Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học

Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việc
sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụng
trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh. Lý do đơn giản là
con người đã hiểu được mặt trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những chất
này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn.
Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng những
chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá... Việc sử dụng
kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sự
kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng
hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong thịt dẫn
đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi.
Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực
tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng minh
được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh
trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại
những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh.
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường
tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi
và thủy sản.

1.2. MỤC ĐÍCH
1
Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus
acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng
thủy sản.
1.3. YÊU CẦU
1.3.1. Đối với Bacillus subtilis
 Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau để

xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và amylase
nhiều nhất.
 Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis .
 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.
1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus
 Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất.
 Tìm môi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và độ chua cao nhất.
 Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus.
 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.
Phần 2. TỔNG QUAN
2
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Lịch sử
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ
chức y học Nari của Đức. Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh
sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Năm 1949 – 1957 Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của
Bacillus subtilis. Từ đó “Subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa.
2.1.2. Phân loại và đặc điểm
2.1.2.1. Phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.1.2.2. Đặc điểm
Vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn
nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương (G
+

), kích
thước 0,5 - 0,8 µm × 1,8 – 3 µm. Đứng thành
chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử
nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm. Phát triển bằng
cách nảy chồi do sự nứt của bào tử. Chúng là loại vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho
sinh trưởng là 36 - 50
o
C, tối đa khoảng 60
o
C, bào tử chịu nhiệt khá cao. Nồng độ muối ăn
làm ngừng phát triển của Bacilluss subtilis là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000). Chúng
phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây).
Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine
nhanh chóng. Sữa cấy Bacillus subtilis trước tiên sau đó cấy men lactic trở nên acid
nhanh chóng hơn sữa chỉ cấy men lactic. Vi khuẩn tác động bằng protease làm hình
thành paraprotein từ casein, sữa cấy Bacillus subtilis bị kết tủa khi cho vào clorua calci
(Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
3
Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Bacillus subtilis có khuẩn lạc tròn, không
đều hay phân tán. Đường kính khuẩn lạc 3 – 5 mm, phát triển chậm, màu vàng xám ở
giữa sậm màu, rìa có răng cưa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
Trong môi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạo
thành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt.
Bacillus subtilis cho một số phản ứng sinh hóa:
• Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
• Indol (-), VP (+), nitrat (+), H
2
S (-), NH

3
(+), catalase (+), amylase (+), casein (+),
citrat (+), có khả năng di động và hiếu khí.
2.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC
Theo hệ thống phân loại của Bergey năm 1979 thì vi khuẩn lactic được phân loại như
sau:
Họ: Lactobacteriaceae
Họ phụ: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus
Leuconostoc
Họ phụ: Lactobacteriaceae
Giống: Lactobacterium
2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
2.2.1.1. Lịch sử
Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của
trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại
cũng như chức năng của vi khuẩn này.
Năm 1906 Metchnikoff xuất bản cuốn “The prolongation of life optinistic studies”.
Ông chứng minh rằng vi khuẩn lactic trong yoghurt bulgarian như là nhân tố chống lại sự
thối rữa ruột và sự lão hóa. Tuy nhiên sau đó người ta khám phá ra rằng chủng vi khuẩn
này không thể sống sót khi qua dạ dày và ruột. Do đó người ta nhanh chóng thay thế
chủng vi khuẩn này bằng chủng L. acidophilus như là một probiotic trong ruột. Họ thấy
rằng có rất nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dị hình sống trong ruột,
miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài Lactobacillus lên men
đồng hình tạo thành nhóm gọi là phức hợp Lactobacillus acidophilus.
4
2.2.1.2. Đặc điểm
Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi
khuẩn lactic. Chúng có dạng trực khuẩn
dài và chịu nhiệt. Tế bào hình que, đầu

tròn, kích thước 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm
đứng riêng rẻ, xếp thành đôi hay thành
chuỗi ngắn, không di động, không sinh
bào tử, tế bào non bắt màu Gram dương
khi nhuộm, tế bào già trở thành Gram âm.
Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37
o
C, không phát triển ở 20 - 22
o
C và 43 - 48
o
C.
Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạng
tròn, nhỏ ở giữa dày và đục hơn mép ngoài. Trong môi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ
và có hình dạng không ổn định. Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc khô, phát
triển kém và giới hạn theo vết cấy.
Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic trong môi trường, không phát
triển trong môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt trên môi
trường dịch thể cao nấm men.
L. acidophilus là một dạng probiotic được sử dụng thường xuyên nhất. Là vi khuẩn có
lợi cư trú trong ruột, âm đạo, trong phân người và động vật. Chúng có khả năng sinh
Bacteriocin là chất có hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột.
L. acidophilus có khả năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose,
mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol,
mannitol, sorbitol, inositol. Cho các phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate
(-), catalase (-), khả năng đông vón sữa (+).
2.2.1.3. Quá trình trao đổi chất
Hiện nay các thành viên của phức hợp Lactobacillus acidophilus được phân vào
nhóm lên men đồng hình bắt buộc. Hexose được lên men để tạo thành acid lactic theo
con đường EMP. Chúng có enzyme aldolase nhưng thiếu phosphoketolase, không lên

