Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rpl16 ở một số mẫu giống nghệ (curcuna longa l ) có hàm lượng curcuminoids khác nhau

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÃ HỮU DŨNG

“NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN
RPL16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (CURCUNA LONGA L.)
CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC NHAU”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÃ HỮU DŨNG

“NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN
RPL16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (CURCUNA LONGA L.)
CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC NHAU”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Lớp
Khóa học
Giáo viên hƣớng dẫn

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: K43 - CNSH
: 2011 - 2015
: 1. TS. Nguyễn Văn Khiêm
2. TS. Nguyễn Văn Duy

Thái Nguyên, năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt
nghiệp em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân
tích gen rpl16 ở một số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lƣợng
curcuminoids khác nhau”.
Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy TS. Nguyễn Văn
Khiêm và TS. Nguyễn Văn Duy đã luôn tận tình hướng dẫn giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn thầy cô trong Khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học
trong suốt thời gian thực tập.
Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị trong Bộ môn giống và Công
nghệ sinh học cùng Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Trồng và Chế biến
cây thuốc Hà Nội - Viện Dược Liệu đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong
suốt thời gian thực hiện nghiên cứu làm khóa luận.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ,
động viên để em có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học.
Em xin trân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2015
Sinh viên

Lã Hữu Dũng


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Danh sách các mẫu nghệ, nguồn gốc và ký hiệu ............................ 13
Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi rpl16..................................................................... 19
Bảng 3.3 Thành phản ứng PCR....................................................................... 19

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt ................................................................................. 19
Bảng 4.1. Sự phụ thuộc của giá trị mật độ quang vào nồng độ curcumin ...... 22
Bảng 4.2: Kết quả phân tích hàm lượng Curcumin tổng số trong các mẫu .... 23
Bảng 4.3: Hàm lượng DNA tổng số trong các mẫu củ nghệ .......................... 25
Bảng 4.4 Kích thước khác biệt về trình tự gene rpl16 của các mẫu giống nghệ..... 34


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: hình thái thân, lá (A); hoa (B) và củ (C) ........................................... 5
Hình 2.2: Công thức hóa học của một số chất chính trong cây nghệ ............... 8
Hình 2.3: Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin............ 9
Hình 4.1: Phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng curcumin ............ 22
Hình 4.2: Điện di DNA tổng số của một số mẫu nghệ. .................................. 24
Hình 4.3: Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ mẫu nghệ .. 25
Hình 4.4 kết quả pha loãng DNA tổng số của 18 mẫu nghệ........................... 26
Hình 4.5: Điện di sản phẩm PCR gene rpl16.................................................. 27
Hình 4.6: Sản phẩm PCR sau tinh sạch. ......................................................... 28
Hình 4.8. Trình tự gen rpl16 ở mẫu giống nghệ N9 (A) và N18 (B) trên máy
đọc trình tự. ..................................................................................................... 36


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
µg

Micro gram

µl

Micro litre

µM

Micro Mole

Bp

base pair (cặp bazơ)

CS

cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

deoxyribonucleotide triphosphates

Kb

Kilobase

mM

Mili Mole

Na2EDTA Ethylene diamine tetra acetate sodium
NST

Nhiễm sắc thể

OD

Optical density

PCR

polymerase chain reaction

RNA

ribonucleic acid

TE

Tris EDTA


v

MỤC LỤC
Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .............................................................................2

1.2.1. Mục tiêu ............................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ...........................................................................................3
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................................3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học: .............................................................................................3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn: ..............................................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
2.1. Tình hình nghiên trong nước ...............................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc, phân bố đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây nghệ vàng ....4
2.1.2 Thành phần hóa học của củ nghệ vàng ..............................................................5
2.1.3. Tác dụng sinh học của củ nghệ vàng ................................................................6
2.1.4. Một số nghiên cứu trong nước về cây nghệ và hoạt chất curcumin .................6
2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước .........................................................................8
2.2.1. Nguồn gốc, phân bố cây nghệ vàng ..................................................................8
2.2.2. Thành phần hóa học của nghệ vàng ..................................................................8
2.2.3. Tác dụng sinh học của nghệ vàng .....................................................................8
2.2.4. Một số nghiên cứu ngoài nước ........................................................................11
Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây nghệ vàng và hoạt chất của nó
trên thế giới. ..............................................................................................................11
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......13
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................13
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................13
3.1.2 Phạm vi nghiên cứu ..........................................................................................14
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành .........................................................................14
3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................14


vi

3.4. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................14
3.4.1. Hóa chất ..........................................................................................................14

