Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensn mang gen mã hoá Chitinase từ Theobroma cacao L.

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Thị Thu Hiền, Phó Viện trưởng,
Trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Khoa

Formatted: Header distance from edge: 0.75"
Formatted: Font: Not Bold
Formatted: Font: Not Bold
Formatted: Font: Not Bold

học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn tận tình, chu đáo để tôi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Nông Văn Hải, Viện trưởng Viện

Formatted: Font: Not Bold

Nghiên cứu hệ gen, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo điều kiện
giúp tôi được thực tập tại Viện và tạo điều kiện cho tôi được thực hiện luận
văn tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo, giảng viên trường Đại
học sư phạm Hà Nội 2 đã hết sức giúp đỡ và chỉ dạy tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiên đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Nghiên
cứu hệ gen, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đặc biệt là NCS. Hà
Hồng Hạnh, HVCH. Nguyễn Văn Phòng đã luôn nhiệt tình hướng dẫn và cho
tôi những lời khuyên và kinh nghiệm trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Luận văn được hoàn thành trong khuôn khổ nhiệm vụ hợp tác quốc tế
“Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển
gen” thuộc “Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh
học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020”.

Hà Nội,, 24 tháng 12 năm
2012
Học viên cao học
Formatted: Centered


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Nguyễn Lệ Thủy

Formatted: Left, Indent: Left: 0", First line:
0"

1


LỜI CAM ĐOAN

Formatted: Font: 15 pt

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả đạt được qua
quá trình cộng tác với các đồng nghiệp khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần
đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào.
Hà Nội, tháng năm 2012
Học viên cao học

Nguyễn Lệ Thủy


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

Formatted

... [1]

Formatted

... [2]

Field Code Changed

... [4]

Formatted

... [5]

Formatted

... [3]

Field Code Changed

... [6]

Formatted

... [7]

Field Code Changed

... [8]

Formatted

... [9]

Formatted

... [10]

Formatted

... [11]

Formatted

... [12]

Formatted

... [13]

Formatted

... [14]

Formatted

... [15]

Formatted

... [16]

Formatted

... [17]

Formatted

... [18]

Formatted

... [19]

Formatted

... [20]

Formatted

... [21]

Formatted

... [22]

Formatted

... [23]

1.2. THỰC TRẠNG VÀ TRIỂN VỌNG CHUYỂN GEN CÓ GIÁ TRỊ
VÀO CÂY TRỒNG VÀ CÂY CA CAO .................................................. 87
1.2.1. Chuyển gen vào cây trồng ........................................................... 87

Formatted

... [24]

Formatted

... [25]

Formatted

... [26]

Formatted

... [27]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ca cao sử dụng vi khuẩn

Formatted

... [28]

Formatted

... [29]

Formatted

... [30]

Formatted

... [31]

Formatted

... [32]

Formatted

... [33]

Field Code Changed

... [34]

Formatted

... [35]

Field Code Changed

... [36]

Formatted

... [37]

Formatted

... [38]

Formatted

... [39]

Formatted

... [40]

Formatted

... [41]

Formatted

... [42]

Formatted

... [43]

Formatted

... [44]

Formatted

... [45]

Formatted

... [46]

Formatted

... [47]

Formatted

... [48]

LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG
MỞ ĐẦU .......................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................3
1.1. CÂY CA CAO VÀ TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN ...............................3
1.1.1. Giới thiệu chung về cây ca cao......................................................3
1.1.2. Tình hình phát triển cây ca cao ở Việt Nam ...................................6

A. tumefaciens ................................................................................... 1110
1.3. PROTEIN VÀ GEN MÃ HÓA CHITINASE ................................. 1312
1.3.1 Giới thiệu về protein và gen mã hóa chitinase ........................... 1312
1.3.2. Các nguồn gen mã hóa chitinase ............................................. 1413
1.3.3. Phân loại chitinase ................................................................... 1514
1.3.4. Vai trò của gen mã hóa chitinase trong công nghệ gen ............. 1716
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP........................... 1918
2.1. NGUYÊN LIỆU............................................................................. 1918
2.1.1. Nguyên liệu sinh học ............................................................... 1918
2.1.2. Hóa chất................................................................................... 2120
2.1.3. Thiết bị .................................................................................... 2221
2.2. PHƯƠNG PHÁP ........................................................................... 2321
2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose ................................................. 2321


Formatted

... [49]

Formatted

... [50]

Formatted

... [51]

Formatted

... [52]

Formatted

... [53]

Formatted

... [54]

Formatted

... [55]

2.2.5. Biến nạp DNA vào vi khuẩn E. coli ......................................... 2725

Formatted

... [56]

Formatted

... [57]

2.2.6. Biến nạp DNA vào A. tumefaciens ........................................... 2826

Formatted

... [58]

Formatted

... [59]

Formatted

... [60]

Formatted

... [61]