men gluconat và pentose. Tất cả các loài đều tạo đồng phân dạng D và L của acid lactic
(Lê Thị Hồng Tuyết, 2004).
5
Hình 2.2. Lactobacillus acidophilus
2.2.1.4. Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men
Trong quá trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có sự thay đổi sâu sắc các
loại đường, casein và các thành phần khác.
• Sự thay đổi đường sữa
Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa
lactose thành glucose và galactose. Lactase là một endoenzyme nên khi lactose muốn
được chuyển hóa thì phải qua màng vi khuẩn. Lactose sẽ được chuyển hóa theo hai con
đường:
 Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H
2
chuyển lactose thành glucose và galactose.
 Lactose được oxi hóa thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionat
sau đó phân giải tiếp thành gluconat và galactose qua một giai đoạn diễn biến phức
tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách.
• Sự thay đổi protein sữa
Trong quá trình lên men, lượng acid hữu cơ các loại càng tích lũy càng làm tăng quá
trình tách calci ra khỏi casein tạo pH đẳng điện. Do đó, casein bị vón lại làm tăng quá
trình lên men tạo pepton và các sản phẩm khác nhau.
6
Con đường chuyển hóa chủ yếu của quá trình lên men sữa
2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực
phẩm.
2.2.2.1. Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vị chua dễ chịu và có

đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch
quả, mứt. Chúng được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài ra còn
được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo.
7
+
CO
2
ADP
ATP
NAD
+
NADH
ATP
ADP
Glucose-6 phosphat
e
galactose
Lactose
glucose
ATP
ADP
Fructose-6 phosphat
1,3 diphosphoglycerat
Glyceraldehyd-3 phosphat
Fructose-1,6 phosphat
Dihydroxyaceton phosphat
acid pyruvic
Aldehyd acetic citric

+

2H
acid malic
-CO
2
Acetyl- CoA
acid propionic
Chu trình acid citric
Rượu etylic
acid malic
acid lactic
+2H
2.2.2.2. Trong nông nghiệp và môi trường
Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm gây bệnh
quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là
cơ hội gây bệnh cho cây trồng.
Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu nó bao gồm
80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là
cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường.
2.2.2.3. Trong y dược
Vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trong
phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa…
2.2.2.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm
Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để làm dưa
chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả. Dùng sản xuất tương, đậu
phụ hay lên men sữa chua.
2.3. KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật thì trong môi trường lên men phải có chứa đầy
đủ các thành phần sau (Lê Xuân Phương, 2001).
Glucid: Là nguồn dinh dưỡng quan trọng để vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi
chất xây dựng và đổi mới, ngoài ra glucid còn đóng vai trò chủ chốt trong việc tạo ra năng

lượng cho tế bào. Glucid thường được sử dụng dưới dạng dịch chiết có đường, mật rỉ, tinh
bột (phải thủy phân thành đường trước khi lên men).
Phosphat vô cơ: Đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi năng lượng và tổng hợp
acid nucleic. Trong lên men các muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphat
amon và phosphat kali.
Nitơ: Tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và chất có đặc tính sinh học
khác của tế bào vi sinh vật. Nitơ thường sử dụng trong lên men dưới dạng muối nitrat, các
hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn gốc vi sinh vật.
Các chất sinh trưởng và các nguyên tố vi lượng: Vitamin và các nguyên tố vi lượng
là những chất cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Chúng thường được sử dụng
với lượng nhỏ nhưng tác dụng rất lớn và đa dạng không thể thiếu được đối với hoạt động
sống bình thường của vi sinh vật.
8
2.3.1. Đối với Bacillus subtilis
2.3.1.1. Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cao
Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả
những chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy khi
tuyển chọn vi sinh vật phải tiến hành tìm kiếm, phân lập và lựa chọn hàng chục, hàng trăm
những giống vi sinh vật để có được những chủng có hoạt độ cao trong việc tạo thành những
enzyme cần thiết. Người ta thấy rằng enzyme thu nhận từ vi khuẩn có nhiệt độ tối ưu và khả
năng chịu nhiệt cao hơn enzyme thu nhận từ nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 1998).
Trong đất có rất nhiều bào tử và tế bào vi sinh vật trong số đó người ta nhận thấy rằng
vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp enzyme α-amylase và protease.
2.3.1.2. Nguyên liệu để sản xuất enzyme α-amylase từ vi khuẩn.
Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật là những nguyên liệu rẻ tiền và dễ
kiếm. Vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường
nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận α-amylase có thể dùng tinh bột,
maltose, saccarose, glucose và glycerin. Ngoài ra người ta còn cho thêm các acid amin ở
dạng phức hợp hoặc riêng từng cơ chất (pepton, protein thủy phân dịch chiết mầm

