Luận văn nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của cuba

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------

Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo
ra các dòng cà chua đột biến cho năng
suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. DƯƠNG HỒNG ANH

Hà Nội

1


MỤC LỤC

2


MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill ) là một loại rau ăn quả có giá
trị kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những loại rau ưu tiên có
chiều hướng phát triển mạnh cả về chất và lượng. Chính vì vậy, sản lượng
cà chua trên thế giới luôn tăng mạnh. Theo thống kê của FAO (2006) sản
lượng cà chua đứng thứ hai trên thế giới sau khoai tây.
Cùng với sự phát triển của nền nông nghiệp thế giới, sản xuất nông

nghiệp ở Việt Nam đang trên đà phát triển dựa trên những tiến bộ về khoa
học kỹ thuật, đưa cây trồng có giá trị cao vào canh tác nhằm tăng thu nhập
cho người dân, đặc biệt là loại cây trồng ngắn ngày nhanh cho thu hoạch
phù hợp với phương thức sản xuất luân canh, có khả năng xuất khẩu và chế
biến công nghiệp nên cây cà chua là đối tượng được quan tâm và đặt lên
hàng đầu.
Trong những năm qua, các cơ quan chuyên môn, nhiều nhà khoa học đã
tập trung nghiên cứu cây cà chua theo nhiều hướng khác nhau, một trong
các hướng đã được các nước ứng dụng rộng rãi là phương pháp chọn giống
đột biến bằng phương pháp chiếu xạ, một ứng dụng của kỹ thuật hạt nhân
trong nông nghiệp để cải tạo, nâng cao chất lượng của các giống cây trồng
đồng thời cũng phát triển các giống mới với đặc điểm sinh học được cải
tiến. Bằng phương pháp chiếu xạ giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống so
với các phương pháp chọn giống truyền thống đồng thời có thể tạo ra
những tính trạng quý chưa có ở giống gốc. Chọn giống đột biến đóng góp
vai trò quan trọng trong việc cải tiến cây trồng nói chung và cà chua nói
riêng.
Trong những năm gần đây, sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ.

3


Việc kết hợp sinh học phân tử và chọn giống đột biến đã chứng tỏ đó là
phương pháp có hiệu quả. Kỹ thuật phân tử được sử dụng để lập bản đồ và
sàng lọc những chỉ thị phân tử liên kết với những gen đột biến để xác định
bản chất đột biến xảy ra trong khi chúng rất khó biểu hiện ra kiểu hình.
Đồng thời, điều đó cũng nhằm xây dựng chiến lược trong việc sử dụng
những gen đột biến trong cải tiến giống. Việc kết hợp giữa kỹ thuật sinh
học phân tử với nghiên cứu gây tạo đột biến được thực hiện một cách chặt
chẽ, có thể cung cấp những phương pháp nghiên cứu chính xác, hiệu quả,

nhanh và kinh tế hơn trong công tác cải tiến cây trồng theo hướng chọn
giống đột biến. Việc xác định các giống cà chua có năng suất cao đáp ứng
nhu cầu con người và giúp tăng thu nhập cho người nông dân là vấn đề cấp
thiết được đặt ra. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài: “ Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua
đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tạo ra các dòng cà chua đột biến có năng suất cao bằng phương pháp
chiếu xạ gây đột biến.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số dòng cà chua có triển
vọng giúp tăng thu nhập cho người dân.
- Đề tài bổ sung thêm vào các tài liệu khoa học phục vụ cho công tác
giảng dạy và nghiên cứu.

Chương1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4


1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm và giá trị của cây cà chua
1.1.1. Nguồn gốc
Cà chua có nguồn gốc ở Pêru, Bolivia và Equado. Trước khi Crixtop Côlông
phát hiện ra châu Mỹ thì ở Pêru và Mêhicô đã có trồng cà chua. Những loài cà
chua hoang dại gần gũi với cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy
núi Andes (Pêru), Bolivia và Equado. Các nhà thực vật học De candolle (1884),
Mulle (1940), Luckuwill (1943), Brezney (1955)… đều thống nhất cho rằng cây
cà chua có nguồn gốc ở bán đảo Galapagos bên bờ biển Nam Mỹ, Pêru, Equado
và Chilê. Người trồng trọt đã thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng
hoang dại, những giống và loài hoang dại được mang từ nơi xuất xứ đến Trung

Mỹ , cuối cùng đến Mêhicô. [6]
Theo các tài liệu của châu Âu thì chắc chắn cà chua được người Aztec và
người Toltec mang đến. Đầu tiên người Tây Ban Nha đem cà chua từ châu
Âu về, rồi sau đó đưa đến vùng Địa Trung Hải.
Đầu thế kỷ 18, cà chua đã trở lên phong phú, đa dạng nhiều vùng trồng
làm thực phẩm. Thời kỳ này cà chua lại từ châu Âu quay lại Bắc Mỹ. Cho
đến thế kỷ 19, cà chua trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa
ăn thường nhật và được trồng rộng rãi.
1.1.2. Phân loại thực vật
Cà chua thuộc họ Solanaceae, chi Lycopersicon. Tên khoa học là
Lycopersicon esculencum Mill. Theo tác giả Breznhev.D (1964)
Lycopersicon gồm 3 loài thuộc hai chi phụ
Subgenus 1- Eulycopersicon: các dạng cây một năm, quả không có lông,
màu đỏ hoặc vàng, hạt mỏng, rộng…..chi này gồm một loài L. Esculentum
Loài này chia làm 3 loài phụ.
+ ssp. Spontaneum Brezh: (cà chua dại): có hai biến chủng là var.
Racemigerum và var.Pimpinellifolium: hai biến chủng này thường quả nhỏ,

5


hàm lượng chất khô cao, chống bệnh tốt và có giá trị để sử dụng làm vật
liệu khởi đầu cho chọn giống.
+ ssp. Subspontaneaum ( cà chua bán trồng): có 5 biến chủng là:
Var. Pruniform: Dạng quả mận
Var. purifomae: dạng quả lê
Var. cerasifomae: dạng quả anh đào
Var. Elongatum: dạng quả dài hay gọi là dạng quả nhót.
Var. Succenturiatum: dạng quả nhiều ngăn hạt.
Năm biến chủng này thân mập, quả rất nhỏ, dùng làm vật liệu chọn giống.

