Khóa luận nghiên cứu tách dòng, giải trình tự và thiết kế vecto biểu hiện gene novw tham gia sinh tổng hợp kháng sinh novobiocin

Số trang

Mục lục

1.3 Đường khử........................................................................................................16
1.3.4 Con đường sinh tổng hợp đường Novioce.................................................18
2.4.6 Chạy điện di ADN plasmid trong Agarose................................................36

Bé gi¸o dục và đào tạo
Viện đại học mở hà nội
Khoa công nghệ sinh học
-----&&&-----

Khóa luận tốt nghiệp
đề tài:


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

NGHI£N CứU TáCH DòNG, GIảI TRìNH Tự Và
THIếT Kế VECTOR BIểU HIệN GEN NOVW THAM GIA
SINH TổNG HợP KHáNG SINH NOVOBIOCIN
Giáo viên hớng dẫn: TS. Tạ Thị Thu Thủy
Sinh viên thực hiện: Vũ Văn Hùng
Lớp KS.CNSH 06 - 04
Hà Nội, tháng 5 năm 2010

LờI CảM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành đến

cô giáo TS. Tạ Thị Thu Thủy, Ngời đà trực tiếp hớng dẫn ân cần và chỉ
bảo giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em cũng xin gủi lời cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ khoa Công
nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội đà tạo điều kiện giúp đỡ em
trong quá trình em thực nghiệm tại Phòng sinh học phân tử Viện Đại Học
Mở Hà Nội.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đà quan tâm và
động viên em trong suốt thời gian qua. Qua đây em cũng xin cảm ơn sự
giúp đỡ nhiƯt t×nh cđa tËp thĨ nhãm G6 nhãm thùc tËp của em tại phòng
sinh học phân tử.
Do thời gian và khả năng bản thân có hạn, nên trong bài khóa luận
này không tránh khỏi những thiếu sót. Nên em rất mong nhận đợc thêm
sự chỉ bảo của các thầy cô và sự góp ý của các bạn để bài khóa luận đợc
đầy đủ và hoàn thiện hơn.
2
V Vn Hựng Lp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Em xin chân thành cảm
Hà nội, ngày 19 tháng 5 năm

ơn!

2010
Sinh viên
Vũ Văn Hùng

NHNG T NG Kí HIU VIT TT
ADN
ARN
mRNA
Amp
EDTA
EtBr
PCR
SDS
TAE
Taq Polymerase
TBE
OD
TE
dNTP
RE
Bio
RAPD
Nu
Tm
Bp
Kb

Axit deoxyribonucleic
Axit ribonucleic
Messenger RNA( RNA thông tin)
Ampicillin
Ethylen diamin tetra-acetic acid
Ethidium bromide

Polymerase Chain Reaction
Sodium dodecyl sulphate
Tris – Acetate –EDTA
Polymerase Thermus aquaticus
Tris – Base –EDTA
Optical Density
Trophectoderm
Deoxiribonucleotide 5’ - triphosphates
Restriction enzyme
Biotechnology
Random Amplified Polymorphic DNA
Nucleotid
Melting temperature
Bazơ pairs
Kilo Bazơ
3

Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Open

ORF

reading frame( khung đọc mở)
Escherichia coli

National Center for Biotechnology

E.coli
NCBI

Information

MỞ ĐẦU
Ngày nay, công nghệ sinh học được coi là một trong năm ngành
công nghệ mũi nhọn của nhân loại gồm: công nghệ sinh học, công nghệ
thông tin, công nghệ điện - điện tử, công nghệ vật liệu mới và công
nghệ năng lượng.
Công nghệ sinh học là một bộ môn tập hợp các ngành khoa học và
công nghệ gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh
hóa học và cơng nghệ học, nhằm tạo ra các quy trình cơng nghệ khai
thác ở quy mô công nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào
động, thực vật để sản xuất các sản phẩm có giá trị phục vụ đời sống,
phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường.
Công nghệ sinh học đã và đang được ứng dụng vào trong rất nhiều
lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm
phục vụ cho mọi như cầu của cuộc sống như dinh dưỡng, giải trí, chăm
sóc sức khỏe... Bằng những kiến thức sinh học về thực vật, động vật,
nấm, vi khuẩn,... và sử dụng “công nghệ ADN tái tổ hợp” những nhà
khoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất và
chất lượng cao, những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc
chữa bệnh cho con người...
4
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học

Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Xu hướng nghiên cứu về hoá dược hiện nay trên thế giới đó là
nghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốc
đường mới vào gốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh

(7)

. Vì vậy

kháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh
đựơc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừ
của thuốc nhanh hơn
Mục tiêu đề tài là tách dịng và giải trình tự gen novW tham gia
sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin. Từ việc giải trình tự gen novW
ta dự đốn chức năng của gen nghiên cứu novW, từ đó thiết kế vector
biểu hiện.
Đề tài được thực hiện theo các bước cơ bản sau:
1.

