trì ở mức
240C với cường độ ánh sáng là 39,06 µmol m-2s-1 và 16 giờ chiếu sáng. Đỉnh chồi
với các kích cỡ khác nhau (1 – 6 mm chiều dài) được tách ra bằng các kim tiêm
từ 4 – 8 tuần tuổi và ủ trên giấy lọc với môi trường MS lỏng bổ sung 0.4 mg/l
GA3, 0.5 mg/l zeatin và 0.2 mg/l IAA ở 240C trong 24 giờ. Sau đó tiền nuôi cấy
với nhiều loại đường khác nhau (sucrose, glucose, mannitol và sorbitol) được thực
hiện ở 240C trong 24h. Sau đó các đỉnh chồi được làm mất nước trong những giọt
4 ml với PVS2 trên lá nhôm (0,6 x 1,5 cm) ở nhiệt độ phòng 10 – 30 phút, trước
khi chuyển vào các cryovial làm lạnh sơ bộ và sau đó chuyển vào nito lỏng. Làm
ấm nhanh chóng được thực hiện bằng cách lắc lá nhôm trong môi trường lỏng ở
nhiệt độ phòng. Để tái sinh các đỉnh chồi được cấy vào môi trường bán rắn với

12


3,5 g/l agar ở 240C trong 20 ngày. Sau đó các chồi kéo dài sẽ được chuyển vào
môi trường rắn với 7 g/l agar (Halmagyi et al. (2005)).
Các tần số tái sinh chồi cao nhất ở các giống khoai tây là 55% ‘Desiree’, 51%
‘Ostara’, 46% ‘Sante’. Panta et al. (2006) sử dụng cây giống đã được tiền nuôi
cấy tại 60C trên môi trường MS với 0,07 M sucrose trong 3 tuần. Sau đó các đỉnh
chồi được tách ra (2 – 3 mm) và ủ trong dung dịch MS với 2 M glycerol và 0,4 M

sucrose trong 20 phút. Các đỉnh chồi được chuyển vào PVS2 ở 00C trong 50 phút,
đặt trên lá nhôm, đưa vào các cryovial và thả vào nito lỏng. Làm ấm được thực
hiện nhanh chóng trong môi trường MS làm giàu với 1,2 M sucrose trong 20 phút.
Mẫu cấy sau đó được nuôi trên môi trường MS với 0,04 mg/l kinetin và 0,1 mg/l
GA3 và 0,1 – 0,3 M sucrose, giảm mức độ 0,1 M sucrose mỗi ngày. Khả năng tái
sinh của các đỉnh chồi phụ thuộc vào kiểu gen và dao động ở mức 8% trong S.
tuberose ‘Wila Yari’ đến 47% trong ‘Desiree’ (Panta et al. 2006; bảng 2). Panta
et al. (2009a) cũng phân tích các hợp chất sinh hóa nhất định, chẳng hạn như
phospholipid, glycolipid, các amin thơm và polyamin để tìm các liên kết đến khả
năng bảo quản lạnh.
- Họ nhận thấy rằng kiểu gen kháng sương giá có tỉ lệ tái sinh cao hơn đáng kể
sau khi bảo quản lạnh và hàm lượng acid lioleic tương quan tuyệt đối với khả
năng chịu bảo quản lạnh. Nó cũng đã được kết luận rằng việc bổ sung putrescine
cho môi trường tiền nuôi cấy có thể nâng cao hơn nữa tỉ lệ phục hồi cho các kiểu
gen tái sinh kém. Trong những năm gần đây, số lượng các loài được bảo quản
lạnh thành công bằng cách sử dụng phương thức giọt thủy tinh hóa kết hợp với
làm lạnh nhanh và làm ấm lại liên tục tăng (Gonzalez-Arnao et al 2008;..
Halmagyi et al 2005; Kim et al 2006;. Leunufna và Keller năm 2005; Panta et al
2006;. Sakai và Engelmann 2007;. Sant et al 2008; Senula et al 2007;.. Yoon et al
2006), trong khi đó phương pháp làm lạnh hai bước đang được sử dụng ít thường
xuyên hơn và sau đó trong nhiều trường hợp chỉ cho mô sẹo và các dịch huyền
phù (Gnanapragasam and Vasil năm 1992; Mikula et al. 2005). Lý do cho việc sử
dụng ngày càng tăng của giọt thủy tinh hóa nằm trong ứng dụng nhanh chóng và
dễ dàng mà không cần thiết bị làm mát đắt tiền mà đó lại là cần thiết cho làm mát
2 bước.
- Các phương pháp khác: tiền xử lý in vitro, tiền xử lý in vitro/khử nước, tạo hạt
nhân tạo/thủy tinh hóa…