Formatted

... [62]

Formatted

... [63]

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 3533

Formatted

... [64]

Formatted

... [65]

3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ
HÓA CHITINASE (TcChi1) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pCB 301 ........ 3533
3.1.1. Sơ đồ thí nghiệm ...................................................................... 3634

Formatted

... [66]

Field Code Changed

... [67]

Field Code Changed

... [68]

Formatted

... [69]

Formatted

... [70]

Formatted

... [71]

Formatted

... [72]

Formatted

... [73]

3.1.4. Thiết kế vào tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa

Formatted

... [74]

Formatted

... [75]

chitinase .............................................................................. 4240

Formatted

... [76]

Formatted

... [77]

Formatted

... [78]

Formatted

... [79]

Formatted

... [80]

Formatted

... [81]

Formatted

... [82]

Formatted

... [83]

Formatted

... [84]

Formatted

... [85]

Formatted

... [86]

Formatted

... [87]

Formatted

... [88]

Formatted

... [89]

Formatted

... [90]

Formatted

... [91]

Formatted

... [92]

Formatted

... [93]

Formatted

... [94]

2.2.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) ...... 2422
2.2.3. Tách và tinh sạch đoạn gen từ gel agarose ............................... 2523
2.2.4. Phản ứng ghép nối gen với vector ............................................ 2624

2.2.7. Tách chiết DNA plasmid.......................................................... 3028
2.2.8. Phân tích bằng enzyme hạn chế ............................................... 3331
2.2.9. Xác định trình tự ...................................................................... 3331

3.1.2. Nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1 từ dòng pJET+TcChi1W/1 bằng kỹ thuật PCR ..................................................................... 3735
3.1.3. Tạo vector trung gian pRTRA + TcChi1 tái tổ hợp .................. 3836

3.1.5. Tạo chủng A. tumefaciens mang Ti-plasmid pCB301+TcChi1 tái tổ
hợp bằng phương pháp xung điện ...................................................... 4744
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ
HÓA CHITINASE (TcChi1-U) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pPIPRA...... 5148
3.2.1. Sơ đồ thí nghiệm ...................................................................... 5148
3.2.2. Kết quả nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1-U từ dòng
pJET+TcChi1-W/1 bằng kỹ thuật PCR .............................................. 5350
3.2.3. Thiết kế vector trung gian pPIPRA522 mang gen mã hóa TcChi1-U 5451
3.2.4. Thiết kế vector biểu hiện thực vật pPIPRA558 với cấu trúc gen
GUS được loại bỏ và thay thế bằng cấu trúc gen mã hóa TcChi1-U... 5653

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................. 5855

Field Code Changed

KẾT LUẬN ............................................................................................. 5855

Field Code Changed

KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 5855
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................... 6056
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………….. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 33

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Tab stops: 6.02",
Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:
…
Field Code Changed
Formatted: Font: 14 pt
Field Code Changed
Field Code Changed

1.1. CÂY CA CAO VÀ TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN ......................... …33
1.1.1. Giới thiệu chung về cây ca cao.................................................... 33

Field Code Changed
Field Code Changed
Formatted: Font: 14 pt

1.1.2. Tình hình phát triển cây ca cao ở Việt Nam ................................. 66
1.2. THỰC TRẠNG VÀ TRIỂN VỌNG CHUYỂN GEN CÓ GIÁ TRỊ
VÀO CÂY TRỒNG VÀ CÂY CA CAO .................................................. 88
1.2.1. Chuyển gen vào cây trồng ........................................................... 88
1.2.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ca cao sử dụng vi khuẩn
A. tumefaciens ................................................................................... 1111

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…
Formatted: Font: 14 pt

1.3. PROTEIN VÀ GEN MÃ HÓA CHITINASE ................................. 1313

Formatted: Font: 14 pt

1.3.1 Giới thiệu về protein và gen mã hóa chitinase ........................... 1313

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
… + Not at 6.1"

1.3.2.Các nguồn gen mã hóa chitinase ............................................... 1313

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…

1.3.3. Phân loại chitinase ................................................................... 1515

Formatted: Font: 14 pt

1.3.4. Vai trò của gen mã hóa chitinase trong công nghệ gen ............. 1616

Formatted: Font: 14 pt

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP....................... 181819
2.1.NGUYÊN LIỆU...........................................................................181819

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Tab stops: 6.02",
Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:
…

2.1.1. Nguyên liệu sinh học ........................................................... 181819

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
… + Not at 6.1"

2.1.2 Hóa chất................................................................................ 202021

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt


2.1.3.Thiết bị ................................................................................. 212122
2.2. PHƯƠNG PHÁP ....................................................................... 212122

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
… + Not at 6.1"

2.2.1 Điện di DNA trên gel agarose [36]....................................... 212122

Formatted: Font: 14 pt

2.2.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction- PCR)

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…

...................................................................................................... 222223

