Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cllulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM
--------------o0o--------------

HỒNG HẢI YẾN

Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE
TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG BẢO VỆ MƠI TRƢỜNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chun ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Cơng nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM
--------------o0o--------------

HỒNG HẢI YẾN

Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE
TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG BẢO VỆ MƠI TRƢỜNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành
: Công nghệ sinh học
Lớp
: K43 - CNSH
Khoa
: CNSH - CNTP
Khóa học
: 2011 - 2015
Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Trần Văn Chí

Thái Nguyên, năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt
nghiệp em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình.

Trước hết, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Văn Chí,
giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại
học Nông Lâm Thái Nguyên, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ
em hồn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời tri ân tới các thầy cơ giáo trong và ngồi khoa Cơng
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã ân cần dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như kinh
nghiệm trong cuộc sống.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã
tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Thái Nguyên, ngày

tháng

Sinh viên

HOÀNG HẢI YẾN

năm 2015


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose ............................. 13
Bảng 3.1: Môi trường CMC ............................................................................ 21
Bảng 3.2: Mơi trường thử hoạt tính cellulose ................................................. 22
Bảng 4.1: Thử sơ bộ hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn ................... 36

Bảng 4.2: Giá trị OD (mật độ quang) của canh trường................................... 38
Bảng 4.3: Hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ thạch ......... 40
Bảng 4.4: Hàm lượng glucose thay thế thành phần CMC trong môi trường ban
đầu ........................................................................................................ 42
Bảng 4.5: Hàm lượng saccharose thay thế thành phần CMC trong môi trường
ban đầu ................................................................................................. 43
Bảng 4.6: Tối ưu điều kiện mơi trường có bổ sung nguồn nitơ ...................... 45
Bảng 4.7: Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn và nấm mốc bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc ................................................................ 47


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Cấu trúc phân tử cellulose ............................................................... 9
Hình 2.2: Sơ đồ phân giải cellulose của Srinivasan, 1973. ............................ 15
Hình 4.1: Hình ảnh cấy trang vi sinh vật trên mơi trường đĩa thạch .............. 34
Hình 4.2: Hình ảnh cấy chuyển khuẩn lạc để giữ giống vi khuẩn .................. 35
Hình 4.3: Hình ảnh dịch enzyme .................................................................... 39
Hình 4.4: Xác định hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ thạch ....................... 40
Hình 4.5: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của chủng vi khuẩn B20 ................ 46


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CBD

: Cellulose binding domain

CMC

: Careboxymethyl cellulose

HEC

: Hydroxyethyl cellulose

OD

: Optical density


v

MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose ............... 3
2.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật ......................................................................... 3
2.1.2. Vi khuẩn phân giải cellulose ................................................................... 4

2.2. Enzyme từ vi sinh vật ................................................................................. 8
2.2.1. Giới thiệu chung về cellulose .................................................................. 8
2.2.2. Enzyme cellulase ..................................................................................... 9
2.3. Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải ........................ 15
2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngồi nước ..................................... 18
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 19
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 19
Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 20
3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu. ........................................... 20
3.1.1. Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu ............................................................ 20
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 20
3.1.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................... 20
3.1.4. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu. ........................................................... 20


vi

3.2. Môi trường sử dụng nghiên cứu ............................................................... 21
3.2.1. Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose: môi trường CMC
(MT1) .............................................................................................................. 21
3.2.2. Môi trường thử nghiệm khả năng phân giải cellulose (MT2)............... 22
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
3.4. Phương pháp nghiên cứu: ........................................................................ 22
3.4.1. Tiến hành phân lập vi khuẩn ................................................................. 23
3.4.2. Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập .............................. 25
3.4.3. Xác định khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn ........... 25
3.4.4. Đo mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD ........................................ 28
3.4.5. Phương pháp thử khả năng phân giải cellulose bằng phương pháp đục
lỗ thạch trên môi trường thử nghiệm. ............................................................. 29