+ ssp. Cultum (cà chua trồng): gồm 3 biến chủng
Var. Vulgare: cà chua thường
Var. Validum: dạng thân bụi.
Var. Grandiflium: dạng kiểu lá khoai tây.
Subgenus 2- Eriopersicon: chi phụ này gồm các loài dại, cây dạng một
năm hoặc nhiều năm, gồm các dạng quả có lông, màu trắng, xanh lá cây
hay vàng nhạt, có các vệt màu antoxian hay xanh thẫm. Hạt dày không có
lông màu nâu…chi phụ này gồm hai loài và các loài phụ.
+ Loài L. Peruvianum. Mill: loài này có nhiều biến dạng trong đó
có.

Var.

Cheesmanii

Riloey;

var.

Chessmaniifminor.C.H.Mull;

var.Dentatum Dum.
+ Loài L. Hirsutum Humb.et.Bonpl: loài này gồm hai loài phụ Var.
glabratum C.H. Mull và var. glandulosum C.H.Mull. có một vài tính trạng
có ý nghĩa trong chọn giống, các cơ quan sinh trưởng phủ một lớp lông tơ.

1.1.3. Đặc tính thực vật
Cà chua là cây một năm. Tuy nhiên trong điều kiện tối ưu nhất định cà

6

chua có thể là cây nhiều năm.
1.1.3.1. Hệ rễ
Cà chua có hệ rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển
rễ phụ rất lớn. Trong điều kiện tối ưu những giống tăng trưởng mạnh có hệ
rễ ăn sâu 1- 1,5m và rộng 1,5-2,5m. Vì vậy cà chua chịu hạn rất tốt. Khi
cây rễ chính bị đứt, bộ rễ phụ phát triển và phân bố rộng nên cây cũng chịu
đựng được điều kiện khô hạn.Trong quá trình sinh trưởng, hệ rễ chịu ảnh
hưởng lớn của điều kiện môi trường như nhiệt độ đất, độ ẩm…ở nhiệt độ
đất thấp (14-160C) sự phát triển rễ chậm lại 15-20 ngày. Nhiệt độ đất cao
(>350C) rễ cà chua phát triển bị trở ngại và có thể bị chết.
1.1.3.2. Thân
Thân tròn thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân
dần dần hoá gỗ. Thân mang lá và phát hoa. Ở nách lá là chồi nách, chồi
nách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau,
thường chồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất có khả năng sinh trưởng
mạnh và phát dục lớn so với các chồi nách gần gốc. Tuỳ khả năng sinh
trưởng và phân nhánh các giống cà chua được chia làm 4 dạng hình:
Dạng sinh trưởng hữu hạn: chiều cao từ 65-120cm
Dạng sinh trưởng vô hạn: Chiều cao cây từ 120->200cm, thân sinh trưởng
mạnh
Dạng sinh trưởng bán hữu hạn: Chiều cao cây 65-95cm
Dạng lùn: cây thấp, chiều cao cây dưới 65cm, cây lùn mập, khoảng cách
giữa các lóng ngắn.

1.1.3.3. Lá
Lá cà chua là đặc trưng hình thái để phân biệt giống này với giống khác.

7

Lá thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3-4 đôi lá chét, ngọn lá có một
lá riêng gọi là lá đỉnh. Rìa lá chét đều có răng cưa nông hay sâu tuỳ giống,
phiến lá thường phủ lông tơ. Đặc tính lá của giống thường thể hiện đầy đủ
sau khi cây có chùm hoa đầu tiên.
Số lá là đặc điểm di truyền của giống, nhưng cũng bị ảnh hưởng của
nhiệt độ trong quá trình hình thành. Khi hình thành 10 lá đầu tiên cần nhiệt
độ trung bình hơn 130C, hình thành 20 lá cần nhiệt độ trung bình ngày đêm
là 240C, nếu nhiệt độ thấp hơn 13 0C thì quá trình xuất hiện lá mới sẽ chậm
lại.
1.1.3.4. Hoa
Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính. Sự thụ phấn chéo
ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa alkaloid độc nên
không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được. Số lượng
hoa trên chùm hoa thay đổi tuỳ giống và thời tiết, thường từ 5-20 hoa.
Màu sắc của cánh hoa thay đổi theo quá trình phát triển từ vàng xanh đến
vàng tươi rồi vàng úa. Hoa cà chua nhỏ, hoa đính vào chùm bằng một
cuống ngắn. Một lớp tế bào riêng rẽ hình thành ở cuống hoa, khi gặp điều
kiện không thuận lợi sẽ thúc đẩy quá trình hình thành tầng rời, lớp tế bào sẽ
khô héo và chết.
Cà chua có 3 loại chùm hoa: Đơn giản, trung gian và phức tạp.
Cà chua là loại cây có khả năng ra hoa nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp,
đặc biệt khi gieo trồng trong những điều kiện bất lợi. Nguyên nhân rụng nụ,
hoa rất phức tạp song chủ yếu do hình thành tầng rời, lớp tế bào bị chết làm
cho hoa rụng khỏi chùm. Số hoa trên cây là đặc điểm di truyền của giống
nhưng cũng chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, chất lượng dinh
dưỡng không đầy đủ, kỹ thuật chăm sóc…..
1.1.3.5. Qủa