3.4.2. Thiết bị ............................................................................................................15
3.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................15
3.5.1. Phương pháp phân tích hàm lượng curcuminoids...........................................15
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số .............................................................17
3.5.3. Phương pháp phân lập gen rpl16 ở lục lạp bằng phương pháp PCR và tinh
sạch sản phẩm PCR ...................................................................................................18
Sử dụng Kít GeneAll® ExpinTM theo mô tả của hãng GeneAll, Hàn Quốc ......................20
3.5.4. Phương pháp giải trình tự, xác đinh chỉ thị phân tử DNA nhận biết các giống
nghệ có hàm lượng curcumin cao. ............................................................................21
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................22
4.1 Xác định hàm lượng curcumin trong củ nghệ .....................................................22
4.1.1 Xây dựng đồ thị chuẩn xác định hàm lượng curcuminoids .............................22
4.1.2 Kết quả xác định hàm lượng curcumin trong các mẫu nghệ............................23
4.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số, phân lập, giải trình tự và phân tích gen rpl16 24
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số ......................................................................24
4.2.2 Kết quả phân lập, tinh sạch, giải trình tự và phân tích gen rpl16 ....................27
4.3. Kết quả chỉ thị phân tử DNA đặc trưng của các mẫu giống nhệ .......................36
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................37
5.1. Kết luận ..............................................................................................................37
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................38


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây nghệ vàng được biết đến như một loại thuốc quý nhưng nó cũng
được biết đến với một loại gia vị không thể thiếu trong ẩm thực Châu Á.

Trong các công thức nấu ăn bên ngoài Nam Á, nghệ được sử dụng làm chất
tạo mầu, nó được sử dụng trong các đồ uống đóng hộp và đồ nướng các sản
phẩm sữa kem, bánh ngọt, bánh quy,…Đây là loại bột quan trọng trong hầu
hết các bột cà ri thương mại. Hầu hết các loại nghệ được sử dụng ở dạng bột
củ, ở một số nơi còn sử dụng cả lá. Mặc dù thường được sử dụng ở dạng bột
khô, nghệ cũng được sử dụng ở dạng tươi. Nhìn chung nghệ được sử dụng
rộng rãi làm gia vị trong ẩm Châu Á.
Từ xa xưa, cây nghệ vàng đã được xem như một thứ thuốc quý bởi
những công dụng mà nó mang lại. Nhân dân ta thường dùng để khử trùng,
làm mờ sẹo và làm lành vết thương. Theo Đông y củ nghệ vàng có vị cay,
đắng, tính bình có tác dụng hành khí, hoạt huyết, làm tan máu, tan ứ và giảm
đau chủ trị bệnh trướng đầy, bế kinh, bệnh sau đẻ, chấn thương, ung thũng.
Bên cạnh đó, nghệ còn giúp giảm cân, lưu thông và lọc máu, giúp cơ thể
chống lại các vi khuẩn kí sinh trong ruột. Weir et al. (2007) [32], đã khám phá
ra khả năng kìm hãm tế bào ung thư của nghệ vàng.
Trong nhiều nghiên cứu đã cho thấy hợp chất curcumin và 2 dẫn xuất
của nó Desmethoxycurcumin và Bisdesmethoxycurcumin là thành phần quan
trọng nhất trong các thành phần tạo nên khả năng chữa bệnh của cây nghệ.
Curcumin có một loạt các hiệu ứng sinh học bao gồm: chống viêm, chống oxy
hóa (Shukla et al. 2008)[28], hóa trị liệu, kháng sinh, kháng virus và các hoạt
động của virus.


2

Một số nghiên cứu về cây nghệ đã cho thấy Trong tự nhiên
curcuminoids phân bố khác nhau trong củ nghệ. Hàm lượng này phụ thuộc
vào giống, loài, giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây cũng như các yếu
tố ảnh hưởng đến như môi trường, khí hậu, thổ nhưỡng. Chọn lọc các các thể
có năng suất chất lượng cao để nhân nhanh phát triển giống phục vụ sản xuất

là điều mong muốn của người trồng nghệ. Về bản chất di truyền hàm lượng
curcuminnoids trong củ nghệ liên quan đến các gen quy định. Các gen này
nằm ở NST trong nhân (như gen CURS1, CURS2, CURS3) và các gen nằm ở
cơ quan tử lục lạp. Để xác định được các cá thể cho hàm lượng curcuminoids
cao theo phương pháp thông thường sẽ mất thời gian, tăng chi phí, và không
chính xác do phụ thuộc vào môi trường và thời gian thu mẫu củ. Chỉ thị phân
tử DNA là đoạn DNA thuộc gen hay một đoạn gen nằm trong nhân hay lục
lạp liên quan đến tổng hợp hoặc trao đổi các chất trong tế bào. Chỉ thị phân tử
DNA đặc trưng cho các giống nghệ có hàm lượng curcuminoids cao sẽ có tác
dụng chẩn đoán chính xác hơn và nhanh hơn những cây cho hàm lượng
curcuminoids cao do kiểu gen quy định và không phụ thuộc vào môi trường
và thời gian thu mẫu. Chỉ thị phân tử DNA có chính xác và tin cậy cao bởi vì
thông tin di truyền là duy nhất không phụ thuộc vào tuổi, các điều kiện sinh lý
và môi trường (Kalpana et al. 2004)[14]. Chỉ thị phân tử DNA đặc trưng cho
các giống nghệ có hàm lượng curcumin cao sẽ có tác dụng chẩn đoán chính
xác hơn và nhanh hơn những cây cho hàm lượng curcumin cao.Do đó, trong
phạm vi luận văn này chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu phân lập, giải trình
tự và phân tích gen rpl16 ở một số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có
hàm lƣợng curcuminoids khác nhau”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Nghiên cứu phân lập, giải trình tự và phân tích gen rpl16 ở một số mẫu
giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lượng curcumin tổng số khác nhau thu
thập ở Việt Nam.