3.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn .................................................................................... 30
3.4.7. Định danh vi khuẩn ............................................................................... 32
3.4.8. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng
vi sinh vật (nấm mốc) ...................................................................................... 32
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 34
4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
cellulose ........................................................................................................... 34
4.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn ................................................................. 34
4.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose ........ 37
4.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện môi trường ................................................ 41
4.2.1. Thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon ................................................. 41
4.2.2. Thử khả năng đồng hóa nguồn nitơ ...................................................... 43
4.3. Định danh sơ bộ vi khuẩn. ....................................................................... 46


vii

4.4. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi
sinh vật khác (nấm mốc) ................................................................................. 47
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 48
5.1. Kết luận .................................................................................................... 48
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 48
PHỤ LỤC


1

Phần 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, ngành Công nghệ Sinh học đang phát triển rất mạnh mẽ, các
chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu
hết các lĩnh vực của đời sống như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông
nghiệp, chăn nuôi, y tế [26, 27]. Một số enzyme được sử dụng phổ biến hiện
nay như protease, amylase, pectinase, glucooxydase, cellulase. Trong số đó
cellulase là enzyme nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì
chúng có thế ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau như trong q trình
chuyển hóa chất liệu chứa cellulose, công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt,
bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trường [7, 23].
Đặc biệt trong ngành công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học, cellulase đang
được nghiên cứu và phát triển để giải quyết vấn đề thiếu nhiên liệu khi các
nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt và giải quyết vấn đề ô
nhiễm môi trường [28].
Nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản
xuất enzyme cellulase là rất phong phú, khoảng một nửa hợp chất cacbon
trong sinh khối trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 35-50% lượng sinh khối
thực vật. Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ được khống hóa nhờ hệ thống enzyme
được cung cấp bởi vi sinh vật. Hệ thống phân giải cellulose thường chậm và
khơng hồn tồn. Tuy nhiên trong khoảng thời gian ngắn (48h) hệ vi sinh vật
trong dạ cỏ (vi khuẩn kỵ khí) có thể phân giải 60 - 65 % cellulose [4]. Vì thế,
việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại
Việt Nam hiện nay đã và đang rất được quan tâm.


2

Từ những luận điểm trên chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng
dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường”.

1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu những lồi vi khuẩn có khả năng
phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại, ứng dụng sản xuất chế phẩm
sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dịch dạ cỏ
động vật nhai lại.
- Tối ưu hóa điều kiện lên men để thu sinh khối và thu chế phẩm
enzyme.
- Định danh sơ bộ về chủng vi khuẩn mà mình phân lập được dựa vào
đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải…
- Thử khả năng khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
với các chủng vi sinh vật khác.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào
nghiên cứu khoa học.
- Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế
phẩm sinh học trong bảo vệ môi trường.
- Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose
2.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật [12]
Vi sinh vật là một thế giới sinh vật vô cùng nhỏ bé mà ta không thể
quan sát bằng mắt thường. Nó phân bố ở khắp mọi nơi, trong đất, trong nước,
trong khơng khí, trong thực phẩm…
Vi sinh vật đóng vai trị vơ cùng quan trọng trong thiên nhiên cũng như
trong cuộc sống của con người, từ xa xưa, con người ta đã biết sử dụng vi
sinh vật trong đời sống hàng ngày như làm dấm, làm tương, muối chua thực
phẩm và các quá trình làm rượu. Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi
sinh vật thì nó được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả hơn, ví dụ như chế vacxin
phịng bệnh, sản xuất kháng sinh và các dược phẩm quan trọng khác, vi sinh
vật được ứng dụng trong bảo vệ môi trường, chế tạo phân bón sinh học thuốc
bảo vệ thực vật không gây độc hại cho môi trường, bảo vệ cân bằng sinh thái.
Ngồi những vi sinh vật có lợi cịn có một số vi sinh vật gây hại gây bệnh cho
người, động vật, thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô
nhiễm các nguồn nước, đất và khơng khí…
• Định nghĩa
Vi sinh vật là những cơ thể vô cùng nhỏ bé, mà mắt thường không nhìn
thấy được, chỉ có thể quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi.
• Ứng dụng của vi sinh vật.
- Trong lĩnh vưc y tế: công nghệ vi sinh đã đóng góp trong việc tìm
kiếm nhiều loại dược phẩm quan trọng, chuẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh
hiểm nghèo cho con người, gia súc, gia cầm như vacxin, insulin, interferon,
chất kháng sinh.