8


Qủa thuộc loại mọng nước gồm: vỏ, thịt quả, vách ngăn và giá noãn. Qủa
cà chua được cấu tạo từ 2 đến nhiều ngăn. Số lượng quả trên cây là đặc tính
di truyền của giống và cũng chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, chất
lượng dinh dưỡng không đầy đủ, kỹ thuật chăm sóc…
Số lượng quả thay đổi lớn từ 4-5 quả đến vài chục quả. Khối lượng quả
có sự chênh lệch đáng kể giữa loài và trong loài từ 2-3g đến 200-300g.
Trên cùng một giống cà chua, số lượng quả và khối lượng quả có sự tương
quan nghịch: số lượng quả nhiều thì khối lượng quả nhỏ và ngược lại. Số
lượng quả trên cây cũng tương quan rất chặt đến năng suất. Đây cũng là
một trong những tính trạng quan tâm của các nhà chọn tạo giống.
Hình dạng quả cà chua thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài. Vỏ quả có thể
nhẵn hoặc có khía. Màu sắc của quả thay đổi tuỳ giống và điều kiện thời
tiết, thường màu sắc quả là màu phối hợp giữa màu vỏ quả và thịt quả.
Chất lượng quả cà chua được thể hiện qua các chỉ tiêu: cấu trúc quả, độ
rắn, tỉ lệ thịt/quả, tỉ lệ đường/ axit và sắc tố quả. Sự cân bằng về đường và
axit thể hiện hương vị thích hợp.
1.1.3.6. Hạt
Hạt cà chua nhỏ, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối. Hạt nằm trong
buồng chứa nhiều dịch bào kìm hãm sự nảy mầm của hạt. Trung bình có
50-350 hạt trong quả, trọng lượng 1000 hạt là 2,5-3g.
1.1.4. Gía trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế
Cà chua là loại rau quả quý được sử dụng rộng rãi trên thế giới hơn 150
năm qua. Trong quả chín có nhiều chất dinh dưỡng như đường, vitaminA,
vitamin C và các chất khoáng quan trọng như Ca, Fe, P, K, Mg…[6]
Theo ED War, D.C Tigche LAAR (1989) thành phần hoá học trong quả
cà chua chín như sau:
- Nước: 94 – 95%

9


-

Chất khô: 5 – 6% trong đó:

55% đường; 21% chất khô hoà tan

trong rượu, protein, xenlulozơ, pectin, polysaccarit; 7% chất vô
cơ; 5% các chất khác.
Theo PGS.TS. Hồ Hữu An (2003-2006) cho thấy thành phần dinh dưỡng
trong quả cà chua phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thời vụ gieo trồng, giống
và các biện pháp kĩ thuật gieo trồng.
Cà chua còn được sử dụng về mặt thẩm mỹ và y học: Cà chua có thể
dùng để chống tiêu chảy, chữa bỏng nắng, giảm đau, làm lành vết thương.
Cà chua còn làm thuốc tăng lực, bổ gan và chống xơ gan, sử dụng cà chua
hàng ngày giúp chúng ta tiêu hoá khi ăn nhiều mỡ động vật, trứng,
phomat…phòng được bệnh xơ cứng thành mạch. Phụ nữ dùng quả cà chua
đắp mặt hàng ngày làm cho da căng sáng, không nếp nhăn, chống lão
hoá.Trong cà chua còn chứa các amino axit (trừ triptophan), giá trị dinh
dưỡng của cà chua rất phong phú vì vậy hàng ngày mỗi người sử dụng từ
100 – 200g cà chua sẽ thoả mãn nhu cầu vitamin cần thiết và các chất
khoáng chủ yếu. Lycopen có trong cà chua là chất chống oxi hoá tự nhiên
liên quan tới vitamin A đã được chứng minh có khả năng ngăn ngừa bệnh
ung thư tuyến tiền liệt, vì lycopen là chất có khả năng ngăn ngừa các gốc tự
do gây ung thư.
Cà chua còn dùng để làm tăng hương vị của các món ăn và tạo cho món
ăn thêm hấp dẫn, cà chua có thể chế biến thành nhiều loại khác nhau như cà

chua cô đặc, nước cà chua, cà chua nguyên quả đóng hộp, cà chua muối,
dầm dấm, làm salat, mứt…[7]
Cà chua không chỉ là cây rau có giá trị kinh tế cao, nó còn là mặt hàng
xuất khẩu của nhiều nước trên thế giới. Tuỳ theo đặc điểm của từng vùng
sinh thái, tuỳ mùa vụ, một sào bắc bộ có thể cho thu nhập từ 1-3 triệu đồng.

10


Theo trung tâm khuyến nông quốc gia (31/03/2006) cà chua trái vụ ở Thực
Đạt (Hải Dương) thu được 3-5 triệu/sào (80 triệu đồng/ha). Có thể nói cà
chua đã trở thành cây xoá đói, giảm nghèo cho người dân nơi đây.
1.2. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới
Cà chua đã trở thành một trong những cây trồng thông dụng và được
trồng phổ biến, rộng rãi trên khắp thế giới. Nghiên cứu lịch sử trồng trọt
cho biết đến tận thế kỉ thứ 19, cà chua vẫn chỉ được trồng như một cây
cảnh nhờ màu sắc đẹp của quả. Ngày nay, người ta đã biết ankaloid trong
quả cà chua là tomatin, một chất ít độc kể cả khi nó có hàm lượng rất cao.
Bởi vậy, sản xuất và sử dụng cà chua trên thế giới không ngừng tăng lên.
Từ năm 1990 – 2001 diện tích trồng cà chua trên thế giới từ 2.868,443 ha
tăng lên 3.745,299 ha và sản lượng từ 76.022,112 tấn tăng lên 100.259,346
tấn nhưng năng suất gần như không tăng. Phải chăng do những ứng dụng
tiến bộ kỹ thuật mới vào trồng trọt, chăm sóc cà chua chưa nhiều.
Trong những năm gần đây diện tích, năng suất và sản lượng cà chua tăng
lên thể hiện qua bảng sau
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới
Năm

Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(nghìn ha)

(tấn/ha)

(nghìn tấn)

11


2000

3.750,176

27,192

101.975,637

2001

3.745,229

26,770

100.259,346

2002

3.998,219

27,005

107.972,098

2003

4.188,389

27,921

116.943,619

2005

4.570,869

27,222

124426,995

Nguồn:Theo thông kê của FAO (2000-2006)
Thống kê của FAO cho thấy, diện tích cà chua trên thế giới năm 2005 đạt
4.570,869 ha tăng gấp 1,4 lần so với năm 1995.
Bảng 2.2: Sản lượng cà chua của thế giới và các nước dẫn đầu
TT