13

III.4. Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ)

Hình III.4. Bảo quản đông lạnh cây khoai sọ bằng phương pháp thủy tinh hóa.
- Vật liệu: 3 loại mô phân sinh đỉnh: đỉnh hở (O: 1 lá), một phần được bao bọc
(PC: 2 lá) và bao bọc hoàn toàn (FC: 3 lá) bởi các lá sơ khởi bên ngoài.
- Phương pháp thủy tinh hóa
1. Chuẩn hóa mẫu (Preconditioning): Chuẩn bị trước 1 tháng với môi trường ½
MS + 6 – 12% sucrose.
2. Lựa chọn đỉnh sinh trưởng (Meristem selection): Có 3 loại O, PC và FC.
3. Tiền xử lý in vitro (Preculture): 1 – 2 đêm, môi trường MS + 0.3 – 0.7 M
sucrose.
4. Thả vào ống eppendoff (Loading): 20 phút, trong dung dịch glycerol 2M +
sucrose 0.4 M.
5: Khử nước (Dehydration): 40 – 60 phút ở 250C trong PVS2.
6. Chuẩn thể tích đúng 0.7 ml.
7. Giữ trong nito lỏng (LN storage): Chỉ sử dụng ống eppendoff 0.7 ml, làm lạnh
nhanh.
8. Giải đông (Thawing): làm tan nhanh chóng, lắc 80 giây trong nước ở 400C.
9. Lấy ra khỏi ống (Unloading): 15 phút, trong môi trường MS lỏng + 1.2 M
sucrose.

14


10. Đặt trên giấy thấm (Blotting): 1 – 2 đêm, trên giấy lọc trên môi trường MS
lỏng với 0.3 M sucrose.
11. Phục hồi (Recovery): Trên môi trường tái sinh + 3% sucrose.
Trong đó, FC thể hiện khả năng chịu đựng khi khử nước bằng PVS2, tiếp theo là
PC còn O thì nhạy cảm nhất. Nhưng sau khi giải đông thì khả năng tái sinh cao

nhất là PC, đến O và cuối cùng là FC (77.6%, 33.5%, 4.6%).
Giải thích: với mô FC do được bao bọc toàn bộ nên phần đỉnh không được khử
nước đúng chuẩn, mô loại O thì toàn bộ đỉnh đều tiếp xúc trực tiếp với PVS2 nên
đôi khi được overdehydrate hóa hoặc bị hư hỏng trong quá trình xử lý mẫu cấy.
chỉ có mô loại PC với chỉ một phần của đỉnh tiếp xúc với tác nhân bên ngoài nên
được coi là mẫu đỉnh đông lạnh phù hợp nhất.
- Làm mất nước với mục đích là làm tăng độ nhớt, làm mất nước thành công khi:
các tế bào bị tổn thương tối thiểu, có khả năng được biến đổi thành thủy tinh khi
làm lạnh trong nito lỏng.
- Dung dịch thủy tinh hóa (PVS2): 30% glycerol + 15% ethylene glycol + 15%
DMSO + 0.4 M sucrose.
- Tiền xử lý in vitro bằng đường (Sucrose preculture): để tăng khả năng sống sót
sau khi giải đông.
- Sucrose trong môi trường chuẩn hóa mẫu (Sucrose preconditioning): để làm
cứng VPTM, thường lạnh cứng ở 4 – 50C, nhưng các mô phân sinh của khoai môn
lạnh cứng tại 10 – 150C.
III.5. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự hồi phục của tế bào đông lạnh
III.5.1. Độ tuổi, đặc tính và mật độ tế bào
- Các tế bào mô phân sinh: Huyền phù tế bào chuyển định kì và tăng trưởng mạnh
trong phase tăng trưởng hàm mũ tốt hơn những mẫu đã nuôi cấy lâu với các tế
bào lớn có vách dày với ít tế bào chất. Các tế bào có không bào to dễ dàng bị chết
do tích lũy và ngập tràn các tinh thể nước đá bên trong không bào.
- Lượng nước: Tế bào hay mô chứa lượng nước càng cao thì càng dễ bị tổn thương
do đông lạnh. Các đỉnh chồi thường có khả năng sống sót cao hơn vì các tế bào ở
đỉnh không có không bào và có vách mỏng, gần giống với tế bào huyền phù tăng
trưởng mạnh.
- Tế bào: các dòng tế bào nhỏ có chứa các tế bào nhiều tế bào chất có tỉ lệ sống
cao hơn. Một lượng lớn mô sẹo lưu trữ trong nito lỏng trở nên xốp và chết khi
giải đông, có thể là do sự hình thành các tinh thể nước đá xuyên mạch làm cho
không khí thoát ra ngoài. Các cụm tế bào thường có sức sống cao hơn các tế bào