3

1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu
+ Thu thập các mẫu giống nghệ và phân tích được hàm lượng

curcuminoids trong các mẫu giống nghệ.
+ Nghiên cứu tách chiết được DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR,
tinh sạch, giải trình tự, phân tích được gen rpl16.
+ Xác được chỉ thị phân tử trên gen rpl16 nhận biết đối với các mẫu
giống nghệ có hàm lượng curcuminoids khác nhau.
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học:
Đề tài cung cấp thông tin về trình tự gen rpl16 ở lục lạp trên có sở đó
có thể hy vọng xác định chỉ thị phân tử DNA liên quan đến hàm lượng
curcuminoids trong các giống nghệ khác nhau ở Việt Nam. Trên cơ sở thông
tin này các nhà chọn giống nghệ có thể sử dụng để sàng lọc các giống nghệ có
hoạt chất cao cho sản xuất.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn:
- Chỉ thị phân tử trên gen rpl16 có thể được áp dụng vào xác định
nhanh các giống nghệ có mức hàm lượng curcuminoids khác nhau.
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ
sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.
- Giúp cho sinh viên nâng cao kiến thức, kỹ năng thực hành và thu nhận
được kinh nghiệm thực tế.


4

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nghiên trong nƣớc
2.1.1. Nguồn gốc, phân bố đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây nghệ
vàng
Cây nghệ vàng (Curcuma longa L.), thuộc họ gừng (Zingiberaceae) có
củ thân rễ dưới mặt đất. Nó còn có tên khác như khương hoàng; Uất kim;
cohem, co khản mỉn (Thái); King lương (Tày) (Đỗ Huy Bích và cs. 2004)[1].

Theo Đỗ Huy Bích và cs. (2004)[1], nghệ vàng có nguồn gốc nguyên
thuỷ từ Ấn Độ và là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt
đới, từ Nam Á đến Đông Nam Á và Đông Á. Hiện nay trên thế giới đã phát
hiện 48 loài nghệ. Ở Việt Nam có 16 loài được phát hiện trong đó có 6 loài
thường được người dân sử dụng để làm thuốc đó là nghệ vàng (Curcuma
longa L.), nghệ đen (Curcuma zedoaria (B)R.), nghệ trắng (Curcuma
aromatica S.), nghệ pierre (Curcuma pierre G.), nghệ rễ vàng (Curcuma
xanhthorrhiza R.), Nghệ ten đồng (Curcuma aeruginosa R.).
Nghệ là cây thân thảo, có ngấn, mầu xanh, chiều cao khoảng 60 –
100cm. Thân củ hình bầu dục hay hình trụ, phân nhánh có đường kính khoảng
1,5 – 2cm, có nhiều đốt, tại các đốt có vẩy khô do lá biến đổi thành, màu
vàng sẫm đến cam sẫm, rất thơm. Lá đơn, mọc từ thân rễ. Phiến lá hình bầu
dục, kích thước dài 30 – 40, rộng 10 – 15 cm, đầu nhọn, bìa phiến nguyên hơi
uốn lượn; màu xanh lục đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới. Gân lá hình lông
chim, gân chính nổi rõ ở mặt dưới, các gân phụ hơi lồi ở mặt trên. Bẹ lá hình
lòng máng, dài 18- 28 cm, ôm sát vào nhau tạo thành một thân khí sinh giả có
màu xanh, trên bẹ lá có các đường gân dọc song song. Cụm hoa mọc hình trụ
hoặc hình trứng đính trên một cán mập dài đến 20 cm, mọc từ giữa túm lá; lá
bắc rời, màu rất nhạt, những lá phía dưới mang hoa sinh sản, màu lục hoặc
màu trắng nhạt, những lá gần ngọn không mang hoa hẹp hơn và pha màu


5

hồng ở đầu lá; đài có 3 răng không đều; tràng có ống dài, cánh giữa dài hơn
các cánh bên, màu vàng; nhị có bao phấn có cựa do một phần lồi ra của trung
đới ở dưới các ô; nhị lép dài hơn bao phấn; cánh môi gần hình mắt chim, hơi
chia 3 thùy; bầu có lông. Quả nang 3 ô, hạt có áo, mùa hoa quả: tháng 3-5 (Đỗ
Huy Bích và cs. 2004)[1]. Nghệ ưa khí hậu ôn hoà, nhiệt độ thích hợp cho
sinh trưởng, phát triển là 20 - 25oC. Lượng mưa trung bình trong năm từ 2000

