Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (manihot esculenta crantz) tại một số tỉnh đông nam bộ (TT)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN ĐỨC THÀNH

NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN
(Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ

CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT
MÃ SỐ: 62 62 01 12

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2016


Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Ngƣời hƣớng dẫn:

1. PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG
2. TS. TRỊNH XUÂN HOẠT

Phản biện 1:

PGS.TS. NGÔ BÍCH HẢO
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 2:PGS.TS. NGUYỄN KIM VÂN
Hội Khoa học Kỹ thuật Bảo vệ thực vật Việt Nam

Phản biện 3:TS. HÀ MINH THANH
Viện Bảo vệ thực vật

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi

giờ, ngày

tháng

năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) được trồng nhiều ở các tỉnh
phía nam Việt Nam với các vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu
nhập cho người dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn đã
trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, có giá trị
kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây trồng được ưu
tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn.
Ở nước ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một
loại bệnh mới được gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với
biểu hiện triệu chứng đặc trưng do bị nhiễm phytoplasma, như cây mọc

nhiều chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá biến vàng. Cây sắn bị
bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lượng tinh bột giảm
20 - 30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay
trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn
xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phương. Do
nguyên nhân gây bệnh chưa được xác định chính xác nên việc quản lý
bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến
hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm để xử lý hom và phun cho cây
sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, các biện pháp này đều
không có hiệu quả phòng chống bệnh.
Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh
phytoplasma. Bệnh phytoplasma hại sắn đã được ghi nhận ở một số
vùng trồng sắn trên thế giới như quần đảo Wallis-Futuna, Uganda,
Cuba, một số nước thuộc châu Mỹ và châu Á. Phytoplasma gây hại trên
cây sắn xác định được liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù
thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía
đông bắc nước này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% và
làm giảm năng suất củ đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng
suất củ giảm sút đến 90% cũng đã được ghi nhận (Lozano, 1992).
Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Con
đường lan truyền của phytoplasma ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô
1


tính và qua côn trùng môi giới. Do phytoplasma không nuôi cấy được
trên môi trường nhân tạo nên chẩn đoán và phân loại nhóm tác nhân gây
bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng gen, quan trọng nhất là
gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014).
Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây
trồng khác nhau và số lượng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo

từng năm (Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về
bệnh phytoplasma trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ
bản trước đây đều chưa phát hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam.
Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và chẩn đoán phân tử, nguyên
nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã được xác định là do
phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013).
Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ
hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác
định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh.
Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần
phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có
dịch ở Đông Nam Bộ.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Chẩn đoán và phân loại được phytoplasma gây hại trên cây sắn
tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá được một số đặc điểm sinh học
chính như tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng.
1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn
đoán, phân loại và một số đặc điểm sinh học.
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông
Nam Bộ, xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại
sắn. Nghiên cứu biện pháp chẩn đoán xác định, phân loại phytoplasma gây
bệnh chổi phù thủy hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma
hại sắn ở điều kiện chậu vại trong nhà lưới.
1.3.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu
Điều tra đồng ruộng, thu thập mẫu được thực hiện tại một số tỉnh
Đông Nam Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình
2

Phước và Tây Ninh; một số tỉnh khác bao gồm Phú Thọ, Yên Bái,
Quảng Ngãi và Kon Tum.
Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học được
thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng
Lộc; nghiên cứu chẩn đoán, phân loại phytoplasma hại sắn thực hiện tại
Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới.
Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến
năm 2014.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài đã xác định được bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do
phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm
16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A). Riêng mẫu
phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm 16SrI
nhưng nằm trong nhóm phụ hoàn toàn mới, chưa được công bố.
Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI để phát
hiện phytoplasma hại sắn tại Việt Nam.
Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định
phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ. Đề xuất được quy
trình chẩn đoán phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ.
Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh
chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. Xác định được con đường
lan truyền chính của bệnh là qua nhân giống vô tính đã bị nhiễm bệnh.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đã xác định được phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh chổi
phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ, phân loại được phytoplasma hại sắn
ở Việt Nam thuộc 2 nhóm 16SrI và 16SrII. Đã ứng dụng thành công
các kỹ thuật để chẩn đoán, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù

thủy trên sắn như kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô cây DAPI,
kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP, kỹ thuật LAMP-PCR. Xác định
được con đường lan truyền của phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy
trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vô tính.
3


1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Xác định được phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn,
cũng như xác định được con đường lan truyền chủ yếu của phytoplasma
hại sắn đã góp phần đưa ra biện pháp quản lý bệnh chổi phù thuỷ một
cách có hiệu quả trong điều kiện sản xuất tại một số tỉnh Đông Nam
Bộ. Biện pháp quan trọng nhất để quản lý bệnh là phát hiện bệnh sớm
và sử dụng giống sạch bệnh.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. CÂY SẮN
Cây sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới của châu Mỹ và được trồng
cách đây 5.000 - 7.000 năm trước Công nguyên (Allem, 2002). Về phân
loại, cây sắn có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz, thuộc chi
Manihot, họ Euphorbiaceae (Howeler et al., 2013).
Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia
súc và lương thực - thực phẩm. Củ sắn chứa nhiều tinh bột nên thường
được chế biến thành bột sắn khô. Trong củ sắn tươi có chứa đến 80%
hàm lượng carbonhydrate, canxi (50 mg/100 g), phốtpho (40 mg/100 g),
vitamin (25 mg/100 g) và các chất dinh dưỡng khác. Lá sắn là một
nguồn cung cấp protein, có chứa nhiều axít amin cần thiết nhưng thiếu
lysine, methionine và tryptophan (Ravindran, 1992).
Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của toàn thế giới trong giai
đoạn 10 năm từ năm 1999 đến năm 2009 đều tăng, các chỉ số này vào
năm 1999 lần lượt là 16,85 triệu ha; 10,09 tấn/ha và 170,01 triệu tấn,