đơn.
15


- Mật độ tế bào: các ống có chứa nhiều huyền phù nén đặc thường có tỉ lệ tế bào
sống sót cao hơn những ống có mật độ thấp.
- Mức độ chịu lạnh: tùy vào từng loại mẫu.
III.5.2. Các tác nhân bảo quản lạnh
(đã được giải thích ở trên)
III.5.3. Tốc độ làm lạnh và phương pháp giải đông
- Tốc độ làm lạnh: quá trình làm lạnh không đúng có thể gây ảnh hưởng đến tế
bào. Vd, trực tiếp hạ nhiệt độ có thể ảnh hưởng xấu đến các con đường sinh hóa
và vật lí nội bào, sự hình thành tinh thể nước đá ngoại bào và nội bào và sự thay
đổi chất tan của tế bào dẫn đến quá trình khử nước.
Sự hình thành các tinh thể nước đá nội bào là một trong những nguyên nhân chính
gây tổn thương do đông lạnh và thường gây chết. Vì thế việc làm lạnh phải được
thực hiện đủ chậm để tất cả lượng nước có thể đông thoát ra ngoài tế bào trong
quá trình làm lạnh.
- Phương pháp giải đông: thường là làm ấm nhanh
III.5.4. Nhiệt độ lưu trữ
Nhiệt độ phải đủ thấp để lưu trữ tế bào trong thời gian dài và để ngưng mọi hoạt
động biến dưỡng, ngăn các tổn thương về mặt sinh hóa, thường lưu trữ ở nhiệt độ
của nito lỏng.
IV. Ưu và nhược điểm của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian
dài
IV.1. Ưu điểm
- Bảo tồn được sự đồng dạng di truyền: Tế bào thực vật nuôi cấy có sự đa dạng
và biến thiên di truyền rất lớn phụ thuộc vào nguồn gốc và kết cấu di truyền của
mô, chịu ảnh hưởng đáng kể bởi các điều kiện vật lý và các chất ĐHST làm mất
ổn định nhiễm sắc thể. Sau nhiều chu kì nuôi cấy, tế bào có khuynh hướng trải

qua quá trình nội nguyên phân (endomitosis), kết quả nuôi cấy sẽ thu được nhiều
mức độ bội nhiễm sắc thể khác nhau.
- Bảo quản được các bộ gen hiếm: các loài đột biến, các loài được lai tạo ra,…
- Lưu trữ tế bào thực vật sống trong thời gian dài mà không mất tính toàn thế của
tế bào.
- Tạo và duy trì được vật liệu sạch bệnh, đặc biệt khả năng làm sạch virus.
- Có thể chọn lọc được các dòng đột biến chịu lạnh.

16


- Duy trì ưu thế phát sinh hình thái: Nuôi cấy mô trong thời gian dài sẽ làm mất
khả năng phát sinh hình thái, bằng cách lưu trữ đông lạnh, ưu thế phát sinh hình
thái có thể được duy trì trong một khoảng thời gian dài.
- Làm chậm sự biến dưỡng và lão hóa: Ở nhiệt độ cực thấp, toàn bộ tế bào được
giữ ở trạng thái bất hoạt về mặt biến dưỡng. Điều này sẽ ngăn chặn hoặc gần như
làm ngưng quá trình lão hóa.
Biến dưỡng hay trao đổi chất là những quá trình sinh hoá xảy ra trong cơ thể sinh
vật với mục đích sản sinh nguồn năng lượng nuôi sống tế bào (quá trình dị hoá)
hoặc tổng hợp những vật chất cấu tạo nên tế bào (quá trình đồng hoá), đó là nền
tảng của mọi hiện tượng sinh học.
- Đối tượng và hình thức lưu trữ khá đa dạng.
- Chỉ cần không gian nhỏ hẹp để lưu trữ một lượng mẫu lớn.
- Tránh được rủi ro do điều kiện ngoại cảnh: dịch bệnh, thiên tai,…
IV.2. Nhược điểm
- Chi phí bảo quản lớn.
- Đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại.
- Có khă năng tạo ra biến dị soma (ít xảy ra): chủ yếu xảy ra trong quá trình nuôi
cấy mô và tái sinh.
- Chưa có những đánh giá đầy đủ về mối tương tác giữa các yếu tố môi trường.

