NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

BỘ NÔNG NGHIỆP

VIỆN NGHIÊN CỨU

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC
THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ
CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP
HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Cơ quan chủ trì đề tài:

Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

Chủ nhiệm đề tài/dự án: ThS. Cao Thành Trung

TP.HCM – 2014


BỘ NÔNG NGHIỆP

VIỆN NGHIÊN CỨU

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC
THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ
CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP
HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Chủ nhiệm đề tài

Cơ quan chủ trì đề tài

Th.S. Cao Thành Trung

Ban chủ nhiệm chương trình

Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn

TP.HCM - 2014


MỞ ĐẦU
Ngành nuôi trồng thủy sản có vai trò hết sức quan trọng trong việc phát triển
nền kinh tế của đất nước. Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có điều kiện tự
nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm thủy sản. Vài năm trở lại đây, các
tỉnh trong khu vực này phát triển khá nhanh nghề nuôi tôm thủy sản. Tuy nhiên,
ngoài những giá trị kinh tế mang lại ngành nuôi tôm còn phải đối mặt với nhiều
thách thức và rủi ro như dịch bệnh do vi sinh vật gây ra như vi nấm, vi khuẩn và
virus. Đặc biệt phải kể đến các bệnh trên tôm do virus gây ra đang là một trở ngại
lớn cho sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm trên thế giới cũng như Việt Nam
nói riêng.
Trong vài thập niên qua, bệnh do virus gây ra lúc đầu chỉ có 6 virus (năm
1989) được biết đến nhưng chỉ trong vài năm sau đó đã có hơn 20 virus (năm 1997)
được phát hiện (Hernández-Rodríguez và ctv., 2001), trong đó có thể kể đến bệnh
đốm trắng do WSSV gây thiệt hại nặng nề đối với nghề nuôi tôm sú Penaeus
monodon thì virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô
(IHHNV) lại gây thiệt hại to lớn cho nghề nuôi tôm Penaeus (Litopenaeus)
stylirostris với tỉ lệ tử vong lên tới 90% (Lightner, 1983). Kể từ khi IHHNV được
phát hiện ở Hawaii vào năm 1981, virus này đã lan truyền nhanh chóng và đã được
ghi nhận ở nhiều khu vực khác nhau. Với nhiều mức độ thiệt hại do IHHNV gây ra
đã được báo cáo từ nhiều trang trại nuôi tôm ở nhiều khu vực trên thế giới. Bằng
chứng cho thấy mức độ thiệt hại do virus gây ra ước tính khoảng 8,5 tỷ USD thì
riêng thiệt hại do IHHNV gây ra ước tính khoảng 0,5 – 1 tỷ USD (Lightner, 2005).
Trước những ảnh hưởng và thiệt hại do IHHNV gây ra trên các trang trại tôm,
nó đã được liệt vào danh mục vào những virus gây bệnh nguy hiểm trên tôm vào
năm 2000 của Tổ chức Thú y Thế giới (Office Internationnal des Epizooties - OIE)
(Lightner và ctv., 1997; OIE, 2009). Hơn nữa, Chương trình trang trại nuôi tôm
nước mặn của Hoa Kỳ (UMSFP) cũng công bố IHHNV là một trong những tác

nhân gây bệnh quan trọng ảnh hưởng đến giá trị kinh tế tôm thương phẩm và virus
này được liệt vào danh mục bệnh của tổ chức này (Lotz và ctv., 1995). Sau khi

1


Shike và ctv, (2000) công bố những thông tin về trình tự bộ gen của IHHNV được
phân lập ở Hawaii trên GenBank (AF218226) thì trình tự gen của một số chủng
IHHNV cũng được công bố rộng rãi ở nhiều nước khác trên thế giới. Qua những
nghiên cứu về vật liệu di truyền của các chủng IHHNV phân lập từ nhiều vùng trên
thế giới, các nhà khoa học cho rằng bộ gen của IHHNV khá ổn định (Tang và
Lightner, 2002). Và nhiều phương pháp chẩn đoán đã được phát triển hỗ trợ phát
hiện sớm sự hiện của virus IHHNV. Trong đó, tập trung chủ yếu là các phương
pháp phát hiện vật liệu di truyền của virus này. Như phương pháp PCR, Real-time
PCR, phương pháp lai tại chỗ, phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP đã được
giới thiệu cho phép phát hiện IHHNV nhanh chóng và tiện lợi (Rai và ctv., 2012).
Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, cho thấy trình tự IHHNV có rất nhiều biến
đổi khi nhiễm trên tôm sú (Tang và ctv. 2006; Saksmerprome và ctv., 2011). Sự
hiện diện của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của tôm sú thì việc chẩn đoán
IHHNV rất phức tạp bởi các biến thể di truyền của virus trong các khu vực địa lý
khác nhau và sự tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền giữa các type IHHNV. Bên
cạnh đó sự chèn trình tự IHHNV type lây nhiễm ngẫu nhiên vào bộ gen tôm sú
thường xảy ra mà những cặp mồi do OIE và bộ kít thương mại có thể bắt cặp với
trình tự chèn này như là trình tự đích. Dẫn đến kết quả chẩn đoán dương tính giả khi
sử dụng những qui trình này (Saksmerprome và ctv., 2010; 2011).
Hiện nay, vẫn còn có nhiều nghiên cứu trái ngược nhau về sự tác động của
virus lên sự tăng trưởng của tôm sú, một số nghiên cứu cho thấy, trên tôm sú nuôi ở
có hiện tượng dị dạng còi cọc, chậm lớn, phát triển có kích thước không đều khi
nhiễm IHHNV (Primavera & Quinitio., 2000; Rai và ctv., 2009). Một số nghiên cứu
khác cho rằng việc nhiễm IHHNV không có tác động lớn về sự phát triển của tôm

nuôi, cũng như số lượng trứng được đẻ và tỷ lệ nở trứng từ tôm mẹ nhiễm hay
không nhiễm cũng như sản lượng nuôi (Withyachumnarnkul và ctv., 2006; Flegel,
1997).
Sự lan truyền của virus này còn được nhiều nghiên cứu cho rằng chúng có thể
lan truyền theo cả trục dọc lẫn trục ngang, do đó mức độ lây nhiễm của virus này

2


trở nên nhanh chóng. Sự lan truyền theo trục dọc là khả năng truyền bệnh từ bố mẹ
mang mầm bệnh và truyền cho thế hệ sau của chúng (Mottle và ctv., 2003), trong
khi đó lan truyền theo trục ngang do tập tính ăn thịt lẫn nhau hay do nguồn nước bị
nhiễm (Lightner và ctv., 1983a,b). Mặc dù, có nhiều nghiên cứu về sự lan truyền
theo trục dọc cũng như theo trục ngang của IHHNV ở các loài tôm he như P.
stylirostris, P. vannamei nhưng có rất ít nghiên cứu về sự lan truyền của IHHNV
trên tôm sú Penaeus monodon.
Ở Việt Nam tôm nhiễm virus xảy ra hàng năm và IHHNV đã xuất hiện trên
tôm nuôi Việt Nam, chủ yếu lây nhiễm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Khảo sát
trên 307 mẫu tôm sú thu từ miền Trung, tây Nam Bộ và Đông Nam Bộ cho thấy có
đến 52% mẫu nghiên cứu nhiễm các type IHHNV khác nhau (Hùng và ctv., 2009).
Trong khi đó những hiểu biết về virus này trên tôm sú ở Việt Nam không nhiều do
có ít nghiên cứu về IHHNV mặc dù những hậu quả tiêu cực do loại vius này gây ra
cho ngành công nghiệp nuôi tôm đã được cảnh báo trên toàn thế giới. Chỉ có một
vài tổ chức chỉ tập trung ứng dụng các qui trình chẩn đoán PCR đã được OIE công
bố để phát triển các kít thương mại để chẩn đoán virus. Một nghiên cứu mới đây của
Hùng và ctv. (2009) cho thấy trình tự chủng IHHNV này có quan hệ rất gần với các
chủng IHHNV ở Đài Loan (AY 355307) và Thái Lan. Chưa có một nghiên cứu nào
về sự lây nhiễm IHHNV trên tôm sú bằng cách cho ăn hay sống chung với tôm
bệnh, như lây nhiễm từ mẹ sang con, hay lây nhiễm giữa các cá thể tôm mang
IHHNV và cá thể trong một quần đàn. Cũng như đánh giá sự hiện diện của chúng

trên tôm sú nuôi trong các mô hình ương nuôi khác nhau. Do đó, nghiên cứu này
của chúng tôi nhằm khảo sát có hay không sự hiện diện chủng mang di truyền khác
nhau của chủng IHHNV, để qua đó nhằm góp phần làm rõ thêm những thông tin về
chủng IHHNV nhiễm trên tôm sú ở Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng như phát triển
các công cụ chẩn đoán, đề xuất các giải pháp hạn chế sự lây lan và có biện pháp
phòng trị trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL.