4

- Trong lĩnh vực nông nghiệp: cải tạo giống cây trồng, sản xuất chế
phẩm (phân bón), sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong bảo vệ thực vật.

- Trong lĩnh vực bảo quản chế biến: hệ vi sinh vật trong thực phẩm và
công nghệ bảo quản chế biến thực phẩm.
- Trong lĩnh vực công nghiệp: ứng dụng vi sinh vật lên men, nhân sinh
khối tế bào sản phẩm như sản xuất protein đơn bào, sản xuất bột ngọt, bia,
rượu, cồn, nước ngọt có ga.
- Trong vấn đề năng lượng và bảo vệ môi trường: sản xuất cồn làm
nguồn năng lượng thay xăng dầu chạy xe các loại, tạo khí sinh học (biogas),
trong bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong xử lý
phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi
trường.
Trong vấn đề bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực
trong việc xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước
thải, làm sạch môi trường. Đây là vấn đề cấp thiết trên toàn cầu hiện nay.
2.1.2. Vi khuẩn phân giải cellulose
2.1.2.1. Dạ cỏ động vật nhai lại
Dung tích dạ cỏ khoảng 60÷100 lít, niêm mạc dạ cỏ có nhiều gờ nổi lên
làm tăng thêm diện tích. Dạ cỏ khơng có tuyến bài tiết HCL và dịch vị mà
chỉ tiết dịch nhày. Tiêu hóa trong dạ cỏ chủ yếu nhờ enzyme của vi sinh
vật cư trú trong đó.
Mơi trường dạ cỏ với các đặc điểm thiết yếu cho sự lên men vi sinh vật
đó là: có độ ẩm cao (80-90%), độ pH cao (6,4-7,5), độ pH dạ cỏ tương đối ổn
định, luôn luôn được đệm bởi bicarbonate và phosphates của nước bọt, nhiệt
độ khoảng 39-410C, luôn luôn được nhào trộn bởi sự co bóp của dạ cỏ, dịng
dinh dưỡng lưu thơng liên tục. Sản phẩm cuối cùng của q trình lên men ra
khỏi dạ cỏ và các cơ chất được nạp vào thông qua thức ăn ăn vào hàng ngày,