mạch, các acid amin...)
Nếu môi trường có CaCO
3
làm tác nhân điều chỉnh pH và pepton thì α-amylase được
tổng hợp gấp hai lần. Trong một phân tử gam α-amylase của Bacillus subtilis có 4g nguyên
tử calci. Trong thành phần dinh dưỡng ion Ca có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α-
amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease (Lương Đức
Phẩm, 1998).
Trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật sinh enzyme nói chung cần phải có mặt
của các nguyên tố khoáng trong các dạng muối magie, phospho, kali, và các ion mangan,
kẽm, và các nguyên tố vi lượng khác. Nồng độ thích hợp để tổng hợp α-amylase của
MnSO
4
là 0,05%. Thiếu muối α-amylase không được hình thành.
Hoạt độ α-amylase được nâng cao ở nồng độ KH
2
PO
4
là 1%. Ion Mg
2+
có tác dụng ổn
định amylase ở nhiệt độ cao.
Lưu huỳnh cũng có tác dụng đến sinh tổng hợp α-amylase. Các nguồn lưu huỳnh là các
acid amin (methionin, sistein, sistin) và các muối sunfat (trừ sunfat đồng), trong đó nguồn
lưu huỳnh tốt nhất là methionin.
9
2.3.1.3. Nguyên liệu để sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn
Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh protease thì cần phải có các chất cảm ứng, các
nguồn nitơ hữu cơ (bột ngô, bột đậu tương, bột mì, cám mì, mầm mạch, dịch chiết nấm men,
pepton, protein....). Vi khuẩn Bacillus subtilis tổng hợp protease có hoạt độ cao ở môi trường

có tinh bột, nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8 – 2% thì hoạt độ protease giảm vài lần.
Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ thì nguồn nitơ vô cơ cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng
hợp protease như HNO
3
, HNO
2
. Trong số các nguồn nitơ vô cơ ta chỉ thấy có phosphat
amon dibazic là tốt hơn cả. Những muối khác như NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
NO
3
, NaNO
3
,
KNO
3
, Ca(NO
3
)
2
làm giảm hoạt độ protease tới 30 – 50% còn α-amylase giảm tới 7 – 10
lần. Trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ thì hoạt độ protease và amylase cũng

thấp hơn trong môi trường đối chứng có (NH
4
)
2
HPO
4
và nước chiết đậu tương (Lương
Đức Phẩm, 1998).
Các acid amin ức chế đến tổng hợp enzyme protease ở Bacillus subtilis là methionin,
acid glutamic, alanin, leucin...
2.3.1.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển
trên bề mặt môi trường. Môi trường sử dụng là môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường
đặc (môi trường bán rắn).
Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn
cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy
từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Ở môi trường đặc để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường
người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Vi sinh vật sẽ phát triển
trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra
enzyme nội bào và ngoại bào. Độ ẩm thích hợp ở môi trường đặc là 55 – 65%.
Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ thường
xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý. Nhưng nhược điểm là tốn nhiều
diện tích và khó cơ giới hóa, tự động hóa.
Phương pháp nuôi cấy chìm
Phương pháp này người ta sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những
thùng lên men. Trong các thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống
10
cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống

điều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi trường làm
tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào vi sinh vật
đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh sản và phát triển, làm
tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật. Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn diện tích
và dễ cơ giới hóa nhưng có nhược điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát.
2.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus
2.3.2.1. Nhu cầu sinh trưởng
Lactobacillus acidophilus là loài vi hiếu khí nên có thể phát triển trong điều kiện hiếu
khí và trong điều kiện nuôi cấy tĩnh không lắc, ở điều kiện kị khí thì sự phát triển thích hợp
hơn. Chúng phát triển mạnh trong môi trường agar ở điều kiện khí chuẩn (5% CO
2
, 10% H
2
và 85% N
2
).
2.3.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng
Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus acidophilus phản ánh bản chất rất khó của
những vi khuẩn này. Môi trường nuôi cấy chuẩn thường rất giàu acid amin và vitamin như
pepton, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol,
monooleat (Tween 80), sodium acetat và muối magie kích thích sự tăng trưởng. Môi trường
nuôi cấy thường sử dụng là MRS lỏng (De Man, Rogosa và Sharpe).
2.3.2.3. Môi trường sản xuất
Trong sản xuất sinh khối người ta thường sử dụng sữa bò hay từ sữa đậu nành. Do
trong sữa bò và sữa đậu nành có nhiều casein và nhiều thành phần dinh dưỡng khác nhau:
Thành phần của sữa bò
Trong sữa bò gồm có thành phần chính là protein bao gồm casein, lactoalbumin,
lactoglobulin. Casein là loại protein phức tạp (phosphoprotein). Trong sữa ngưng kết
casein ở dạng phức chất caseinat-calci-phosphat.
Trong sữa tươi, casein ở dạng hòa tan là caseinogen, nếu sữa acid (pH = 4,5 - 4,7)

