Bài giảng vi sinh vật học trong công nghiệp bia chương 3 lê văn việt mẫn

CHƯƠNG 3

HỆ VI SINH VẬT NHIỄM
TRONG CÔNG NGHIỆP BIA
3.1. Nguồn gây nhiễm
3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
3.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu vi sinh
của bia
3.4. Phương pháp hạn chế nhiễm vi sinh vật
trong sản xuất bia

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

1

3.1. Nguồn gây nhiễm
Bia thành phẩm
• Thành phần dinh dưỡng:
Glucid
Saccharide
Oligosaccharide
Các hợp chất chứa nitơ
Các hợp chất khác
• pH
• Thế oxy hóa khử

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

2

3.1. Nguồn gây nhiễm
Bia thành phẩm
• Các hợp chất ức chế vi sinh vật:
Ethanol
Carbon dioxide
Iso-alpha acid…
• Quy trình sản xuất bia
• Hệ quả

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

3

3.1. Nguồn gây nhiễm
Thiết bị và đường ống
• Khái niệm biofilm:
Định nghĩa
Thành phần
Extra-polysaccharide (EPS) → 5-10µm
Vi sinh vật → 100-200µm
• Đối tượng bị nhiễm
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

4


3.1. Nguồn gây nhiễm
Thiết bị và đường ống
• Các công đoạn nhiễm thường gặp
Phân xưởng nấu

Phân xưởng lên men
Phân xưởng rót
Các vị trí khác

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

5

3.1. Nguồn gây nhiễm
Thiết bị và đường ống

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

6


3.1. Nguồn gây nhiễm
Thiết bị và đường ống

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

7

3.1. Nguồn gây nhiễm
Thiết bị và đường ống

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

8

3.1. Nguồn gây nhiễm
Thiết bị và đường ống
• Vi khuẩn và biofilm:
Tỉ lệ thống kê: 99%
EPS
Capsule
Zooglea
Sản phẩm trao đổi chất
→ Giải pháp

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

9

3.1. Nguồn gây nhiễm
Không khí
• Hệ vi sinh vật trong không khí

• Đối tượng bị nhiễm

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

10


3.1. Nguồn gây nhiễm
Không khí
• Các công đoạn nhiễm thường gặp
Phân xưởng xử lý bia sau lên men

Phân xưởng rót
→ Giải pháp

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

11

3.1. Nguồn gây nhiễm
Không khí

Số liệu thống kê từ 10 nhà máy bia của Phần lan

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

12


3.1. Nguồn gây nhiễm
Các loại khí sử dụng trong sản xuất
• Phân loại
Không khí
Carbon dioxide
Nitrogen
• Khả năng gây nhiễm
→ Giải pháp

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

13

3.1. Nguồn gây nhiễm
Nguyên liệu
• Malt và thế liệu
Hệ vi sinh vật
Khả năng gây nhiễm
• Mối quan hệ giữa hệ VSV trong malt và hệ VSV trong bia
→ Giải pháp

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

14


3.1. Nguồn gây nhiễm
Nguyên liệu

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

15

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

16


CHƯƠNG 3

HỆ VI SINH VẬT NHIỄM
TRONG CÔNG NGHIỆP BIA
3.1. Nguồn gây nhiễm

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
3.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu vi sinh
của bia
3.4. Phương pháp hạn chế nhiễm vi sinh vật
trong sản xuất bia

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

17

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm

Vi sinh vật nhiễm trong bia

Vi khuẩn

Nấm men dại

(Bacteria)

(Wild yeast)

Gram (+)

Gram (-)

Saccharomyces

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

Non-Saccharomyces

18


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn
Procaryote
Vi sinh vật đơn bào
Có thể chuyển động hoặc không chuyển động
Kiểm tra sơ bộ
Catalase test
Ý nghĩa
Cách thực hiện
Nhuộm Gram
Ý nghĩa
Cách thực hiện
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

19

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

20

Phương pháp nhuộm Gram


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn

Phương pháp nhuộm Gram

Clostridum perfringens

Escherichia coli

Gram (+)

Gram (-)

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

21

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn

VK Gram dương

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

22


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn

VK Gram âm

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

23

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm

Vi khuẩn Gram âm
trong bia

Vi khuẩn acetic
(2 giống)

Các vi khuẩn khác
Coliforms

(3 giống)

(4 giống)

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

24


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Acetobacter
Loài thường gặp: A. aceti, A.
pasteurianus
Đặc điểm: hình gậy (0.6-0.8µm x
1-4µm), catalase (+), hiếu khí bắt

buộc, oxy hóa ethanol thành carbon
dioxide và nước
Nguồn nhiễm
Hệ quả: gây đục bia, tạo váng trên
bề mặt sản phẩm