3


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở Đồng bằng Sông Cửu Long
2.1.1 Tình hình nuôi tôm
Trong những năm gần đây, ngành thủy sản với phát triển không ngừng đã và
đang trở thành ngành kinh tế đóng vai trò quan trọng trong việc xuất khẩu. Việt
Nam với lợi thế bờ biển dài chạy dọc theo địa lý từ Bắc chí Nam nên có một tiềm
năng to lớn cho sự phát triển của ngành thủy sản nước mặn và nước lợ. Trong đó,
nuôi tôm nước lợ chiếm một vị trí và vai trò quan trọng trong ngành thủy sản. Ngoài
những giá trị kinh tế mang lại trong việc xuất khẩu thu nguồn ngoại tệ lớn, ngành
nuôi tôm ở nước ta còn góp phần vào việc giải quyết công ăn việc làm cho đông đảo
người lao động. Theo Tổng cục thống kê (2010) cho thấy vào năm 2000 cả nước chỉ
có khoảng hơn 324.000 ha diện tích nuôi tôm nhưng trong vòng khoảng 10 năm trở
lại diện tích nuôi tôm đã tăng lên gần gấp đôi khoảng 629.000 ha vào năm 2008 và
diện tích nuôi trồng có xu hướng mở rộng vào những năm sau đó (năm 2013 là
652.612 ha).
Ở Việt Nam, các giống tôm nuôi chủ yếu có nguồn gốc tự nhiên như tôm sú,
tôm chì, tôm sắt, tôm nghệ và tôm thẻ được nhập vào nước ta ở thập niên gần đây.
Tuy nhiên, hiện nay tôm sú (Penaeus monodon) vẫn là loài quan trọng được nông
dân lựa chọn nuôi nhiều tại Việt Nam từ nhiều năm qua. Theo Tổng cục Thủy sản
Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn (2011) thì đến năm 2011 cả nước thả nuôi

được 656.425 ha tôm nước lợ thì trong đó diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha.
Trong nhiều năm tôm sú được xem là giống chính giúp đưa Việt Nam vào danh
sách những nước cung cấp tôm quan trọng của thế giới. Năm 2011, tôm sú vẫn giữ
vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt Nam với tổng giá trị xuất khẩu tôm
trong năm 2011 đạt 2,396 tỷ USD thì trong đó xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ
USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị.
Phần lớn diện tích nuôi tôm và sản lượng tôm tập trung từ Nam Bộ đặc biệt là
một số tỉnh ở ĐBSCL có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi
tôm he. Theo điều tra của Tổng cục Thủy sản Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông
4


thôn (2011), tổng diện tích thả nuôi tôm là 602.416 ha chiếm 91,8 % diện tích nuôi
tôm của cả nước, trong đó có diện tích nuôi tôm sú đã lên tới 588.419 ha. Các tỉnh
có diện tích nuôi tôm lớn như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng,
Kiên Giang…
2.1.2 Tình hình dịch bệnh
Mặc dù ngành nuôi tôm mang lại nhiều thuận lợi về kinh tế và xã hội nhưng
cũng gặp phải nhiều khó khăn và thách thức cho ngành. Đó là tình hình dịch bệnh
do vi sinh vật gây ra, đặc biệt là virus trên tôm diễn biến rất phức tạp và khó lường.
Tình hình gia tăng nhanh về diện tích nuôi trồng kéo theo những vấn đề xử lý ao
nuôi, nguồn nước đặc biệt là con giống đầu vào không được kiểm soát chặt chẽ dẫn
đến dịch bệnh trên tôm thường xảy ra thường xuyên. Những dẫn chứng cụ thể từ
năm 1999 đến năm 2003, dịch bệnh tràn lan và bùng phát mạnh làm nhiều diện tích
nuôi tôm mất trắng do tôm chết hàng loạt. Do đó, nó gây ra nhiều thiệt hại to lớn về
tài sản và kinh tế của người nuôi. Qua những nghiên cứu và tìm hiểu cho thấy các
tác nhân gây bệnh cho tôm nuôi đều có nguồn gốc từ virus.
Các bệnh do virus gây ra và dẫn đến nhiều thiệt hại nặng nề về kinh tế cho
ngành nuôi tôm thâm canh phải kể đến như bệnh hoại tử gan tụy do
Hepatopancreatic Parvovirus (HPV), bệnh còi do Monodon Baculovirus (MBV),

bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng do virus
gây hội chứng đầu vàng (YHV - Yellow head virus), và trong những năm gần đây
(từ 2011 đến nay) bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS - Acute Hepatopancreatic
Necrosis Syndrome) do Vibrio parahaemolyticus mang gen độc gây ra khiến tôm
chết hàng loạt ở những vùng nuôi tôm trong nước (ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và
các tỉnh Miền Trung). Gần đây, ở Việt Nam còn xuất hiện thêm bệnh do virus gây
bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) tuy nhiên chưa ghi
nhận được bất kỳ thiệt hại nào do virus này gây ra trên tôm nuôi. Những dấu hiệu
bệnh lâm sàng do virus này cho thấy không rõ ràng, bệnh không gây chết đối với
tôm sú nuôi và những thông tin tìm hiểu và nghiên cứu về virus này ở Việt Nam
hiện chưa có nhiều.

5


2.2. Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious
hypothermal and hemotopoietic necrosis)
Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô có tác nhân gây bệnh là
virus hypothermal and hemotopoietic necrosis (IHHNV) còn có tên khoa học là
PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus), đây là một trong số bệnh nguy hiểm trên
tôm Litopenaeus stylirostris. Bệnh IHHN lần đầu tiên được mô tả trên hệ thống
nuôi siêu thâm canh tôm L. stylirostris tại Hawaii năm 1981 (Lightner và ctv.,
1983). Khi mắc bệnh này, tôm L. stylirostris có tỷ lệ chết lên đến 90%. Sau khi
được phát hiện ở Hawaii, bệnh IHHN tiếp tục được phát hiện phân bố rộng rãi ở Mỹ
và các vùng nuôi ven bờ biển Thái Bình Dương. Ngay sau khi phát hiện IHHNV
trên tôm L. stylirostris các nhà khoa học đã phát hiện virus này có mặt ở cả tôm thẻ
chân trắng Penaeus vannamei cũng từ cùng khu vực phát hiện IHHNV trên tôm L.
stylirostris ở khu vực này, và những tôm thẻ này là vật mang virus không biểu hiện
các bệnh tích (Lightner và ctv, 1983; Bell và Lightner, 1984). Các nghiên cứu sau
này cho thấy IHHNV là nguyên nhân gây biến dạng lớp vỏ kitin của chủy, râu, vùng