đến năm 2009 các chỉ số này là 18,92 triệu ha; 12,36 tấn/ha và 233,80
triệu tấn (FAOSTAT, 2014).
Năng suất sắn củ tươi bình quân của thế giới đạt 12,38 tấn/ha vào
năm 2009. Ấn Độ là nước có năng suất sắn cao nhất thế giới (34,36
tấn/ha), kế tiếp là Thái Lan (22,68 tấn/ha) và Indonesia (18,74 tấn/ha).
Thái Lan là nước xuất khẩu sắn khô lớn nhất, chiếm 77% sản lượng
xuất khẩu của thế giới trong năm 2005. Nước xuất khẩu sắn khô lớn thứ
hai là Việt Nam (13,6%), tiếp theo là In-đô-nê-xi-a (5,8%) và Costa
Rica (2,1%) (FAOSTAT, 2014).
4


Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2014), diện tích cây sắn ở Việt
Nam vào năm 1995 có khoảng 277,4 nghìn ha với sản lượng là 2211,5
nghìn tấn; các chỉ số này đến năm 2012 lần lượt là 551,9 nghìn ha và
9735,4 nghìn tấn. Năm 2011, diện tích trồng sắn là cao nhất (558,4 nghìn
ha), với sản lượng cũng cao nhất (9897,9 nghìn tấn).
2.2. PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT
Hiện nay, về phân loại, tất cả phytoplasma được xếp vào chi
‘Candidatus Phytoplasma’ (‘Ca. Phytoplasma’), bộ Acholeplasmatales,
lớp Mollicutes, ngành Firmucutes (IRPCM, 2004; Hogenhout et al.,
2008). Dựa trên cơ sở so sánh chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome,
các loài thuộc chi ‘Ca. Phytoplasma’ được xếp vào 33 nhóm phả hệ
khác nhau (ký hiệu từ 16SrI đến 16SrXXXIII).
Phytoplasma là tác nhân gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn trong
mạch phloem, nên truyền qua nhân giống vô tính như ghép, củ giống, hom
giống, thân ngầm, là con đường lan truyền quan trọng, có thể được xem là
quan trọng nhất đối với các loài cây được nhân giống vô tính. Tuy nhiên,
phytoplasma không truyền được qua tiếp xúc cơ học vì khi phytoplasma
được đưa vào tế bào biểu bì hoặc nhu mô thì chúng cũng không có khả

năng di chuyển xuống tế bào ống rây của mạch phloem (Lee et al., 2000;
Christensen et al., 2005; Duduk and Bertaccini, 2006).
Tơ hồng (Cuscutas spp.) là loại thực vật không có diệp lục ký
sinh trên thực vật. Vì có đặc điểm ký sinh khá đặc biệt nên tơ hồng có
thể truyền dễ dàng phytoplasma và do đó thường được sử dụng như một
loại vector hiệu quả để truyền phytoplasma sang cây thí nghiệm
(Přibylová and Špak, 2013).
Phytoplasma không được xem là tác nhân gây bệnh truyền qua
hạt (Lee et al., 2000). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, phytoplasma có
thể phát hiện thấy ở vỏ hạt nhưng không thể truyền sang cây con
(Faghihi et al., 2011).
Các nghiên cứu lan truyền đã chứng tỏ côn trùng chích hút là môi
giới quan trọng nhất của các bệnh phytoplasma nhiễm trên cây trồng từ
hạt. Tất cả các loài côn trùng môi giới của phytoplasma đều thuộc bộ
Hemiptera. Các loài côn trùng thuộc bộ Hemiptera có hành vi chích hút
5


khá đa dạng, có nhóm chích hút ở mạch phloem, có nhóm chích hút ở
mạch xylem. Do phytoplasma chỉ giới hạn ở mạch phloem nên chỉ
nhóm côn trùng chích hút ở loại mô này mới có khả năng truyền chúng
(Wilson and Weintraub, 2007). Hiện có ít nhất 102 loài côn trùng chích
hút bộ Hemiptera đã được xác định là côn trùng môi giới của
phytoplasma, phần lớn thuộc họ Rầy xanh (Cicadellidae).
Phytoplasma không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo
nên chẩn đoán loại tác nhân gây bệnh này khá phức tạp. Chính vì vậy,
đối với bệnh phytoplasma, ngoài triệu chứng, nhiều biện pháp chẩn
đoán khác thường được sử dụng gồm 2 nhóm chính là (i) chẩn đoán
trực tiếp phytoplasma trong tế bào bằng hiện vi điện tử hoặc nhuộm mô
bằng thuốc nhuộm huỳnh quang; và (ii) chẩn đoán gián tiếp bằng các