Formatted: Font: 14 pt

2.2.3. Tách và tinh sạch đoạn gen từ gel agarose ........................... 232324

Formatted: Font: 14 pt

2.2.4. Phản ứng ghép nối gen với vector ........................................ 242425

Formatted: Font: 14 pt

2.2.5. Biến nạp DNA vào vi khuẩn E. coli ..................................... 252526

Formatted: Font: 14 pt

2.2.6. Biến nạp DNA vào A. tumefaciens ....................................... 262627

Formatted: Font: 14 pt

2.2.7. Tách chiết DNA plasmid...................................................... 282829

Formatted: Font: 14 pt

2.2.8. Phân tích bằng enzyme hạn chế ............................................... 3131

Formatted: Font: 14 pt

2.2.9. Xác định trình tự .................................................................. 313132

Formatted: Font: 14 pt

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................... 333334
3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ
HÓA CHITINASE (TcChi1) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pCB 301. ... 333334

Formatted: Tab stops: 6.02",
Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:
…

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
… + Not at 6.1"

3.1.1. Sơ đồ thí nghiệm .................................................................. 343435

Formatted: Font: 14 pt

3.1.2. Nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1 từ dòng pJET+TcChi1-

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…

W/1 bằng kỹ thuật PCR ..................................................................... 3535
3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp trung gian pRTRA + TcChi1 .................. 3636

Formatted: Font: Italic
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt

3.1.4. Thiết kế vào tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa
chitinase ............................................................................................ 4040

Formatted: Font: 14 pt

3.1.5. Tạo chủng A. tumefaciens mang Ti-plasmid pCB + CaMV35S +
TcChi1 tái tổ hợp bằng phương pháp xung điện ................................. 4444

3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
… + Not at 6.1"

HÓA CHITINASE SỬ DỤNG HỆ VECTOR pPIPRA. ........................ 4848
3.2.1. Sơ đồ thí nghiệm ...................................................................... 4848

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…
Formatted: Font: 14 pt


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

3.2.2. Kết quả nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1-U từ dòng
pJET+TcChi1-W/1 bằng kỹ thuật PCR .............................................. 5050

1

Formatted: Font: 14 pt


3.2.3. Thiết kế vector trung gian pPIPRA522 mang gen mã hóa TcChi1-U
.......................................................................................................ssssssssss5151

Formatted: Font: 14 pt

3.2.4. Thiết kế vector biểu hiện thực vật pPIPRA558 với cấu trúc gen
GUS được loại bỏ và thay thế bằng cấu trúc gen mã hóa TcChi1-U535354
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................... 555556
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................. 565657

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Tab stops: 6.02",
Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:
…

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:
…


CÁC TỪ VIẾT TẮT
Amp

Ampicillin

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Bp

Cặp base

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

DNA

Deoxyribonucleic acid

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

EGFP

Enhanced greenflorescent protein

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

EtOH

Cồn (Ethanol)

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

GlcNAC

N-acetylglucosamine

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

GMOs

Genetically modified organisms

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

GUS

ß-Glucuronidase

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Kan

Kanamycin

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Kb

Kilo base (1kb = 1000bp)

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

LB

Luria broth

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

chain reaction)
RNA

Ribonucleic acid

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

RIP

Ribosome inactivating protein

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

rRNA

Ribosome ribonucleic acid

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

T-DNA

Transfer-DNA

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

TAE

Tris-acetate-EDTA

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Tm

Nhiệt độ nóng chảy

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

ISAAA

International Service for the Acquisition of

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Agri-biotech Aplications
v/p

Vòng/phút

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Formatted: Left

Amp

1


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Hình 1.1
Hình 2.1

Hình 3.1

Tên hình

Trang

Formatted: Font: Bold
Formatted: Centered

Theobroma cacao L.
Một số vector tạo dòng và biểu hiện thực vật sử
dụng trong nghiên cứu
Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen
mã hóa TcChi1

3
19

34

Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1 và
Hình 3.2

sản phẩm xử lý enzyme hạn chế BglII và NotI các
plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose

35

0,8%
Hình 3.3
Hình 3.4

Hình 3.5

Hình 3.6
Hình 3.7
Hình 3.8

Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NotI
Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pRTRATcChi1
Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid pRTRA tái
tổ hợp 0.8%
Hình ảnh điện di kết quả tạo pRTRA+TcChi1 trên
gel agarose 0,8%
Các vị trí nhận biết của enzyme HindIII
Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector
pCB301+TcChi1

37
38

Formatted: Font color: Auto

39

Formatted: Font color: Auto

40

Formatted: Font color: Auto

41
42

Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid tái tổ hợp
Hình 3.9

pCB301 mang gen mã hóa TcChi1

43

Formatted Table


Hình 3.10

Hình 3.11

Hình 3.12

Hình 3.13

Điện di sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng
HindIII trên gel agarose 0,8%
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa
TcChi1-U trên gel agarose 0,8%
Sơ