đốt ngực và vùng bụng ở tôm thẻ chân trắng và được gọi là hội chứng dị dạng còi
cọc (Runt-deformity Syndrome, RDS). Tác động IHHNV lên tôm thẻ gây ảnh
hưởng về giá trị thương mại do tôm chậm lớn, có kích thước nhỏ, biến dạng vỏ kitin
mặc dù IHHNV không gây chết nghiêm trọng khi tôm nhiễm virus.
Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan thành lập biểu mô là một trong
những bệnh do virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm. Virus này khi xâm nhiễm
vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ. Tôm nuôi ở giai đoạn
postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này. Tôm nhiễm virus này
có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi nước, xoay tròn và chết từ từ trong 2 – 3 tuần. Các loài
tôm khác nhau khi nhiễm bệnh thì có dấu hiệu khác nhau. Loài P. monodon, những
con nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ và hệ cơ vân ở phần bụng có thể bị
mờ đục, chậm lớn (Rai và ctv., 2009). Loài P. vannamei, khi bị bệnh ở dạng mãn
tính và thể hiện một số đặc điểm như còi cọc, dị dạng, như chùy đầu sẽ bị uốn cong
hoặc bị dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị sùi. Tôm kém ăn dẫn đến phân

6


đàn cao. Loài P. stylirostris, nếu bị nhiễm ở cấp tính có thể gây chết tôm ở giai đoạn
ấu niên, ấu trùng và hậu ấu trùng có thể đã nhiễm bệnh nhưng không phát bệnh, sau
35 ngày trở đi bệnh mới bộc phát. Ở mức độ nặng thì tôm sẻ kém ăn, có sự thay đổi
về trạng thái và diện mạo, tôm bơi lội chậm chạp và chết sau vài giờ, xuất hiện các
vùng trắng hay vàng sẫm ở lớp biểu bì kitin, đặc biệt là ở các khớp nối làm cơ thể
tôm xuất hiện các vùng vằn vện (Lightner và Bell, 1984).
2.3. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious
hypothermal and hemotopoietic necrosis virus – IHHNV)
2.3.1. Tên khoa học và phân loại
Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) là
virus có kích thước nhỏ nhất được phát hiện lần đầu tiên trên tôm Penaeus
(Litopenaeus) stylirostris. Do đó, IHHNV còn có tên khoa học là PstDNV (Penaeus

stylirostris densovirus) (Shike và ctv., 2000). Virus này có kích thước từ 20 – 22
nm, có cấu trúc khối đa diện và không có vỏ ngoài. Dựa trên kích thước và hình thái
học, hóa sinh IHHNV được xếp vào họ Parvoviridae và có thể là thành viên của chi
Brevidensovirus (Bonami, 1990).
2.3.2. Bộ gen và chức năng của các protein
Virus này mang vật liệu di truyền là DNA mạch đơn, kích thước khoảng 4,1
kb chứa 3 trình tự ORF (1, 2, 3) (Nunan và ctv. 2000, Shike và ctv. 2000) ở hình
2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của chủng IHHNV phân lập ở Mỹ (AF273215,
Shike và ctv., 2000). Ba khung đọc mở (ORF trái, ORF giữa, ORF phải ) được chỉ
ra trong khung cùng với vị trí của chúng. Vị trí cho (donor-D1) và nhận (ReceptorA1, A2 và A3) giả định được thể hiện hình tam giá. P2, P11 và P61 là vị trí các
vùng promotor (Bổ sung Dhar và ctv., 2010)
Trong bộ gen của IHHNV, ORF bên trái hay còn được gọi ORF1 có kích
thước 2001 nucleotide (nt), chiếm 50% trình tự bộ gen và được dự đoán có thể mã
7


hóa cho một chuỗi peptide 666 amino acid với trọng lượng phân tử là 75.77 kDa,
trên cơ sở tương đồng trình tự với 2 virus Brevidensoviruses trên muỗi, trình tự
amino acid này được dự đoán là non-structural protein 1 (NS1). Trình tự acid amin
được mã hóa bởi ORF1 chứa các motif đặc trưng cho IHHNV. Bao gồm motif nhân
tố khởi đầu sao chép có tính bảo tồn cao (RCR – motifs) chứa motif I (ở vị trí a.a
258 đến a.a 266) và motif II (ở vị trí a.a 307 đến a.a 314) của protein khởi đầu sao
chép và vùng NTP – binding và helicase (ATPase motifs) chung cho tất cả các
parvoviruses (Rai và ctv., 2011; Shike và ctv., 2000). So sánh sự tương đồng trình
tự a.a giữa các chủng ở nhiều vùng trên thế giới cho thấy, mặc dù có sự khác biệt về
trình tự, có nhiều sự thay đổi được tìm thấy ở trong 200 a.a đầu tiên nhưng các
motif đặc trưng của IHHNV vẫn được bảo tồn (Shike và ctv., 2000; Tang và
Lightner, 2003). Tương tự các parvovirus khác, ORF ở giữa (ORF2) bắt đầu từ

nucleotide 56 tính theo chiều ngược và có đoạn chồng lấp trình tự với ORF1, có
kích thước 1092 nt, có khả năng mã hóa cho vùng N – terminal của một chuỗi
peptide mang 343 a.a và được gọi là protein không cấu trúc 2 (NS2). Cuối cùng,
ORF bên phải (ORF3) cũng chồng lấp trình tự với ORF2 (56 nucleotide), có kích
thước 990 nt và có thể mã hóa cho một chuỗi peptide chứa 329 a.a (Dhar và ctv.,
2007; Nunan và ctv, 2000, Shike và ctv, 2000). Bằng phân tích SDS-PAGE có ít
nhất bốn protein cấu trúc khác nhau được phát hiện từ thể virus IHHNV tinh sạch
và chúng có trọng lượng phân tử 74, 47, 39 và 37,5 kD (Bonami và ctv., 1990; Mari
và ctv., 1993). Trong đó protein có kích thước 47 kD đã được xác định là có nguồn
gốc từ ORF3.
2.3.3. Sự đa dạng di truyền của IHHVN
2.3.3.1 Phân loại kiểu gen
Cho đến nay, có rất nhiều bộ gen hoàn chỉnh của chủng IHHNV khác nhau đã
được giải trình tự và mô tả chi tiết. Bao gồm một số chủng như Hawaii ở Mỹ (trên
Genbank có kí hiệu AF218266) có kích thước 3909 bp; Ấn Độ (GQ411199) có kích
thước 3908 bp (Rai và ctv., 2011); Hàn Quốc (JN377975) có kích thước 3914 bp
(Kim và ctv., 2011) và Trung Quốc (EF633688) có kích thước 3833 bp và cùng một

8


số chủng IHHNV có trên GenBank như từ Mexico (AF273215), Đài Loan
(AY355307, AY355306 và AY355308); Thái Lan (AY362547 và AY102034); Việt
Nam (JN616415); Ecuador (AY362548) và Úc (GQ475529). Qua những nghiên
cứu trên vật liệu di truyền của các chủng IHHNV phân lập từ nhiều nơi trên thế giới
cho thấy có ít nhất bốn kiểu gen (type) IHHNV bao gồm: kiểu gen 1 có nguồn gốc
từ Châu Mỹ, Đông Á (chủ yếu là Phillippines), kiểu gen 2 có nguồn gốc từ Đông
Nam Á và hai kiểu gene này là kiểu gen lây nhiễm. Những thí nghiệm lây nhiễm đã
chứng minh kiểu gen 1 và 2 có khả năng lây nhiễm từ vật chủ này sang vật chủ
khác, đại diện là tôm thẻ chân trắng P. vannamei và hoặc tôm sú P. monodon