Quốc gia

1

Thế giới

2

1995

2000

2003

2005

87.592,093 108.339,598 116.943,619

124.426,995

Trung Quốc

13.172,494

22.324,767

28.842,743

31.644,040

3

Mỹ

11.784,000

11.558,800

10.522,000

11.043,300

4

Thổ Nhĩ Kỳ

7.250,000

8.890,000

9.820,000

9.700,000

5

Ấn Độ

5.260,000

7.430,000

7.600,000

7.600,000

6

Italy

5.182,000

7.538,100

6.651,505

7.087,016

7

Ai Cập

5.034,179

6.785,640

7.140,198

7.600,000

8

Tây Ban Nha

2.841,100

3.766,328

3.947,327

4.651,000

9

Braxin

2.715,016

2.982,840

3.708,600

3.396,767

10

Iran

2.403,367

3.190,999

4.200,000

4.200,000

11

Mêhico

2.309,968

2.086,030

2.148,130

2.800,115

12

Hy Lạp

2.064,160

2.085,000

1.830,000

1.713,580

Nguồn:Thống kê của FAO (200-2006)
Qua bảng tổng kết cho thấy: Đến năm 2005 thì Trung Quốc vẫn luôn là
nước đứng đầu trên thế giới về diện tích và sản lượng cà chua, tiếp theo là

12


Mỹ và Thổ Nhĩ Kỳ.
Có thể thấy rằng cà chua đang là mặt hàng nông sản được sản xuất chủ lực
ở các nước ôn đới và á nhiệt đới.
1.2.2. Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam
Ở nước ta, cà chua được trồng trên 100 năm nay, diện tích trồng cà chua
hàng năm biến động 12.000 -13.000 ha. Theo thống kê sơ bộ năm 2005 thì
diện tích trồng cà chua cả nước là 23.354 ha tăng 3,34 lần so với năm 2000
(6967 ha), với năng suất trung bình đạt 198 tạ/ha. Sản lượng đạt 462,435
tấn. Năng suất cà chua ở nước ta nói chung còn thấp, chỉ khoảng 60-65%
so với năng suất bình quân của thế giới. Các vùng trồng cà chua lớn nhất ở
nước ta là : Hải Dương, Nam Định, Bắc Giang, Lâm Đồng… đây là những
vùng trồng cà chua đạt năng suất cao nhất cả nước ( năng suất ≥ 200 tạ/ha).

Bảng 2.3. Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua giai đoạn 2000-2005
Năm

Diện tích

Năng Suất

Sản lượng

(1000 ha)

(tạ/ha)

(1000 tấn)

2000

6,967

196,3

136,734

2001

11,492

156,4

179,755

2002

18,868

165,5

312,178

2003

21,628

164,1

354,846

2004

24,644

172,1

424,126

13


2005

23,354

198,0

462,435

Nguồn: Trích số liệu của tổng cục thống kê 2006
Ở nước ta, cây cà chua sinh trưởng và phát triển tốt nhất vào vụ đông,
mặc dù trong những năm gần đây có nhiều cố gắng trong công tác chọn
giống và công nghệ nhưng vụ đông vẫn là vụ chính cho sản lượng và chất

lượng cao nhất.
Trong cả nước có khoảng 22 giống cà chua chủ lực trong đó có 10 giống
được sử dụng nhiều nhất với tổng diện tích 6253 ha tương đương với 55%
diện tích cả nước đứng đầu là giống M383 sau đó đến giống VL200,
Tn002, Cà chua Mỹ, cà chua balan, Red crow, T42, VI2910 và giống Trang
Nông.

1.3. Khái quát về các nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống
cây trồng
1.3.1. Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng
Chọn tạo giống cây trồng là một ngành khoa học cải tiến di truyền của
thực vật vì lợi ích của loài người [32]. Để tạo ra nguồn biến dị mới với các tính trạng
mong muốn các nhà chọn tạo giống phải áp dụng nhiều biện pháp khác nhau như chọn
lọc, lai giống, tạo đột biến, gây đa bội thể và gần đây nhất là áp dụng công nghệ sinh
học trong chọn giống. Chọn lọc là phương pháp cơ bản của chọn giống. Tuy nhiên,
phương pháp chọn lọc chỉ đưa lại kết quả khi quần thể ban đầu đa dạng về kiểu gen. Kết
quả của các phương pháp chọn lọc chỉ là thừa hưởng những kho tàng biến dị có sẵn
trong tự nhiên chứ không phải là tạo ra được những biến dị mới.
Bằng các biện pháp lai tạo và gây đa bội thể thực nghiệm người ta đã làm phong phú
thêm nguồn biến dị trong tự nhiên. Một hiệu ứng đặc biệt nhận được trong lai giống là

14


ưu thế lai biểu hiện ở thế hệ F1. Tuy nhiên ở cây trồng do đặc điểm cấu trúc hoa và hệ
thống sinh sản của chúng gây cản trở cho việc áp dụng tạo giống ưu thế lai (bất hợp lai,
F1 không có khả năng sống, F1 bất dục, sự suy nhược của con lai). Bằng các phương
pháp này ta cũng chỉ mới sử dụng một số ít gen trong hệ thống gen của một cơ thể thực
vật quá trình chọn lọc và lai tạo cũng phải trải qua một khoảng thời gian khá dài.
Đột biến là cơ sở của tiến hoá hình thành nên các giống cây trồng, vật nuôi mới. Đột

biến là một con đường quan trọng dẫn đến việc làm tăng sự biến dị trong cơ thể sinh
vật, nó là sự biến đổi bất thường về vật chất di truyền dẫn đến sự biến đổi một hoặc
nhiều tính trạng và có thể được di truyền cho thế hệ sau. Đột biến gồm hai loại đột biến
tự phát và đột biến nhân tạo.
Đột biến tự phát là dạng đột biến xảy ra một cách ngẫu nhiên trong tự
nhiên do những biến đổi thời tiết, khí hậu do những thay đổi về yếu tố địa lý
v.v… Trong tự nhiên những biến đổi đột ngột do những biến động thời tiết khí
hậu, địa lý làm cho sinh vật mới thích nghi hơn với điều kiện sống qua quá trình
tiến hoá hàng trăm, thậm trí hàng nghìn năm những giống cây trồng, vật nuôi
mới này hình thành những đặc tính khác biệt so với giống cũ. Đột biến tự phát
xảy ra trong tự nhiện có tần số rất thấp thường 10-9 nghĩa là khoảng 10 triệu cá
thể mới xuất hiện một cá thể bị đột biến và không phải đột biến nào cũng có ý
nghĩa cho con người.
Đột biến nhân tạo: là đột biến xảy ra do các tác nhân (vật lý hoặc hoá học)
gây đột biến được thực hiện bởi con người vì mục đích chọn giống. Nhờ việc sử dụng
của các tác nhân gây đột biến người ta có thể tạo được các giống mới trong một khoảng
thời gian ngắn và trong một phạm vi thí nghiệm hẹp. Gây đột biến là một phương pháp
để bổ sung nguồn gen trong chọn giống cây trồng.
Sau những năm 1995, cùng với sự bùng nổ thông tin của công nghệ thông tin đã có
sự tăng cường trao đổi thông tin giữa các nhà khoa học về việc không chỉ gây đột biến
để cải tiến giống cây trồng mà còn ứng dụng gây đột biến để khám phá gen kiểm soát
những tính trạng quan trọng và tăng sự hiểu biết chức năng và cơ chế hoạt động của
chúng, mà còn giải mã bản chất sinh học của những biến đổi trong chuỗi ADN, sự tự
sửa chữa các đột biến. Những nghiên cứu về đột biến đã có những thay đổi về lượng và
cả về chất, nghiên cứu tìm hiểu tận gốc những thay đổi trong chuỗi ADN do những tác
nhân đột biến gây nên. Thậm trí người ta có thể nghĩ đến gây bất hoạt gen nhờ đột biến