đồ

thiết

kế

vector

biểu

hiện

pPIPRA558+TcChi1-U
Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1-U
trên gel agarose 0,8%

Hình 3.14 Các vi trí nhận biết của enzyme BamHI và BglII
Hình 3.15

Điện di sản phẩm tinh sạch vector pPIPRA522 và
gen mã hóa TcChi1-U

Hình 3.16 Kiểm tra pPIPRA522 tái tổ hợp bằng BamHI
Hình 3.17

Sản phẩm tinh sạch pPIPRA558/PacI đã loại bỏ
cấu trúc FMV34S+GUS+E9

44

46

49

50

51
52
53
54

DANH MỤC CÁC BẢNG

Formatted: Font: Bold
Formatted: Centered

Bảng

Tên bảng

Trang

Formatted: Font: Bold
Formatted: Centered

Bảng 2.1

Trình tự các cặp mồi được sử dụng

20

Bảng 2.2

Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật

21

Bảng 2.3

Thông tin về các chủng vi khuẩn A. tumefacien tái 46
tổ hợp mang vector pCB+TcChi1


Ampicillin

Formatted

bp

Cặp base

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

EGFP

Enhanced greenflorescent protein

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtOH

Cồn (Ethanol)

Formatted: Indent: Left: 0.5"
Formatted: Font: 15 pt
Formatted: Centered, Indent: Left: 0"

GlcNAC
GMOs

N-acetylglucosamine

Genetically modified organisms
GUS

ß-Glucuronidase

Kan
Kb

Kanamycin
Kilo base (1kb = 1000bp)

LB

PCR

Luria broth

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction)
RNA
RIP

Ribonucleic acid

Ribosome inactivating protein

rRNA

Ribosome ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulphate
T-DNA

ISAAA

Transfer-DNA

TAE

Tris-acetate-EDTA

Tm

Nhiệt độ nóng chảy

International service for the acquisition of agribiotech aplications
v/p

Vòng/phút


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG

Formatted: Line spacing: single
Formatted: Font: 15 pt

DANH MỤC CÁC HÌNH
Field Code Changed

Hình 1.1: Theobroma cacao L ..................................................................... 336

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 2.1: Một số vector tạo dòng và biểu hiện thực vật sử dụng trong nghiên

Formatted: No underline, Font color: Auto

cứu .......................................................................................................... 19230
Hình 3.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa TcChi134384

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1 và sản phẩm xử lý enzyme

Formatted: No underline, Font color: Auto

hạn chế BglII và NotI các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8%
..................................................................................................................................... 35395
Hình 3.3: Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NotI .................... 374037

Formatted: No underline, Font color: Auto

Formatted:
No underline,
Auto k
Hình 3.4: Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pRTRA-TcChi13841Hình 3.4: Các
cấu trúc
gen vàFont
sơ color:
đồ thiết
Formatted:
underline,
Auto
Hình 3.5: Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid pRTRA tái tổ hợp 0.8%.3942Hình 3.5:
HìnhNoảnh
điệnFont
di color:
chọn
lọc

Formatted:
underline,

Font quả
color: Auto
Hình 3.6: Điện di kết quả tạo pRTRA+TcChi1 trên gel agarose 0,8%.4043Hình 3.6: Hình
ảnhNođiện
di kết
tạo pR

Hình 3.7: Các vị trí nhận biết của enzyme HindIII. ................................. 41431

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 3.8: Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1 ..... 42452

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 3.9 : Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid tái tổ hợp pCB301 mang

Formatted: No underline, Font color: Auto

gen mã hóa TcChi1.................................................................................. 43463
Hình 3.10: Điện di sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel

Formatted: No underline, Font color: Auto

agarose 0,8%. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; ............................................ 44474
Hình 3.11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1-U trên gel
agarose 0.8%. .......................................................................................... 46496

Formatted: No underline, Font color: Auto
Formatted: Font color: Auto

Hình 3.12: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pPIPRA558+TcChi1-U ...... 494953

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 3.13: Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1-U trên gel

Formatted: No underline, Font color: Auto

agarose 0,8% ........................................................................................... 50540
Hình 3.14: Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và BglII ................... 51551

Formatted: No underline, Font color: Auto


Hình 3.15: Điện di sản phẩm tinh sạch vector pPIPRA522 và gen mã hóa

Formatted: No underline, Font color: Auto

TcChi1-U .................................................................................................. 5255
Hình 3.16: Kiểm tra pPIPRA522 tái tổ hợp bằng BamHI ......................... 5356

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 3.17: Sản phẩm cắt pPIPRA558/PacI Error! Bookmark not defined.57

Formatted: No underline, Font color: Auto

để loại bỏ cấu trúc FMV34S+GUS+E9 ...... Error! Bookmark not defined.57

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 3.178: Sản phẩm tinh sạch pPIPRA558/PacI đã loại bỏ cấu trúc