- Chưa xác định được thời gian bảo quản tối đa cho từng đối tượng.
V. Khả năng ứng dụng của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian
dài
- Trong nông nghiệp: bảo tồn các cây trồng chuyển gen, cây lai F1, cây trồng sạch
bệnh, tạo cây sạch virus,…
- Trong công nghiệp: các dây chuyền sản suất giống bằng phương pháp nuôi cấy
mô.
- Trong y học: bảo tồn các cây dược liệu.
- Trong nghiên cứu khoa học: bảo tồn các giống cây quý nằm trong sách đỏ, lưu
trữ tế bào thực vật sống trong thời gian dài mà không mất tính toàn thế của tế bào,
…
VI. Kết luận
- Có rất nhiều nhiều cách bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài nhưng
đều có một điểm chung là bảo tồn trong nito lỏng, sử dụng các tác nhân bảo quản
17


đông lạnh và giảm nước trong tế bào. Trong các phương pháp đó thì Thủy tinh
hóa (Vitrification) được sử dụng phổ biến nhất.
- Để thành công trong việc lưu trữ lạnh, cần phải tránh việc gây đông bên trong
và làm chết tế bào vốn thường xảy ra trong quá trình làm lạnh nhanh trong nito
lỏng. Do đó các mẫu cần lưu trữ phải được khử nước cẩn thận để tránh xảy ra
đông nội bào. Sự thủy tinh hóa có thể là cơ chế chống đông duy nhất cho phép tế
bào, mô và cơ quan hydrate hóa sống sót ở nhiệt độ của nito lỏng. (Các mẫu càng
ít nước thì khả năng sống sót sẽ cao hơn, ví dụ như đỉnh sinh trưởng). Sự thủy
tinh hóa là một quá trình vật lý, có thể được định nghĩa như một sự chuyển phase
của một dung dịch nước từ dạng lỏng sang một trạng thái rắn thủy tinh vô định
hình tại một nhiệt độ gọi là nhiệt độ hóa thủy tinh trong khi tránh được sự tạo
thành các tinh thể nước đá với các cạnh sắc nhọn gây tổn thương tế bào và mô.
Thủy tinh sẽ lấp những chỗ trống trong mô, và trong suốt quá trình khử nước có

thể góp phần vào việc ngăn cản sự hủy hoại mô nhiều hơn, nồng độ chất tan và sự
thay đổi pH. Dạng thủy tinh có độ nhớt rất cao và làm ngừng mọi phản ứng hóa
học đòi hỏi có sự khuếch tán phân tử, sự hình thành của dạng này sẽ dẫn đến sự
ngủ và ổn định trong thời gian dài.
- Việc bảo tồn nguồn gen in vitro cũng có rất nhiều ý nghĩa đặc biệt là trong nông
nghiệp và nghiên cứu khoa học.

18


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Dương Tấn Nhựt, Công nghệ sinh học thực vật – nghiên cứu cơ bản và ứng
dụng, tập 1, NXB Nông Nghiệp, tp Hồ Chí Minh, 2011.
2. Vũ Văn Liết, Giáo trình quỹ gen và bảo tồn quỹ gen, Bộ Giáo dục và đào tạo
trường Đại học nông nghiệp Hà Nội, 2009.
Tiếng Anh:
1. Nguyen Tien Thinh, Hiroko Takagi and Akira Sakai, Cryopreservation of in
vitro-grown apical meristems of some vegetatively propagated tropical monocots
by vitrification, Cryopreservation techniques, p. 227 – 232.
2. Masaya Ishikawa, Hiroyuki Ide, William S. Price, Yoji Arata and Tomomi
Kitashima, Freezing behaviours in plant tissues as visualized by NMR
microscopy and their regulatory mechanisms, Cryopreservation of Tropical Plant
Germplasm, p. 22 – 35.
3. A Review, Anja Kaczmarczyk, Veli – Matti Rokka, E. R. Joachim Keller, 2011,
Potato Shoot Tip Cryopreservation, Potato Research, 54: 45 – 79.
4. Biao Wang, Zhenfang Yin, Chaohong Feng, Xiao Shi, Yupeng Li, Qiaochun
Wang, 2008, Cryopreservation of Potato shoot Tips, Global Science Books.