- 2500 mm, ẩm độ không khí 80 - 90%, Nghệ ưa đất cao ráo, thoát nước, có
độ pH = 6,5 - 7.Một số hình ảnh về hình thái cây, hoa, củ được thể hiện trong
Hình 2.1

Hình 2.1: hình thái thân, lá (A); hoa (B) và củ (C)
2.1.2 Thành phần hóa học của củ nghệ vàng
Thành phần hóa học của củ nghệ vàng gồm có nước (13,1%), protein
(6,3%), chất béo (5,1%), chất vô cơ (3,5%), sợi (2,6%), carbonhydrat
(69,4%), carotene và vitamin. Tinh dầu nghệ có chứa d. phelandren (1%), d.


6

sabinen (0,6%), cineol (1%), borneol (l0,5%;) zingi, beren (25%),
sesquiterpen (58%). Nghiên cứu ở nước ta cho thấy hoạt chất chính có hoạt
tính sinh học trong thân rễ nghệ là curcuminoids với hàm lượng trung bình là
0,4 -3,3% (dao động từ 1-8%) (Đỗ Huy Bích và cs. 2004)[1].
2.1.3. Tác dụng sinh học của củ nghệ vàng
Thân rễ nghệ có độc tính rất thấp, không có tác dụng gây đột biến và
ung thư. Nghệ được sử dụng chữa đái ra máu, phụ nữ bị u uất sinh điên, chữa
trị lở, sưng đau, chữa dạ dày - tá tràng viêm loét, ung nhọt, ghẻ lở, phong
thấp, tay chân đau nhức, vàng da; chữa viêm gan, suy gan, vàng da do virus,
thổ huyết máu cam. Tinh dầu nghệ có tác dụng sát khuẩn, chống oxy hóa,
chống viêm cấp tính và mãn tính, liền vết thương. Tác dụng bảo vệ tế bào gan
là do hợp chất curcumin có trong củ nghệ (Đỗ Huy Bích và cs. 2004)[1].
2.1.4. Một số nghiên cứu trong nước về cây nghệ và hoạt chất curcumin
Theo số liệu nghiên cứu củ nghệ vàng là 1 trong 14 loại nghệ được tìm
thấy và rất sẵn có ở Việt Nam. Nhưng trong nghệ bao gồm các tạp chất khác
nhau mà Curcumin chỉ chiếm một phần rất nhỏ là 0,3%. Trong dân gian,
người ta đã từng nghiền bột nghệ làm thực phẩm-thuốc. Nghiên cứu của TS

Phạm Đình Tỵ và nhóm nghiên cứu của Viện hóa học các hợp chất thiên
nhiên – Viện Khoa học công nghệ Việt Nam đã tạo ra 2 chế phẩmTNV-999
và TNV-999-AC gọi chung là bột đường tinh nghệ chứa Curcumin độ tinh
khiết 92,5%. Phối hợp với Học viện quân y, nhóm nghiên cứu đã thử thành
công độ an toàn và hiệu lực của Curcumin. Bột đường tinh nghệ đã được đang
ký chất lượng tại Sở y tế HN làm thực phẩm chữa bệnh. Bước đầu đã có nhiều
bệnh nhân bị ung thư, bị mắc bệnh viêm đại tràng, dạ dày, thiểu nǎng gan,
mật ǎn tinh bột nghệ này có chuyển biến tích cực rất rõ rệt. Một số người sau
khi điều trị bằng tinh nghệ, khối u ác tính đã bị thu hẹp, thể trạng tốt hơn.


7

Ở nước ta đã có tới 40 sản phẩm thuốc, mỹ phẩm được sản xuất có sử
dụng tinh chất và bột từ củ nghệ như: các sản phẩm được sản xuất từ nghệ
vàng do Xí nghiệp Dược phẩm 26, Công ty XNK Y tế Đồng Tháp, Công ty
Dịch vụ Y tế tổng hợp Q4... chủ yếu là những bài thuốc chữa dạ dày, bao tử
dạng bột nghệ và cao mật ong nghệ tuy nhiên phần lớn các loại thuốc đều
chưa có tính công nghiệp cao là sử dụng triệt để tinh chất Curcuminoids từ củ
nghệ.Viện Dược liệu đã có những nghiên cứu chiết xuất được tinh chất
Curcuminoids trong Nghệ vàng và đã có những sản phẩm thực phẩm chức
năng và thuốc thành phần chính là curcuminoids hiện đang được thị trường rất
ưa chuộng và đánh giá cao về hiệu quả phòng trị bệnh (Trần Thị Lan, Hoàng
Thị Sáu, 2008)[2].
Năm 2013, sau 8 năm nghiên cứu, các nhà khoa học của Viện Hàn lâm
Khoa học và công nghệ Việt Nam đã sản xuất thành công Nano Curcumin từ
dịch chiết cây nghệ vàng trong nước, với kích thước tiểu phân từ 50-70nm,
sinh khả dụng đạt 95%, tương đương chất lượng chế phẩm của Mỹ, đã đánh
thức tiềm năng của cây nghệ vàng.Nguồn nguyên liệu Nano Curcumin do
viện sản xuất đã được thử nghiệm tại Trung tâm ung thư thực nghiệm, ĐH