Formatted: No underline, Font color: Auto

FMV34S+GUS+E9 ................................................................................... 5458

Formatted: No underline, Font color: Auto

Formatted: Font color: Auto

DANH MỤC CÁC BẢNG
Field Code Changed

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng ........................................... 2025

Formatted: No underline, Font color: Auto

Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật ............................... 2126

Formatted: No underline, Font color: Auto

Bảng 3.1: Thông tin về chủng.................................................................. 46504

Formatted: No underline, Font color: Auto


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

MỞ ĐẦU
Từ những năm 1970, với sự can thiệp của con người, quá trình chọn tạo
giống có thể vượt qua các rào cản tự nhiên. Công nghệ sinh học hiện đại sử
dụng các kỹ thuật DNA tái tổ hợp để biến đổi vi sinh vật, cây trồng hoặc vật
nuôi bằng cách đưa các gen có giá trị vào bộ gen của sinh vật nhận và nhanh
chóng tạo ra các sinh vật biến đổi gen (Genetically modofied organisms –
GMOs), mang những tính trạng mong muốn.
Phát triển cây trồng công nghệ sinh học dựa trên nền tảng khoa học kỹ
thuật DNA tái tổ hợp là một trong những hướng trọng tâm của công nghệ sinh
học nói chung và nông nghiệp nói riêng. Cây trồng công nghệ sinh học không
chỉ có khả năng kháng các bệnh do virus, vi khuẩn, nấm, kháng chất diệt cỏ,
chống chịu điều kiện bất lợi, góp phần tạo nền nông nghiệp sạch, ít dùng hóa
chất mà cây trồng công nghệ sinh học còn cải thiện chất lượng sản phẩm nông
nghiệp theo hướng gia tăng chất lượng dinh dưỡng, tăng giá trị thương mại
[1]. Trên thế giới, diện tích canh tác cây trồng công nghệ sinh học ngày càng
tăng. Theo số liệu của ISAAA (International service for the acquisition of
agribiotech aplications), trong năm 2011 diện tích trồng cây công nghệ sinh
học trên toàn thế giới đạt 160 triệu ha so với 148 triệu ha của năm 2010 (tăng
8%). Các quốc gia đã và đang tham gia mạnh mẽ vào lĩnh vực nghiên cứu và
thương mại cây trồng công nghệ sinh học trải khắp sáu lục địa: Bắc Mỹ, Mỹ
Latinh, châu Á, châu Đại Dương, châu Âu và châu phi, trong đó dẫn đầu là
Mỹ, Brazil, Argentina, Ấn Độ và Canada. Các giống cây trồng chính được
thương mại hóa bao gồm đậu tương, ngô, bông, cải dầu… Các tính trạng được
ưu tiên phát triển và ứng dụng là tính trạng kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn
trùng gây hại.

1

Formatted

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cùng với một số cây nông nghiệp và cây công nghiệp chính, ca cao
(Theobroma cacao L.) đang là đối tượng được quan tâm trong cải biến di
truyền nhằm tăng hơn nữa năng suất, chất lượng và tạo khả năng chống chịu
bệnh, thích nghi với các điều kiện sinh thái. Việc chuyển các gen kháng sâu,
kháng nấm để tạo giống ca cao kháng bệnh là vấn đề được đặc biệt lưu tâm ở
các quốc gia ưu tiên phát triển cây ca cao, trong đó có Việt Nam.
Với mục đích tạo các vật liệu phục vụ việc chuyển gen kháng nấm có
nguồn gốc thực vật vào cây ca cao nói riêng và các cây trồng khác nói chung,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens mang gen mã hóa chitinase từ Theobroma cacao L.” với
những nội dung chính sau:
1. Nhân gen mã hóa chitinase có nguồn gốc từ hệ gen cây ca cao bằng
kỹ thuật PCR;
2. Tạo dòng gen mã hóa chitinase trong vector tạo dòng;
3. Thiết kế và tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase;
4. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện thực
vật đã tạo được.
Đề tài luận văn được tiến hành tại Phòng Công nghệ DNA Ứng dụng
và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học;
Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen (thuộc Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam). Đây là các phòng thí nghiệm có đầy đủ các
trang thiết bị kỹ thuật hiện đại, đã và đang tiến hành các nghiên cứu phân lập
gen, thiết kế vector và chuyển gen vào nhiều đối tượng cây trồng.

2

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY CA CAO VÀ TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN
1.1.1. Giới thiệu chung về cây ca cao
 Hình thái giải phẫu, phân loại học và phân bố của cây ca cao
 Hình thái giải phẫu
Theobroma cacao L.
Giới :

Thực vật

Bộ :

Malvales (Cẩm quỳ)

Họ :

Malvaceae (Cẩm quỳ)

Phân họ: Byttnerioideae (Trôm
leo)
Chi :

Theobroma

Loài:

T. cacao L.

Hình 1.1: Theobroma cacao L.