thì casein lắng xuống, sữa ngưng kết thành khối. Khi bị tác dụng của pepsin hay
chymozin thì casein chuyển thành dạng không hòa tan.
Trong sữa còn có triglyceric, acid béo bay hơi và acid béo không bay hơi chủ
yếu là acid oleic (40,6%), acid palmitic và stearic (50,9%), các glyceric khác chiếm
8,5%. Ngoài ra còn có vết lecithin, cholesterol (Trần Thị Dân, 2000).
11
Thành phần hóa học của sữa đậu nành
Trong đậu nành có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng nhưng người ta quan tâm nhiều
nhất là hàm lượng protein và lipid, nhóm glucid của đậu nành không thuộc loại có giá
trị cao về dinh dưỡng.
Protein đậu nành chiếm trên 40%, nó gấp 10 lần so với sữa, gấp 2 lần so với thịt bò.
Ngoài ra protein đậu nành còn có chứa đủ các acid amin thiết yếu như lysine,
methionin, isoleucin, tryptophan....
Lipid đậu nành chiếm 20%, chủ yếu chứa hai thành phần quý là trylycerid và
lecithin, hàm lượng acid béo không no cao (khoảng 85%), acid béo no thấp (15%).
Trong đậu nành còn chứa các vitamin A, E, K, B
1,
B
2
chiếm khoảng dưới 1% và các
khoáng chất chiếm khoảng 5% nhưng chất lượng dinh dưỡng của các khoáng chất từ
đậu nành thấp hơn so với các khoáng chất của động vật.
Ngoài ra trong đậu nành còn chứa một số chất không có lợi khác như chất ức
chế trypsin, chất này làm giảm sự sinh trưởng gây phình to tụy tạng động vật...
Những chất như hemaglutinins gây đông tế bào máu, cản trở sự hoạt động của hồng
cầu. Chất goitrogens gây phình to tuyến giáp, urease gây phân giải protein thành
amoniac gây độc cho cơ thể... Các chất độc này đa số tập trung ở màng ngoài của
hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2004).
2.3.2.4. Điều kiện sản xuất
Trước khi lên men, sữa phải được thanh trùng để loại bỏ những vi sinh vật tạp nhiễm

có trong sữa. Người ta thường sử dụng phương pháp Pasteur để thanh trùng sữa (65
o
C trong
30 phút hoặc 72 – 75
o
C trong 10 - 20 giây). Sau khi thanh trùng người ta cấy vi khuẩn lactic
vào sữa, lượng giống cho vào từ 5 - 10%. Sau một thời gian lên men thì sữa có độ chua khá
cao thường là 90 – 120
o
T (
o
T = độ chua Therne) và đông vón lại.
2.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PROBIOTIC (Trích dẫn của Lã Văn Kính, 1998).
2.4.1. Định nghĩa probiotic
Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô tả
những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được bắt
nguồn từ gốc Hylạp với nghĩa “tiền sự sống” (prolife).
Năm 1989 Fuller định nghĩa probiotic như là một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có
tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó.
12
Năm 1992 Havenar et al chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ở
những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông nới rộng định nghĩa probiotic
của Fuller như là một lứa cấy đơn hay hỗn hợp của các vi sinh vật sống mà chúng (dùng
áp dụng cho người và động vật) có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện
những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ.
2.4.2. Cơ chế tác động
2.4.2.1. Duy trì hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột
Động vật khỏe mạnh có hệ thống tiêu hóa hoạt động tốt. Đó là cơ sở cho sự chuyển
hóa có hiệu quả thức ăn cho duy trì và sản xuất. Đặc tính quan trọng nhất của đường
tiêu hóa hoạt động tốt là sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong nó. Vi khuẩn lactic có mặt

khắp đường ruột và trong một số điều kiện nó là vi khuẩn chiếm ưu thế (Fuller, 1977;
Jin et al,1997). Sự cân bằng trong đường ruột bị phá vỡ khi các động vật bị stress như
nhiệt độ cao, độ ẩm cao, thay đổi thức ăn, vận chuyển…Việc cho con vật ăn thường
xuyên probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật bằng hai con đường: Chống lại vi sinh vật
gây bệnh và bằng hoạt động đối kháng.
2.4.2.2. Hoạt động đối kháng
Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức chế sự
phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm. Chateau et al (1993) phân lập được
103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và
kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47% Lactobacillus của sản
phẩm A và 70% của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6 serotype E. coli.
Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L. acidophilus, L.
casei và L. faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella.
Jin et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát
triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E. coli .
Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và hydroperoxyd.
Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành phần protein sinh học
chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976).
Các chủng Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm
khác cũng sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al.,
1995). Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác.
Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp,
13
Salmonelle spp, E. coli và Staphylococcus spp. Vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng.
Vincent et al (1959) kết luận rằng L. acidophilus có thể đóng vai trò quan trọng trong việc
kiểm soát các vi sinh vật có hại trong đường ruột của gia súc và người.
Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối của
quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi do
Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm). Các sản
phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic, acetic (Trammer,