15

nhằm ức chế hoặc tạo ra một loại sản phẩm protein mới dẫn đến thay đổi chất lượng của
cây trồng.
1.3.2. Cơ sở di truyền của đột biến
Đột biến có thể xảy ra ở bất kỳ lúc nào và ở bất kỳ tế bào nào. Các tác động lên kiểu
hình có thể là những biến đổi nhỏ nhất mà chỉ có thể phát hiện bằng các phương pháp
phân tích phân tử đến những biến đổi lớn dẫn đến thay đổi những quá trình cơ bản của
tế bào dẫn đến có thể làm chết tế bào hoặc cả cơ thể.
Đột biến có thể phân chia theo nhiều cách khác nhau. Ở các sinh vật đa bào, sự phân
biệt quan trọng dựa trên các dạng tế bào đầu tiên xảy ra đột biến. Những đột biến xuất
hiện ở các tế bào hình thành giao tử được gọi là đột biến gen nhân (germ- line
mutations). Những đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng được gọi là đột biến tế bào sinh
dưỡng (somatic mutations) hay còn gọi là đột biến soma. Đột biến soma có thể tạo ra
một sinh vật vừa có các mô tế bào đột biến vừa có các mô bình thường. Hiện tượng này
còn được gọi là đột biến khảm. Đột biến tế bào sinh dưỡng có thể không được di truyền
cho thế hệ sau. Đối với cây nhân giống vô tính thì tuỳ vào vị trí và phần trăm của mô
sinh dưỡng người ta có thể phân lập được hai hoặc ba loại đột biến khác nhau. Ở các
loài thực vật bậc cao các đột biến soma có thể được nhân giống vô tính do đó vẫn có thể
giữ lại được các đột biến này [34].
Dựa vào sự thay đổi cấu trúc di truyền đột biến được phân thành hai loại đó là đột
biến nhiễm sắc thể và đột biến gen. Đột biến nhiễm sắc thể (NST) là sự biến đổi về cấu
trúc hoặc số lượng nhiễm sắc thể. Đột biến có thể xảy ra ở một cặp NST nào đó hoặc ở
toàn bộ các cặp NST. Loại đột biến này phát sinh có thể là do các tác nhân của ngoại
cảnh (do chất phóng xạ, hoá chất, sự biến đổi đột ngột của nhiệt độ) hoặc những rối
loạn của quá trình trao đổi chất của nội bào dẫn đến sự phân ly không bình thường của
các cặp NST. Trường hợp NST trong tế bào sinh dưỡng tăng lên thành bội số của n
(nhiều hơn 2n) được gọi chung là thể đa bội. Tế bào đa bội có lượng ADN tăng gấp bội,
quá trình tổng hợp các chất hữu cơ diễn ra mạnh mẽ do đó kích thước tế bào lớn hơn.
Cơ thể đa bội thường có cơ quan sinh dưỡng to, phát triển khoẻ, chống chịu tốt. Hiện
tượng đa bội khá phổ biến ở thực vật và đã được ứng dụng hiệu quả trong chọn giống
cây trồng. Đột biến NST có các dạng mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn.

Đột biến gen là những biến đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide

16


xảy ra tại một điểm nào đó trên phân tử ADN. Sự biến đổi về cấu trúc phân tử của gen
có thể dẫn tới biến đổi cấu trúc của một loại protein do gen đó mã hoá và cuối cùng dẫn
đến biến đổi ở kiểu hình. Ngoài những đột biến gen xảy ra trên ADN của NST còn xảy
ra đột biến ADN của các bào quan như ty thể, lạp thể có thể gây ra những biến dị di
truyền theo dòng mẹ.
1.3.3. Các tác nhân gây đột biến
Bằng chứng về các tác nhân ngoại cảnh có thể làm tăng tỉ lệ đột biến được
công bố vào năm 1927 bởi Hermann Muller, ông đã chứng minh tia X là tác nhân gây
đột biến ở ruồi giấm. Kể từ đó một số lượng lớn các tác nhân gây đột biến được khám
phá và được phân thành hai loại đó là tác nhân vật lý và tác nhân hoá học [35].
Ngay từ những năm 1940 Auerbach và Robson dã khẳng định một số hoá chất có
khả năng gây đột biến. Trước những năm 60 của thế kỉ XX trên thế giới người ta mới sử
dụng các tác nhân gây đột biến hoá học. Ngày nay có đến hàng chục nhóm chất hoá học
hoặc hàng ngàn dẫn xuất của chúng có khả năng gây đột biến nhưng nếu xét về phương
thức tác dụng chúng có thể được chia thành năm nhóm như sau:
- Các chất kìm hãm sự tổng hợp của các bazơ nitơ, tham gia vào thành phần axit nucleic
dẫn đến việc hình thành các gốc không bình thường gây ra sự đột biến. Các chất này
gồm có: coephin, ethyluretan, theobromin…
- Các chất đồng đẳng của bazơ nitơ như 5- bromuracil (đồng đẳng của thymin), 2aminopurin (đồng đẳng của adenin) tham gia vào thành phần DNA cũng có thể gây đột
biến.
-Các hợp chất alkyl hoá như EI (ethyleneimin), EMS

(ethylmethanesulfonate).