phân tích phân tử như phản ứng trùng hợp chuỗi acid nucleic
(polymerase chain reaction, PCR), giải trình tự...
Để phòng chống bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng, các
biện pháp sau thường được áp dụng trong sản xuất: i) Chọn giống chống
bệnh, sử dụng cây sạch bệnh; ii) Nhổ bỏ, tiêu hủy tàn dư cây bệnh, kết
hợp với vệ sinh đồng ruộng; iii) Không vận chuyển, trao đổi hom giống
từ các vùng bị bệnh đến các vùng chưa bị bệnh, hay vùng trồng mới. Tổ
chức sản xuất và kiểm tra giống sạch bệnh trước khi trồng; iv) Tiêu diệt
côn trùng môi giới truyền bệnh (nếu có) và trong một số trường hợp, có
thể xử lý hom giống bằng nước nóng hoặc hơi nước nóng.
2.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH PHYTOPLASMA HẠI SẮN
Bệnh phytoplasma hại sắn được phát hiện thấy tại nhiều vùng trên
thế giới như vùng Wallis-Futuna, Uganda, Cuba; một số nước thuộc châu
Mỹ như Bra-xin, Cô-lôm-bia, Costa Rica, Peru, Panama, Venezuela; một
số nước thuộc châu Á như Việt Nam, Thái Lan, Cam-pu-chia và Trung
Quốc. Phytoplasma hại sắn xác định được liên quan đến bệnh chổi phù
thuỷ (Frison and Feliu, 1991; Davis et al., 2005; Alvarez et al., 2013;
Flôres et al., 2013; Alvarez et al., 2014), bệnh biến vàng lá (Arocha et
al., 2009a, 2009b) và bệnh da cóc (Alvarez et al., 2009; Souza et al.,
2014; Oliveira et al., 2014).
6


Cho đến hiện nay, có 3 dạng triệu chứng bệnh do phytoplasma
hại sắn trên thế giới đã được mô tả, bao gồm: i) Bệnh chổi phù thuỷ
(witches’ broom), ii) Bệnh biến vàng lá (yellowing), iii) Bệnh da cóc
(frog skin). Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn được ghi nhận lần đầu ở các
bang Ceara, Pernambuco, Sao Paula thuộc Brazil và phía nam Mê-hicô. Lúc đó, tác nhân gây bệnh được xác định là do phytoplasma gây ra
(Costa and Kitajima, 1972); bệnh được xác định lan truyền qua hom
giống nhưng không lan truyền qua tiếp xúc cơ học.

Hiện nay trên thế giới, phytoplasma hại sắn được phân loại vào 8
nhóm khác nhau dựa trên giải trình tự vùng gen 16S RNA ribosome.
Các nhà khoa học, các chuyên gia về bệnh cây tại Trung tâm
Nông nghiệp nhiệt đới Quốc tế (CIAT), Đại học Bologna (I-ta-li-a), và
các nước khác như Bra-xin, Cuba, Cô-lôm-bi-a, Ốt-xtrây-li-a,...đều xác
định nguyên nhân gây bệnh là phytoplasma hại sắn được dựa chủ yếu
vào kỹ thuật sinh học phân tử; việc xác định một số đặc trưng sinh học
của bệnh vẫn còn rất hạn chế, trong 43 năm qua (từ năm 1972 đến
2015), việc xác định loài côn trùng có khả năng lan truyền bệnh
phytoplasma hại sắn vẫn chưa được tìm thấy.
2.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU BỆNH PHYTOPLASMA HẠI
THỰC VẬT Ở VIỆT NAM
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma gây hại
trên cây trồng vẫn còn rất ít. Nghiên cứu ở mức giải trình tự gen đầu
tiên đối với phytoplasma là một nghiên cứu của các nhà khoa học Anh
và Mỹ thực hiện trên cây xoan ta (Melia azedarach) bị bệnh biến vàng
thu thập tại Huế năm 2003.
Đến nay, một số phytoplasma được xác định ở mức giải trình tự
gen do các nhà nghiên cứu Việt Nam thực hiện, phát hiện tác nhân gây
bệnh chồi cỏ mía, bệnh trắng lá mía đều do phytoplasma gây ra (Hoat et
al., 2012, 2013); bệnh diệp hóa cây vừng, bệnh chổi phù thuỷ đậu
tương và một số bệnh trên một số loài cây khác do phytoplasma gây ra
(Nguyễn Đức Thành và cs., 2012, 2013, 2014).
7


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
3.1.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
Các giống sắn KM94, KM419 và SM937-26.

Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR, máy huỳnh quang, máy li tâm để
bàn, máy cắt tiêu bản, cân điện tử, bể nhiệt.
Hóa chất dùng trong phản ứng PCR.
Hóa chất dùng trong phản ứng LAMP-PCR.
Các hóa chất khác: agarose, chloroform/isoamyl alcohol (24/1),
glutaraldehyde,…có nguồn gốc từ các hãng Wako (Nhật Bản),
Fermentas (Đức).
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
 Viện Bảo vệ thực vật, Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội.
 Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông
nghiệp Việt Nam - Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội.
 Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc xã Hưng Thịnh, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai.
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ năm 2011 đến năm 2014.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn.
- Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm
mô và PCR.
- Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn.
- Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma
nhóm 16SrII hại sắn.
- Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại
sắn do phytoplasma gây ra.
3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phát hiện phytoplasma trên sắn bằng kính hiển vi điện tử truyền
qua trên máy JEOL 1010 và nhuộm với DAPI.
- DNA tổng số được tách chiết bằng CTAB theo tài liệu mô tả
của Doyle and Doyle (1990). Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được
8