Quốc gia HN cho thấy Nano Curcumin xâm nhập tốt, tập trung nhiều quanh
nhân và ức chế sự phát triển của cả 3 dòng tế bào dòng tế bào ung thư vú
(MCF7), phổi (H1299) và đại trực tràng (HCT116) ngay tại nồng độ thấp.
Hiện nay, ung thư đang được xem là bệnh nan y và được điều trị dựa trên
sự kết hợp của ba phương pháp: xạ trị, phẫu trị và hóa trị. Riêng thuốc trị ung thư
trong hoá trị là loại thuốc khó sử dụng hơn cả vì độc tính cao. Thuốc trị ung thư có
tác dụng ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự
phát triển và di căn của ung thư. Tuy nhiên đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay
đều dễ bị nhờn thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian sử dụng, ngoài ra
chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác dụng phụ như: rụng
tóc, buồn nôn... Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư có
nguồn gốc từ tự nhiên và tăng hoạt tính của các hoạt chất đó đang là vấn đề được


8

quan tâm hàng đầu. Curcumin là được xem một hoạt chất điều trị ung thư vào loại
mạnh theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính (Lê Xuân Tiến và cs.
2008)[5].
2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
2.2.1. Nguồn gốc, phân bố cây nghệ vàng
Cây Nghệ (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng Zingiberaceae có nguồn
gốc nguyên thuỷ từ Ấn Độ. Nghệ là cây ưa khí hậu nhiệt đới nên vùng trồng
nghệ chủ yếu tập trung ở một số nước châu Á như: Ấn Độ, Trung Quốc,
Myanma, Sri Lanca, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam(Apavatjrut, 1999)[3].
2.2.2. Thành phần hóa học của nghệ vàng
Theo Kapoor (1990)[15], nghệ có chứa protein (6,3%), chất béo
(5,1%), chất vô cơ (3,5%), carbonhydrate (69,4%), nước (13,1%), carotene và
vitamin. Tinh dầu (5,8%), có màu vàng nhạt, thơm.Công thức hóa học của một
số chất chính trong cây nghệ được thể hiện ở Hình 2.2

Hình 2.2: Công thức hóa học của một số chất chính trong cây nghệ
2.2.3. Tác dụng sinh học của nghệ vàng
Nghệ được sử dụng rất phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm,
dược phẩm. Củ nghệ có hoạt chất dược học, chất chống oxy hóa, có tác dụng


9

chống lại các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, … kìm hãm phát triển
khối u (Sasaki et al. 2002)[25] ( Ravindran et al. 2007)[22]. Trong những
năm gần đây nhu cầu nghệ tăng lên để làm nguyên liệu trong ngành công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm để sản xuất các chế phẩm thuốc và thực
phẩm chức năng.
2.2.3.1. Hoạt tính chống ung thư
Theo các tác giả Chearwae et al.(2004)[5], Lin et al.(2001)[16],
curcumin có tác dụng vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn không cho hình
thành các tế bào ung thư mới mà không ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên
cạnh, nó loại bỏ các gốc tự dohydroxyl OH*, gốc peroxyl ROO*, singlet
oxygen, nitric oxide (NO) và peroxynitrite ONOO- và các loại men như COX1, COX-2 gây ung thư có trong thức ăn, nước uống hằng ngày. Vì vậy, Cur được
xem là hoạt chất hỗ trợ, phòng chống và chữa trị ung thư một cách có hiệu quả
Ngoài ra, curcumin còn có khả năng ức chế sự hình thành khối u, tác động
đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển của khối u như:
biến đổi, phát triển, lan rộng của tế bào ung thư. Tác động của curcumin đến các
giai đoạn của phất triển của khối u được minh họa như Hình 2.3 (Selvam et al.
2005)[26].

