Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA KIÊN CHƢƠNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.)
Harms) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khoá học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH & CNTP
: 2011 - 2015

Thái Nguyên, 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA KIÊN CHƢƠNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.)

Harms) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành
: Công nghệ sinh học
Khoa
: CNSH & CNTP
Khoá học
: 2011 - 2015
Giảng viên hƣớng dẫn: 1. ThS. Vi Đại Lâm
Khoa CNSH & CNTP- Trƣờng ĐHNL Thái Nguyên
2. ThS. Đào Duy Hƣng
Viện Khoa học Sự Sống - Trƣờng ĐHNL Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Viện khoa học sự sống em đã
tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng

(Polyscias fruticosa

(L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro” tại Phòng thí nhiệm

nuôi cấy mô của Bộ môn Công Nghệ Tế Bào thuộc Viện Khoa học Sự Sống
thuộc trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Hiện nay, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp Đại Học. Được kết quả
như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban
chủ nhiệm khoa và các thầy cô Bộ môn Công nghệ Tế bào cùng các thầy cô
trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: ThS. Vi Đại Lâm và ThS. Đào
Duy Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết
lòng động viên, giúp đỡ tạ điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi
những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các
bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 26 tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Ma Kiên Chƣơng


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1. Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào
thực vật .................................................................................................... 19
Bảng 2.2. Bốn loại vitamin thường dùng ........................................................ 20
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2
(5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy ...................................................... 31

Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng
Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy .............................. 33
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl2 (0,1%) ...... 34
đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy ....................................................................... 34
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi ............. 36
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi ................ 38
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả
tái sinh chồi ............................................................................................. 40
Bảng 4.7. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả
tái sinh chồi ............................................................................................. 42


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng
dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy………………..32
Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng
viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy ..... 33
Hình 4.3: Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng v ới
HgCl2 (0,1%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy ........................................ 35
Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh
chồi .......................................................................................................... 37
Hình 4.5 Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng Hình A:
Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 2 ........................................... 38
Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh
chồi .......................................................................................................... 39
Hình 4.7 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A:

Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 4 ........................................... 40
Hình 4.8. Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và
IAA đến hiệu quả tái sinh chồi ............................................................... 41
Hình 4.9 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A:
Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 4 ........................................... 42
Hình 4.10 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và
IBA đến hiệu quả tái sinh chồi ................................................................ 43
Hình 4.11 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A:
Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 3 ........................................... 44


iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
Cs

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

LSD

: Least Significant Difference Test

Kinetin

: Furfurylaminopurine

BAP

: Best Absolute Perfect

IAA

: Indole-3- lacetic acid

IBA

: Indole-3-butyric acid

NAA

: α-naphthaleneaceticd

Đ/C

: Đối chứng

B1

: Thiamin

B2

: Ribonavin

B6

: Pyridoxien

2,4D

: 2,4-diclorophenoxy axetic acid

C

: Acid ascorbic

MS

: Murashige and skoog

TDZ

: Thidiazuron

WPM

: Woody Plant Medium

GA3

: Gibberellin

v

MỤC LỤC
Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
1.3. Yêu cầ u của đề tài ...................................................................................... 3
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài ................................................... 3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiến của đề tài..................................................................... 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4
2.1. Giới thiệu chung về cây Đinh lăng ............................................................ 4
2.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng .............................................. 4
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố............................................................................. 4
2.1.3. Giá trị của cây Đinh lăng ........................................................................ 5
2.1.4. Saponin .................................................................................................... 7
2.2. Tình hình nghiên cứu cây Đinh lăng ở trong nước .................................. 10
2.3. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ............... 10
2.3.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật ......................................... 10
2.3.2. khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật............................................. 12
2.3.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy ................................ 13
2.3.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................. 14
2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................... 16
2.4.1. Vật liệu nuôi cấy ................................................................................... 16
2.4.2. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 17
2.4.3. Thành phần môi trường nuôi cấy .......................................................... 17
2.4.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................ 23