5

có sự chế tiết vào dạ cỏ những chất cần thiết cho vi sinh vật phát triển và

khuếch tán ra ngoài những sản phẩm tạo ra trong dạ cỏ. Ðiều này làm cho áp
suất thẩm thấu của dạ cỏ luôn ổn định. Thời gian thức ăn tồn lưu trong dạ cỏ kéo
dài tạo điều kiện cho vi sinh vật công phá. Những điều kiện đó là lý tưởng
cho sự phát triển của vi sinh vật dạ cỏ. Ðiều này được đánh giá bởi sự
phong phú về chủng loại và mật độ vi sinh vật. Mơi trường dạ cỏ được kiểm
sốt và điều khiển bởi nhiều yếu tố như: số lượng và chất lượng thức ăn ăn
vào, nhào trộn theo chu kỳ thơng qua co bóp dạ cỏ, nước bọt và nhai lại,
khuyếch tán và chế tiết vào dạ cỏ, hấp thu dinh dưỡng từ dạ cỏ, chuyển dịch
các chất xuống bộ máy tiêu hóa [1].
2.1.2.2. Hệ vi sinh vật dạ cỏ
Hệ vi sinh vật cộng sinh trong dạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và
thường gọi chung là vi sinh vật dạ cỏ. Hệ vi sinh vật dạ cỏ gồm có 3 nhóm
chính là: vi thực vật, nấm v vi ng vt.
ã Vi ng vt: s lng 200.000ữ2.000.000/ml, chủ yếu là động vật
nguyên sinh, quan trọng nhất là lớp tiên mao trùng, giống Entodinium
diplodinium có số lượng lớn nhất.
• Nấm: gồm nấm men và nấm mốc, nấm kỵ khí ở dạ cỏ như:
Caecomyces communis, Neocallimastix frontalis, Neocallimastix patriciarum,
Piromyces communis.
• Vi thực vật: chủ yếu là các vi khuẩn, chúng có tới trên 200 lồi, số
lượng lớn, 109 vi khuẩn trên 1 gam chất chứa trong dạ cỏ.
Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi cịn non, mặc
dù chúng được ni cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng. Thông thường vi
khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính
trong q trình tiêu hóa xơ. Tính từ năm 1941 là năm Hungate cơng bố những
cơng trình nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật dạ cỏ đến nay đã có tới hơn 200


6

lồi vi khuẩn dạ cỏ đã được mơ tả (Theodorou và France, 1993). Tổng số vi
khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ.
Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoảng 25-30%, số còn lại bám vào
các mẩu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa.
Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà
vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng. Sau đây là một
số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính:
- Vi khuẩn phân giải cellulose.
- Vi khuẩn phân giải hemixenlulose.
- Vi khuẩn phân giải gluxit.
- Vi khuẩn phân giải ure và vi khuẩn sử dụng NH3.
- Vi khuẩn sử dụng các axit hữu cơ tạo ra trong dạ cỏ.
- Vi khuẩn phân giải protein và dẫn xuất của protein.
- Vi khuẩn tạo metan (CH4).
- Vi khuẩn tổng hợp vitamin (B12).
Sự phân chia cũng chỉ là tương đối vì nhiều loại vi khuẩn có khả năng
phân giải nhiều cơ chất khác, ngồi khả năng phân giải chúng còn tổng hợp
chất dinh dưỡng khác nhau cho bản thân chúng mà cuối cùng là nguồn dinh
dưỡng cho động vật nhai lại [1].
Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm có số lượng rất lớn trong dạ
cỏ của những gia súc sử dụng khẩu phần giàu cellulose. Những loài vi khuẩn
phân giải cellulose như là:
Vi khuẩn hảo khí:
- Bacillus criculans
- Bacillus subtilis
- Cellulomonas fimi
- Cellvibrio gilvus


7

- Microbispora bispora
- Pseudomonas fluorescens
Vi khuẩn kỵ khí:
- Actovibrio cellulolyticus
- Clostridium cellulovorans
- Clostridium thermocellum
Vi khuẩn ở dạ cỏ:
- Butyrivibrio fibrisolvens
- Fibrobacter succinogenes
- Ruminococcus albus
Người ta dự đoán rằng 70% các vi khuẩn trong dạ cỏ vẫn chưa được
xác định [7].
2.1.2.3. Tác dụng tiêu hóa của vi sinh vật dạ cỏ [1]
- Tiêu hóa cơ học: tiên mao trùng cắn xé thức ăn thành từng mảnh nhỏ,
tạo điều kiện cho vi khuẩn phân giải tiếp theo.
- Tiêu hóa hóa học: chủ yếu do tác dụng của các enzyme do vi khuẩn
và một số tiên mao trùng tiết ra.
- Tiêu hóa gluxit: vi sinh vật trong dạ cỏ có hệ enzyme tiêu hóa gluxit
như: amilaza, mantaza…
- Tiêu hóa protein và nitơ-phi protein trong dạ cỏ: trong dạ cỏ vi sinh
vật phân giải protein tạo ra peptit, axit amin và cuối cùng là ammoniac (NH 3),
sau đó sử dụng NH3 để tổng hợp protein của bản thân vi sinh vật.
- Tiêu hóa cellulose và hemicellulose (xơ):
+ Cellulose là một pilisaccarit gồm 2000÷4000 phân tử β-D-glucose tạo
thành. Trong thành phần của tế bào thực vật thì cellulose chiếm 20÷40%,
hemicellulose chiếm 10÷40%.