Hình 2.3: Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin

10

2.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa
Theo Aggarwal

et al.(2005)[1],Các dạng oxygen hoạt động (ROS-

Reactive oxygen species) là thành phần tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác
nhau trong cơ thể . Cur cumin có khả năng ức chế hiệu quả các ROS trong cơ thể
như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite ở mức độ in vitro và in vivo
(Chattopadhyay et al. 2004)[4]. Curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa
dạng, các hoạt tính đó đều xuất phát từ tính kháng oxy hóa mạnh của curcumin,
tính kháng oxy hóa của nó mạnh hơn vitamin E (Runothayanun et al.2005)[24].
Do vậy thông qua hoạt tính kháng oxy hóa, Cur có khả năng khống chế sự phát
triển nhiều loại bệnh tật và các tác nhân gây hại khác nhau. Curcumin thể hiện khả
năng ức chế mạnh với những thương tổn do H2O2 gây ra ở tế bào sừng, tế bào
fibroblast và các tế bào NG108 (Phan et al.2001)[20]. Curcumin ngăn chặn sự
peroxy hóa lipid trong vi lạp thể gan, màng hồng cầu và dịch đồng thể não chuột
nhờ vậy mà nó duy trì hoạt động của những enzyme kháng oxy hóa như SOD,
catalase và glutathione peroxidase (Reddy et al.1992)[23]. Trong cấu trúc của
curcumin có hydrogen của nhóm phenolic và hydrogen của nhóm methylene
(giữa liên kết β-diketone) đều có thể tạo nên khả năng kháng oxy hoá. Tuy nhiên,
hoạt tính của curcumin thực chất là do hydrogen ở vị trí nào gây ra vẫn còn nhiều
tranh cãi.
Chen et al. (2006)[6] nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’- azobis (2amidinopropane hydrochloride) (AAPH), Cu2+ trong oxy hóa lipoprotein nồng độ
thấp của curcumin và các chất tương tự như curcumin nhưng không có nhóm
phenolic:1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene 3,5-dione (1), 1,7-bis(4methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7- diphenyl-1,6-heptadiene3,5-dione (3). Hoạt tính kháng oxy hoá của các chất (1), (2), (3) đều yếu hơn các
dẫn xuất curcumin nhiều lần. Do đó, nhóm nghiên cứu cho rằng nhóm phenolic
đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính của các dẫn xuất curcuminoid.

11

Shen et al.(2007)[27] cho rằng nhóm enolic có tính acid cao hơn nhóm
phenolic nên hydrogen của enolic đóng vai trò quyết định hoạt tính kháng oxy
hoá của curcumin. Do đó trong quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do
hydrogen của enolic tách ra đầu tiên).
Tuy nhiên Wright et al (2002)[33] lại cho rằng vai trò kháng oxy hoá của
nhóm phenolic hay methylene trên curcumin tuỳ thuộc vào loại gốc tự do tấn
công và môi trường phản ứng.
Priyadarsini et al. (2003)[21] lại cho rằng hoạt tính kháng oxy hoá của
curcumin chủ yếu là do quá trình tách hydrogen trên nhóm phenolic và một phần
trên nhóm methylene.
Ngoài ra, curcumin có khả năng tạo phức mạnh với các ion kim loại như
chì, cadmium, sắt… mà các ion kim loại này là nhân tố xúc tác cho nhiều phản
ứng oxy hoá, đầu độc tế bào thần kinh và là nguyên nhân gây ra các căn bệnh như
Alzheimer, Parkinson, … Do vậy, curcumin là một trong các hợp chất thiên nhiên
tiềm năng có thể sử dụng để loại trừ các ion kim loại độc trong cơ thể người
(Daniel et al. 2004)[8].
2.2.3.3. Hoạt tính chống viêm, kháng vi sinh vật
Theo nghiên cứu của Shukla et al. (2008)[28] hoạt chất curcumin có tác
dụng kháng viêm rất hiệu quả. Nó còn có khả năng kháng nấm (Jayaprakasha et
al. 2001)[12], kháng khuẩn(Mahadi et al. 2002)[17]. Đáng chú ý là khả năng ức
chế men sinh mã ngược HIV-1-RT virus HIV-1 gây ra bệnh AIDS ở người.
2.2.4. Một số nghiên cứu ngoài nước
Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây nghệ vàng và hoạt
chất của nó trên thế giới.
Nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm ở các nước trên thế giới đã
khẳng định từ lâu rằng hoạt chất Curcumin có tác dụng huỷ diệt tế bào ung thư
vào loại mạnh. Tại Mỹ, Đài Loan, người ta đã tiến hành thử lâm sàng dùng

12

Curcumin điều trị ung thư và kết luận: Curcumin có thể kìm hãm sự phát tác của
tế bào ung thư da, dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con, bàng quang. Curcumin còn là
chất bổ cho dạ dày, ruột, gan, mật, lọc máu, làm sạch máu, điều trị vết thương,
chống viêm khớp, dị ứng, nấm, chống vi khuẩn có hiệu lực. Từ nǎm 1993, các
nhà khoa học thuộc ĐH Harvarrd (Mỹ) đã công bố 3 chất có tác dụng kìm hãm
tế bào HIV-1, HIV-1-RT và 1 trong 3 chất đó là Curcumin.
Hayakawa et al. (2011a)[9], đã xây dựng mối liên quan di truyền giữa
các loài trong chi Curcuma và phát hiện chỉ thị haplotype (A, B, C, D) trong
loài C. longa tương ứng với dòng cây chứa hàm lượng curcuminoids cao từ
việc phân tích một số vùng microsatellite DNA lục lạp (rps16 intron 2, petB
intron 1, petB intron 2) của các loài trong chi Curcuma và các giống trong
loài C. longa thu thập từ Việt Nam, Indonesia và Nhật Bản
Hayakawa et al.(2011b)[11]đã phân tích gene matK của DNA lục lạp
(cpDNA) và đoạn ETS (external transcribed spacer) của DNA nhân mã hóa
cho riboxom (nrDNA). Kết quả nghiên cứu đã cho thấy sự khác nhau về hàm
lượng curcumin trong số các dòng nghệ của loài C. longa gây ra bởi lai và
chuyển gen từ các loài khác trong chi Curcuma. Họ cũng đã tìm được băng
đặc trưng cho các dòng nghệ trong loài Curcuma longa L. có hàm lượng thấp,
trung bình và cao.
Aoi et al.(1986)[2] đã thông báo có sự khác nhau về hàm lượng
curcumin giữa các cá thể riêng biệt của loài C. longa, do đó cần thiết sử dụng
chỉ thị gen hay chỉ thị phân tử DNA để xác định hàm lượng curcumin trong
các cá thể của loài này để thu được kết quả chính xác.
Cintra et al.(2005)[7] đã sử dụng chỉ thị RAPD phân tích đa dạng di
truyền 20 mẫu nghệ ở Bzasil. Các nghiên cứu đã cho thấy mức độ băng đa
hình giữa các mẫu giống thấp hơn trong nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR.