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25


vi

3.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................... 25
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 25
3.1.2. Hóa Chất................................................................................................ 25
3.1.3.Thiết bị ................................................................................................... 25
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 25
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 25
3.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 25
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25
3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 26
3.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đế n hiệu
quả vô trùng mẫu Đinh lăng.................................................................... 26
3.4.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh
trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng. .......................................... 28
3.5. Xử lý số liệu ............................................................................................. 30
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 31
4.1. Kết quả ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu
Đinh lăng ................................................................................................. 31
4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%)
đến hiệu quả vô trùng mẫu ...................................................................... 31
4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng
Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy .............................. 33
.1.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl

2

(0,1%) đến hiệu

quả vô trùng mẫu cấy .............................................................................. 34
4.2. Kết quả của một số chất điều hòa sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi
Đinh lăng ................................................................................................. 36
4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi ................... 36
4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi....................... 38


vii

4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái
sinh chồi .................................................................................................. 40
4.2.4. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái
sinh chồi .................................................................................................. 42
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 45
5.1. Kết luận .................................................................................................... 45
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 46
I. Tài liệu tiếng Việt ........................................................................................ 46
II. Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................... 48


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây Đinh lăng có tên khoa ho ̣c là Polyscias fruticosa (L.) Harms, thuộc họ
ngũ gia bì Araliaceae (Đỗ Tất Lợi, 2004) [17]. Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ

Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc họ Ariliaceae, chi Polyscias Forst và Forst.f,
chi này gần 100 loài trên thế giới phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới,
nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1].
Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh
lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng
lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi
làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm
Hoàng Hộ, 1999) [6].
Đinh lăng là một loài thực vật được sử dụng nhiều trong y học dân gian
Viê ̣t Nam và Trung Quố c (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4]. Cây Đinh lăng có
chứa hai hơ ̣p chấ t chin
n, các hợp chất này
́ h quan tro ̣ng là polyacetylen và saponi
có nhiều ở rễ và lá (Phạm Thị Tố Liên và cs, 2007) [12]. Saponin trirtepen có tác
dụng tích cực chố ng oxy hóa, chố ng stress. Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa
20 acid amin và các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin,
tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985) [15]. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở
rễ củ của cây Đinh lăng có chứa nhiều chất có tác dụng bồi bổ sức khoẻ và chữa
bệnh. Đặc biệt, trong cây Đinh lăng chứa các hợp chất saponin tương tự như
trong nhân sâm (Ninh Thi Phím,
2013) [20].
̣
Năm 1961, các khoa dược lý, dươ ̣c liê ̣u và giải phẫu bê ̣nh lý Viê ̣n y ho ̣c
quân sự Viê ̣t Nam nghiên cứu tác du ̣ng của Đinh lăng làm tăng cường sức dẻo
dai của cơ thể và mô ̣t số tác du ̣ng khác. Trên cơ sở kế t quả nghiên cứu dươ ̣c ly,́
Viê ̣n y ho ̣c quân sự Viê ̣t Nam năm 1964 cho thử nghiê ̣m trên người thấ y với