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

A. aceti

25

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Gluconobacter
Loài thường gặp: G. oxydans
Đặc điểm: hình gậy (0.6-0.8µm x
1-4µm), chuyển động, catalase (+),
hiếu khí bắt buộc, oxy hóa ethanol
thành acetic acid.
Nguồn nhiễm
Hệ quả: gây đục bia, tạo váng trên
bề mặt, tăng độ nhớt

G. oxydans
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

26

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Obesumbacterium (Hafnia)
Loài thường gặp: O. proteus (H. protea)
Đặc điểm: hình gậy (0.8-1.2µm x 1.5-4.0µm), kỵ khí tùy tiện,
catalase (+), chịu cồn (<6%).
Nguồn nhiễm: nấm men
Hệ quả: phát triển vào giai đoạn đầu của quá trình lên men
chính
Tốc độ lên men
Sinh tổng hợp DMS
Tăng pH
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

27

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Citrobacter
Loài thường gặp: C. freundii
Đặc điểm: hình gậy (1µm x 2-6µm), kỵ
khí tùy tiện, catalase (+)
Nguồn nhiễm: dịch nha
Hệ quả:
Sinh tổng hợp DMS và acid hữu cơ

C. freundii

Bị ức chế bởi quá trình lên men
ethanol

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

28


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Enterobacter (Rahmella)
Loài thường gặp: E. agglomerans,
E. cloacae
Đặc điểm: hình gậy (0.6µm x 23µm), kỵ khí tùy tiện, catalase (+)
Nguồn nhiễm: nấm men
Hệ quả:
Sinh tổng hợp DMS và diacetyl
Tăng pH
Tăng tốc độ lên men
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

E. cloacae
29

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Klebsiella
Loài thường gặp: K. terrigena,
K. aerogenes, K. pneumonia
Đặc điểm: hình gậy (0.6-1.0µm x
0.6-6.0µm), kỵ khí tùy tiện, catalase
(+)

Nguồn nhiễm: dịch nha
Hệ quả:
Sinh tổng hợp DMS
Tạo mùi phenolic
(4-vinylguaiacol)

K. aerogenes
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

30


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Zymomonas
Loài thường gặp: Z. mobilis
Đặc điểm: hình gậy (1.0-1.4µm x
2-6µm), kỵ khí chịu dưỡng, catalase
(+), lên men glucose thành ethanol,
không lê men maltose, rất chịu cồn,
Topt=25-30oC
Nguồn nhiễm: dịch nha sản xuất ale
Hệ quả:

Z. mobilis

Sinh tổng hợp acetaldehyde
Sulphide
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

31

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Pectinatus
Loài thường gặp: P. cerevisiiphilus
Đặc điểm: hình gậy kéo dài (0.8µm x 2-30µm), kỵ khí bắt buộc,
pHopt=4.5-6.0
Nguồn nhiễm
Hệ quả:
Sinh tổng hợp hydrogen sulphide
Acetaldehyde
Propionic acid

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

32


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram âm
Megasphaera
Loài thường gặp: M. cerevisiae
Đặc điểm: hình cầu (1.0-1.2µm), kỵ khí bắt buộc, catalase (-),
không thể sinh trưởng khi pH < 4.1 và nồng độ ethaol > 3.5-5.5%
Nguồn nhiễm
Hệ quả:
Sinh tổng hợp hydrogen sulphide
Butyric acid và acid béo
→ Khó phân lập

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

33

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm

Vi khuẩn Gram dương
trong bia

Vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn khác

(2 giống)

(2 giống)

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

34


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram dương
Lactobacillus
Loài thường gặp: L. brevis, L. damnosus,
L. casei, L. fermentum, L. buchneri, L.
delbruekii, L. lindneri
Đặc điểm: hình gậy (0.6-1.2µm x 1-15µm),
kỵ khí chịu dưỡng, catalase (-), lên men

lactic đồng hình lẫn dị hình, tính mẫn cảm
với iso-alpha acid thay đổi tùy chủng

L. brevis

Nguồn nhiễm
Hệ quả:
Sinh tổng hợp diacetyl
Độ chua
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

35

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm

Vi khuẩn Gram dương

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

36


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram dương
Pediococcus
Loài thường gặp: P. damnosus,
P. inopinatus
Đặc điểm: hình cầu (0.7µm) ở dạng
tứ cầu khuẩn, kỵ khí chịu dưỡng,
catalase (-), lên men lactic đồng hình,

bền với iso-alpha acid và ethanol
(< 10% v/v)

P. inopinatus

Nguồn nhiễm
Hệ quả:
Sinh tổng hợp diacetyl
Độ chua

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

37

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram dương
Bacillus
Loài thường gặp: B. coagulans
Đặc điểm: hình gậy, hiếu khí bắt buộc,
catalase (+), có khả năng sinh bào tử, thuộc
nhóm ưa nhiệt, mẫn cảm với iso-alpha acid
Nguồn nhiễm: dịch nha trong phân
xưởng nấu