8

+ Hemicellulose do các đường đơn arabinose, galactose, ksilose, axit
glucoronic, manose và ramnose tạo thành. Vi sinh vật có enzyme cellulase
phân giải xơ (các vật ni khác khơng có enzyme này).
+ Hệ enzyme phân giải xơ gồm: enzyme nội bào phân giải xơ tự nhiên,
enzyme ngoại bào phân giải xơ hịa tan
Q trình phân giải xơ gồm 3 giai đoạn chính:
Cellulose => cellobiose
Cellobiose => glucose
Glucose => axit béo bay hơi (axit axetic, propionic, butyric và valeric)
Tỉ lệ tiêu hóa xơ trong dạ cỏ từ 30÷80%. Tùy thuộc vào mức độ lignin
hóa của thức ăn. Cỏ non có tỉ lệ tiêu hóa cao, rơm rạ, cỏ già hàm lượng lignin
cao thì tỉ lệ tiêu hóa thấp hơn.
2.2. Enzyme từ vi sinh vật
2.2.1. Giới thiệu chung về cellulose
Trong tự nhiên, cellulose là một pholysaccarit có số lượng nhiều nhất,
chiếm ½ tổng lượng hydrocacbon hữu cơ trong sinh quyển, gặp phổ biến ở
thực vật là thành phần chủ yếu của tế bào thực vật. Thông thường cellulose
của thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất chúng ta. Hàng
ngày hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy lại trong đất do các sản
phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống. Một
phần không nhỏ là do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn
cưa…Nếu khơng có q trình phân giải của vi sinh vật thì lượng chất hữu cơ
khổng lồ này sẽ tràn ngập trái đất [8].
Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật cellulose có cấu tạo dạng
sợi, các sợi cellulose trong tự nhiên thường chứa khoảng 10.000-12.000 gốc
gluco, các sợi này liên kết thành bó sợi gọi là microfibrin [6].


9

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử cellulose [6]
Cellulose có cấu trúc phân tử là 1 polymer mạch thẳng. Mỗi đơn vị là
một disaccarit gọi là cellobiose. Cellobiose có cấu trúc từ 2 phân tử Dglucose. Cấu trúc bậc 2 và 3 rất phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với
nhau bằng lực liên kết hydro. Liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền
vững, bởi vậy cellulose là hợp chất khó phân giải. Dịch tiêu hóa của người và
động vật khơng tiêu hóa được chúng. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người
thải ra các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật để lại trong môi trường
lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm,
xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ
phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007) động vật
nhai lại tiêu hóa được cellulose là nhờ khu hệ vi sinh vật sống trong dạ cỏ [8].
2.2.2. Enzyme cellulase
2.2.21. Giới thiệu chung [16]
Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thơng
qua việc thủy phân liên kết -1,4-glucoside trong cellulose. Cellulase có khả
năng thủy phân cellulose thành đường. Con người và động vật khơng có khả
năng phân giải cellulose. Phương pháp tìm chế phẩm cellulase còn hạn chế.
Chế phẩm Cellulase thường được dùng để:
- Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc.
- Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.