Joshiet al.(2010)[13] đã sử dụng chỉ thị SSR để xác định đa dạng di truyền
trong loài curcuma longa L. ở Ấn Độ.


13

PHẦN 3
ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 18 giống nghệ (C. longa L.) có nguồn gốc từ
14 tỉnh (Bảng 1). Các giống nghệ này được trồng tại Nghiên cứu trồng và chế
biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu (Thanh Trì, Hà Nội).
Bảng 3.1: Danh sách các mẫu nghệ, nguồn gốc và ký hiệu
STT

Kí hiệu

Nguồn gốc thu thập

1

N1

Tân Kỳ, Nghệ An

2

N2

Lê Ninh, Quảng Bình

3

N3

Bạch Thông, Bắc Cạn

4

N4

Bá Thước, Thanh Hóa

5

N5

Nho Quan, Ninh Bình

6

N6

Đà Bắc, Hòa Bình

7

N7

Ba Chẽ, Quảng Ninh

8

N8

Cao Lộc, Lạng Sơn

9

N9

Phú Quốc, Kiên Giang

10

N10

Khoái Châu, Hưng Yên

11

N11

Thạch Thành, Thanh Hóa

12

N12

Thanh Hà, Hải Dương

13

N13

Khoái Châu, Hưng Yên

14

N14

Khoái Châu, Hưng Yên

15

N15

Thanh Oai, Hà Nội

16

N16

Sơn La, Sơn La

17

N17

Kon Tum – Kon Tum

18

N18

Mỹ Đức – Hà Nội


14

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu là phân lập, giải trình tự, phân tích gen rpl16 và
xác định chỉ thị phân tử DNA các mẫu giống nghệ có hàm lượng
curcuminoids khác nhau trên cơ sở trình tự gen rpl16.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Giống và công nghệ
sinh học và Khoa hóa Phân tích tiêu chuẩn-Viện Dược liệu.
- Thời gian nghiên cứu: 12/2014-6/2015
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Thu thập mẫu và xác định hàm lượng curcumin trong các mẫu giống nghệ
- Tách chiết DNA tổng số, phân lập và giải trình tự gene rpl16 của các
giống nghệ
- Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến mức hàm lượng curcuminoids
khác nhau trên cơ sở trình tự gen rpl16.
3.4. Hóa chất và thiết bị
3.4.1. Hóa chất
3.4.1.1. hóa chất cho tách chiết DNA
- Đệm chiết DNA gồm: 4 % CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM TrisHCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β-Mercaptoethanol (βMercaptoethanol được bổ sung trước khi chiết).
- Đệm TE: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0.

- Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1),
- Cồn 100%
3.4.1.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR và điện di
- Hóa chất cho điện di: maker DNA, Ethilium Bromide, đệm điện di
TAE (1X), Loading buffer 6X, gel agarose
- Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Master mix của Biorad (gồm Taq


15

DNA polymerase, Taq Buffer 10X, dNTPs), nước cất hấp 2 lần, cặp mồi được
sử dụng là rpl16 – F và rpl16 – R trình tự cặp mồi được thể hiện trong bảng
3.4.1.3.Hóa chất, kít tinh sạch sản phẩm PCR
- Kít loại GeneAll® ExpinTM (GeneAll) theo mô tả của Hãng GenAll,
Hàn Quốc gồm các dung dịch đệm EB, NW và PB.
3.4.2. Thiết bị
- Eppendorf các loại: 0.2 ml, 0.5ml, 1.5 ml
- Micropippette và các đầu tip.
- Lò vi song
- Cân phân tích 10

4

- Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad)
- UV transilluminator (Biorad)
- Máy chụp và phân tích gel loại Gel DocIt2 của Hãng UVP, Hoa Kỳ.
- Máy thermal cycle ( thực hiện phản ứng PCR)
- Máy quang phổ hấp thụ UV-1800 (Shimadzu) của Nhật Bản
- Máy li tâm, bể ổn nhiệt, tủ mát, tủ âm sâu 20 oC, cối chày sứ, nồi hấp
vô trùng, tủ sấy.