Thực hiện phản ứng PCR gen novW.

2.

Chuyển gen novW vào vector pGEM 7+

3.

Giải trình tự gen novW

4.

Thiết kế vector biểu hiện ta sử dụng vector pET-32a(+),

là vector biểu hiện để chuyển gen novW vào vector pET-32a(+).

5
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về kháng sinh
1.1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh
- Lịch sử
Giữa thế kỷ 17, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng
cách dùng rêu áp lên vết thương.
Cuối thế kỷ 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc được dùng để chữa
vết thương.
Năm 1928, Alexander Fleming (Bệnh viện Saint Mary, London)
phát hiện nấm tiết ra chất có tác dụng diệt khuẩn.
-Nấm Penicillium notatum
-Chất có tác dụng diệt khuẩn : penicillin
Ơng được coi là người mở ra kỉ nguyên sử dụng kháng sinh trong y
học. Ông đã được trao Giải thưởng Nobel về y học năm 1945 cùng với

Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey về việc tìm ra và phân tách
được penicilin – được coi là loại kháng sinh đầu tiên trong việc điều trị
những bệnh nhiễm trùng
6
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Năm 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey (Đại Học
Oxford) bắt đầu nghiên cứu tác dụng điều trị của penicillin(1).
Ngày 25/5/1940 thử nghiệm tác dụng của kháng sinh thành công
trên chuột.
Edward Abraham nghiên cứu điều chế penicillin tinh chất.
Năm 1943 dự án sản xuất penicillin được chính phủ Mỹ đặc biệt
chú ý nghiên cứu thử nghiệm và bước đầu sản xuất.
Năm 1945, Chain và Florey nhận giải Nobel y học. Năm 1939,
Chain theo Howard Florey nghiên cứu các tác nhân tự nhiên chống vi
khuẩn, do các vi sinh vật sản xuất. Việc này đã dẫn ông và Florey xem
xét lại cơng trình của Alexander Fleming, người đã mơ tả penicillin 9
năm trước đây. Chain và Florey đi tới việc khám phá tác dụng chữa
bệnh của penecillin và thành phần hóa học của nó. Ơng cũng tạo ra lý
thuyết về cấu trúc của penicillin, lý thuyết này đã được xác nhận bởi
việc xác định cấu trúc trong một tinh thể bằng phương pháp chiếu tia X
3 chiều (X-ray crystallography) do Dorothy Hodgkin làm. Vì thế
Chain, Florey và Fleming đã đoạt giải Nobel năm 1945.
Sulfonamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào năm 1932
Streptomycin được Selman Waksman và Albert Schatz tìm ra vào

năm 1934
Đến nay, có hơn 1600 chất kháng sinh được tìm ra nhưng chỉ có
khoảng 150 loại là sử dụng rộng rãi ( do phần lớn: độc, có tác dụng
phụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành sản xuất cao…)
- Lịch sử phát triển kháng sinh ở Việt Nam

7
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Ở nước ta loại thần dược này đã đánh dấu một bước ngoặt lớn
trong công tác cấp cứu và điều trị chiến thương và bảo vệ sức khỏe
cộng đồng.
Năm 1950 trong kháng chiến chống Pháp, GS. Đặng Văn Ngữ đã
nuôi cấy Penicillium Chryroylum và dùng chiết môi trường nuôi cấy để
điều trị vết thương cho thương binh.
Năm 1968 Bộ môn công nghệ dược, đại học dược hà nội được
thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho sự
phát triển của ngành công nghiệp kháng sinh, năm 1970 đơn vị nghiên
cứu chuyên đề kháng sinh do giáo sư Trương Công Quyền làm chủ
nhiệm ra đời, hoạt động trong một thời gian nhưng không thành công
rồi giải thể. Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nươc ngồi như Liên
Xô (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp đỡ sản
xuất, điều chế kháng sinh, sau cũng không thành công do nhiều nguyên
nhân(2).
Năm 1985 – 1990 một chương trình nghiên cứu nhà nước 64C bộ y

tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin
nhưng kết quả đạt không cao về cả công nghệ lẫn hiệu suất.
Như vậy trong một thời gian nghiên cứu cộng tác điều chế sản xuất
kháng sinh gặp rất nhiều khó khăn và chưa thành cơng.
Hiện nay trên thế giới có khoảng 8000 kháng sinh được tìm thấy có
nguồn gốc từ vi sinh vật. và việc sử dụng kháng sinh khơng chỉ giới
hạn trong lĩnh vực y học mà có áp dụng rộng rãi trong chăn nuôi trồng
trọt và công nghiệp thực phẩm.
1.1.2 Khái niệm về kháng sinh
Chất kháng sinh được hiểu là các chất hố học xác định, khơng có
bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi
8
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

sinh vật), với đặc tính là ngay ở nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khả
năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà
vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị(3).
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay các đối tượng gây
bệnh khác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang
đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó, trong đó,
những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào,
rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế
bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rối
loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai

đoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất(4).
- Ức chế q trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn.
Các nhóm kháng sinh gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Do
tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các
đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu.
- Ức chế chức năng của màng tế bào. Các nhóm kháng sinh gồm
có : colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất
chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion
bị thốt ra ngồi.
- Ức chế q trình sinh tổng hợp protein.
Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của
ribosome làm cho q trình dịch mã khơng chính xác.
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế
enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào
chuỗi polypeptide.
9
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của
ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của
chuỗi polypeptide.
- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản q
trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thơng tin)
Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme ADN gyrase làm cho

hai mạch đơn của ADN không thể duỗi xoắn làm ngăn cản q trình
nhân đơi của ADN.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzonic acid)
có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản q trình tổng hợp acid
nucleotid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo
nhân purin làm ức chế q trình tạo acid nucleic.
Mỗi ngày lại có rât nhiều loại kháng sinh được các dược sĩ bào chế
ra bởi vì quá trình kháng kháng sinh của vi khuẩn.
1.1.4 Phân loại kháng sinh
Phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danh
mục các kháng sinh ngày càng nhiều thêm, có nhiều cơ sở để phân loại
kháng sinh, có thể dựa vào phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, có thể dựa
vào nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay theo cấu trúc hóa học.
Dưới đây là cách phân loại dựa theo cấu trúc hóa học. Theo cách này
kháng sinh có 9 nhóm chính(3):
1. Các kháng sinh cacbonhydrat
Các saccacrid thuần nhất như nojirimycin
Các aminoglycosid như streptomycin
10
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

2. Các lacton macrocylic
Các kháng sinh macrolid như erythromycin
Các kháng sinh polyen như nystatin

3. Các kháng sinh quinon và dẫn xuất
Các tetracylin như tetracylin
Các antracylin như adriamycin
4. Các kháng sinh peptid và axit amin
Các dẫn xuất axit amin như cycloserin
Các kháng sinh β- lactam như penixilin
5. Các kháng sinh dị vòng chứa Nitơ
Các kháng sinh nucleotid như polyoxin
6. Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
Kháng sinh polyete monenzin
7. Kháng sinh mạch vòng no
Các dẫn xuất alkan cycloheximid
Kháng sinh steroid như axit fuzidic
8. Các kháng sinh chứa nhân thơm
Các dẫn chất benzen như chloramphenicol
Các chất nhân thơm ngưng tụ như griseofulvin
Các ete thơm như novobiocin_kháng sinh nghiên được nghiên cứu
trong đề tài này.
9. các kháng sinh mạch thẳng
Các kháng sinh chứa photpho như photphomycin
1.1.5 Đơn vị kháng sinh
11
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng

sinh thường được biểu thị bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, µg/ml,
hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit(3) ).
Đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tối
thiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế
hoàn toàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn, thí dụ,
với penicillin là số miligam penicillin pha vào trong 50 ml môi trường
canh thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm
định; với Streptomicin là số miligam pha trong 1 ml môi trường canh
thang và kiểm định bằng vi khuẩn Escherichia coli).
1.1.6 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu
Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm
hãm hay tiêu diệt một cách chọn lọc các chủng vi sinh gây bệnh, trong
khi không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên người
bệnh được điều trị(3). Đặc tính này được biểu thị qua hai giá trị là:
Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration Viết tắt là MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal
Concentration - Viết tắt là MBC), xác định trên các đối tượng vi sinh
vật gây bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho mỗi chất kháng sinh.
1.1.7 Phổ kháng khuẩn của kháng sinh
Phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh biểu thị số lượng các chủng
gây bệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này. Theo đó, chất kháng sinh có
thể tiêu diệt được nhiều loại mầm bệnh khác nhau được gọi là chất
kháng sinh phổ rộng, chất kháng sinh chỉ tiêu diệt được ít mầm bệnh là
chất kháng sinh phổ hẹp(3).
1.2 Tổng quan về Novobiocin
12
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13

Viện Đại Học Mở Hà Nội

1.2.1 Novobiocin
- Novobiocin là kháng sinh thuộc nhóm aminocaumarin được sinh
ra bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces Spherodes sp có tác dụng rất hiệu
quả trong điều trị các bệnh bị nhiễm bởi nhóm vi khuẩn Gram (+) như
Staphylococcus spp., Streptococcus spp, đồng thời có khả năng kháng
lại với các enzim thuộc nhóm beta – lactamase. Hiện nay novobiocin
đang được sử dụng để bào chế kháng sinh dùng điều trị bệnh cho người
và trong thú y dùng điều trị một số bệnh cho đại gia súc.(5)
1.2.2 Cơ chế tác dụng của Novobiocin
Về cơ chế tác dụng của thuốc, novobiocin có khả năng kìm hãm
quá trình tổng hợp ADN của vi khuẩn bởi sự tương tác của thuốc với
tiểu phần B của enzim ADN gyrase (GyrB), enzim này có tác dụng
tham gia q trình cắt và nối ADN vịng để hình thành siêu xoắn
(suppercoils) hoặc tham gia sửa chữa lỗi sao chép của quá trình tổng
hợp ADN

của nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào đơn giản

(prokaryotes)(5)
1.2.3 Cấu tạo của Novobiocin
Về cấu tạo, novobiocin bao gồm 3 tiểu phần, gốc đường khử
noviose (ring C), gốc coumarin (ring B) và gốc acit prenylated 4hydroxylbenzoic (ring A). (hình 1). Trong đó gốc đường noviose có tác
dụng tăng tính tan của thuốc và tăng sự tương tác của thuốc với tác
nhân gây bệnh, ring B và ring A có vai trị chính trong q trình gây bất
hoạt chức năng của enzyme tại trung tâm hoạt động của enzim ADN
gyrase.(6) . (Hình 1)
1.2.4 Các nghiên cứu trong và ngồi nước về novobiocin
Năm 2000 nhóm gen tham gia vào con đường sinh hóa tổng hợp

novobiocin đã được tách dịng thành cơng bởi nhóm nghiên cứu M
13
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Steffensky và các cộng sự. Toàn bộ đoạn ADN với tổng số 26,5 kb và
với 23 gen (ORFs) nằm trên hệ gen của xạ khuẩn Streptomyces
Spheroides sp NCIB 11891 đã được giải trình tự và cơng bố trên ngân
hàng gen (genbank – NCBI). Bằng cách so sánh trình tự với các gen
tương tự trên ngân hàng gen tất cả chức năng của từng ORF trong
nhóm gen đó đã được dự đốn. Tuy nhiên để chứng minh chức năng
này cần phải có các nghiên cứu tiếp theo bằng các nghiên cứu thực
nghiệm.(7)

14
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Hình 1. Cấu trúc hóa học của kháng sinh novobiocin
Tên khoa học:
4-Hydroxy-3-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2enyl)benzamido]-8-methylcoumarin-7-yl 3-Ocarbamoyl-5,5-di-C-methyl-α-l-lyxofuranoside
Công thức phân tử: C31H36N2O11

Khối lượng phân tử: 612.624 đvc

Theo như cơng bố của nhóm nghiên cứu C T Walsh năm 2008 và
các cộng sự, gốc coumarin là gốc chính tương tác với enzim gyrase của
vi khuẩn và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chính. Gốc này được bắt
đầu tổng hợp từ tyrosin dưới sự xúc tác của các enzyme được tạo ra từ
novH, novJ, novK và cuối cùng được kết thúc bằng hoạt tính của enzim
novH (hình 3). Các gen này được tách dịng chứng minh hoạt tính bằng
phương pháp gây đột biến ngồi ra gen tách dịng được biểu hiện trên