10

Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Đây là
enzyme được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase.
2.2.2.2. Nguồn gốc của enzyme cellulase [29]
- Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…
- Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa

mì, mạch đen…
- Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật.
Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:
- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae…
- Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticul…
- Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…
Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 - β-D-glucoside) tạo ra sản
phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides.
2.2.2.3. Phân loại enzyme cellulase.
Có 3 loại enzyme cellulase chính: [20, 21, 22]
- Cellulobiohydrolase: enzyme này cắt đầu không khử của chuỗi
cellulose để tạo thành cellobiose. Khối lượng phân tử của các enzyme thuộc
nhóm này trong khoảng 53-75 kDa. Các enzyme này khơng có khả năng phân
giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng.
- Endo- β-D-cellulase: có khối lượng phân tử trong khoảng 42-49 kDa.
Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4
glucoside trong cellulose trong lichenin và β-D-glucan. Sản phẩm của quá
trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose.
- β-glucosidase: có khả năng hoạt động ở PH rất rộng (pH 4,4-4,8),
khối lượng phân tử trong khoảng 50-98 kDa. β-glucosidase tham gia thủy
phân cellobiose tạo thành glucose.


11

Cellulose có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự
nhiên, trong đó có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc
và một số loại nấm men. Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước,
hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất

các chế phẩm enzyme.
2.2.2.4. Cấu trúc của enzyme cellulase
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin,
các axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH-. Ngồi ra, trong
cấu trúc cịn có những phần phụ khác. Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại
enzyme nhóm endoglucanase và exoglucanase giống nhau trong hệ cellulase
của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này
xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi
là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng này có
vai trị tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong q trình phân hủy cellulose
có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các
enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của
cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với
cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh
thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện
việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellulose
có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều
dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme [9,
18, 19].
2.2.3.5. Tính chất của enzyme cellulase.
Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như
carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC).


12

Cellulase cắt liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose, lichenin và các β-Dglucan của ngũ cốc.
Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau, cellulase hoạt
động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5. Nhiệt độ tối ưu từ 40500C, hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong 10 đến 15 phút.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose,

cellubiose và bị ức chế hồn tồn bởi Hg. Ngồi ra, cellulose cịn bị ức chế
bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng thay đổi từ 30-110 KDa
(Begunin, 1990, Gilkes và cộng sự, 1991).
2.2.2.6. Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong
điều kiện hiếu khí và yếm khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt. Các loài vi sinh vật
thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số
lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện
tự nhiên rất phong phú, chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn được tìm
thấy nhiều trong đất, nước, đường tiêu hóa một số động vật và trong một số
trường hợp các nhà khoa học cịn thấy cả nấm men cũng tham gia q trình
phân giải cellulose [4].
Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose đã được nghiên cứu
được trình bày ở bảng sau:


13

Bảng 2.1: Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose [7]
Nấm mùn mềm