thực hiện theo tài liệu của Deng and Hiruki (1991), Lee et al. (1994),
Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996).
- Tinh chiết sản phẩm PCR dùng QIAquick Gel Extraction Kit
(Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Phân tích RFLP thực hiện mô phỏng bằng chương trình
pDRAW32.
- Sử dụng các phần mềm tin sinh học như ClustalW2, BioEdit
7.0. Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining
trong MEGA 5.0.
- Các mồi LAMP-PCR được thiết kế sử dụng phần mềm Primer
Explorer V4. Các mồi LAMP-PCR thiết kế gồm CWB-F3, CWB-B3,
CWB-FIP, CWB-BIP, CWB-F-loop, CWB-B-loop được tổng hợp bởi
hãng Macrogen (Hàn Quốc).
3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu thập được xử lý trong Microsoft Office Excel. Số liệu
thí nghiệm được tính toán, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích
phương sai bằng chương trình IRRISTAT 4.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA HẠI SẮN BẰNG HIỂN VI
ĐIỆN TỬ, NHUỘM MÔ VÀ PCR
4.1.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng hiển vi điện tử
Việc sử dụng hiển vi điện tử truyền qua được thực hiện vào hai
đợt trong năm 2011 nhằm phát hiện phytoplasma trên cây sắn bị nhiễm
bệnh chổi phù thuỷ tại vùng Đông Nam Bộ. Đợt 1 (tháng 4 năm 2011)
thử nghiệm 3 mẫu cây sắn giống KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ được thu
thập trên đồng và 1 mẫu cây sắn khỏe. Đợt 2 (tháng 11 năm 2011) thử
nghiệm 2 mẫu cây sắn giống KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ được thu
thập trên đồng và 1 mẫu cây sắn khỏe.
Kết quả hiển vi điện tử chỉ quan sát, phát hiện được các thể

phytoplasma với dạng hình tròn, hình oval với kích thước từ 108 - 199
nm trong tế bào tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn biểu hiện triệu
9


chứng bệnh chổi phù thuỷ nhưng không thấy sự hiện diện của chúng
trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn không bị bệnh. Ngoài ra,
không phát hiện thấy tác nhân gây bệnh nào khác trong tế bào ống rây
của mạch phloem cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ và cây không bị bệnh.
Phương pháp hiển vi điện tử đã xác định sự có mặt của phytoplasma
trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù
thuỷ tại các tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai thuộc Đông Nam Bộ.
4.1.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô
Kỹ thuật nhuộm mô bằng DAPI được thực hiện vào tháng 02
năm 2014 dựa theo tài liệu mô tả của Andrade and Arismendi (2013)
nhằm phát hiện phytoplasma trên giống sắn KM94 bị bệnh chổi phù
thuỷ (4 mẫu) và giống sắn KM94 không bị bệnh (4 mẫu).
Kết quả thí nghiệm nhuộm mô cây bằng kỹ thuật DAPI đã phát
hiện được các thể phytoplasma trong mẫu cây bị nhiễm bệnh chổi phù
thuỷ nhưng không phát hiện thấy trên mẫu cây khỏe. Kỹ thuật này dễ
áp dụng, thực hiện đơn giản và ít tốn kém, tuy nhiên, kỹ thuật nhuộm
DAPI không định danh được tác nhân gây bệnh là phytoplasma.
4.1.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR
4.1.3.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR lồng với
cặp mồi R16F2n/R16R2
Đầu tiên, phản ứng PCR lồng được thực hiện dùng 2 tổ hợp mồi
là P1/P7 (bước 1) và R16F2n/R16R2 (bước 2).
P1/P7 R16F2n/R16R2
M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

M

10

11

12

13

14

15

16

17

18

1200 bp

Hình 4.1. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp
mồi P1/P7-R16F2n/R16R2
M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 18: các mẫu thử nghiệm;
Kích thước sản phẩm PCR được chỉ rõ bằng mũi tên

10


Kết quả kiểm tra PCR cho thấy 35/57 (61,4%) mẫu sắn bị bệnh chổi
phù thuỷ thu tại 7 tỉnh gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Quảng Ngãi, Đồng Nai,
Kon Tum, Bình Phước, Phú Thọ và Yên Bái đều tạo sản phẩm PCR với
kích thước mong muốn ~1,2 kb (hình 4.1). Các mẫu thử này đều là gân
lá của cây sắn nhiễm bệnh, trong khi đó, các mẫu thử là lõi thân chính,
vỏ thân chính, vỏ củ và lá ngọn của cây sắn nhiễm bệnh đều không tạo
sản phẩm PCR trên bản điện di (22/57 mẫu thử, chiếm 38,6%).
4.1.3.2. Phát hiện phytoplasma bằng kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi
R16mF2/R16mR1
Một thí nghiệm PCR bổ sung nhằm phát hiện phytoplasma trên
các mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ được thu thập tại một số tỉnh khác
nhau trong đó có các tỉnh thuộc Đông Nam Bộ. Phản ứng PCR lồng được

thực hiện dùng 2 tổ hợp mồi là P1/P7 (bước 1) và R16mF2/R16mR1
(bước 2) cũng được sử dụng nhằm phát hiện phytoplasma gây hại trên
cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ.
Kết quả kiểm tra PCR lồng dùng hai cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 trên 26 mẫu sắn bệnh cho thấy 20/26 (76,9%) mẫu
thử đã tạo sản phẩm PCR với kích thước mong muốn ~1,4 kb. Cần chú
ý là có 14 mẫu kiểm tra trong thí nghiệm này (gồm các mẫu: BRVT-01,
BRVT-02, BRVT-03, QNg-01, QNg-02, QNg-03, ĐN-01, ĐN-02, ĐN03, KT-01, KT-02, KT-03, YB-01 và YB-02) đều là các mẫu đã được
kiểm tra với 2 cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2 ở trên.
Nghiên cứu của phần này, dựa trên cả các kỹ thuật chẩn đoán
truyền thống cũng như PCR, đã lần đầu tiên xác định được sự có mặt của
phytoplasma trong cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở Việt Nam, đặc biệt ở
vùng trồng sắn trọng điểm bị dịch bệnh chổi phù thuỷ tại Đông Nam Bộ.
Kết quả kiểm tra PCR cũng gợi ý có sự đa dạng về trình tự gen mã hóa
16S RNA ribosome của các phytoplasma nhiễm trên các mẫu này.
4.2. ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ
PHYTOPLASMA HẠI SẮN
4.2.1. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR
Trong tổng số 83 sản phẩm PCR từ 67 mẫu sắn bị bệnh chổi phù
thuỷ thu tại 8 tỉnh được giải trình tự, cuối cùng thu được 19 mẫu có
chất lượng trình tự tốt. Tìm kiếm trình tự tương đồng trên Ngân hàng
11