3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp phân tích hàm lượng curcuminoids
Hàm lượng curcumin tổng số trong củ nghệ được xác định theo phương
pháp quang phổ bằng máy quang phổ hấp thụ tử ngoại UV-1800 (Shimadzu) của
Nhật Bản (Himesh et al., 2011).
- Chuẩn bị mẫu
Củ nghệ rửa sạch, thái lát nhỏ sấy khô ở 50 oC đến khô tuyệt đối.
+ Bước 1: Cân 0,5 (g) nghệ khô đã được xay nhỏ, chuyển vào bình tam giác.
+ Bước 2: Thêm 50 ml cồn tuyệt đối, siêu âm trong 30 phút, sau đó lọc
qua giấy lọc vào bình định mức 100 ml ( lặp lại 2 lần).


16

+ Bước 3: Thêm tiếp 30 ml cồn vào phần bã, siêu âm tiếp trong 15
phút, lọc tiếp vào bình định mức 100 ml trên, thu được dung dịch mẫu thử. Từ
dung dịch này, hút chính xác 1ml chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm
cồn lượng vừa đủ tới vạch định mức, thu được dung dịch mẫu thử dùng để đo
độ hấp thụ quang, dung dịch này có nồng độ chính xác khoảng 0,1 mg/ml.
- Tiến hành đo:
Quá trình đo quang được thực hiện tại khoa hóa phân tích tiêu chuẩn,
sử dụng hệ thống máy đo quang phổ hấp thụ UV-1800, mẫu trắng là cồn tuyệt
đối, bước sóng hấp thụ cực đại là 430 nm.
Đo mật độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau ở
bước sóng 430nm. Từ các kết quả độ hấp thụ quang (Abs) thu được, xây
dựng đường tuyến tính giữa nồng độ curcumin và giá trị mật độ quang (Abs).
Tiếp tục đo mật độ quang của các mẫu thử, từ giá trị mật độ quang đó, nội
suy từ phương trình đường chuẩn suy ra được nồng độ curcumin có trong
mẫu thử. Từ đó, tính được hàm lượng (%) của curcumin có trong mẫu thử.
- Tính kết quả:

Hàm lượng curcumin ( X%) được tính theo công thức:

Trong đó:
C: Nồng độ curcumin có trong mẫu thử từ phương trình đường chuẩn
(mg/ml).
B: Hàm ẩm dược liệu nghệ (%).
m: Khối lượng dược liệu nghệ (mg).
P: Độ tinh khiết của chuẩn curcumin (P = 0,98).


17

3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
- DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp CTAB của Dolye &
Dolye (1987), cải tiến cho phù hợp với tách chiết DNA tổng số từ mô nghệ
- Pha đệm chiết (Extration buffer): 100ml
+ Bước 1: Đong chính xác 28ml NaCl vào bình định mức 100ml
+ Bước 2: Cân 2g CTAB 2% cho vào bình 100ml trên
+ Bước 3: Bổ sung 4ml Na2EDTA 0.5M (pH=8)
+ Bước 4: Bổ sung 10ml tris – HCl 1M (pH=8)
+ Bước 5: Bổ sung tiếp 1ml β – Mecaptoetanol 100mM
+ Bước 6: Hòa tan các thành phần trong dung dịch
+ Bước 7: Chuẩn dung dịch lên 100ml và đem hấp khử trùng ở 120oC.
(β – Mecaptoetanol chỉ bổ sung trước khi tách chiết DNA).
- Phương pháp tách chiết DNA tổng số được tiến hành như sau:
+ Bước 1: Lấy khoảng 100 mg mẫu mô lá nghệ tươi, xay với Nitơ lỏng
thành bột mịn.
+ Bước 2: Bổ sung thêm 800μl dung dịch đệm chiết.
+ Bước 3: chuyển dung dịch vào ống eppendorf và đặt ở 60 oC trong bể
ổn nhiệt trong vòng 30 phút.

+ Bước 4: Thêm 700μl phenol: chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1),
lắc mẫu trong vòng 15 phút, sau đó li tâm lạnh ở nhiệt độ 4 oC, 10.000
vòng/phút trong khoảng thời gian 10 phút. Chuyển dịch trên ống sang ống
mới. Quá trình chiết lặp lại 2 lần.
+ Bước 5: Tủa DNA bằng isopropanol với 2/3 thể tích
+ Bước 6: Li tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút.
+ Bước 7: Rửa lại tủa bằng cồn 70o. Tiếp tục li tâm với 10.000 vòng/phút,
trong khoảng thời gian 10 phút để thu tủa DNA và quá trình này lặp lại 3 lần.
+ Bước 8: Hòa tan tủa DNA trong đệm TE hoặc hòa tan DNA trong nước.