(Chayaburakul và ctv., 2005). Thông qua việc phân tích bằng PCR và trình tự DNA,
IHHNV được phát hiện ở tôm sú từ vùng Đông Nam Á và 2 biến thể (đại diện là
các chủng từ Thái Lan và Philippine) được nhận diện dựa trên phân tích cây di
truyền (Tang và ctv., 2003).
Bên cạnh trình tự bộ gen IHHNV lây nhiễm, hai trình tự bộ gen IHHNV không
lây nhiễm được chèn vào bộ gene của tôm (IHHNV type 3A/3B) gần đây đã được
phát hiện trên tôm sú ở tự nhiên từ Đông Phi và Úc (Krabsetsve và ctv., 2004; Tang
và Lightner, 2006). Những trình tự tương đồng với virus này có mức độ tương đồng
trình tự nucleotide khá cao (từ 86 – 92 %) với bộ gen virus IHHNV (Tang và ctv.,
2007). Kiểu gen 3A có nguồn gốc từ Đông Phi (Madagascar), Ấn Độ và Úc
(Genbank DQ228358) có chiều dài 4655 bp nucleotide (Tang và Lightner, 2006).
Cuối cùng kiểu gen 3B với trình tự vật liệu di truyền dài 2935 nucleotide (kí hiệu
trên Genbank AY123937) có nguồn gốc từ khu vực phía tây Ấn Độ - Thái Bình
Dương (Indo-Pacific) bao gồm Mozambic, Mauritius và Tanzania (Tang và ctv.,
2003). Các nghiên cứu cho thấy kiểu gen 3A và 3B chỉ tồn tại ở tôm sú và không có
khả năng lây truyền (Tang và ctv., 2006). Tuy nhiên, các parvovirus khác được biết
đến như nguyên nhân lây nhiễm tiềm tàng, đôi khi chúng liên quan đến sự chèn vào
bộ gene và có thể có hoạt tính trở lại dưới tác động của nhân tố môi trường hoặc sự
xâm nhiễm cùng với các virus DNA không có họ hàng với chúng (Tattersall và ctv.,
2005; Geoffroy và ctv., 2006).

9


2.3.3.2. Đa dạng di truyền
Những nghiên cứu ở mức độ di truyền chỉ ra có sự thay đổi đáng kể giữa các
chủng virus phân lập ở Châu Á và có sự thay đổi nhỏ ở các chủng phân lập ở Châu
Mỹ (Tang và Lightner, 2006; Tang và ctv., 2003). Tất cả các chủng IHHNV phân
lập ở Châu Mỹ có sự tương đồng gần với chủng IHHNV từ Philippine. Xem xét về
khía cạnh lịch sử và dịch bệnh của IHHNV ở Châu Mỹ, các tác giả cho rằng

IHHNV từ tôm nuôi ở Mỹ là có nguồn gốc từ Philippine thông qua việc nhập khẩu
tôm P. monodon như là loài thủy sản nuôi trong thập niên 1970 của các trang trại
nuôi tôm (Lightner, 1996; Tang và ctv., 2003). Một vài nghiên cứu trước kia cho
thấy, IHHNV trên P. stylirostris và P. vannamei từ Tây bán cầu đã chứng minh bộ
gen IHHNV rất ổn định và sự phát triển giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ đã ổn
định hơn (Tang và Lightner, 2002). Mặt khác, dựa trên phân tích sự đa dạng trình tự
bộ gen IHHNV mã hóa vùng protein không cấu trúc và vỏ capsid (trình tự
nucleotide có kích thước 2,9 kb của IHHNV chứa đựng 3 ORF), cho thấy sự khác
biệt trình tự thấp (ít hơn 0,5 % trình tự nucleotide khác biệt) được tìm thấy trong 14
chủng phân lập từ Hawaii và châu Mỹ từ năm 1982 đến 1997. Thậm chí không có
sự mất đi hay thêm vào trong vùng này của bộ gen virus. Sự thay đổi của 30
nucleotide được ghi nhận thì chỉ có 15 nucleotide thay đổi dẫn đến sự thay đổi của
các a.a (7 ở ORF1, 1 ở ORF2 và 7 ở ORF 3) nhưng không có sự liên hệ giữa sự thay
đổi và động lực virus (Tang và Lightner, 2002). Tuy nhiên, trái ngược với báo cáo
của Tang và Lighter (2002), một nghiên cứu gần đây cho thấy sự đa dạng di truyền
của IHHNV còn cao hơn nữa và ước tính tỉ lệ thay đổi nucleotide ở những chủng
IHHNV phân lập khoảng 1,39 ×10−4 thay đổi/vị trí/năm (Robles-Sikisaka và ctv.,
2010). Bên cạnh đó, khi phân tích trinh tự gen ORF 3 mã hóa cho vỏ capsid của
chủng IHHNV mới được phân lập ở Philippine cho thấy trình tự mới phân lập này
có thể là một chủng khác biệt với các chủng còn lại ở nước này (Caipang, và ctv.,
2011).
Bên cạnh đó, chủng IHHNV từ Hawaii (AF218266) cũng được dùng để so
sánh với các chủng khác được phân lập trên tôm sú từ các vùng khác nhau trên thế

10


giới. Trình tự 2,9 kb được so sánh (chứa đựng khoảng 70 % toàn bộ bộ gen virus
bao gồm cả chiều dài của ORF1 và ORF2) cho thấy chủng IHHNV phân lập từ
Philippine khá giống với chủng ở Hawaii với sự khác biệt khoảng 0,2 % trong trình

tự nucleotide. Chủng IHHNV ở Thái Lan cho thấy sự sai khác lớn hơn so với chủng
Hawaii (ở mức 96 % sự tương đồng). Chủng phân lập từ Đài Loan rất giống (99,7
%) với chủng phân lập từ Thái Lan, sự khác biệt chỉ là 9 nucleotide. Ngoài ra, DNA
ly trích từ tôm sú ở Đông Phi (Tanzania, Madagascar và Mauritius) cũng chứa trình
tự IHHNV và sự khác biệt với chủng từ Hawaii khoảng từ 8,2 % đến 14,1 % (Tang
và ctv., 2003). Nhìn chung, sự sai khác di truyền ở trong họ parvovirus chỉ lên đến 4
% (Erdman và ctv, 1996). Tuy nhiên, trình tự IHHNV được phân lập từ tôm sú có
sự sai khác cao hơn lên tới 14 %. Điều này trái với những kết quả trước đó có ít hơn
0,5 % sự sai khác giữa các chủng IHHNV được phân lập trên tôm P. stylirostris và
P. vannamei ở Tây bán cầu (Tang và Lightner, 2002). Sự đa dạng di truyền cao của
IHHNV trên tôm sú cho thấy các đoạn trình tự ngẫu nhiên của virus được chèn vào
bộ gen của tôm. Kết quả của nghiên cứu ở Thái Lan khi sử dụng 7 cặp mồi ngẫu
nhiên để khuếch đại trình tự gen của IHHNV chỉ ra 20 trong tổng số 99 mẫu tôm (tỉ
lệ khoảng 20 %) có sự chèn vào một hoặc hai đoạn trình tự ngẫu nhiên
(Saksmerprome và ctv., 2011). Sự đa dạng di truyền ở P. stylirostris và P. vannamei
thấp hơn có thể được giải thích do đời sống ngắn nên ít có sự biển đổi di truyền, trái
lại tôm P. monodon lại có khả năng mang virus trong suốt vòng đời của chúng. Các
loài này bị nhiễm IHHNV sau khi IHHNV từ nguồn tôm sú nhiễm bệnh được xuất
khẩu từ châu Á từ giữa và cuối những năm 1970.
2.3.4. Sự lan truyền của IHHNV
Sự lan truyền của IHHNV diễn ra trong tự nhiên cả truyền dọc và truyền
ngang đã được nghiên cứu và chứng minh khi nhiễm trên tôm he. Một số cá thể
trong quần đàn L. stylirostris và P. vannamei sống sót qua các đợt dịch bệnh và
mang IHHNV trong suốt thời gian sống, chúng đã truyền IHHNV sang thế hệ con
và các quần đàn khác thông qua cả đường truyền ngang, lẫn truyền dọc (Bell và
Lightner, 1984; Lotz, 1997). IHHNV rất dễ gây bệnh cho tôm L. Stylirostris, tôm