Gen bằng phần mềm BLAST cho thấy tất cả 19 mẫu này có trình tự
trùng khớp với trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome của
phytoplasma gây bệnh cây. Do đó, khẳng định nguyên nhân gây bệnh
chổi phù thuỷ sắn tại Việt Nam là do phytoplasma gây ra.
Ngoài ra, kết quả giải trình tự và tìm kiếm BLAST cũng cho thấy
các mồi chung P1, P7, R16F2n, R16R2, R16mF2 và R16mR2 có tính
đặc hiệu cao trong chẩn đoán bệnh phytoplasma trên sắn tại Việt Nam.

Trình tự của 19 mẫu này có độ dài phù hợp, đủ để phân tích định danh
dựa trên so sánh trình tự, phân tích đa hình RFLP và phả hệ, do vậy đã
được đăng ký trên Ngân hàng Gen.
4.2.2. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP
Phân tích RFLP mô phỏng (virtual RFLP) là công cụ phân loại
và định danh rất hữu hiệu đối với phytoplasma. Kỹ thuật này được thực
hiện bởi một số phần mềm như pDRAW32 cho phép so sánh mô hình
cắt của 1 bộ gồm 17 enzym cắt giới hạn khác nhau trên trình tự gen mã
hóa 16S RNA ribosome (Lee et al., 2000).
Có 9 enzym cắt AluI, BfaI, HaeIII, HpaII, KpnI, MseI, RsaI,
Sau96I và TaqI cho kết quả sai khác, phân biệt rõ ràng giữa các mô
hình cắt của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (12/25 mẫu) so với nhóm
16SrII (11/25 mẫu), so với nhóm 16SrIIII (1/25 mẫu) và so với nhóm
16SrXV (1/25 mẫu).
Enzym KpnI, MseI RsaI và được coi là enzym khóa để phân biệt
các nhóm phytoplasma khác nhau. Đối với mô hình cắt của
phytoplasma thuộc nhóm 16SrI, enzym KpnI tạo ra 3 vạch băng có kích
thước khoảng 42, 188 và 473 bp trên bản điện di. Còn enzym MseI tạo
ra 5 vạch băng có kích thước khoảng 41, 45, 56, 265 và 288 bp trên bản
điện di; enzym RsaI tạo ra 6 vạch băng có kích thước khoảng 16, 44,
55, 73, 131 và 336 bp đối với các trình tự thuộc nhóm 16SrI sai khác
hẳn so với nhóm 16SrII, 16SrIII và 16SrXV.
Dựa trên mức tương đồng di truyền của các mẫu, mối quan hệ di
truyền của các mẫu cũng được xác định dùng phần mềm NTSYSpc với
khoảng cách di truyền được xác định theo phương pháp ghép cặp mẫu
dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng (unweighted pair
group method with arithmetic mean, UPGMA) (hình 4.2).
12

Dựa trên mô hình cắt của các mẫu, mức tương đồng di truyền của
26 mẫu đã được xác định dựa trên phân tích hệ số tương đồng của Nei
and Li (1979).

Hình 4.2. Cây đƣợc vẽ theo phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng
khoảng cách trung bình số học ngang bằng (UPGMA)
Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt
Nam, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN02 và YB-02, có hệ số tương đồng gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma
thuộc nhóm 16SrI (mã truy cập M30790 và AY787139), từ 77% đến
100%. Trên cây phả hệ, cả 9 mẫu này cũng phân nhóm với 2 mẫu
phytoplasma thuộc nhóm 16SrI-A và 16SrI-B.
Phân tích cũng cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt
Nam, BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg,
T18-TN và T19-BRVT, có hệ số tương đồng gần gũi nhất với 2 mẫu
phytoplasma thuộc nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập
JQ957931 và L33765), với giá trị từ 94% đến 100%. Tương tự, trên cây
13


phả hệ, cả 9 mẫu trên phân nhóm rõ ràng với 2 mẫu phytoplasma nhóm
16SrII, nhóm phụ 16SrII-A.
Đáng chú ý, mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 ở Yên Bái mặc dù
có quan hệ gần gũi với các mẫu nhóm 16SrI nhưng có hệ số tương đồng
khá thấp với các mẫu phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI, từ 63%
đến 78%. Phân tích đã cho thấy mẫu YB-01 thuộc một nhóm phụ mới
trong nhóm 16SrI.
Như vậy, phân tích RFLP mô phỏng dùng 17 enzym cắt giới hạn
đã xác định phytoplasma hại sắn tại Việt Nam gồm ít nhất 2 nhóm,
16SrI và 16SrII.
4.3. ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ

PHYTOPLASMA HẠI SẮN
4.3.1. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự
nucleotide
Ngoài phân tích RFLP mô phỏng, tiến hành so sánh mức đồng
nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của 26 mẫu
phytoplasma thử nghiệm.
Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt
Nam, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN02 và YB-02, có mức đồng nhất trình tự nucleotide gần gũi nhất với 2
mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (mã truy cập M30790 và
AY787139), với giá trị từ 98% đến 100%. Phân tích cũng cho thấy 9
mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT-02, QNg-19.2, BR-5,
BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg, T18-TN và T19-BRVT, có mức
đồng nhất trình tự nucleotide gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma
thuộc nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập JQ957931 và
L33765), với giá trị từ 99% đến 100%.
4.3.2. Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide
4.3.2.1. Phân tích phả hệ các nhóm phytoplasma hại sắn
Nhằm hiểu rõ hơn mối quan hệ của các mẫu phytoplasma hại sắn
với các phytoplasma khác, phân tích phả hệ dựa trên trình tự nucleotide
vùng gen 16S RNA ribosome đã xác định được. Đầu tiên, quan hệ phả
hệ của 19 mẫu trong nghiên cứu này được phân tích với đại diện của 28
nhóm phytoplasma được ghi nhận cho tới nay (hình 4.3).
14


Hình 4.3. Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc vẽ
theo phƣơng pháp Neighbor-Joining
 Trình tự của phytoplasma hại sắn ở Việt Nam xác định được trong nghiên cứu này.
Giá trị bootstrap (%) được chỉ rõ ở gốc các nhánh. Tên của nhóm phytoplasma ở phía
bên tay phải.

15


Kết quả phân tích phả hệ cho thấy có 10/19 (52,6%) mẫu
phytoplasma hại sắn ở Việt Nam trong nghiên cứu này, BRVT-01,
QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN-02, YB-01 và
YB-02, phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với tất cả 3 mẫu
phytoplasma nhóm 16SrI gồm phytoplasma hại sắn (AY787139) ở
Wallis - Futuna, hại cúc tây (NC_007716, M30790) ở Hoa Kỳ. Tương
tự như kết quả phân tích RFLP mô phỏng ở trên, mẫu YB-01 hình
thành một nhánh riêng biệt trong cụm nhóm 16SrI.
Cả 9/19 (47,4%) mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam còn lại
đã phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với các đại diện của
phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn tại Trung Quốc
(JQ957931), hại lạc tại Đài Loan (L33765).
Như vậy, phân tích phả hệ dựa trên trình tự cho kết quả tương tự
với các phân tích RFLP mô phỏng và so sánh trình tự. Các mẫu
phytoplasma hại sắn ở Việt Nam được xếp vào 2 nhóm phytoplasma
gồm nhóm 16SrI và 16SrII trong hệ thống phân loại phytoplasma (Lee
et al., 1998; Bertaccini et al., 2014).
4.3.2.2. Phân tích phả hệ nhóm phụ của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI
Tiếp theo, nhằm làm rõ hơn vị trí phân loại, xác định nhóm phụ
của các mẫu phytoplasma nhóm 16SrI hại sắn, sử dụng 10 mẫu
phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc nhóm 16SrI trong nghiên cứu
này đã được phân tích với 29 mẫu đại diện của 16 nhóm phụ được xác
định cho tới nay (hình 4.4).
Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, có 9/10 mẫu (90%) gồm
BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17, ĐN-34, BP-01, ĐN-02 và
YB-02, phân nhóm rõ rệt, cùng cụm với phytoplasma gây bệnh biến

vàng cúc tây (M30790, EU215426, AY265210), lục hóa dừa cạn
(HM590621), biến vàng gân báo xuân (HM590623), lục hóa cải dầu
(HM590625), lục hóa cây anh thảo (HM590616) và chúng đều thuộc
nhóm phụ B (16SrI-B).
16


Hình 4.4. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn
thuộc nhóm 16SrI
 Trình tự của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI ở Việt Nam. Tên viết tắt, mã
truy cập trên Ngân hàng Gen nằm trong dấu ngoặc đơn

17


4.3.2.3. Phân tích phả hệ nhóm phụ của phytoplasma thuộc nhóm 16SrII
Tiếp theo, nhằm làm rõ hơn vị trí phân loại, xác định nhóm phụ
của các mẫu phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn, sử dụng 9 mẫu
phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc nhóm 16SrII trong nghiên cứu
này đã được phân tích với 9 mẫu đại diện của 5 nhóm phụ được xác
định cho tới nay trong hệ thống phân loại phytoplasma của Lee et al.
(1998), Bertaccini et al. (2014). Kết quả trình bày ở hình 4.5.

Hình 4.5. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn
thuộc nhóm 16SrII
 Trình tự của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII ở Việt Nam. Tên viết tắt, mã
truy cập trên Ngân hàng Gen nằm trong dấu ngoặc đơn

Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, tất cả 9/9 phytoplasma hại sắn
của Việt Nam, gồm BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7ĐN, T11-QNg, T18-TN và T19-BRVT, đã phân nhóm rõ rệt (giá trị

bootstrap 99%) với các đại diện của phytoplasma nhóm 16SrII gồm
phytoplasma hại sắn tại Trung Quốc (JQ957931), hại lạc tại Đài Loan
(L33765), và chúng đều thuộc nhóm phụ A (16SrII-A).
18


Dựa trên các kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP, xác định
mức tương đồng di truyền dựa trên phân tích hệ số tương đồng, định
danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide và phân tích phả hệ
phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide, nghiên cứu này đã xác định
phytoplasma hại sắn tại Việt Nam gồm ít nhất 2 nhóm, 16SrI và 16SrII.
4.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN
PHYTOPLASMA NHÓM 16SrII HẠI SẮN
4.4.1. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII
Sau khi xác định được vùng phù hợp để thiết kế mồi, sử dụng
trình tự gen 16S RNA ribosme của mẫu phytoplasma đại diện nhóm
16SrII làm khuôn để thiết kế mồi. Dựa trên 4 yếu tố chủ chốt là nhiệt
độ tách mồi, độ ổn định đầu 3’, hàm lượng GC và cấu trúc thứ cấp, 8
trình tự tốt nhất trên vùng gen đích của mẫu T7-ĐN (KM280679) đã
được chọn (hình 4.6).