19

PHỤ LỤC
Các chữ viết tắt:
- DMSO: Dimethyl sulfoxide
- MS: Murashige and Skoog (1962)
- PVS2: Plant vitrification solution 2: hỗn hợp dung dịch đông lạnh thực vật số 2.
- ĐHST: Điều hòa sinh trưởng thực vật
- LD: hỗn hợp glycerol 2M bổ sung sucrose 0.4M
- BAP: 6 – Benzyl amino purine
- GA3: Gibberellic acid
- IAA: Idole – 3 – acetic acid
So sánh các phương pháp bảo tồn in vitro
Giống nhau:
- Cùng chung mục đích bảo quản là hạn chế cấy chuyền nhiều lần gây biến dị, giữ
giống, duy trì sự phong phú đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ
sinh thái nói chung để làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách
hợp lý cho hiện tại và trong tương lai.
- Đều bổ sung các tác nhân bảo quản và bảo quản ở nhiệt độ thấp.
- Được thực hiện dưới điều kiện bảo quản vô trùng và hạn chế ảnh hưởng đến sức
sống của mẫu in vitro.
- Lựa chọn vật liệu và xử lý sạch bệnh.
Khác nhau:
Bảo quản ngắn hạn: nuôi cấy in vitro dưới điều kiện sinh trưởng bình thường.
Bảo quản dài hạn
Phương
Phương pháp bảo quản
pháp
ngừng sinh trưởng tạm
thời.

Nguyên lý Làm cho mẫu ngừng sinh
trưởng tạm thời.
Đặc điểm -Mẫu được bảo quản
trong nito lỏng.
-Trong thời gian bảo quản
tế bào mô hoàn toàn
ngừng sinh trưởng.
-Có thể bảo quản 20-30
năm hoặc lâu hơn.

Bảo quản trung hạn
Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối
thiểu.
Làm cho tốc độ sinh trưởng của mẫu
giảm tới mức tối thiểu.
-Sử dụng chất ức chế sinh trưởng như
ABA, CCC; chất gây áp suất thẩm thấu
như mannitol, sorbitol, saccarose.
-Trong thời gian bảo quản mô và tế bào
vẫn tiếp tục sinh trưởng nhưng với tốc
độ rất chậm.
-Có thể kéo dài một vài năm.

20


Đối tượng Mẫu đem bảo quản ở dạng Mẫu dạng phôi, chồi, mầm, cây con.
phôi, mô sẹo, các mô nuôi
cấy…
Điều kiện Nito lỏng -1960C

Cường độ ánh sáng yếu kết hợp nhiệt độ
bảo quản
thấp 0-50Cvới loài nguồn gene chịu
lạnh; 15-200C với cây nhiệt đới.
Xử lý mẫu Phá băng ở -350C đến - Mẫu được chuyển sang môi trường mới
sau bảo 400C
pha chế và đặt trong điều kiện tối thích
quản
một thời gian ngắn để kích thích sự tái
sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu
một chu kì bảo quản mới.
Khả năng làm sạch virus (Virus elimination)
Phương pháp bảo tồn này có thể loại bỏ virus với tần số cao:
Ví dụ: virus PVY (Potato virus Y) ở khoai tây nếu tách đỉnh sinh trưởng chỉ loại
được 65% trong khi phương pháp này có thể loại được 91 – 95%. Ngoài ra,
phương pháp tách đỉnh sinh trưởng cần 87 ngày để tạo ra các cây sạch virus với
kích thước đỉnh sinh trưởng rất nhỏ (0,01 – 0,05 mm) còn phương pháp này chỉ
mất có 55 ngày với kích thước đỉnh chồi có thể tách lớn hơn rất nhiều (1 – 3 mm).
(Biao Wang, Zhenfang Yin, Chaohong Feng, Xiao Shi, Yupeng Li, Qiaochun
Wang, 2008, Cryopreservation of Potato shoot Tips, Global Science Books.)

21