11

thẻ chân trắng L. vannamei và postlarvae tôm càng xanh Macrobrachium
rosenbergii (Hsieh và ctv., 2006). Kết quả là tôm tăng trưởng bất thường trong suốt
quá trình phát triển (Kalagayan và ctv, 1991.; Lightner và ctv, 1992). Trong sản
xuất tôm thẻ chân trắng, khi nhiễm virus này, tôm có sự chênh lệch về kích thước,
dị dạng còi cọc và thiệt hại về kinh tế khoảng 10-50% sản lượng so với tôm nuôi
không nhiễm virus (Lightner và Redman, 1998). Hiện tại rất ít thông tin liên quan
đến đáp ứng miễn dịch và sinh lý học của tôm khi nhiễm IHHNV, đặc biệt là liên
quan đến sinh sản và phát triển của phôi. Sự lây nhiễm IHHNV tùy thuộc chủng
virus, tùy vào ký chủ lây nhiễm trong tự nhiên và phân bố theo vùng địa lý khác (từ
châu Mỹ đến châu Á, Châu Úc và Châu Phi). Ký chủ của IHHNV hầu hết là các
loài họ tôm he, có thể bị nhiễm bởi IHHNV như tôm sú P. monodon, tôm thẻ chân
trắng P. Vannamei, tôm xanh P. Stylirostris, và một số loài tôm trong tự nhiên P.
occidentalis,

P.

semisulcatus,

Litopenaeus

Schmitti,

Farfantepenaeus

Californiensis, Marsupenaeus japonicus. IHHNV nhiễm tự nhiên trên postlarvae
và cận trưởng thành trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) được ghi
nhận ở miền Nam Đài Loan, còn những loài tôm khác như Fenneropenaeus indicus,
Fenneropenaeus merguiensis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus duorarum
và Litopenaeus setiferus cũng được cho lây nhiễm trong phòng thí nghiệm (Rai và
ctv., 2012; Hsieh và ctv., 2006). Cho đến nay chưa có vật chủ trung gian truyền lây

của IHHNV được biết đến.
Thí nghiệm truyền dọc cũng đã được xác lập thông qua giám sát sự hiện diện
IHHNV ở phôi và thế hệ ấu trùng trên tôm thẻ chân trắng khi cho thụ tinh trứng từ
hai tôm thẻ chân trắng cái (một bị nhiễm IHHNV và một không nhiễm IHHNV) với
tôm đực không mang IHHNV. Kết quả phân tích PCR cho thấy khi tôm cái nhiễm
IHHNV thì phôi và thế hệ con của chúng cũng nhiễm IHHNV, trường hợp tôm mẹ
không mang IHHNV thì phôi và thế hệ con không mang virus IHHN (Motte và ctv.,
2003). Một nghiên cứu khác về lây truyền dọc cho thấy, IHHNV nhiễm trên mô của
buồng trứng và trứng đã thụ tinh của tôm Fenneropenaeus chinesis thì các giai đoạn
con của chúng đều mang virus này (Zhang và Sun., 1997). Lây truyền dọc đã được
xác định, vì virus đã được phát hiện trong các mô buồng trứng và nang buồng trứng
12


(Lotz, 1997). Truyền dọc có thể là một yếu tố rất quan trọng cho sự gia tăng của
IHHNV phổ biến trong gia hóa tôm từ thế hệ này sang thế hệ khác. Một vấn đề thực
tế, khi bố mẹ bị nhiễm virus sinh ra một số lượng lớn thế hệ con mang mầm bệnh và
tiếp tục truyền cho các cá thể khác trong cùng một ao. Vì phần lớn các tôm bị nhiễm
bệnh tồn tại mà không có dấu hiệu lâm sàng, nhiều con tôm này sẽ được lựa chọn
làm bố mẹ mang IHHNV và chúng có thể truyền virus cho thế hệ con sau này
(Motte và ctv., 2003).
Thử nghiệm lây truyền ngang của IHHNV đã được thực hiện bằng cách tiêm
virus, cho tôm ăn vật liệu mang virus, sống chung với tôm mang virus hoặc ngâm
tôm khỏe trong nước có chứa virus (Bell và Lightner, 1984; Lotz, 1997). Kết quả
lây nhiễm cho thấy, lây nhiễm tự nhiên từ tôm bệnh mang virus chết truyền cho tôm
khỏe cao nhất. Trong các trang trại, tôm bùng phát nhiễm virus có thể là kết quả của
con đường truyền ngang thông qua tôm khỏe ăn những con tôm mang mầm bệnh
chết.
Để nghiên cứu sự lây nhiễm của virus trên tôm, có rất nhiều mô hình (phương
pháp) lây nhiễm cho tôm trong phòng thí nghiệm như phương pháp tiêm vào cơ thể

tôm, phương pháp cho tôm ăn nguồn nhiễm bệnh hay cho tôm tiếp xúc với nguồn
nước nhiễm virus và phương pháp cho tôm sống chung với đối tượng nhiễm virus.
Phương pháp tiêm là phương pháp cho kết quả gây nhiễm nhanh và có độ tin cậy
cao tuy nhiên phương pháp này thường gây sốc với tôm và con đường xâm nhập
không giống với cách xâm nhiễm của virus trong tự nhiên. Nên phương pháp này
được chọn để chuẩn bị nguồn lây nhiễm (sống chung và làm nguồn thức ăn nhiễm
bệnh) cho thí nghiệm lan truyền theo trục ngang và tiêm vào cá thể tôm mẹ trong thí
nghiệm theo trục dọc. Có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để cảm
nhiễm nhiều loại virus cho tôm như WSSV (Vijayan và ctv., 2005), MrXV và XSV
(Sudhakaran và ctv., 2007), IHHNV (Brock và ctv., 2007). Tùy thuộc vào kích
thước mà liều lượng được tiêm cho tôm có thể được tính toán thông thường thể tích
từ 10 -100µl. Phương pháp cho ăn mô tôm bệnh là phương pháp khá giống với cách
thức xâm nhiễm của virus trong tự nhiên thông qua tập tính ăn thịt những cá thể yếu
mang mầm bệnh hay xác bã mà cá thể tôm thải ra. Phương pháp này được sử dụng
13


rất nhiều trong những nghiên cứu cảm nhiễm virus cho tôm như thí nghiệm lây
nhiễm WSSV cho tôm thông qua Polycharte Pereneis nuntia nhiễm virus (Vijayan
và ctv., 2005; Loarun và ctv., 2005), lây nhiễm MrNV và XSV cho tôm thông qua
Artemia (Sudhakaran và ctv., 2007) và lây nhiễm IHHNV cho tôm thẻ thông qua
nguồn thức ăn nhiễm virus (Bell và Lightner, 1984; Lotz và ctv., 1997; Tang và
ctv., 2006; Coelho và ctv., 2009). Trong thí nghiệm lây nhiễm bằng cách thức cho
ăn, nguồn thức ăn được thu thập hay sàng lọc từ những cá thể cho kết quả dương
tính với virus. Sau đó chúng được xay nhuyễn và cân đo liều lượng cho ăn, thông
thường các bể thí nghiệm sẽ được cho ăn với tỉ lệ từ 5 – 10 % trọng lượng tôm thí
nghiệm. Đối với các bể đối chứng tôm sẽ được cho ăn mô tôm khỏe hoặc thức ăn
viên. Do đó, phương pháp này thường được lựa chọn để nghiên cứu sự lan truyền
của virus theo trục ngang. Phương pháp sống chung (cohabitant) là phương pháp
khắc phục được nhược điểm của phương pháp tiêm là làm cho tôm nhiễm bệnh

giống với cách thức xâm nhiễm trong tự nhiên của virus. Đây là phương pháp cho
tôm khỏe mạnh sống chung với các cá thể tôm bệnh. Các cá thể tôm bệnh được tạo
ra bằng phương pháp tiêm virus vào cơ thể tôm và được kiểm tra dương tính với
virus bằng PCR. Mô hình này cũng được sử dụng cho nhiều thí nghiệm cảm nhiễm
WSSV (Corre và ctv., 2012) và IHHNV (Lightner và Bell, 1984).
2.3.5 Sự phân bố và lây nhiễm
IHHNV được báo cáo trên nhiều loài tôm và ở nhiều vùng trên thế giới bao
gồm Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Trung Mỹ; khu vực Caribe và vùng Indo – Thái Bình
Dương. Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào ghi nhận sự hiện diện của virus này ở vùng
duyên hải Đại Tây Dương. Hiện nay, với tốc độ lan truyền nhanh chóng IHHNV
được xem như tác nhân có tính phân phối toàn cầu (Lightner và ctv., 1996). Sự xâm
nhiễm trong tự nhiên đã được công bố ở các loài như P. vanamei, P. stylirostris, P.
occidentalis, P. monodon, P. semisulcatus, P. californiensis, P. schmitti và P.
japonicas trên khắp thế giới (Flegel và ctv., 1997; Morales-Covarrubias, 1999). Sự
lây nhiễm trong thí nghiệm cũng được báo cáo ở P. setiferus, P. azteau và P.