2

0,23g đến 0,50g bô ̣t Đinh lăng mô ̣t ngày dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu
nhẹ độ (30 đô ̣) thì có kết quả tăng sức dẻo dai của cơ thể n hư khi nghiên cứu
trong phòng thí nghiệm. Trong dân gian, ngoài công dụng ăn gỏi ca,́ có nơi dùng
Đinh lăng chữa ho, ho ra máu , thong tiể u, thong sữa, kiế t lỵ nă ̣ng. Tại Ấn Độ,
theo K. M. Naikairai, Đinh lăng đươ ̣c dùng chữa số t , làm săn da (Đỗ Tất Lợi,
2004) [17].
Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng
thuốc sắc, rượu ngâm hoắc bột khô để chữa ho, đau tức cú, tắc tia sữa, làm lợi
sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè.
Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y
dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực.
Hiện nay, công tác sản xuất giống phần lớn cây Đinh lăng được trồng
bằng phương pháp giâm hom, vì vậy cây giống có độ đồng đều không cao, hệ
số nhân giống thấp, chất lượng thấp không đáp ứng được yêu cầu của thị
trường. Trong khi đó cây Đinh lăng giống được sản xuất bằng công nghệ
nguôi cấy mô tế bào cho hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, đồng đều và giữa
được tính trạng ưu việt của giống gốc. Việc ứng dụng phương pháp này để
nhân giống cây Đinh lăng là một phương pháp mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Nhằm đáp ứng được nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất
lượng cao bằng kỹ thuật in vitro” nhằ m góp phầ n hoàn thiê ̣n quy triǹ h nhân
nhanh cây Đinh lăng.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô
trùng mẫu cây Đinh lăng bằ ng kĩ thuật invitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu
quả tái sinh chồi Đinh lăng.


3

1.3. Yêu cầ u của đề tài
Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu
cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro
Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến
hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Quá trình nghiên cứu sẽ đưa ra được một số kĩ thuật góp phần xây dựng
và hoàn thiện tái sinh giống Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro. Từ đó đánh giá
được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến kỹ thuật tái sinh
giống cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro.
Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kỹ thuật nhân
giống cây dược liệu nói chung và cây Đinh lăng nói riêng.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiến của đề tài
Từ các kết quả nghiên cứu bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ
cho các nghiên cứu, giảng dạy và kỹ thuật tái sinh giống Đinh lăng có chất
lượng cao bằng kỹ thuật in vitro.
Góp phần nhân giống cây Đinh lăng, tạo ra một số lượng cây giống lớn,
đồng đều có chất lượng cao để cung c ấp phu ̣c vu ̣ cho s ản xuất và thị trường
tiêu dùng ngày mô ̣t lớn.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Đinh lăng
2.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng
Đinh lăng là cây dạng bụi, cao 1,5-2m. Thân ngắn, không có gai, ít

phân nhánh, các nhánh có nhiều lỗ bì lồi, Rễ phù như củ. Lá kép 3 lần, mọc so
le, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim, dài 20-40cm, không có lá kèm rõ. Lá chép có
cuống dài 3-10mm, phiến lá chép có răng cưa không đều, chóp nhọn, các
đoạn đều có cuống, lá có mùi thơm. Cụm hoa hình chùy ngắn 7-18mm ở
ngọn, gồm nhiều tán, mang nhiều hoa nhỏ, màu trắng xám, tràng 5, nhị 5 với
chỉ nhị gầy, bầu hạ ngăn có 2 đĩa trắng nhạt. Quả hình trứng dẹp, dài 3-4mm,
dày 1mm, màu trắng bạc (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6].
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc họ
Ariliaceae, chi Polyscias Forst và Forst.f, chi này gần 100 loài trên thế giới
phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo
Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]. Ở Việt Nam, hiện có 10 loài
Đinh lăng (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6], đa số Đinh lăng hiện nay được trồng
làm cảnh, chỉ có một vài loài được sử dụng làm thuốc, loài Đinh lăng được sử
dụng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Đây là loài
có tác dụng dược lý giống Nhân sâm (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4].
Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình, lá có vị nhạt, hơi đắng, tính
bình. Có thể thu hoạch rễ ở những cây trồng 3 năm trở lên (trồng càng
nhiều năm thì hệ rễ càng phát triển và lượng hợp chất thu càng được
nhiều). Có thể thu rễ vào mùa đông sau đó rửa sạch phơi khô và bảo quản
ở chỗ mát. Có thể thu lá quanh năm, thường dùng tươi (Đỗ Huy Bích và
cs, 2004) [1], (Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2004) [8].