Các hợp chất này có khả năng alkyl hoá các nhóm phosphate trong phân tử ADN cũng

như các bazơ purin hay pyrimidine dẫn đến sự đột biến.
- Các chất ôxi hoá khử và các gốc tự do như peroxyt, HNO2, aldehyt…gây đột biến
liên quan đến sự dezamin hoá các gốc purin và pyrimidine của ADN và ARN.
- Các chất nhuộm màu thuộc nhóm acridin, các chất này khi phản ứng với ADN thì tạo
thành một phức hệ làm rối loạn sự tái sinh bình thường của ADN. Tác nhân gây đột
biến vật lý là những dạng tia phóng xạ. Muller và Xapeghin là những người đầu tiên
đưa ra khả năng sử dụng tia phóng xạ để nâng cao tần số đột biến ở cây trồng. Sau đó

17


phương pháp chọn giống mới này đã thu hút được sự chú ý của nhiều người đặc biệt là
các nhà di truyền chọn giống của Liên Xô, Đức, Nhật, Thuỵ Điển…Có rất nhiều dạng
tia phóng xạ và nguồn phóng xạ cho các nhà chọn gống lựa chọn. Bên cạnh tia cực tím
một số các tia phóng xạ ion hoá như tia X, tia gamma, hạt alpha, beta, hạt proton,
neutron, ion beam có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện
từ có thể gây ra tổn thương sinh học cho tế bào. Những tổn thương sinh học do phóng
xạ gây ra được hình thành qua hai con đường:
- Phóng xạ tác động trực tiếp xảy ra ở phân tử ADN và gây ra đột biến gen.
- Phóng xạ tác động gián tiếp, nó được các các phân tử khác trong tế bào hấp thụ, sau
đó các năng lượng này hoặc các sản phẩm của nó được truyền vào ADN dẫn đến biến
đổi về cấu trúc ADN.
Tia phóng xạ có tác dụng khác nhau đến thực vật tuỳ thuộc vào kiểu phóng xạ, liều
lượng phóng xạ, đặc tính di truyền của giống, trạng thái sinh lý sinh hoá của bộ phận
được xử lý và một yếu tố của môi trường bên ngoài [35].
1.4. Ứng dụng của phương pháp gây đột biến trong nghiên cứu chọn giống
1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 1964 ở Roma, một hội nghị do FAO và IAEA tổ chức đã đưa
ra những đánh giá về kết quả và triển vọng của phương pháp chọn giống

đột biến đối với cải tiến giống cây trồng và 5 năm sau người ta công bố đã
có 77 giống đột biến ra đời.
Những năm 1970, Cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) và
Tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã tài trợ mở rộng hướng nghiên cứu
gây đột biến cải tạo cây nông nghiệp và cây công nghiệp nhiều nước trên
thế giới nhằm tạo ra hàng loạt giống mới như: lúa, lúa mỳ, lúa mạch, táo,
chanh, mía, chuối...
Năm 1990, hội nghị do FAO/IAEA tổ chức thông báo có 1363 giống
cây trồng được tạo ra từ phương pháp đột biến ở 48 quốc gia, trong đó có
559 giống hoà thảo và 415 giống cây trồng. Đến năm 1996 cũng theo FAO/
IAEA công bố đã có tới gần 1800 giống cây trồng.

18


Cho tới năm 2003 (FAO/IAEA Mutant Varieties Database), 2317 giống
cây trồng đã được tạo ra bằng gây đột biến thực nghiệm trên phạm vi 60
nước, trong số đó có 1585 giống cây trồng được trực tiếp sử dụng sau khi
gây đột biến và 667 giống được sử dụng một cách gián tiếp như là vật liệu
trong các phép lai. Việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tiến cây trồng đã
mang lại hiệu quả cực kỳ to lớn về mặt kinh tế, ước tính các nước đã thu
được hàng tỷ đô la từ hàng triệu hecta gieo trồng những giống cây được tạo
ra từ đột biến.[33]
Hiện nay theo thống kê mới nhất của FAO/IAEA đã có trên 3000
giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp đột biến, trong đó riêng lúa
có hơn 600 giống và Trung Quốc là nước dẫn đầu thế giới về trồng lúa đột
biến có những tính trạng đặc sắc.
Hơn 90% các giống đột biến nói trên đựơc tạo ra nhờ việc sử dụng tia x
và tia Gamma. Phần lớn các giống được đưa vào sản xuất là những dạng có
thay đổi về kiểu hình thời gian ra hoa, màu và dạng hoa, kích thước và màu

quả, chống sâu bệnh. Một số đột biến có giá trị khác như: thay đổi hàm
lượng Protein, axit amin, chất lượng tinh bột ở nội nhũ hạt…
Năn 1967, Swaminathan (Ấn Độ) đã dùng tia gamma và tia tử ngoại
chiếu lên hạt giống lúa mỳ Mehico Suorra 64 đã tạo ra giống đột biến
Sảbati có hàm lượng protein cao hơn giống gốc 2,3%.
Ở viện nghiên cứu Crasnoda của Nga năm 1976 đã xử lý tia Laze lên hạt
lúa mỳ tạo được giống đột biến Ljubov có hàm lượng protein tăng và năng
suất tăng 15% so với giống gốc.
Kutefa ( Trung Quốc) năm 1989 xử lý tia Rơnghen liều 9,3 Krad lên hạt
nảy mầm giống lúa Wuxian 20 và chọn tạo được giống mới tăng năng suất
so với giống gốc 30%. Cũng xử lý lên hạt nảy mầm giống Lungjing ở 2
liều 1 Kr và 2Kr tác giả thu được dạng đột biến thấp cây hơn giống gốc

19


30cm và năng suất vượt giống gốc 2,3 tấn/ha.
Năm 1965, Tedoradze XG đã sử dụng tia gamma liều 17Kr xử lý hạt đậu
tương, chọn lọc qua nhiều thế hệ và thu được giống đậu tương chín sớm,
chống chịu bệnh và năng suất vượt giống gốc 6,7 tạ/ha.
Ở Ấn Độ tác giả Kerketta V., Haque M.F bằng xử lý phóng xạ lên hạt
giống đậu tương Birsa1 có vỏ hạt màu đen đã thu được những dòng đột
biến có vỏ màu nâu, trắng hoặc vàng sẫm, cho năng suất cao hơn giống
gốc. [36]
Tạo được giống đậu chống bệnh cũng là một thành công của phương
pháp chiếu xạ. Tác gỉa Laseejan S. xử lý tia gamma liều 15 – 30 Kr lên hạt
11 giống và chọn lọc qua nhiều thế hệ thu được 16 dòng cho sản lượng hạt
cao và chống bệnh gỉ sắt.
Sonnino A, khi xử lý phóng xạ lên chồi cây khoai tây đã thu nhận được các
đột biến cây lùn, thay đổi màu sắc vỏ củ.