B. coagulans

Hệ quả: sinh tổng hợp nitrosamine

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

38


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Vi khuẩn Gram dương
Micrococcus
Loài thường gặp: M. kistinae, M. varians
Đặc điểm: hình cầu, hiếu khí bắt buộc (ngoại trừ M. varians
thuộc nhóm kỵ khí tùy tiện), catalase (+)
Nguồn nhiễm: dịch nha và bia
Hệ quả: tạo mùi trái cây
→ Ít gặp

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

39

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Saccharomyces
Tác động đến chất lượng bia
Phân loại
S. turbidans, S. ellipsoideus, S. willianus, S. diastaticus →
S. cerevisiae
S. bayanus, S. pastorianus
Killer yeast

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

40

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Saccharomyces
Ví dụ: chủng S. cerevisiae (S. diastaticus)
Nguồn nhiễm: phân xưởng lên men và rót
Hệ quả:
Độ lên men rất cao
Mùi phenolic
→ Gene POF (phenolic acid decarboxylase): decarboxyla hóa
acid ferulic và cinnamic thành 4-vinyl guaiacol và styrene

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

41

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Saccharomyces
Killer yeast
Killer yeast toxin
Bản chất
Chức năng
Phân loại
ds RNA plasmid → S. cerevisiae
ds DNA plasmid
cDNA → S. cerevisiae

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

42

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae với dsRNA plasmid
Độc tố

Gene

Kích thước gene

K1

M1 ds RNA plasmid

1.9

K2

M2 ds RNA plasmid

1.7

K3

M3 ds RNA plasmid

1.5

KT28

M28 ds RNA plasmid

1.99

K3GR1

M3GR1 ds RNA plasmid

1.5 và 2.0

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

43

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Saccharomyces
Killer yeast
Hệ quả
Tỉ lệ killer yeast 2-3% → tỉ lệ tế bào nấm men bia còn
sống sẽ giảm từ 95% xuống 20%
Mùi cỏ/ phenolic

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

44


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Non-Saccharomyces
Brettanomyces

Loài thường gặp: B. anomalus,
B. bruxellensis, B. lambicus
Đặc điểm: lên men glucose, ít khi lên
men maltose, không lên men
saccharose, sinh tổng hợp acid acetic,
khử nitrate, oxy thúc đẩy quá trình
lên men

B. bruxellensis

Nguồn nhiễm: dịch nha và bia
Hệ quả: ảnh hưởng đến chất lượng
cảm quan bia
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

45

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Non-Saccharomyces
Candida
Loài thường gặp: C. tropicalis,
C. boidinii, C. vini (C. mycodema)
Đặc điểm: lên men glucose
(C. tropicalis có thể lên men maltose)
Nguồn nhiễm: dịch nha (giai đoạn
đầu của quá trình lên men chính) và
bia
Hệ quả: ảnh hưởng đến chất lượng
cảm quan bia

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

C. tropicalis

46


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Non-Saccharomyces
Cryptococcus
Loài thường gặp: C. laurentii
Đặc điểm: không lên men
nhưng có thể sử dụng nhiều loại
đường, một số chủng sinh tổng
hợp pigment
Nguồn nhiễm: bia tươi
Hệ quả: ảnh hưởng đến chất
lượng cảm quan bia
C. laurentii
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

47

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Non-Saccharomyces
Dekkera
Loài thường gặp: D. bruxellensis,
D. hansenii
Đặc điểm: sinh ascospore, lên men
glucose và saccharose, một số chủng

lên men maltose, oxy sẽ thúc đẩy
quá trình lên men
Nguồn nhiễm: bia tươi
Hệ quả: ảnh hưởng đến chất
lượng cảm quan bia

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

D. bruxellensis

48


3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Non-Saccharomyces
Kluyveromyces
Loài thường gặp: K. marxianus
Đặc điểm: lên men glucose, khả
năng lên men các đường khác tùy
thuộc vào chủng, chịu nhiệt
Nguồn nhiễm: thế liệu syrup,
dịch nha
Hệ quả: ảnh hưởng đến chất
lượng cảm quan bia

Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

K. marxianus

49

3.2. Hệ vi sinh vật nhiễm
Nấm men dại Non-Saccharomyces
Pichia
Loài thường gặp: P. anomala,
P. fermantans, P. membranifaciens
Đặc điểm: lên men glucose
Nguồn nhiễm: dịch nha (giai đoạn
đầu của qt lên men chính) và bia tươi
Hệ quả:
Độ trong

P. anomala

Tạo màng
Mùi sauerkraut (P.
membranifaciens)
Lê Văn Việt Mẫn (3/2009)

50