Vi khuẩn hảo khí

Aspergillus niger

Bacillus circulans

Chaetomium cellulolyticum

Bacillus subtilis

Fusarium oxysporum

Cellulomonas fimi

Neurospora crassa

Cellvibrio gilvus

Penicillium pinophilum

Microbispora bispora

Trichoderma reesei

Pseudomonas fluorescens

Nấn mùn nâu

Vi khuẩn kỵ khí

Coniophora puteana

Acetovibrio cellulolyticus

Lanzites trabeum

Clostridium cellulovorans

Poria placenta

Clostridium thermocellum

Tyromyces palustris
Nấm mùn trắng

Vi khuẩn ở dạ cỏ

Phanerochaete chrysosporium

Butyrivibrio fibrisolvens

Sporotrichum thermonphile

Fibrobacter succinogenes

Coriolus versicolor

Ruminococcus albus

Nấm kỵ khí ở dạ cỏ

Xạ khuẩn

Caecomyces communis

Streptomyces lividans

Neocallimastix patriciarum

Thermoactinomyces curvata

Neocallimastix fontalis

Thermomonospora fusca

Piromyces communis


14

2.2.2.7. Cơ chế tác động
Cellulose là một cơ chất không hịa tan, khó phân giải vì vậy muốn
phân giải được cellulose các loại vi sinh vật phải tiết ra men cellulase. Men
cellulase là men ngoại bào [12].
Hệ enzyme cellulase bao gồm 4 enzyme khác nhau. Enzyme C 1 có tác
dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng cellulose tự nhiên có cấu hình khơng
gian thành dạng cellulase vơ định hình, enzyme này gọi là Cellobiohydrase.
Enzyme thứ 2 là Endoglucanase có khả năng cắt đứt các liên kết β-1,4 bên
trong phân tử tạo thành những chuỗi dài. Enzyme thứ 3 là Exo-gluconase tiến
hành phân giải các chuỗi trên thành disaccarit gọi là cenlobiose. Cả 2 loại
enzyme Endo và Exo-gluconase được gọi là Cx. Enzyme thứ 4 là βglucosidase tiến hành thủy phân cellobiose thành glucose.
Cellulose
(tự nhiên)

C1

Cellulose

Cx

Cellobiose

β-glucosidase

Glucose [8]

(vơ định hình)

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme
cellulase endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Thiếu một trong ba
loại enzyme trên thì khơng thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng. Từ
những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác
động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa
ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy
cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách giải
thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, nhiều tác giả đã trình bày sơ
đồ quá trình phân giải cellulose nhờ men (Mandes và Recse (1964); Ogawa,
Toyam (1964); Iwasaki, Hayoshi, Walabayais, Nisizwa (1964); Funata
(1965); King (1965) và Srinivasan (1973) [6].


15

Hình 2.2: Sơ đồ phân giải cellulose của Srinivasan, 1973 [6].
- A: ở nấm Trichodesma viride
- B: ở vi khuẩn Cellvibriofuvus
- C: ở nhiều vi sinh vật khác
2.3. Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải
Hiện nay rác thải sinh hoạt và phế thải, nước thải nơng nghiệp, cơng

nghiệp là một thảm họa khó lường trong sự phát triển mạnh mẽ của quá trình
sản xuất, cơng nghiệp và hoạt động của tồn xã hội, phế thải không chỉ làm ô
nhiễm môi trường sinh thái, ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm đất, gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến sức khỏe của con người, vật nuôi và cây trồng.


16

Việt Nam là nước nơng nghiệp có nguồn phế thải rất lớn, rất đa
dạng, nhưng người ta xếp thành 3 nhóm sau: phế thải hữu cơ, phế thải rắn,
phế thải lỏng.
Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất
thải. Trong các chất thải hữu cơ có nguồn gốc thực vật, cellulose chiếm
khoảng 50%. Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất
khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên. Nếu để các chất hữu cơ phân hủy
trong điều kiện tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu (khoảng hơn tám tháng
ở điều kiện khí hậu nhiệt đới), tuy nhiên nếu bổ sung vi sinh vật giàu cellulase
thì thời gian phân hủy sẽ rút ngắn chỉ còn khoảng một tháng. Điều này rất có
ý nghĩa trong việc bảo vệ mơi trường (hạn chế sự ơ nhiễm nước, khơng khí và
đất) đồng thời thúc đẩy q trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Ngoài
việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các
chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu
và sản xuất [10].
Thành phần của rác thải hữu cơ: các chất hữu cơ trong rác thải là các
phần của thực vật, động vật bị loại bỏ, chúng có chứa các thành phần như
trong cơ thể sinh vật bị loại bỏ, trong đó quan trọng nhất là: hydratcacbon,
protein, lipit.
- Các hydratcacbon: chiếm tỷ trọng lớn nhất trong sinh khối động vật,
thực vật, vi sinh vật. Chúng tương đối phức tạp và khó phân hủy. Trong rác
thải thường gặp các loại như: cellulose, hemincellulose, ligin, tinh bột, pectin.

- Protein: là hợp chất hữu cơ cao phân tử chứa nitơ, thường chứa 15% 17% nitơ, là phần quan trọng trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật.
- Lipit: lipit là các chất sáp có nhiều trong cơ thể sinh vật [8, 11, 13].