Ca cao là cây thường xanh tầng trung, cao 4 - 8 m (15 - 26 ft). Cây
thích hợp với những vùng có nhiệt độ trung bình 25 - 28 độ, độ ẩm trung bình
85%, lượng mưa hàng năm 1.500 - 2.000 mm. Cây có ưu điểm 1 năm thu 2
vụ, nhu cầu nước không lớn, ít phải tưới, không kén đất nhưng cũng không
chịu được các vùng quá khô hạn như đất cát hoàn toàn.
 Phân loại học
Từ năm 1882, loài T. cacao L. đã được Morris phân loại ra 2 loài phụ:
Criollo và Forastero. Criollo có hạt dạng tròn, nội nhũ trắng, có hương vị nhẹ

3

Formatted: Font: 15 pt


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

và tương đối dễ nhiễm bệnh. Criollo gồm 2 dòng chính là Criollo Mexico và
Criollo Lagarto. Mặc dù có nhiều đặc tính tốt nhưng ngày nay Criollo gần
như không được trồng do cây không khỏe và rất dễ nhiễm bệnh, thời gian cho
quả lâu, 4-5 năm. Forastero gồm nhiều dòng ca cao thuần, nửa hoang dại và
hoang dại. Quả Forastero màu xanh lá cây tươi sáng, khi chín thì vàng, dáng
hình bầu dục, không có rãnh sâu, vỏ dày và cứng, rất khó cắt vì chứa nhiều
chất gỗ. Hạt ít nhiều dẹp, lá mầm chưa ủ màu tím đậm như nếp than, hạt nhỏ
hơn Criollo nhưng hương vị đậm hơn. Có 3 dòng Forastero chính gồm:
Angoleta, Cundeamor và Amelonado. Trong đó dòng ca cao Amelonado được
trồng mạnh nhất, cung cấp hầu hết số ca cao thông thường trên thế giới.
Ngoài ra, còn 2 giống loài hoang dại thường gặp là T. bicolor và T.
grandiflorum [29][30].

Field Code Changed

 Phân bố cây ca cao
Nguồn gốc của cây ca cao là từ Trung Mỹ và Mexico, được những
người Aztec và Maya bản xứ khám phá. Chúng tồn tại dưới tầng đặc hữu của
khu rừng nhiệt đới ẩm thấp Amazon. Từ đây, ca cao phát triển rộng sang
nhiều quốc gia khác trên thế giới, tập trung ở khu vực Nam Mỹ và Tây Phi.
Ca cao đặc biệt thích hợp ở những quốc gia có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm.
Những khu vực trồng ca cao phần lớn tập trung ở những điểm nóng đa dạng
sinh học quan trọng trên thế giới, trong đó có đến 13 vùng được coi là đa dạng
sinh học nhất [32]. Theo xếp loại của Tổ chức Ca cao Thế giới thì hai quốc
gia dẫn đầu về sản lượng ca cao hiện nay là Bờ Biển Ngà (Côte d’Ivoire) và
Ghana (thuộc Tây Phi) [43]. Ở khu vực châu Á, từ năm 1985 trở lại đây, ca
cao được phát triển khá mạnh, tiến tới trở thành vùng trồng ca cao lớn không
kém Nam Mỹ và châu Phi. Các quốc gia sản xuất ca cao hàng đầu ở khu vực
này là Indonesia và Malaysia. Việt Nam cũng nằm trong cùng vĩ độ “ca cao”

4


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

với Ghana, Bờ Biển Ngà, Indonesia, Malaysia với khí hậu nhiệt đới mưa
nhiều, đất đai màu mỡ, rất thích hợp với cây ca cao.
 Giá trị kinh tế của cây ca cao trong nền kinh tế quốc dân
Cây ca cao là cây kinh tế quan trọng đem lại lợi nhuận rất cao nhờ xuất
khẩu cho một số quốc gia trên thế giới. Hạt ca cao, được xem là “Thực phẩm
từ Thượng đế”, là nguồn cung cấp thực phẩm giàu dinh dưỡng không thể
thiếu của con người. Ca cao cho hạt làm nguyên liệu sử dụng cho ngành công