14


duoranrum. Tuy nhiên P. indicus và P. merguiensis có lẽ không cảm nhiễm với sự
lây nhiễm của IHHNV (Lightner, 1996).
IHHNV lần đầu tiên được công bố trên tôm P. stylirostris và P. vanamei ở
Hoa kỳ (Lightner và ctv., 1983) và sau đó là ở trên tôm P. monodon từ Châu Á.
Người ta cho rằng, nó được tìm thấy thông qua quá trình nhập khẩu tôm sú có
nguồn gốc từ Philippine (Lightner và ctv., 1992; 1996; 1999). Ở Châu Mỹ, IHHNV
còn được ghi nhận ở các trang trại nuôi tôm ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Trung Mỹ, vịnh
Carribe và khu vực Indo – Thái Bình Dương. Vịnh California ở Mexico virus này
được phát hiện ở các trang trại nuôi tôm xanh P. stylirostris (Lightner, 1992). Sự
phân bố địa lý và giới tính của tôm là yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nhiễm virus
trong quần đàn. Trong các vùng mà virus gây thành dịch trên các đàn tôm hoang dã,

thì IHHNV đã được phát hiện trên các mẫu tôm tự nhiên ở các địa phương là từ 0
đến 100%. Một vài số liệu đã được báo cáo về sự hiện diện IHHNV trong các đàn
tôm hoang dã lần lượt là 26% và 46% trong P. stylirotris ở hạ lưu và thượng lưu của
Vịnh California, 100% và 57% ở tôm cái và tôm đực trưởng thành của P. stylirotris
ở vùng giữa của Vịnh California. Trên tôm P. vannamei thu thập được từ bờ biển
Thái Bình Dương của Panama là 28% khi kiểm tra bằng lai dot blot (Nunan và ctv.,
2001). Mặt khác, những báo cáo gần đây cho thấy sự lưu hành của IHHNV trên tôm
P. setiferus và P. aztecus hoang dã ở Mexico là rất thấp khoảng 4,4 % (GuzmanSaenz và ctv., 2009). Ở Nam Mỹ, những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được
tiến hành trên các mẫu xét nghiệm tôm hoang dã F. subtilis thu thập từ cửa sông
Pacoti ở vùng biển miền Đông Bắc Brazil cho thấy chúng cảm nhiễm với IHHNV
(Coelho và ctv., 2009). Sự lưu hành cao của IHHNV được báo cáo ở các trang trại
tôm từ vùng Đông Bắc Brazil ở phạm vi từ 9,4 – 81 % (Braz và ctv., 2009). Sự lưu
hành thấp (1,1 – 1,3 %) được tìm thấy ở tôm P. vanamei nuôi ở Venezuela và Peru
(0.31%) (Boada và ctv., 2008; Alfaro-Aguilera và ctv.,2010). Ngoài các loại họ tôm
he thì IHHNV hiện diện trên 3 loài giáp xác khác Artemesia longinaris,
Cyrtograpsus angulatus, và Palaemon macrodactylus ở Argentina với tỷ lệ nhiễm
56%, 67% và 40% (Martorelli và ctv., 2010).

15


Owen và ctv., (1992) đã báo cáo sự hiện của IHHNV trong tự nhiên ở
Australia (Úc) thuộc vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương. Năm 2008, dạng lây nhiễm
của IHHNV được tìm thấy trên tôm P. monodon nuôi ở Úc (Saksmerprome và ctv.,
2010). Ngoài ra, IHHNV được phát hiện ở P. stylirostris được nhập khẩu vào
Polynesia (thuộc địa Pháp) và Guam để nuôi trồng (Costa và ctv., 1998; Tang và
ctv., 2002).
Ở Châu Á, virus này đã được tìm thấy ở kiện hàng tôm P. vannamei nhập khẩu
từ tôm nuôi ở Đài Loan vào năm 1986 (Lightner và ctv., 1987). Sau đó, những báo
cáo về sự hiện diện của virus này trên tôm P. monodon hoang dã và nuôi ở các nước

thuộc vùng Đông Á (Trung Quốc và Đài Loan), Đông Nam Á (Singapore,
Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Philippin) và Ấn Độ (Flegel, 1997; Lightner và ctv.,
1996; Tang và ctv., 2003; Rai và ctv., 2009). Những nghiên cứu gần đây cho thấy
sự hiện diện của IHHNV trên tôm P. monodon hoang dã ở Brunei với sự lưu hành
thấp khoảng 14,1 % (Claydon và ctv., 2010). Một cuộc điểu tra ở Trung Quốc cho
thấy sự hiện diện của vius này ở cua biển hoang dã Hemigrapsus penicillatus ở
miền bắc Trung Quốc (Zhang và ctv., 1997). Hơn nữa, sự lưu hành của IHHNV ở
tôm và cua thu thập từ các vùng nuôi trồng thủy sản lần lượt là 51,5 % và 8,3 %
(Yang và ctv., 2007). Gần đây Virus IHHN cũng đã được nghi nhận trên tôm thẻ
nuôi ở Hàn Quốc và trong nước (Kim và ctv., 2011). Ở nuôi trồng thủy sản nước
ngọt, sự xâm nhiễm trong tự nhiên của IHHNV ở giai đoạn ấu trùng và cận trưởng
thành của Macrobrachium rosenbergii được công bố ở miền nam Đài Loan và
Malaysia (Hsieh và ctv., 2006). Một nghiên cứu ở Malaysia cho thấy sự hiện diện
của IHHNV ở tôm giống M. rosenbergiii với sự lưu hành khoảng 20 % (HazreenNita và ctv., 2012).
2.4. Các nghiên cứu IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam
Kể từ khi IHHNV được tổ chức thú y thế giới (OIE) xếp loại vào một trong
những virus gây thiệt hại đến nghề nuôi tôm, đặc biệt là tôm xanh và tôm thẻ chân
trắng, đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến loại virus này. Tuy nhiên, trên tôm sú
nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng và ở Việt Nam nói chung, chỉ có ít
16


nghiên cứu liên quan đến việc phát hiện IHHNV nhiễm trên tôm sú và đặc tính di
truyền cũng như phân bố của chúng. Nghiên cứu về tần xuất hiện diện và sự lan
truyền của IHHNV trên tôm sú nuôi rất hạn chế. Chỉ có một vài nghiên cứu gần đây
của nhóm nghiên cứu Hùng và ctv (2009) đánh giá về tần xuất xuất hiện IHHNV
trên tôm sú ở một số lượng mẫu rất hạn hẹp, 307 mẫu (tỷ lệ nhiễm 160/307 ≈
52,12%), cũng như phân tích trình tự bộ gen của virus (An và ctv., 2009) . Các
thông tin về sự hiện diện của IHHNV và tác động lên tôm sú nuôi tại Việt Nam vẫn
chưa được làm rõ. Hiện tại chỉ có 1 nghiên cứu giải trình tự bộ gen chủng IHHNV