Trên đối tượng hoa cây cảnh cũng thu được nhiều thành công từ chọn
giống chiếu xạ. Trong những năm từ 1987 – 1989, các nhà chọn giống Ấn
Độ đã tạo được 37 dạng đột biến ở hoa cúc, 14 dạng đột biến ở hoa hồng
khác nhau về kích thước, màu sắc hoa.
Năm 2000, các tác giả của Thái Lan đã tiến hành chiếu xạ cụm chồi hoa
cúc bằng tia gamma ở các liều chiếu là 10, 30, 50, 70, 90,110 Gy. Kết quả
thu được cho thấy liều chiếu xạ 10Gy cho tỉ lệ sống cao nhất. Sau chiếu xạ
đã tạo ra các cây cúc cho hoa có màu sắc kích thước và số lượng cánh hoa
khác nhau trên cùng một bông hoa.
Tác giả Xiao-Shan Shen, Jue-Zhen Wan, Wei- YiLuo và CS (2004)
người Trung Quốc đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ đến
chồi đồng tiền trong các môi trường nuôi cấy M1,M2,M3 ( là các môi
trường tái sinh callus, môi trường tái sinh chồi, môi trường tạo rễ) trong in

20


vitro. Vật liệu sử dụng để chiếu xạ là callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều
chiếu xạ gây chết callus đồng tiền là từ 8 – 9Kr và liều có hiệu quả đột biến
là 5 – 6Kr.
1.4.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, lĩnh vực này đã được cố giáo sư Lương Đình Của khởi
xướng từ những năm 1960. Nhưng mãi đến năm 1980, hướng nghiên cứu
này mới được phát triển một cách tương đối có hệ thống và định hướng do
cố tiến sĩ Phan Phải và cộng sự tiến hành. Sau đó, một loạt nghiên cứu của
các tác giả khác trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như: lúa, ngô,
đậu, lạc, táo, cà chua, hoa cúc... đã tạo ra nhiều dòng đột biến có giá trị,
được chọn lọc và phát triển trực tiếp thành các giống quốc gia hoặc các
dòng có triển vọng phục vụ cho công tác lai tạo giống mới.
Từ năm 1989 – 2000 Viện di truyền Nông nghiệp đã công bố 6 giống lúa

quốc gia, trong đó giống DT10 được tạo ra nhờ xử lý tia gamma liều 20Kr
lên hạt khô của giống C4-63. Cũng từ xử lý tia gamma liều 20Kr lên hạt
khô của con lai F1 giữa giống TB1 và IR22, Viện kỹ thuật Nông nghiệp
tỉnh Thái Bình đã chọn lọc được M174 có P1000 hạt là 40g .[15]
Năm 1992, Phạm Văn Ro bằng phương pháp phóng xạ đối với một số
giống lúa như Tài nguyên đục, Tép hành đã chọn tạo được các giống có
thời giam sinh trưởng ngắn hơn rất nhiều so với giống gốc.
Năm 1994, Nguyễn Minh Công và Đào Xuân Tân tạo được 2 dòng đột
biến từ nếp Quýt Bắc Ninh có hàm lượng protein cao hơn hẳn giống gốc
bằng xử lý tia gamma lên hạt nảy mầm.[18]
Nghiên cứu mới đây của Hoàng Quang Minh, Nguyễn Như Toản” Hiệu
ứng chiếu xạ tia gamma ( nguồn Co 60) lên hạt lúa và những biến đổi di
truyền trong M1 và M2” đã rút ra kết luận: Xử lý chiếu xạ tia gamma lên
hạt lúa ướt ( ngâm sau 20h) với 3 liều lượng 15K, 20K, 25K đã tạo ra hiệu

21


ứng đột biến cao. Từ đó tạo nguồn vật liệu khởi đầu rất đa dạng và phong
phú cho công tác chọn tạo giống lúa. [10]
Chiếu xạ tia gamma liều 18Kr lên hạt giống đậu tương AK-04 có hạt
màu xanh, tác giả Mai Quang Vinh, Trần Văn Lài và CS đã chọn được
dòng DT95 có khả năng sinh trưởng khỏe và cho năng suất cao, có trường
hợp tới 200% so với giống đối chứng.[9]
Trên cây lạc, tác giả Lê Song Dự khi chiếu liều 5Kr lên giống Bạch sa
đã tạo ra giống mới B5000 có năng suất cao hơn giống gốc 20 – 30%, hàm
lượng protein đạt 21,48%, dầu 52,5%. [11]
Năm 2003, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo ra
nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống cúc bằng việc gây đột biến thực
nghiệm từ việc chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) trên chồi in vitro.

Năm 2005, Đào Thanh Bằng và cộng sự thuộc Viện Di Truyền Nông
nghiệp đã chiếu xạ vào mô sẹo cây hoa cúc bằng tia gamma ở các liều 1, 3,
5, 7 và 15Kr nhằm tăng phổ đột biến màu sắc hoa từ màu trắng ban đầu.
Kết quả thu được cho thấy liều gây chết 50% về khả năng tái sinh chồi là
5Kr và thu được 3 thể đột biến về màu sắc: hoa màu hồng, hoa vàng và hoa
có chóp cánh màu xanh.[40]
Năm 2007, Viện Di Truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu ảnh hưởng của
liều chiếu xạ lên callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều gây chết là 12Kr và
liều chiếu xạ có hiệu quả cho tỉ lệ sống và tỷ lệ đột biến cao là 16Kr
1.5. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng
1.5.1. Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng
Chỉ thị phân tử được coi là những đoạn ADN đã được tìm thấy ở các vùng đặc hiệu
trên bộ gen và được di truyền theo các quy luật từ thế hệ này sang thế hệ khác. Sự phát
triển và sử dụng các loại chỉ thị phân tử để phát hiện và khám phá sự đa hình của ADN,
lập bản đồ di truyền và nghiên cứu sự liên kết của các tính trạng là một trong những
tiến bộ nhất trong lĩnh vực di truyền phân tử. Sự hiện diện của rất nhiều loại chỉ thị