15
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

vật chủ E.coli các enzim được được tinh sạch và chứng minh hoạt tính
bằng phương pháp khối phổ
Theo Heide và các cộng sự công bố năm 2008, xu hướng ngày nay
của nghiên cứu kháng sinh đó là ứng dụng cơng nghệ gen để tạo các thế
hệ kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn và có khả năng
khơng bị kháng lại bởi vi sinh vật gây bênh. Để tạo ra các thế hệ
coumarin mới, vật chủ ngoại là xạ khuẩn Streptomyces coelicolor và vật
chủ chuyển gen là E. coli M512 phage PhiC31 đã được sử dụng để
chuyển nhóm gen tạo novobiocin để kết hợp vào hệ gen của vật chủ
ngoại. Tồn bộ cosmid có chứa 23 gen tham gia tổng hợp novobiocin
đã chuyển vào hệ gen Streptomyce coelicolor từ đó đã tạo được chủng
tái tổ hợp mới, cùng với phương pháp gây đột biến điểm hoặc đột biến

thay thế một số gen trong nhóm gen vật chủ tái tổ hợp mới đã tạo ra
hàng loạt các chất dẫn xuất mới của aminocoumatin hay chính là các
thế hệ aminocoumarin mới.
1.2.5 Ứng dụng novobiocin
Novobiocin là một kháng sinh chống lại sự hoạt động của
Staphylococcus epidermidis và có thể đã được dùng để nhận biết vi
khuẩn coagulase-negative Staphylococcus saprophyticus – Một vi khuẩn
kháng lại được với novobiocin. Trong nuôi cấy novibiocin được đặt và
dùng với cái tên Albamycin (Pharmacia And Upjohn) năm 1960. Hiệu
quả của nó đã được chứng minh thử nghiệm trong các thuốc điều trị
bệnh. Novobiocin có hiệu lực trong điều trị MRSA (Methicillinresistant Staphylococcus aureus )
1.3 Đường khử
1.31 Gốc đuờng trong cấu trúc kháng sinh

16
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều trong cấu
trúc tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của rất nhiều các
chất có hoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của rất nhiều
thuốc kháng sinh hay các chất chống ung thư

(1)

. Về cấu tạo các chất

đường khử là chất mà trong phân tử của chúng có một hay nhiều hơn
một nhóm hydroxyl (-OH) được thay thế bởi nguyên tử H hay các
nhóm chức khác như amino, methyl, alkyl….Các loại đường khử này
có thể tồn tại ở dạng đường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và là
dẫn xuất của các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tự
nhiên. (5)
Trong các chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trị quan
trọng đối với xác định hoạt tính của các chất này, có rất nhiều các
nghiên cứu đã chứng minh rằng các chất hoạt tính sinh học sẽ bị mất
hoàn toàn hoạt tinh nếu như gốc đường trong cấu trúc bị loại bỏ(6)
Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật đường khử tham gia tạo thành cấu
trúc peptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loài
vi sinh vật đặc biệt là một số vi khuẩn gram dương hoặc hình thành lớp
Lipopolyscharide trong cấu trúc màng tế bào của nhóm gram âm.

1.3.2 Một số các nghiên cứu về gốc đường khử
- Theo như nghiên cứu

(7)

gốc đường khử trong nhóm kháng sinh

enedine có vai trị quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng
khuẩn, nghiên cứu cho thấy gốc đường rhamnose trong kháng sinh
calicheamicin đóng vai trò làm cầu nối liên kết phân tử kháng sinh với
enzyme tham gia vào quá trình sao mã hay sinh tổng hợp mRNA
17
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học

Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

- Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm kháng
sinh macrolide như erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trò
trong gắn kháng sinh này với các enzyme tham gia tổng hợp protein
của vi khuẩn
- Việc nghiên cứu vai trò của gốc đường đã chỉ ra rằng nếu mất đi
gốc đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ức
chế sự sinh truởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật (6)
- Xu hướng nghiên cứu về hoá dược hiện nay trên thế giới đó là
nghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốc
đường mới vào gốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh

(7)