1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et al, 1952) Dahiafa và Speck,
1968); Price và Lee, 1970). Các acid acetic, lactic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh
vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick, 1972): Adams và Hall (1988)
phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộc vào độ pH. Nếu độ pH thấp sẽ tăng
mức độ acid ở dạng không hòa tan.
2.4.2.3. Sự loại trừ cạnh tranh
Fuller (1977) báo cáo rằng các chủng Lactobacillus 59 và 74/1 có khả năng giảm E.
coli trong diều và ruột non nhưng không làm giảm trong ruột già của gà.
Muralidhara (1977) tìm ra rằng tính đồng nhất của các mô bào ruột non được cung
cấp Lactobacillus lactic đã có nhiều Lactobacilli hơn và ít E. coli hơn các động vật
bình thường hoặc tiêu chảy.
Francis (1978) kết luận rằng việc thêm các chế phẩm Lactobacillus ở mức 75 mg/kg thức
ăn đã giảm đáng kể (p < 0,05) số lượng Coliform trong ruột non và ruột thừa ở gà tây.
Watkin (1982) và Miller (1983) đã thấy sự giảm đáng kể E. coli trong đường dạ dày
ruột của gà đã được cho ăn, uống Lactobacillus acidophilus.
Tuy nhiên có nhiều yếu tố cần phải lưu ý nếu muốn nhận được kết quả tốt khi sử dụng
probiotic. Trong đa số các trường hợp cần phải biết chắc chắn rằng các vi sinh vật cần
phải sống sót và phát triển trong đường ruột phải có khả năng sống trong môi trường pH
thấp và có khả năng chống lại tác dụng của mật. Để sống được trong đường ruột, các
chủng vi sinh vật cần có khả năng đính vào và sinh sôi nảy nở ở trên bề mặt của ruột non.
Mặc dù một vài tác giả đưa ra một số cơ chế giải thích tại sao vi sinh vật có lợi trong
đường ruột có thể ức chế sự thâm nhập của vi sinh vật có hại (Rolfe, 1991) nhưng cơ chế
chính xác của sự loại trừ cạnh tranh của vi sinh vật gây bệnh bằng probiotic vẫn chưa
được khẳng định. Trong số các cơ chế này có sự cạnh tranh về vị trí, cạnh tranh chất dinh
dưỡng, cạnh tranh về khối lượng các chất sinh ra bởi vi sinh vật.
14
2.4.2.4. Tăng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa
Hệ vi khuẩn đường ruột của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêu
hóa và hấp thụ thức ăn ăn vào của vật chủ. Chúng tham gia vào sự trao đổi chất của các
chất dinh dưỡng như là carbon hydrat, protein, lipid và khoáng. Các chất này cũng có

vai trò trong sự tổng hợp các vitamin. Nahashon et al (1992, 1993, 1994, 1996) phát
hiện rằng bổ sung lứa cấy Lactobacillus vào trong khẩu phần bắp/ lúa mạch/ đậu nành
đã kích thích tính thèm ăn và làm tăng tích lũy mỡ, nitơ, phospho, đồng và mangan cho
gà đẻ.
2.4.2.5. Sự trao đổi chất của vi khuẩn.
• Hoạt tính enzyme tiêu hóa.
Lactobacillus spp và Bacillus spp có khả năng sản xuất enzyme tiêu hóa trong điều
kiện thí nghiệm và trong ruột. Chúng làm tăng khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng
đặc biệt trong ruột dưới (March, 1979; Sison, 1989).
Những enzyme chúng tiết ra gồm: amylase, protease, và lipase…(Jin et al,1996).
Những enzyme này có hoạt tính phân giải tinh bột, lipid và protein (Moon và Kim, 1989;
Lee, 1990).
• Ngăn chặn sản sinh amoniac
Ngăn chặn sự sản sinh amoniac và hoạt động của urease có thể là có lợi để cải thiện
sức khỏe gia súc và làm tăng cường sinh trưởng của gia súc bởi vì amoniac được sản
sinh do sự phân giải urê trong màng nhày ruột non có thể gây nên một sự thiệt hại đáng
kể đến bề mặt của tế bào.
Chiang và Hsieh (1995) báo cáo rằng probiotic (chứa L. acidophilus, S. faecium và B.
subtilis) làm giảm nồng độ amoniac trong phân và chất độn chuồng của gà Broiler.
2.4.3. Vai trò của probiotic
Probiotic tác dụng rất có lợi đối với cơ thể con người và động vật như:
 Trung hòa độc tố ruột.
 Kích thích hệ thống miễn dịch, đặc biệt quan trọng trong sự phát triển khả năng
miễn dịch ở gia súc non chống lại những kháng nguyên có thể gây ra những phản
ứng viêm. (Perdigon et. al,1990).
 Khả năng gắn vào tế bào ruột nhằm loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân
gây hại.
 Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh.
15
 Tạo ra các acid, H