5

2.1.2.3. Phân loại
Nghành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Lớp phụ: Rosidae

Bộ: Apiales
Họ: Araliaceae
Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms
Tên thông thường: Đinh lăng lá nhỏ, cây gỏi cá, Nam dương lâm, Đinh
lăng lá xẻ, Đinh lăng hương (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6].
2.1.2.4. Thành phần hóa học
Trong rễ Đinh lăng có glycoside, alkaloild, vitamin (B1, B2, B6, C),
các phytostrol và 20 acid amin, trong đó các acid amin không thể thay thế
(lysin, methionin, trytophan, cystein) (Ngô Ứng Long, 1985) [15]. Qua phân
tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá, thấy có saponin, coumarin, tinh dầu,
phytosterol, tanin, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic. Từ rễ và lá
Đinh lăng, 11 saponin triterpen có thành phần aglycon và acid oleanolic đã
được xác định, trong đó có 8 hợp chất mới được đặt tên là polysioside A-H
(Võ Duy Huấn, 1998) [28]. Có 5 hợp chất polyacetilen trong rễ Đinh lăng
cũng được phân lập, trong đó panaxynol, panaxydol và heptadecaien-dyindyol là những chất có trong Nhân Sâm (Trần Công Luận, 1996) [18] và 2
polyacetilen chủ yếu được phân lập từ lá cũng là panaxynol, heptadecaiendyin-duol (Trần Công luận và cs, 2000) [19].
2.1.3. Giá trị của cây Đinh lăng
2.1.3.1. Giá trị dinh dưỡng
Đinh lăng có chứa các hợp chất như alkaloid, glycoside, saponin, và
các acid a min tan trong nước như B1, B2, B6, C và các phytosterin.


6

Ở tất cả các bộ phận như rễ, và thân lá đều chứa saponin nhưng nhiều
nhất là ở vỏ rễ và lá (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]. Ngoài ra trong Đinh lăng
còn chứa 20 acid amin và có các loại acid amin không thay thế như lysin,
methionin, trytophan, cystein (Ngô Ứng Long, 1985) [15].
Trong lá: Trong lá, Đinh lăng có chưa saponin triterpen (chiếm 1,65%),
tinh dầu, phytosterol, tamin, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic.

Saponin triterpen có thành phần aglycon và acid oneanolic, đây là một chất có
tác dung dược liệu (Wenck A. R., 1988) [29]. Có 5 hợp chất polyacetylen
được phân hóa từ lá cây Đinh lăng là: Panaxydol, panoxydol, heptadeca – 1,8
(E) dien – 4,6 diyn – 3,4 diol, Heptadeca – 1,8 (E) – dien – 4,6 diyn – 3ol –
10on và Heptadeca – 1,8 (Z) – 4,6diyn – 3ol – 10on (Đỗ Huy Bích và cs,
2004) [1].
Trong rễ: Trong rễ, Đinh lăng có chứa 5 hợp chất polyacetylen, bao
gồm: Panaxydol, panoxydon, heptadeca – 1,8 (E) – dien – 3,10 diol và 3 hợp
chất giống trong lá, các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống
một số dạng ung thư (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1].
2.1.3.2. Giá trị dược liệu.
Đinh lăng có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng thể trọng, thúc đẩy sự hình
thành và củng cố trí nhớ đặc hiệu trên động vật có trí nhớ kém, tang lực, tăng
sức dẻo dai của cơ thể, có tác dụng liên hệ nội tiết.
Lá đinh lăng chống bệnh co giật cho trẻ em, lấy lá non và lá già phơi
khô đem lót vào gối hoặc trải giường cho trẻ nằm. Thân cành đinh lăng sắc
uống chữa được bệnh đau lưng, mỏi gối, tê thấp, dùng phối hợp với rễ cây
xấu hổ, cúc tần, cam thảo dây.
Đinh lăng có tác dụng chống stress.
Đing lăng có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống sơ vữa động mạch,
dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn và lipid toàn phần trong huyết thanh.