. Vì vậy

kháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh
đựơc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừ
của thuốc nhanh hơn.
1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh
vật
- Hầu hết đường khử trong cấu trúc kháng sinh đựợc sinh ra từ vi
sinh vật là đường 6- deoxyhexose. Tiền chất đầu tiên tham gia quá trình
sinh tổng hợp các gốc đường này đều bắt đầu từ glucose -1- phosphate
qua một chuỗi các phản ứng sinh hoá trong tế bào được xúc tác bởi
nhóm enzyme và kết quả là tạo ra được gốc đường khử có thể 1 hay

nhiều hơn 1 nhóm OH bằng các nguyên tử H, nhóm -CH 3, nhóm =O,
hay nhóm CHO- (hình 3)
1.3.4 Con đường sinh tổng hợp đường Novioce
- Giới thiệu về đường novioce
Trong các kháng sinh đại phân tử gốc đường khử có vai trị vơ
cùng quan trọng trong việc tăng tính tan của chúng trong dung môi,
tăng khả năng tương tác của thuốc với tác nhân gây bệnh. Trong đó gốc
18
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

đường noviose (ring C) (hình 2) có vai trị rất lớn trong việc xác định
phổ kháng khuẩn của gốc Coumarin bởi các 3 nhóm methyl tromg phân
tử đường và chính phân tử noviose giúp cho gốc Coumarin của kháng
sinh này tương tác tốt hơn với enzim gyrase (GyrB) (Hình 2).
- Con đường sinh tổng hợp đường novioce.
Quá trình sinh tổng hợp đường noviose được bắt đầu từ đường
Glucose- 1- phosphate dưới sự hoạt động của enzyme dTDP-D-glucose
synthase novV, sự xúc tác của emzyme dTDP – D-glucose-4,6dehydratase novT để hình thành của dTDP-4-keto-6 deoxyglucose như
một chất trung gian trong con đường sinh tổng hợp phần lớn đường
deoxy từ dTDP-D-glucose. Quá trình đồng phân hóa dTDP-4-keto-6deoxy-D-glucose được thực hiện dưới sự xúc tác của enzyme dTDP-4keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase được mã hóa bởi novW. Bước
tiếp theo trong sinh tổng hợp noviose. Q trình methyl hóa tại C5 bởi
enzyme 5-methyltransferase được mã hóa bởi novU, sự khử C4
carbonyl carbon được thực hiện bởi enzyme 4-ketoreductase được mã
hóa bởi novS và enzyme O-methyltransferase được mã hóa bởi novP.
Sự gắn đường deoxy vào phân tử coumarin trong kháng sinh coumarin

và vào aglycons trong những kháng sinh khác bởi enzyme
glycosyltransferases trước khi q trình methyl hóa vào nhóm 4hydroxyl của vòng pyranose. Những giả thuyết về chức năng của
proteins được mã hóa bởi novW, novS, novU được đưa ra bởi sự so
sánh về độ tương đồng của trình tự axit amin đã biết và đã được đăng
ký trên ngân hàng gen thế giới 8). Tuy nhiên để chứng minh chức năng
của các gen này bằng các nghiên cứu thực nghiệm và các phuơng pháp
nghiên cứu khác thì chưa được thực hiện .

19
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Để khám phá chức năng của các sản phẩm của gen novWSU trong
q trình sinh tổng hợp đường noviose. Chúng tơi đã clined và biểu
hiện những gen này trong E. coli và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra
những đặc tính đã biểu hiện.
1.3.5 Giới thiệu về gen novW
Gen novW trong nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp
gốc đường khử noviose trong cấu trúc kháng sinh novobiocin đuợc dự
đốn là gen có tên 3,5 epimerase hay gen này có chức nănng là tham
gia xúc tác cho phản ứng chuyển đồng phân 2 nhóm methyl (-CH 3) ở vị
trí C6 và chuyển vị trí nhóm OH ở vị trí C3 từ vị trí mằt phẳng phía
trên xuống mặt phẳng phía duới vng góc với mặt phảng khơng gian
của gốc đường dTDP – noviose (hình 8, hình 9)
Hiện nay, có rất ít các nghiên cứu về các nhóm gen tham gia tạo
kháng sinh và đặc biệt chưa có nghiên cứu nào công bố về các gen

tham gia sinh tổng hợp đuờng khử. Vì vậy việc nghiên cứu về các gen
đường này vơ cùng quan trọng nó giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra
cơ chế tổng hợp kháng sinh và từ đó có thể tác động đến con đuờng
sinh tổng hợp kháng sinh ở mức độ phân tử theo ý muốn. Từ những ý
nghĩa trên nhóm nghiên cứu đã thực hiện nghiên cứu với tên là
“ Nghiên cứu tách dòng, giải trình tự và thiết kế vector biểu hiện
gen novW tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin”