thu nhận từ mẫu tôm ở Bạc Liêu, kết quả cho thấy bộ gen IHHNV từ mẫu nghiên
cứu này có kích thước 3815 bp, có độ tương đồng cao nhất 98% với chủng IHHNV
phân lập ở Đài Loan, 97% với chủng IHHNV Thái Lan (An và ctv., 2009). Tuy
nhiên, do sự du nhập tôm bố mẹ từ nhiều nguồn khác nhau nên rất có thể có sự đa
dạng về di truyền của các chủng IHHNV truyền nhiễm hiện diện tại ĐBSCL. Sự
thiếu hụt các hiểu biết về IHHNV trong hệ thống nuôi tôm sú tại Việt Nam làm lúng
túng trong việc chọn lựa phương pháp xét nghiệm để kiểm soát chất lượng tôm
nuôi.
2.5. Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh IHHNV hiện nay
Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở rất nhiều bộ phận như mang,
biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh…(Lightner và ctv.,1983). Những bộ
phận này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh.
2.5.1. Dựa trên dấu hiệu lâm sàng
Tôm sú nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ (hình 2.2) và hệ cơ vân ở
phần bụng có thể bị mờ đục (Rai và ctv, 2009). Ngoài ra IHHNV hiện diện trên tôm
sú cũng gây ra hội chứng RDS làm biến dạng lớp vỏ kitin. Chùy đầu sẽ bị uốn cong
hoặc dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị xùi, tôm kém ăn (Bell và
Lightner., 1984; Kalagayan và ctv., 1991; Primavera và Quinitio., 2000). Tuy nhiên,
dấu hiệu lâm sàng không phải luôn luôn rõ ràng, dễ nhầm lẫn với dấu hiệu các cơ
quan gây ra bởi các bệnh khác như bệnh đốm trắng WSSV.

17


Hình 2.2. Tôm sú (P. monodon) 50 ngày tuổi bị nhiễm IHHNV với các kích thước
khác nhau (Rai và ctv., 2009). P. monodon bị nhiễm IHHNV khi gần chết có màu
xanh biếc, hệ cơ ở phần bụng có thể mờ đục.
2.5.2. Phương pháp mô học
Đây là phương pháp sử dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán bệnh thủy sản
(Lightner và ctv., 1983; Bell và Lightner., 1984). Các tế bào bị bệnh xuất hiện ở

mang, biểu bì, dưới vỏ, biểu mô phía trước, ruột sau, dây thần kinh, hạch thần kinh
cũng như ở cơ quan tạo máu, tuyến anten, tuyến sinh dục, cơ quan bạch huyết và
mô liên kết. Nội nhân bắt màu thuốc nhuộm Eosin (với thuốc nhuộm H&E), các thể
vùi Cowdry type A (CAIs) hình 2.3 sẽ giúp cho việc dự chẩn nhiễm virus IHHNV.
Nhân của tế bào bệnh bị phồng to với thể vùi trung tâm bắt màu Eosin đôi khi bị
tách ra từ chất nhiễm sắc có viền bằng một vòng không bắt màu, được lưu giữ bằng
các chất cố định có chứa axit acetic. Ngoài vấn đề thời gian kỹ thuật này thực tế
không đủ nhạy để phát hiện giai đoạn sớm, thường chỉ cho kết quả chính xác khi
tôm nhiễm bệnh nặng, cũng như dấu hiệu bệnh lý tế bào của một số bệnh giống
nhau, dễ nhầm lẫn. Kính hiển vi điện tử được áp dụng để chẩn đoán song rất đắt
tiền.

18


Hình 2.3. Một lát cắt mô học trên tôm sú nhiễm IHHNV nhuộm với H& E ở độ
phóng đại 1000X lần cho thấy các thể vùi nội nhân bắt màu Eosin (thể vùi Crowdry
type A) đặc trưng cho nhiễm virus IHHNV (Rai và ctv., 2009)
2.5.3. Lai Dot Blot
Kỹ thuật dot blot đã được ứng dụng nghiên cứu IHHNV và chỉ ra sự hiện diện
của IHHNV ở tôm cái và tôm đực là khác nhau (Morales−Covarrubia và ctv., 1999)
ngoài ra lai dot blot còn dùng thử nghiệm độ nhạy và độ đặc hiệu với DNA IHHNV,
kết quả cho thấy các đầu dò DNA có độ nhạy cao và độ đặc hiệu mạnh mẽ với DNA
IHHNV không có DNA tôm, độ nhạy là 24.8 pg (Zhi−Qin Yue và ctv., 2006).
Nhưng phương pháp này cũng có nhược điểm là phân tích, định lượng các phân tử
lai kém chính xác, hiệu quả thấp, do một phần các nucleic acid được cố định trên
giá thể bị che khuất, không tiếp xúc với các trình tự bổ sung.
2.5.4. Real−time PCR
Phương pháp Real−time PCR là một trong những cải tiến mới nhất của kỹ
thuật PCR. Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA (hay

RNA) được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Do đó có
thể phát hiện và định lượng được nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên
cường độ phát huỳnh quang (Tang và ctv., 2000). Kỹ thuật Real−time PCR được
ứng dụng nghiên cứu IHHNV và biết được độ nhạy của phương pháp này dùng
chẩn đoán DNA IHHNV trong mẫu là 0.15 pg (Khawsak và ctv., 2008). Bên cạnh
đó phương pháp này còn được dùng trong phát hiện IHHNV trên các cơ quan khác

19


nhau của tôm sú bố mẹ hoang dã, thế hệ con của chúng (Chayaburakul và ctv.,
2005). Hiện đã có bộ kit Real-time PCR (IHHNV) (trung tâm công nghệ sinh học
Tp. Hồ Chí Minh., 2008). Tuy nhiên kỹ thuật Real-time PCR đòi hỏi phòng thí
nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao và người phân tích
phải có kiến thức cơ bản về chúng.
2.5.5. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)
Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự nucleic acid cần tìm (trình
tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô lai tại chỗ cho phép nghiên cứu
nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Hiện
nay phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) cũng được phát triển để chẩn
đoán bệnh IHHNV (Mari và ctv., 1993; Jimenez và ctv., 1999), phát hiện IHHNV
ngay trên mẫu mô mà không cần li trích DNA. Kỹ thuật này được dùng để nghiên
cứu sự thay đổi tế bào và mẫn cảm giữa hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng khi
nhiễm IHHNV (Chayaburakul và ctv., 2005). Mẫu dò đặc hiệu với virus IHHNV
được đánh dấu và đem lai trực tiếp với DNA virus trên mô đích trong điều kiện
nghiêm ngặt. Phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng lại cần thời
gian dài để hoàn thành (2 – 3 ngày).
2.5.6. Phương pháp kháng thể đơn dòng
Phương pháp kháng thể đơn dòng cũng được xem như là 1 công cụ ứng dụng
cho những nghiên cứu khác về IHHNV. Kháng thể đơn dòng này có thể phát hiện

IHHNV ở độ nhạy 0.1–0.5 x 10−3 μg/μl GP3 protein. Đồng thời cũng thể hiện băng
đậm khi phát hiện vi khuẩn E. Coli chứa protein tái tổ hợp GP3−pET15b ở vị trí 37
kDa với độ pha loãng 1:100. Hơn thế nữa, kháng thể với nồng độ 1:10 cũng cho
phản ứng đặc hiệu khi bao xung quanh các thể vùi IHHNV ở nhiều bộ phận của tôm
bị nhiễm IHHNV như mang, dây thần kinh, cơ và tế bào biểu bì (Hằng và Flegel.,
2008). Nhưng phương pháp này không đề cập đến chẩn đoán IHHNV lây
nhiễm hay không lây nhiễm.