22


phân tử khác nhau và sự khác nhau về nguyên lý, phương pháp và sự ứng dụng của
chúng đòi hỏi sự cân nhắc trong việc lựa chọn một hoặc nhiều phương pháp. Chưa có
một loại chỉ thị phân tử nào đáp ứng được tất cả các nhu cầu của các nhà nghiên cứu.
Tuỳ theo các dạng nghiên cứu sẽ được đảm nhận có thể chọn một trong số các kỹ thuật
sinh học phân tử khác nhau, mỗi kỹ thuật đó kết hợp ít nhất một vài đặc tính được mong
đợi. Cho đến nay đã có rất nhiều loại chỉ thị phân tử được phát triển và ứng dụng trong
lĩnh vực chọn giống cây trồng ở mức độ phân tử người ta gọi là chọn giống nhờ chỉ thị
phân tử (Marker Assisted Selection-MAS). Các loại chỉ thị này được phân thành các
nhóm khác nhau dựa trên:
a) Phương thức di truyền (di truyền nhân từ bố mẹ, di truyền nhân từ mẹ, di

truyền cơ quan từ mẹ, di truyền cơ quan từ bố và mẹ.)
b) Phương thức hoạt động của gen (chỉ thị trội hay đồng trội)
c) Phương pháp phân tích (chỉ thị lai hoá hay chỉ thị PCR) [26]
Chỉ thị phân tử dựa trên sự lai hoá
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là chỉ thị phân tử dựa
trên lai hoá được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này dựa trên sự nhận biết của các
enzyme giới hạn ở các vị trí khác nhau giữa các đoạn ADN ở các sinh vật riêng biệt.
Nguyên lý và phương pháp của chỉ thị RFLP như
sau:
- Phân cắt ADN với một hoặc nhiều enzyme
- Phân đoạn các đoạn cắt giới hạn bằng agarose gel
- Chuyển các đoạn cắt riêng biệt từ agarose gel sang màng lọc bằng
Southern blotting.
- Phát hiện các băng cá biệt bằng sự lai hoá axít nucleic với các mẫu dò.
- Ưu điểm chủ yếu của chỉ thị RFLP là có khả năng tái bản cao, ưu thế trội, có khả năng
chuyển giao tốt giữa các phòng thí nghiệm, cung cấp các chỉ thị locus đặc hiệu mà cho
phép nghiên cứu (bảo tồn các gen giữa các sinh vật có họ hàng), không đòi hỏi thông
tin về trình tự, và tương đối dễ chấm điểm do kích thước khác nhau giữa các đoạn

23


ADN. Tuy nhiên, phương pháp RFLP vẫn còn có một vài hạn chế như sau:
- Đòi hỏi mẫu ADN đem phân tích phải có số lượng và chất lượng tốt
- Nó phụ thuộc váo sự phát triển của thư viện các mẫu dò đặc hiệu đối với
từng loài.
- Kỹ thuật này rất khó tự động hóa.
- Mức độ đa hình thấp và chỉ có một vài locus được nhận biết sau mỗi lần thử.
- Tốn thời gian, thiết bị và đắt tiền
- Yêu cầu phải có mẫu dò đánh dấu phóng xạ.

Các chỉ thị dựa trên PCR
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử, nó là sự sao mã các đoạn ADN nhờ enzyme mà
không cần đến cơ thể sống. Chỉ cần một lượng nhỏ ADN có thể nhân bản một số lượng
lớn các gen cần thiết nhờ một thiết bị biến đổi nhiệt và enzyme ADN polymerase.
Những ưu điểm chính của kỹ thuật PCR so với phương pháp phân tích dựa trên sự lai
hoá đó là chỉ cần một lượng nhỏ ADN và có thể không cần đến mẫu dò gắn phóng xạ,
có khả năng khuếch đại trình tự ADN từ các mô đã được bảo quản, có thể ứng dụng cho
nhiều loại chỉ thị di truyền, có khả năng chọn lọc nhiều gen trong cùng một thời điểm
và trong thời gian ngắn và đây là một phương pháp có thể áp dụng được ở tất cả các
phòng thí nghiệm quy mô nhỏ và có thể tiết kiệm về chi phí. Ngày nay dựa trên kỹ
thuật PCR nhiều loại chỉ thị phân tử đã được phát triển và cho kết quả rất triển vọng.
Các loại chỉ thị phân tử khác nhau dựa trên PCR được chia thành hai dạng dựa vào các
mồi sử dụng để khuếch đại như sau:
- Chỉ thị phân tử mồi ngẫu nhiên hoặc bán ngẫu nhiên không phát triển trên các
đoạn ADN không cần biết trước trình tự (như AP- PCR, RADP, DAF, AFLP,
ISSR)
- Chỉ thị phân tử có chủ đích được phát triển từ các trình tự ADN đã biết (như
ETS, CAPS, SSR, SCAR, STS…)
SSR (Simple Sequence Repeat, Microsatellites)

SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp
lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6bp có trong hệ gen của các loài sinh vật bậc cao (Litt

24


and Luty, 1989; Jacob et al, 1991). Phản ứng PCR đối với chỉ thị SSR
được thực hiện nhờ sự có mặt của mồi xuôi, mồi ngược và kéo dài mạch từ đầu 5’ đến
3’ của ADN mạch khuôn. Các đoạn sản phẩm PCR thường được phân tích bằng cách
điện di trên băng polyacrylamide kết hợp với nhuộm AgNO3 hoặc Ethylrium bromua

(EtBt). Gel agarose (thường 3%) với EtBr cũng được sử dụng khi sự khác

biệt về kích thước của các allen giữa các mẫu lớn hơn 10 bp. Tuy nhiên,
tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotid trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay
đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai
đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại:
- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau.
- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một
số nucleotid khác.
- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau.
Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của
nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan
trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng
nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc
thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di
truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.
Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ
ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự
gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locut SSR được
phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản
phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose
hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp).
Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền
của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt

25