7

Có tác dụng chống khuẩn tốt trên vi khuẩn Gram (+) như
Staphylococus.
Kích thích sự hoạt động của K+, Na+, ATPase (Phạm Thị Tố Liên và cs,
2007) [11], (Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2001) [9].
2.1.4. Saponin

Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi
trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao
(Trần Hùng, 2003) [7].
Saponin có một số tính chất đặc biệt:
- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác
dụng nhũ hoá và tẩy sạch.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
- Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp
nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài
thân mềm như giun, sán, ốc sên.
- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi
tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng.
- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-bhydroxysteroid khác.
- Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng (vì tạo bọt
như xà phòng).
Dựa vào cấu chúc người ta chia Saponin thành 2 nhóm là saponin triterpen
(Có 30 chất cấu tạo bởi 6 nhóm Hemiterpen) và saponon steroid có 27 chất. Trong
họ Nhân sâm thường chứa saponin triterpen (Trần Công Luận, 1996) [18].
Saponin là một nhóm hợp chất thứ cấp có vai trò quan trọng trong thực
vật, saponin hiện diện ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm. Quá trình tổng
hợp saponin trong thực vật phụ thuộc vào sự di truyền, các loại mô khác nhau,
tuổi của thực vật và các yếu tố môi trường xung quanh


8

Saponin có nhiều tác dụng dược lý như có tính phá huyết, tạo phức hợp
với cholesterol, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống tạo khối u,
nhiều saponin có tác dụng diệt các loài nhuyễn thể,… Nhiều saponin có tính
chất tạo bọt khi gia nhiệt, tính chất này có thể áp dụng để định tính saponin

(Ngô Văn Thu, 1990) [24].


9


10

2.2. Tình hình nghiên cứu cây Đinh lăng ở trong nƣớc
Theo (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4] tiến hành đề tài: “Nhân giống cây
Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms thông qua con đường tạo phôi soma
trong nuôi cấy in vitro” và cho kết quả như sau: cây con được tạo thành từ mô
phân sinh của cây Đinh lăng trong môi trường có thành phần là MS có bổ
sung BAP 2,0 mg/l, sau 60 ngày từ mô phân sinh tạo thành chồi và chồi nách.
Theo (Trần Thị Liên và cs, 2005) [13] tiến hành nghiên cứu nhân nhanh
cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms bằng phương pháp in vitro và cho
kết quả như sau: Vật liệu sử dụng là chồi đỉnh và chồi bên còn non của cấy
Đinh lăng. Môi trường sử dụng là môi trường MS có bổ sung vitamin Morel,
nước dừa 10%, sucrose 30g/l và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Cây
con được tái sinh qua con đường tạo phôi soma.
Theo (Lê Thiên Thư và cs, 2005) [25] tiến hành: “Nghiên cứu sự phát
sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.)
Harms” và đưa ra kết quả như sau: Mô sẹo được hình thành từ các chồi in
vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4 – D2,0 mg/l các mô sẹo phát triển tốt
nhất trển môi trường này và từ đó tạo phôi trên môi trường không có chất điều
hòa sinh trưởng ngoại sinh, những vật liệu này có thể phát hiện saponin bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng hay khả năng tạo bọt.
2.3. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden và Schwan đã

đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm
nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các
thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và
là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn
Đức Thành, 2000) [22].


11

Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế
bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành
một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy mô tế bào đã phân lập,
người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông cũng đã
tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây lá mầm như: Erythronium,
Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27].
Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại
thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà
thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng
khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như
vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác
giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000) [22].
Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào
thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi
trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men.
Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các
vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [32].
Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh
trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và
cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi
và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [32]. Cũng trong thời

gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA,
2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và
NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật
mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005) [21].
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào
môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy chế phẩm này có