20


2.5.7. Phương pháp khuyếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop−mediated isotheral
amplification)
Phương pháp LAMP được Tsugunori Notomi và các cộng sự công bố năm
2000 (Notommi và ctv., 2000). Phương này cho phép phát hiện số lượng DNA mẫu
ban đầu rất nhỏ chỉ vài bản mẫu cho tới 100 bản mẫu gốc. Trong lĩnh vực chẩn đoán
bệnh trên tôm nuôi, phương pháp LAMP đã được phát triển để phát hiện cho nhiều
tác nhân virus gây bệnh nguy hiểm trên cá và các thủy sản khác (Savan và ctv.,
2005). Phương pháp LAMP cũng được công bố cho phép phát hiện IHHNV với giới
hạn phát hiện là 5− 500 bản sao của bộ gen IHHNV bằng cách xác định sản phẩm
theo phương pháp đo độ đục và quan sát sự đổi màu với thuốc nhuộm SYBR Green
I, kết quả so sánh còn cho thấy phương pháp LAMP cũng cho phép phát hiện
IHHNV nhạy hơn 100 lần so với phương pháp PCR thông thường (Sun và ctv.,
2006).
So với các phương khác truyền thống, LAMP được xem có nhiều điểm ưu việt
như không cần thiết bị luân nhiệt và thời gian khuếch đại ngắn hơn (40−60 phút),
ngoài ra, độ nhạy của phản ứng cũng tăng cao 10 − 100 lần so với phương pháp
PCR truyền thống (Savan và ctv., 2005), do vậy việc áp dụng phương pháp này trở
nên dễ dàng hơn cho nhiều phòng thí nghiệm không trang bị máy luân nhiệt mà thay
vào đó chỉ cần bể ủ nhiệt (water bath) hoặc thiết bị nhiệt khô (heating block). Mặc

dù mới được giới thiệu nhưng số lượng công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp
LAMP như một công cụ chẩn đoán tăng lên đáng kể trong một vài năm gần đây đã
cho thấy tính hấp dẫn của phương pháp này. Nhưng nhìn chung thì LAMP vẫn còn
là một phương pháp mới và đang được nghiên cứu thêm.
2.5.8 Phương pháp PCR
Phương pháp PCR được ứng dụng phát hiện IHHNV từ các động vật biển (Shi
và ctv., 2003). Hiện có nhiều quy trình PCR được công bố từ các nhóm nghiên cứu
trên toàn thế giới như PCR phát hiện IHHNV (Nunan và ctv., 2000; Rai và ctv.,
2009). Một số quy trình PCR còn cho phép phát hiện phân biệt IHHNV lây nhiễm
và không lây nhiễm (Tang và ctv., 2007; Saksmerprome và ctv., 2010). Đến nay,
PCR vả realtime PCR được xem là một trong những phương pháp hiện đại, nhanh
21


chóng và cho kết quả chính xác nhất trong chẩn đoán IHHNV (Tang và Lightner.,
2001; Dhar và ctv., 2001). Multiplex reverse transcription polymerase (mRT-PCR)
cũng được phát triển để chẩn đoán đồng thời 6 loại virus khác nhau gây bệnh trên
tôm bao gồm IHHNV với độ nhạy phát hiện IHHNV là 0.15pg trong phản ứng
(Khawsak và ctv., 2008). Yang và ctv. (2006) đã phát triển PCR một bước phát hiện
đồng thời 2 virus WSSV và IHHNV nhiễm trên một mẫu tôm với độ đặc hiệu khá
cao. Gần đây, Chen và ctv. (2012) cũng đã phát triển multiplex PCR phát hiện
IHHNV và WSSV mới nhiễm trên tôm với độ nhạy cá 1x 103 copy DNA trong bản
mẫu. Khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp nêu trên, phương
pháp PCR cho kết quả nhanh (trong khoảng 4 giờ) và có độ tin cậy cao. Kết quả thu
được mang tính khách quan, trung thực khi người phân tích kết quả tốt. Do những
ưu điểm trên chúng tôi đã chọn phương pháp PCR để thực hiện đề tài này.
2.5.9 Các nghiên cứu PCR về chẩn đoán IHHNV lây nhiễm trên tôm nuôi
ở Việt Nam
Nhờ tiến bộ về công nghệ sinh, các phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh
trên thủy sản ngày càng đa dạng và phong phú như: chẩn đoán dựa trên vật liệu di

truyền hoặc phản ứng miễn dịch đặc hiệu với tác nhân gây bệnh. Trong đó, PCR là
phương pháp được đánh giá có hiệu quả và độ tin cậy cao. Các đơn vị nghiên cứu
trong nước (Viện công nghệ sinh học, trường Đại học và Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thủy sản) đã phát triển áp dụng nhiều công cụ chẩn đoán giúp cho việc sàng
lọc con giống sạch bệnh. Hiện nay, một số nghiên cứu về IHHNV đã được đưa
vào ứng dụng và thương mại như bộ Kit Mono PCR (IHHNV) hay bộ hóa chất
cho phép phát hiện đồng thời ba virus WSSV, MBV, IHHNV (Trung tâm công
nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh., 2008). Tuy nhiên bộ hóa chất này không đề
cập đến chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm hay không lây nhiễm. Công ty Nam
Khoa cũng đưa ra bộ hóa chất phát hiện đồng thời và phân biệt type IHHNV lây
nhiễm và type A IHHNV không lây nhiễm dựa trên hai cặp mồi 309F/R và
MG831F/R do OIE công bố. Đại học Cần Thơ cộng tác với Thái Lan đã tạo được
dòng kháng thể đơn dòng nhận diện protein 37 kDa của IHHNV (Hằng và Flegel.,

22


2008) nhưng cũng không đề cập đến chẩn đoán IHHNV lây nhiễm hay không lây
nhiễm.
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Xác định được đặc tính di truyền, phương thức lan truyền của IHHNV, đề xuất
giải pháp nhằm hạn chế sự lây lan của virus này.
CÁCH TIẾP CẬN
Virus IHHNV (type truyền nhiễm) có bộ gen với kích thước nhỏ (3,8 - 4,1kb),
một vài nghiên cứu chỉ ra rằng có một số khác biệt về trình tự bộ gen giữa các
chủng IHHNV phân lập giữa các vùng địa lý khác nhau (giữa các quốc gia và trong
cùng một quốc gia). Nghiên cứu này sẽ khảo sát các mẫu IHHNV thu nhận từ 5 tỉnh
thuộc khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) và 3 mẫu từ Miền Trung và
Vũng tàu. Trình tự gen của các type IHHNV thu nhận sẽ được giải trình tự và so
sánh kiểm tra sự khác biệt để có được cái nhìn tổng quan về mặt di truyền những

type IHHNV lây nhiễm đang hiện diện tại khu vực ĐBSCL và mối quan hệ di
truyền của chúng đối với các chủng khác đã được phân lập và nghiên cứu từ các
nước trong khu vực và trên toàn cầu.
Trong quần đàn tôm sú tự nhiên, sự xuất hiện hai dạng trình tự “related
sequences IHHNV” (Type không lây nhiễm) gồm type 3A và type 3B chèn trong
bộ gen của tôm sú đã được công bố. Hai trình tự của type 3A và type 3B được cho
là có nguồn gốc từ IHHNV và có độ tương đồng về trình tự cao với virus này, đồng
thời, sự hiện diện của chúng trong bộ gen tôm cũng không gây ra triệu chứng bệnh
hoặc truyền bệnh. Do trình tự bộ gen IHHNV nhỏ và sự xuất hiện trình tự Type 3A
và Type 3B (khoảng 2,9 kb) trong bộ gen của tôm sú đã gây ra sự nhầm lẫn trong
chẩn đoán sự lây nhiễm IHHNV ở nhiều phương pháp PCR. Nghiên cứu một phần
trình tự type 3A và type 3B trên các mẫu tôm thu được từ 5 tỉnh sẽ cho phép chọn
lựa được phương pháp PCR thích hợp cho ứng dụng phát hiện sớm IHHNV tại Việt
Nam.
IHHNV được cho lây nhiễm ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm thẻ chân
trắng và sự truyền lan được xác định diễn ra theo cả chiều ngang và chiều dọc. Mặc
23