Hình 4.6. Tám đoạn trình tự đƣợc lựa chọn để thiết các mồi LAMP
cải tiến đặc hiệu nhóm 16SrII
Dựa trên 8 trình tự lựa chọn trên, một bộ 8 mồi LAMP được thiết
kế; các mồi LAMP-PCR thiết kế gồm CWB-F3, CWB-B3, CWB-FIP,
CWB-BIP, CWB-F-loop, CWB-B-loop được tổng hợp bởi hãng
Macrogen (Hàn Quốc) và chúng được ứng dụng để đánh giá khả năng
phát hiện phytoplasma thuộc nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ.
19

4.4.2. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP
Trước tiên, thử nghiệm khả năng phân biệt 2 nhóm phytoplasma
gây hại trên sắn của bộ mồi LAMP tự thiết kế. DNA tổng số của 4 mẫu
cây sắn bệnh chổi phù thuỷ với phytoplasma gây bệnh được xác định
trước bằng PCR và giải trình tự đã được sử dụng để kiểm tra bộ mồi
LAMP (bảng 4.1).
Bảng 4.1. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ
DNA tổng số chiết từ cây
STT

Mẫu thử

1
2
3
4
5
6

DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 1
DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 2
DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 3
DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 4
DNA tổng số cây sắn khỏe (đối chứng)
Nước siêu sạch Invitrogen (đối chứng)

Nhóm
phytoplasma*
16SrII

16SrI
16SrII
16SrII

Kết quả
LAMP**
+
–
+
+
–
–

Ghi chú: * Nhóm của mẫu kiểm tra đã được xác định bằng PCR lồng và giải trình tự;
** (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính

Kết quả kiểm tra cho thấy, bộ mồi LAMP đã cho kết quả dương
tính trên 3 mẫu DNA tổng số được chiết bằng CTAB từ các cây sắn bị
nhiễm với phytoplasma nhóm 16SrII. Các mồi này cho kết quả âm tính
đối với mẫu cây bị nhiễm phytoplasma nhóm 16SrI và cả đối chứng cây
khỏe cũng như nước siêu sạch (Invitrogen).
Tương tự, bộ mồi LAMP tự thiết kế được thử nghiệm với các
mẫu thử là sản phẩm PCR đã tinh sạch (dùng QIAquick gel extraction
kit, GmbH) được nhân lên từ nguồn cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Các
mẫu kiểm tra đã được xác định thuộc nhóm 16SrII bằng giải trình tự
(bảng 4.2).
Bảng 4.2. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII
từ sản phẩm PCR tinh sạch
STT
1

2
3
4
5
6

Mẫu thử*
Sản phẩm PCR tinh sạch 1
Sản phẩm PCR tinh sạch 2
Sản phẩm PCR tinh sạch 3
Sản phẩm PCR tinh sạch 4
DNA tổng số sắn khỏe (đối chứng)
Nước sạch Invitrogen (đối chứng)

Nhóm
phytoplasma**
16SrII
16SrII
16SrII
16SrII

Kết quả
LAMP***
+
+
+
+
–
–

Ghi chú: * Phản ứng PCR lồng được thực hiện dùng cặp mồi R16mF1/R16mR1; ** Nhóm
của mẫu kiểm tra đã được giải trình tự; *** (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính

20


Kết quả kiểm tra (bảng 4.2) cho thấy bộ mồi LAMP đã cho kết
quả dương tính trên 4 mẫu sản phẩm PCR tinh sạch từ các cây sắn bị
nhiễm với phytoplasma nhóm 16SrII. Các mồi này cho kết quả âm tính
đối với đối chứng cây khỏe cũng như nước siêu sạch (Invitrogen).
Như vậy, bộ mồi LAMP đều có khả năng phát hiện phytoplasma
nhóm 16SrII từ DNA tổng số và từ sản phẩm PCR đã tinh sạch.
Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy bộ mồi LAMP thiết kế
hoàn toàn có thể phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII gây hại trên cây
sắn ngoài đồng ruộng. Đây là kết quả đầu tiên sử dụng kỹ thuật LAMP
chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII gây hại trên cây sắn tại Việt Nam.
4.5. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BỆNH
CHỔI PHÙ THUỶ HẠI SẮN DO PHYTOPLASMA GÂY RA
4.5.1. Ảnh hƣởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền
của bệnh
Bằng phương pháp nhân giống vô tính, sắn chủ yếu được lấy từ
phần thân để làm hom giống. Việc sử dụng hom giống không bị bệnh là
điều rất quan trọng, điều này góp phần kiểm soát được nguồn vật liệu
giống ban đầu, tránh cho bệnh lây lan nhanh trên đồng ruộng. Hom
giống sắn KM94 nhiễm bệnh (kiểm tra PCR cho kết quả dương tính với
phytoplasma) và hom giống sắn KM94 khoẻ được dùng trong thí
nghiệm, tiến hành khử trùng đất bằng hơi nước nóng 121oC trong thời
gian 30 phút và lấy đất ở ruộng trồng có cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù
thuỷ ở ngay phần gốc cây (bảng 4.3).
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của đất trồng và hom giống đến khả năng lan

truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012)
STT

Công thức thí nghiệm*

1

CT1: Trồng hom sắn bị bệnh chổi
phù thuỷ trên đất đã hấp khử trùng
CT2: Trồng hom sắn khoẻ trên đất
trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ
CT3: Trồng hom sắn bị bệnh chổi
phù thuỷ trên đất trồng có cây sắn bị
bệnh chổi phù thuỷ
CT4: Trồng hom sắn khỏe trên đất
đã hấp khử trùng

2
3

4

Tỷ lệ cây
phát bệnh
sau 9 tháng
(%)
43,3

Kiểm tra
PCR (số cây

nhiễm/số
cây thử)
5/5

Kết
luận
về
PCR
+

0,0

0/5



56,7

5/5

+

0,0

0/5



Ghi chú: * n = 30 cây; (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính; LSD0,05 = 7,12.