2
O
2
và các Bacterion chống lại sự phát triển của các tác nhân
gây bệnh.
 An toàn, không lan truyền rộng, không gây ung thư và không gây bệnh (Lê Thị
Hồng Tuyết, 2004).
 Giúp ích cho tiêu hóa thức ăn đặc biệt một số loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp
vitamin nhóm B, vitamin K… Có thể làm giảm cholestrol trong máu nếu sử dụng
liều cao và thường xuyên. Giúp cải thiện được tình trạng không sử dụng được
đường lactose. Gần đây nhất có nghiên cứu cho thấy người mẹ mang thai dùng
thuốc có chứa Lactobacillus, sau khi sinh tiếp tục dùng trong thời gian cho con bú
có thể giúp trẻ ngừa được một số bệnh dị ứng như eczema (Nguyễn Hữu Đức,
Thuốc và sức khỏe số 202, 2001).
2.4.4. Một số chế phẩm probiotic có chứa B. subtilis và L.acidophilus hiện nay
Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác
nhau. Những chế phẩm này được dùng trong chăn nuôi và thủy sản như:
• Enzymbiosub của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng để phòng và trị các
bệnh tiêu chảy cấp, mãn tính, rối loạn đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm và cá,
giúp tăng cường tiêu hóa, kích thích tăng trưởng.
• Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng kích
thích tôm, cá sử dụng triệt để nguồn thức ăn, giúp tôm, cá tiêu hóa tốt thức ăn và tăng trọng nhanh. Cải
thiện môi trường nước, kích thích tảo có lợi, phiêu sinh vật phù du có trong ao nuôi, tạo nguồn thức ăn
tự nhiên dồi dào cho tôm, cá. Ổn định hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột, lấn át, tiêu diệt các vi khuẩn
có hại. Phòng và điều trị có hiệu quả các bệnh đường tiêu hóa, bệnh phân trắng, bệnh nhiễm trùng
đường ruột cho tôm, cá…
• Baciflora For Shrimp của công ty liên doanh Bio – Pharmachemie có tác dụng
tượng tự như các chế phẩm trên.
• Vime-bactevit, của công ty Vemedim Vietnam được dùng cho cá, tôm cũng có tác dụng tương tự.
• Lactogen của công ty Gấu Vàng được dùng cho heo gà cũng có tác dụng tương tự.

• Ngoài các chế phẩm trong nước còn có rất nhiều loại chế phẩm của nước ngoài được
dùng trong chăn nuôi và thủy sản như: Protexin, Unleash, hay Florazyme efa ….
2.4.5. Một số đề tài đã nghiên cứu
2.4.5.1. Trong nước
• Theo Nguyễn Văn Đông (1993) đã khảo sát một số tính chất của vi khuẩn
Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl để phòng và trị bệnh tiêu
16
chảy cho heo con. Ghi nhận vi khuẩn Bacillus subtilis không có độc lực khi
truyền qua đường tiêu hóa, có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh:
Staphylococcus aureus, E.coli.
• Năm 2001, Đậu Ngọc Hào, Phạm Minh Hằng, Nguyễn Chí Quốc đã nghiên cứu
một số đặc tính trợ sinh học (probiotic) của Bacillus subtilis trong phòng bệnh
đường tiêu hóa của gà và ghi nhận rằng Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự
sinh trưởng và phát triển của E. coli invitro. Gà được ăn chế phẩm Bacillus
subtilis ở lượng 10
6
cfu/g có thể ổn định hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đặc biệt là
E. coli, và có thể tồn tại trong chế phẩm với thời gian bảo quản là 6 tháng.
• Tạ Thị Vịnh và cộng tác viên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm Vitom3
(Bacillus subtilis chủng VKPMV – 7092) để phòng trị bệnh phân trắng cho heo
con ghi nhận rằng Vitom3 có tác dụng kích thích tăng trọng, phòng bệnh heo
con phân trắng, tỷ lệ mắc bệnh giảm 11%, tỷ lệ khỏi bệnh 100% và không có heo
bị tái phát.
• Đinh Văn Cải, Phạm Hồ Hải và Võ Thị Hạnh (2004) đã nghiên cứu sản xuất và sử
dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ sung vào khẩu
phần ăn của bò vắt sữa và bê sau cai sữa đã kết luận rằng bê được bổ sung 50 gam
BIO-C tăng trọng cao hơn từ 48 – 49 g/ con/ ngày so với bê không bổ sung.
• Nguyễn Thị Lam Kiều, 2004 “Khảo sát đặc điểm sinh học của hai chủng Lactobacillus
trong men tiêu hóa” ghi nhận chúng có khả năng chịu được mật từ 0,2 – 0,6%, ức chế E.
coli và có khả năng sinh acid và tiêu thụ đường.

• Tăng Thị Rít, Nguyễn Thị Bích Thủy, Quan Quốc Đăng và Nguyễn Kim Trinh,
2004 đã tổng hợp chế phẩm sinh học SH bổ sung vào thức ăn tôm sú Penaeus
monodon nhằm kích thích tăng trưởng và tăng sức đề kháng bệnh đốm trắng. Kết
quả tỷ lệ pha trộn 1% chế phẩm vào thức ăn của tôm giúp tăng trọng hơn 10% và
tỷ lệ tôm sống sót trên 80% sau 30 ngày gây nhiễm nhân tạo bệnh đốm trắng so
với khoản 20% của lô không có bổ sung chế phẩm.
2.4.5.2. Ngoài nước
• Nhóm nghiên cứu của Alexopoulos (Đức) đã nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm
Bioplus 2B (chứa Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis) lên trình trạng sức
khỏe, tính năng sinh đẻ của heo nái và lên chất lượng thịt của heo thịt. Kết quả ghi
17
nhận được khi bổ sung chế phẩm Bioplus 2B cho heo nái con và mẹ làm hạn chế sự
giảm trọng lượng của heo mẹ trong thời kỳ tiết sữa (15,3 ± 3,6 đối với chế phẩm
Bioplus 2B so với đối chứng là 18,8 ± 3,1. Làm cải thiện các thông số của máu và
sữa (ngoại trừ lactose và chất rắn).
Ngoài ra nhóm nghiên cứu còn kết luận chế phẩm Bioplus 2B có ảnh hưởng đến
tình trạng sức khỏe và tính năng sinh sản của heo nái và làm tăng phẩm chất
quầy thịt ở heo đang lớn.
• Nhóm nghiên cứu của Sirirat Rengpipat (Thái Lan) về tác dụng của probiotic
trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) ghi nhận rằng Bacillus dòng S11 không
hạn chế quá trình nở của Artemia, làm tăng trọng lượng và chiều dài của ấu trùng
tôm (trọng lượng là 43,8 mg so với 26 mg so với đối chứng, chiều dài (cm) là 1,83 ±
0,31 so với đối chứng là 1,71 ± 0,2. Tôm có tỷ lệ sống sót cao (13% so với 4% đối
chứng) khi thử nghiệm với Virio harveyi (vi khuẩn gây bệnh phát sáng). Ngoài ra
nhóm còn kết luận Bacillus dòng S11 không có ảnh hưởng đến chất lượng nước
ao nuôi và Arterma là vật mang probiotic có hiệu quả.
2.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME
Enzyme hay còn gọi là “men” là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Chúng
có trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật. Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc
hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá

trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà nó còn xúc tác cho các
phản ứng ngoài tế bào “invitro”. Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme còn được gọi là
chất xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.
2.5.1. Enzyme amylase
18
Hình 2.3. Enzyme α-amylase
Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong
công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác trong đời sống.
Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm 1811 -
1814. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong
hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Cho mãi tới thời gian gần đây người ta mới
thu nhận amylase từ malt. Hiện nay người ta thu amylase từ canh trường vi sinh vật chủ yếu
là từ vi khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men (Nguyễn Quyết, 2004).
2.5.1.1. Đặc điểm enzyme α-amylase
Enzyme amylase có thể thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Hiện nay
người ta đã biết enzyme amylase được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp nhiều nhất, còn ở
các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn.
Các loại enzyme amylase thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α-amylase (α- 1,4
glucan-4-glucanhydrolase), ß-amylase (α-1,4glucan-4-maltohydrolase), γ-amylase
(glucoamylase). Trong đó vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tổng hợp nên α-amylase.
α-amylase thủy phân liên kết α -1,4 glucoside ở giữa mạch polysaccharide chính vì
thế nhiều tài liệu còn gọi chúng là endoamylase.
Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt bị
giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các loại amylase khác. Khi có mặt ion
calci cấu trúc của α-amylase sẽ bền hơn, và kém bền trong môi trường acid.
Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản ứng này bao
gồm: dextrin (trong đó chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp), maltose, glucose.
α-amylase từ nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, song chúng đều có
khá nhiều tyrosin và tryptophan còn methionin rất ít và chỉ có khoảng 7 - 10 gốc cystein.
α-amylase của Bacillus subtilis không có các liên kết disulfit và disunithidin. Hoạt độ

của chúng có liên quan mật thiết với sự có mặt của ion calci trong phân tử vì ion này được
dùng để duy trì hình thể hoạt động của enzyme, từ đó nó có vai trò quan trọng trong việc ổn
định hoạt tính của enzyme và tăng cường độ bền của α-amylase trước các tác nhân gây biến
tính và tác dụng phân hủy protease.
Phản ứng thủy phân tinh bột bằng α-amylase thường xảy ra hai giai đoạn:
• Giai đoạn đầu: Chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ
tinh bột giảm nhanh, người ta gọi đây là giai đoạn dịch hóa.
19
• Giai đoạn 2: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành. Nhờ đó
tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử
thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu
thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iốt và một ít maltose.
Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế
phẩm amylase từ Bacillus subtilis là giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2. Còn số
liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6 – 7, bị vô hoạt hoàn
toàn ở pH = 1 và bị vô hoạt một phần ở pH = 8.
2.5.1.2. Ứng dụng của α-amylase
Amylase là một trong những enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh
học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược
phẩm, lên men, công nghiệp dệt, sản xuất giấy và trong nông nghiệp.
 Trong công nghiệp rượu – bia
Vài chục năm trở lại đây chế phẩm amylase từ nấm mốc (Aspergillus oryzae, Asp.
awamori,…) hoặc từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus) được thay thế malt
(đại mạch nảy mầm) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ
nguyên liệu có tinh bột.
 Trong sản xuất bánh mì
Khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng
của bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng, độ xốp của bánh mì.
 Trong công nghiệp dệt
Chế phẩm amylase được dùng để rủ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải

mộc thường chứa 5% tinh bột và nhiều tạp chất khác. Để làm vải mềm, có khả năng
nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt thì phải tách tinh bột và người ta thường sử dụng
enzyme amylase từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus mesentricus) hay từ nấm mốc.
Khi rủ hồ vải thì lượng chế phẩm tính cho dung dịch là 0,3 – 0,6g. Nhiệt độ xử lý là
90
o
C, thời gian từ 5 – 15 phút.
 Trong sản xuất thức ăn gia súc
20
Sử dụng amylase của Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay B. subtilis thêm
vào thức ăn giàu tinh bột của động vật nhất là động vật còn non làm tăng khả năng đồng
hóa thức ăn dẫn đến tăng trọng nhanh.
 Trong nghiên cứu sinh học
Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng của
amylase. Một dung dịch bền vững chứa α-amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide
phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao.
2.5.2. Enzyme protease
2.5.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong
tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp
protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn, Str. griseus, Str. rimosus… và
một số loài nấm mốc Asp. oryzae, Asp. niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.5.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật
cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,
… các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau:
• Protease – xerin
• Protease – tiol
• Protease – kim loại
• Protease – acid

Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm
dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm:
• Protease acid: pH < 3 được ứng
dụng trong sản xuất bia và công
nghiệp bánh kẹo.
• Protease trung tính: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH
hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
thermoproteolyticus.
• Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm hoạt
động của chúng có serine.
21
Hình 2.4. Enzyme protease
Trong bốn nhóm kể trên, các protease-xerin và protease-tiol có khả năng phân giải
liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các
protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với
các dẫn xuất của aminoacid.
Các protease-xerin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000 - 27.000 dalton, trọng
lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin vào khoảng 33.800 -
48.400 dalton. Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng
30.000 – 40.000 dalton.
Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng
cho từng nhóm còn có một số gốc aminoacid khác. Ví dụ histidin thường tham gia trong
trung tâm hoạt động của các proteae-xerin, protease tiol còn tyrosin là trung tâm hoạt
động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật
có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:
E + S E – S E – S’ + P
1
E + P
2

Trong đó:
E – là enzyme, S – là cơ chất.
E - S – là phức chất enzyme – cơ chất
E - S’ – là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hóa (axilenzyme).
P
1
– là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amine tự do mới được tạo thành)
P
2
– là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành).
2.5.3. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme
Hiện nay người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt
độ hoạt động của enzyme. Ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác
định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm
cơ chất sau một thời gian phản ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.5.3.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme
Hiện nay người ta sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năng
xúc tác của enzyme:
• Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một
thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước.
22
• Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định
của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định.
• Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu
được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
2.5.3.2. Đơn vị hoạt độ
Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme.
Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt độ. Người ta biểu diễn
đơn vị hoạt độ qua những đơn vị:

• Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI)
• Đơn vị Katal (Kat)
• Đơn vị hoạt độ riêng
• Đơn vị hoạt độ riêng phân tử
• Ngoài ra còn có nhiều cách biểu thị đơn vị hoạt độ của enzyme như: đơn vị
Wohgemuth cải tiến (MWU), đơn vị SKB, GAU, NU, HU, AU...
Các đơn vị hoạt độ này được trình bày chi tiết ở mục 3.7 phần phụ lục.
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
23
Khóa luận được thực hiện từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 tại phòng thí nghiệm Vi
Sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Giống vi khuẩn
Chế phẩm chúng tôi sản xuất sử dụng hai loại vi khuẩn:
• Bacillus subtilis ATCC - 6633 được cung cấp từ khoa Công Nghệ Sinh Học
trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh.
• Lactobacillus acidophilus được phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc
sản xuất.
3.2.2.Thiết bị - dụng cụ
• Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, giá đỡ ống nghiệm, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, giấy đo
pH, kính hiển vi, cân, máy lắc, đường kế, bếp điện…
• Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, pipet, micropipet, đầu type vô trùng,
que cấy trang, đũa thủy tinh, khăn giấy…
3.2.3. Hóa chất
• Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, fushin, lugol…
• Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH 1N, HCl 1N, H
2
O
2

30%, dầu soi kính, cồn...
• Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt 0,02%, dung
dịch casein 0,1%...
3.2.4. Môi trường nuôi cấy
3.2.4.1. Đối với Bacillus subtilis
• Môi trường tăng sinh nutrien broth (NB)
• Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào nutrien agar (NA)
• Môi trường nhân giống cấp1: môi trường Frage, môi trường pepton – gelatin,
môi trường chứa mật rỉ đường + 2 % tinh bột, môi trường Edward và môi
trường Nomura.
• Môi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì…
Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục.
3.2.4.2. Đối với Lactobacillus acidophilus
• Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSB
24
• Môi trường phân lập MRSA
• Môi trường nuôi cấy và thử các phản ứng sinh hóa
• Môi trường sản xuất: môi trường sữa đặc có đường và môi trường sữa đậu nành.
Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục.
3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3.1. Đối với Bacillus subtilis
3.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi
trường nhân giống cấp 1
Cách tiến hành:
Giống gốc chứa Baclillus subtilis được tăng sinh trong môi trường NB có pH = 7
trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37
o
C. Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh này vào từng
loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột 2%, và pepton-gelatin
với các điều kiện khảo sát:

• Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
• Lượng giống: 5%
• pH = 7
• Thời gian nuôi cấy là 48 giờ
• Nhu cầu oxi: sử dụng máy lắc
Sau 48 giờ nuôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase
và protease.
Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trực tiếp trên lame
(được trình bày ở mục 3.6 phần phụ lục)
Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:
o Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth (xem mục 3.1
phần phụ lục)
o Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld (Xem mục
3.2 phần phụ lục)
25