nghiệp thực phẩm để sản xuất các sản phẩm cao cấp như chocolate... Ngành
công nghiệp sản xuất chocolate với vật liệu chính là hạt ca cao trị giá nhiều tỷ
dollar. Tại Mỹ, việc sử dụng ca cao và bơ ca cao trong sản xuất chocolate, mỹ
phẩm và các sản phẩm khác mang lại lợi nhuận khoảng 70 tỷ USD [28][29].
Bên cạnh đó, gần đây ca cao còn được chứng minh về tác dụng phòng các
bệnh tim mạch. Các flavanol và procyanidin có trong hạt ca cao đã thể hiện
khả năng chống oxi hóa mạnh trong các thử nghiệm in vitro [20]. Các ứng
dụng của hạt ca cao đã một lần nữa khẳng định giá trị quan trọng của loài cây
công nghiệp này.
Ngoài ra, trồng ca cao còn mang lại những lợi ích về môi trường. Do ca
cao là loại cây ưa bóng với thời gian thu hoạch trên 50 năm, có thể trồng dưới
tán những cây lâu năm khác, chúng mang lại các lợi ích như tăng cường đa
dạng sinh học, bảo vệ hành lang đầu nguồn, đất, nguồn nước và các vùng đệm
của những khu rừng nhiệt đới [31][33]. Các tổ chức quốc tế như USAID,
Conservation International, The World Wildlife Federation và The World
Cocoa Foundation đã nhận thức được vai trò của ca cao trong việc ổn định
nền kinh tế địa phương và môi trường nên đã khuyến khích nông dân trồng ca
cao trong những khu vực này [16].

5


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Trên toàn thế giới, nhìn chung việc trồng, chế biến, tiêu thụ các sản
phẩm của cây ca cao đang có xu hướng tăng rất cao và nhanh nhờ sự phát
triển kinh tế năng động với mức sống của hàng tỷ người được nâng cao và các
sản phẩm ca cao, trước đây coi như mặt hàng của những người giàu, nay dần
dần sẽ được tiêu thụ phổ biến hơn. Sản lượng ca cao sản xuất hàng năm rất
bấp bênh, không đủ đáp ứng nhu cầu… do bị ảnh hưởng bởi sâu bệnh, giống

bị thoái hóa, sự cạnh tranh của các loại cây trồng khác, kỹ thuật canh tác
kém... Trong đó, bệnh thường gặp ở ca cao do nấm hoặc côn trùng gây ra.
Một số bệnh hại chính do nấm bao gồm: Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (do
nấm Phytophthora palmivora); Bệnh khô vỏ thân (do nấm Colletotrichum
gloeosporioides); Bệnh vết sọc đen (do nấm Oncobasidium theobromae);
Bệnh nấm hồng (do nấm Corticium salmonicolor)… Để phòng trị các bệnh
trên cây ca cao, bên cạnh các biện pháp canh tác và xử lý như tỉa cành hợp lý
tạo thông thoáng, tiêu hủy cành, lá và trái bị bệnh, nhổ bỏ cây con… thì đều
cần phun, tiêm các loại thuốc hóa học – tác nhân gây ô nhiễm môi trường và
tác động xấu đến sức khỏe của người dân. Vì vậy, việc phát triển ca cao bền
vững, chuyển dịch cơ cấu cây trồng, nâng cao chất lượng giống, hạt ca cao là
những vấn đề được đặc biệt lưu tâm ở các quốc gia ưu tiên phát triển cây ca
cao.
1.1.2. Tình hình phát triển cây ca cao ở Việt Nam
Nhận thức rõ vai trò quan trọng của cây công nghiệp này đối với sự
phát triển kinh tế – xã hội của đất nước, Ban Điều phối Phát triển Ca cao Việt
Nam đã được thành lập theo Quyết định số 803/QĐ-BNN do Bộ Nông nghiệp
và Phát triển Nông thôn ký ngày 11 tháng 4 năm 2005. Sau đó, ngày 14 tháng
9 năm 2007, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã phê duyệt Đề án
phát triển ca cao đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 (Kèm theo
Quyết định số 2678/QĐ/BNN-KH), trong đó đặt mục tiêu cụ thể là “Đến năm

6


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

2015, dự kiến diện tích cây ca cao đạt 60.000 ha, trong đó có 35.000 ha kinh
doanh, năng suất bình quân 15 tạ/ ha, sản lượng hạt khô đạt 52.000 tấn, kim
ngạch xuất khẩu đạt 50 – 60 triệu USD...”.

Các chính sách, chương trình ưu tiên phát triển chiến lược của Chính
phủ cũng như sự hợp tác nhiều mặt của các tổ chức quốc tế, cùng với những
thế mạnh rõ rệt về khí hậu, thổ nhưỡng, nguồn nhân lực, là cơ sở đưa Việt
Nam vào bản đồ ca cao quốc tế, trở thành quốc gia giàu tiềm năng cung cấp
ca cao. Một số dự án liên quan đến phát triển ca cao ở các vùng miền có khí
hậu, thổ nhưỡng thích hợp đã được triển khai, trong đó đặc biệt đáng chú ý là
Chương trình phát triển ca cao do nhóm nghiên cứu đứng đầu bởi TS. Phạm
Hồng Đức Phước, Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. Chương trình đã đạt
được thành công rực rỡ. Kết quả đạt được của các dự án là nhiều giống ca cao
mới như TD1, TD2, TD3, TD5, TD6, TD8, TD10, TD14 đã được Bộ Nông
nghiệp và Phát triển Nông thôn cho phép phát triển ở các vùng trồng ca cao
thuộc các tỉnh phía Nam. Tổng diện tích canh tác ca cao ở nước ta tăng nhanh
mỗi năm, đạt hơn 20.600 ha (năm 2012). Theo quy hoạch, diện tích ca cao
của nước ta đến năm 2015 là 35.000 ha, trong đó diện tích thu hoạch khoảng
7.000 ha và năng suất bình quân 0,7 tấn/ ha. Đến năm 2020, diện tích canh tác
ca cao dự kiến đạt 50.000 ha, tập trung tại các tỉnh: Bình Phước, Bến Tre, Đăk
Lăk, Đăk Nông, Tiền Giang, Bà Rịa – Vũng Tàu [42].