21


Hom sắn KM94 bệnh trồng trên đất đã hấp khử trùng và đất
trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đều thể hiện triệu chứng chổi
phù thuỷ xuất hiện gây hại, ngược lại hom sắn KM94 khỏe khi trồng
trên cả hai loại đất này đều không xuất hiện triệu chứng bệnh. Tỷ lệ
bệnh cao nhất ở công thức 3 (17/30 cây), tiếp theo là công thức 1
(13/30 cây). Để khẳng định chắc chắn hơn nữa, sử dụng kỹ thuật PCR
lồng bằng các cặp mồi phát hiện phytoplasma gây hại trên sắn như các
phần đã trình bày ở trên, mỗi 1 công thức kiểm tra 5 cây, kết quả kiểm
tra cho thấy rằng, chỉ có hom sắn KM94 khoẻ trồng trên đất đã hấp khử
trùng (5/5) và đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (5/5) đều cho
kết quả PCR dương tính. Các kết quả nghiên cứu đã cho biết rằng, do
phytoplasma là tác nhân gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn trong mạch
phloem, nên truyền qua nhân giống vô tính như ghép, củ giống, hom
giống, thân ngầm là con đường lan truyền quan trọng, có thể được xem
là quan trọng nhất đối với các loài cây được nhân giống vô tính (Lee et
al., 2000; Christensen et al., 2005; Duduk and Bertaccini, 2006). Như
vậy, bệnh phytoplasma gây hại sắn KM94 chỉ lan truyền qua nhân
giống vô tính từ cây đã bị nhiễm bệnh trong thí nghiệm chậu vại.

Hình 4.7. Ảnh thí nghiệm ảnh hƣởng của đất trồng đến khả năng
lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ sắn trong thí nghiệm nhà lƣới
(năm 2012)
A) Giống sắn KM94 khỏe trồng trên đất đã hấp khử trùng (công thức 4); B) Giống sắn
KM94 nhiễm bệnh chổi phù thuỷ sắn trồng trên đất đã hấp khử trùng (công thức 1).

4.5.2. Khả năng lan truyền của bệnh qua tơ hồng
Tơ hồng (Cuscutas spp.) được dùng làm vật liệu thí nghiệm trong

nghiên cứu bệnh hại thực vật, được coi là vật trung gian để xác định bệnh
hại, trong đó có bệnh phytoplasma. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) được
coi là cây chỉ thị trong nghiên cứu bệnh do phytoplasma gây ra vì loài
22


cây này mẫn cảm với tác nhân gây bệnh phytoplasma và được dùng làm
cây duy trì, cây nhân nguồn trong nghiên cứu bệnh cây. Cây dừa cạn
được trồng từ hạt để thu nguồn cây sạch làm thí nghiệm. Sử dụng giống
sắn KM94 bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ tại Đồng Nai làm nguồn bệnh
(bảng 4.4).
Bảng 4.4. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012)
STT

1
2

3

Công thức thí nghiệm*

Tỷ lệ cây
Kiểm tra PCR
phát bệnh sau
(số cây
9 tháng (%) nhiễm/số cây
thử)
CT1: KM94 bệnh chổi phù
13,3

2/5
thuỷ - Tơ hồng - KM94 khỏe
CT2: KM94 bệnh chổi phù
26,7
4/5
thuỷ - Tơ hồng - Cây dừa
cạn khỏe
CT3: KM94 khỏe - Tơ
0,0
0/5
hồng – KM94 khỏe

Kết
luận về
PCR
+
+



Ghi chú: * n = 15 cây; (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dương tính; LSD0,05 = 2,80.

Kết quả thí nghiệm (bảng 4.4) cho thấy tơ hồng bám dính tốt lên
các cây thí nghiệm. Tuy nhiên, triệu chứng bệnh lâu xuất hiện (9 tháng)
và tỷ lệ cây nhiễm bệnh thấp, trong đó lan truyền từ cây sắn bệnh qua tơ
hồng lên cây sắn khỏe là 13,3% (2/15 cây bị nhiễm bệnh), còn lan truyền
từ cây sắn bệnh qua tơ hồng lên cây dừa cạn (C. roseus) khỏe là 26,7%
(4/15 cây bị nhiễm bệnh) và đều cho kết quả PCR dương tính.
Tiến hành giải trình tự mẫu cây sắn nhiễm bệnh (công thức 1) và
mẫu cây dừa cạn nhiễm (công thức 2) đối với sản phẩm PCR lồng

(R16F2n/R16R2) và tìm kiếm các chuỗi tương đồng bằng công cụ trực
tuyến BLAST trên Ngân hàng Gen cho thấy trình tự nucleotide từ sản
phẩm PCR của các mẫu bệnh phân lập trên mẫu cây sắn và mẫu cây
dừa cạn đều là các chuỗi mã hóa 16S RNA ribosome của phytoplasma
gây bệnh cây, trong đó có các mẫu phytoplasma gây hại sắn.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra được phát
hiện tại 9 tỉnh gồm Bà Rịa-Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình
23