20
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

21
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Hình 2. Con đường sinh tổng hợp đường noviose (ring C)

OH
O

HO

HO

OH
OPO-3

NDP-D-hexose sythase
OH
O

HO
HO
NDP-D-hexose-4,6-dehydratase
C4
* Deoxygeneration
* O-methylation
* Transamination
* Ketoreduction

O

H3C

OH

OdTDP
C5
* epimeration
* C-methylation

O

HO

NDP
OH

C3
* epimeration
* deoxygeneration
* O-methylation
* C- methylation
* Transamination
* N-demethylation
* Ketoreduction

4

keto

6

deoxyglucose

OdTDP

C2
* Deoxygeneration
* O-methylation

Hình 3: Con đường chung mô tả cơ chế sinh tổng hợp đuờng deoxyhexose từ glucose-1-phosphate,

Các vị trí đánh dấu chỉ ra vị trí có thể có các nhóm
chức hay các nguyên tử khác thay thế cho gốc OH của
22
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

phân tử đường để hình thành nên các cấu trúc đường
khác nhau

novO

novP

novQ

novR

novS

novT

novU

novV

nov

W

Hình 4: Chuỗi gen tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin
Gen novW khoanh trịn, nằm ở cuối chuỗi

như hình vẽ

23
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Hình 5: Mơ tả vai trị đồng phân hóa của gen novW

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU
NGHIÊN CỨU
2.1 Hóa chất
Enzyme cắt giới hạn, Emzyme Arnase được cung cấp bởi Công ty
Takara ( nhật bản) được dùng trong cloning và các phản ứng cắt ADN
bằng enzyme giới hạn, enzym EcoRI, Hind III dùng để cắt gen novW.
Kháng sinh ampicillin được cung cấp bởi cơng ty hóa chất xich-ma
(U.S.A), dùng trong ni cấy vi khuẩn, tạo mơi trường có kháng sinh
trong ni cấy chủng vi sinh vật có khả năng kháng sinh, thử kháng
sinh.
TE buffer, Isopropanol, cồn 70 và 90 độ (Sigma U.S.A), Sử dụng
trong tách plasmid.
Cao nấm men, trypton, NaCl, agar, (Sigma U.S.A), dùng để pha

môi trường nuôi cấy vi sinh vật.

24
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học


Khóa Luận Tốt Nghiệp K13
Viện Đại Học Mở Hà Nội

Tris.Cl, EDTA, NaOH, SDS, potassium, acetate, nước cất (Takara
-nhật bản) dùng pha dung dich solution I, II, III dùng trong tách
plasmid.
TBE 5X dùng pha dung dịch chạy điện di
Ethybromine (Takara - nhật bản), dùng trong chạy điện di ADN.
Buffer loading, được cung cấp bởi cơng ty hóa chất dùng trong
chạy điện di ADN
2.2 Một số thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu
Máy nhân gen PCR dùng nhân gen.
Máy chạy điện di ADN dùng chạy điện di ADN.
Máy soi ADN UV-high performance ultraviolet transilluminator
dùng soi ADN.
Máy lắc vortex, Dùng lắc, trộn, hòa tan dung dich.
Máy ly tâm dùng ly tâm.
Nồi hấp vô trùng dùng hấp vô trùng thiết bị và môi trường nuôi
cấy.
Tủ cấy UV dùng trong cấy vi sinh vật.
Tủ ấm dùng nuôi vi sinh vật trong môi trường LB đặc.
Tủ lắc dùng nuôi vi sinh vật trong môi trường LB lỏng.
Tủ lạnh, tủ đông dùng trong bảo quản mơi trường, hóa chất và giữ

giống vi sinh vật.
Thiết bị khác như bình ổn nhiệt, cân điện tử, pipet, ống nghiệm,
bông, đĩa pettri,...
2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy
25
Vũ Văn Hùng Lớp: 06 - 04
Khoa Công Nghệ Sinh Học