7


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

1.2. THỰC TRẠNG VÀ TRIỂN VỌNG CHUYỂN GEN CÓ GIÁ TRỊ
VÀO CÂY TRỒNG VÀ CÂY CA CAO
1.2.1. Chuyển gen vào cây trồng
Mục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải biến di truyền
cây trồng, vật nuôi... nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông
nghiệp. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng
phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra

con lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện
bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. Tuy
nhiên, phép lai chéo này bị hạn chế bởi chỉ có thể thực hiện được giữa các cá
thể cùng loài. Nhờ những thành tựu trong lĩnh vực DNA tái tổ hợp, công nghệ
chuyển gen ra đời đã cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây
trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,
không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau.
Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được
giống mới và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống.
Cây trồng công nghệ sinh học là cây mang một hoặc nhiều gen được
đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây.
Những gen được đưa vào cây nhận có thể được phân lập từ những loài thực
vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. Nhìn chung,
việc ứng dụng cây trồng công nghệ sinh học đã có những lợi ích rõ rệt như
tăng sản lượng, giảm chi phí sản xuất, tăng lợi nhuận nông nghiệp, cải thiện
môi trường. Nhiều cây trồng công nghệ sinh học quan trọng ra đời như lúa,
ngô, lúa mỳ, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp
cải... Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng

8


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

côn trùng gây hại, gen cải tiến protein hạt, gen có khả năng sản xuất những
loại protein mới, gen chịu hạn, gen bất thụ đực, gen kháng thuốc diệt cỏ...[4].
Trên thế giới, quốc gia dẫn đầu lĩnh vực nghiên cứu và thương mại cây
trồng công nghệ sinh học là Hoa Kỳ (69 triệu ha), Brazil (30,3 triệu ha),
Argentina (23,7 triệu ha); Ấn Độ (10,6 triệu ha) và Canada (10,4 triệu ha).
Trong 16 năm (1996 - 2010), diện tích đất canh tác cây trồng công nghệ sinh

học trên toàn cầu đã tăng liên tục tới hơn 80 lần (từ 1,7 triệu ha vào năm 1996
lên 160 triệu ha trong năm 2010). Năm 2011, cây trồng công nghệ sinh học đã
được gieo trồng ở 29 quốc gia với sự tham gia của 16,7 triệu nông dân, lên
1,3 triệu so với năm 2010 – đáng chú ý là 15 triệu hoặc 90% là nông dân
nghèo từ các nước đang phát triển. Các loại cây trồng công nghệ sinh học
được trồng nhiều nhất hiện nay là đậu tương, bông, ngô và cải dầu với hai
tính trạng được sử dụng phổ biến là tính trạng kháng thuốc diệt cỏ và kháng
côn trùng [17][18].

Formatted: Not Highlight
Field Code Changed

Ở nước ta, trong vài năm trở lại đây, hướng nghiên cứu chọn tạo giống
bằng công nghệ gen và công nghệ tế bào được đặc biệt quan tâm. Trên quy
mô cả nước, một số phòng thí nghiệm công nghệ gen và công nghệ tế bào
thực vật đã và đang được nhà nước đầu tư trang thiết bị, có thể triển khai các
kỹ thuật hiện đại. Chính phủ đã và đang ưu tiên đầu tư cho một số dự án tạo
cây trồng công nghệ sinh học như: (1) Phân lập các gen có giá trị kinh tế của
cây trồng nông lâm nghiệp Việt Nam, thiết kế vector, tạo các chủng
Agrobacterium phục vụ cho tạo giống cây trồng chuyển gen; (2) Phân lập và
thiết kế các vector mang gen điều khiển tính chịu hạn phục vụ công tác tạo
giống cây chuyển gen; (3) Tạo dòng ngô biến đổi gen kháng sâu và kháng
thuốc diệt cỏ; (4) Nghiên cứu tạo giống bưởi và cam không hạt bằng công
nghệ sinh học; (5) Nghiên cứu tạo giống bèo tấm và nấm men tái tổ hợp mang
kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm gia cầm… Bước đầu, một số kết

9