12

tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt. Một năm sau, Skoog và
cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và
đặt tên là kinetin. Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác
dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung
là nhóm cytokinin. Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là
zeatin có trong mầm ngô. Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân
chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt
đã phơi khô (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [32].
Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các
protocorm (mô sẹo) từ địa lan. Khi để trong các điều kiện nhất định, các
protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh. Cùng năm
đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần
(protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym xenlulaza.
Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của
cây cà độc dược (Datura inoxia). Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài
thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rất lớn cho các
ngiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27].
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng
của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và
Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được

xenlulozo. Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast
của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai
xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27].
2.3.2. khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy in vitro các nguyên
liệu như đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có kích thước phù


13

hợp được nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng và môi trường
thích hợp để tạo thành mô hay cây hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ và cs,2009) [27].
Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có
thể tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiện quanh năm không
phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây
ban đầu (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4], (Ngô Ứng Long, 1985) [15].
2.3.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy
Trong nhiều thập kỷ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển
mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói đây là công cụ cần thiết
trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của nghành sinh học
Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus,
nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần... con người đã thúc đẩy thực
vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Điều này sẽ
góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của
cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới vào sản xuất với quy mô
lớn (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) [15], (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [27]
Ngoài ra, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản được
nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài sinh
vật sinh dưỡng. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra
những con lai về mặt di truyền mà phương pháp nhân giống cổ điện không thực

hiện được. Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ
cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn định và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản
xuất thực vật ở ngoài tự nhiên “mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi
cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận các hợp
chấp trên quy mô công nghiệp” (Quách thị liên, 2004) [14]
Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro dễ sản
xuất các hợp chất thứ cấp:


14

 Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo mà
không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cẩn thiết để vận chuyển và bảo
quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
 Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu quả sản phẩm bằng cách loại bỏ
những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của
nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá
trình vận chuyển và bảo quản.
 Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất được từ nuôi cấy mô
dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh (Nguyễn Hoàng
Lộc, 2006) [15].
 Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ xung các kỹ thuật nhân giống
vô tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng... một kỹ
thuật tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực
kỳ cao và có tiềm năng công nghiệp hóa (Lê Trần Bình, 1997) [3].
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực
vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật
như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền - đột biến, sinh lý
sinh dưỡng ở các tế bào thực vật và nhiều đề sinh học khác…(Vũ Văn Vụ và
cs, 2008) [27].

2.3.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.4.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến
hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy,
mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình
phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ


15

chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp
điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một
cơ thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một
cơ thể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có
tiềm năng tổng hợp những kiểu protein – enzym giống hệt nhau và nếu được
nuôi trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn
đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường. Khả năng đó của tế
bào được gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật” (Nguyễn Đức Thành,
2002) [22].
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt đã đưa ra chính là cơ sở lí
luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn
chứng minh được khả năng tái tạo của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ (Nguyễn Đức Thành, 2002) [22].
2.3.4.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Theo (PGS.TS Nguyễn Quang Thạch, 2015) [23]: Cơ thể thực vật
trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng
khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào

đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành
nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa).
Sau đó từ tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các
tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan khác nhau của cơ thể.
Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa có chức năng riêng
biệt.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng
chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong
trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế


16

bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái
sinh thành cây hoàn chỉnh. Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hóa tế
bào,ngược lại với phân hóa tế bào. Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu
thị bằng biểu đồ:
Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh

Tế bào giãn

Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực
chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa. Kỹ thuật nuôi cấy
mô, tế bào thực vật xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái

của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản
phân hóa của tế bào. Trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Nguyễn
Đức Thành, 2002) [22].
2.4. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.4.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân
giống in vitro. Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết.
Đối với Đinh lăng, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro có thể là
chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng, hoặc đoạn thân non. Các vật liệu này cần được
đảm bảo vô trùng trước khi tiến hành nuôi cấy in vitro. Phương pháp vô trùng
vật liệu thông dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất hóa học. Đối với các thí
nghiệm nuôi cấy Đinh lăng in vitro, tôi sử dụng đỉnh sinh trưởng đã qua khử
trùng để phục vụ cho việc nhân giống in vitro.