Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng

MỞ ĐẦU
Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với
thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng
nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc
biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ
biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi
trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn
trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống
kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm
trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng
nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ
thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo
vệ.
Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ
sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ
con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ
thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền
vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified
Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo
dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng
thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông
nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử
dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống,
nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng
các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc
tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng
loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như
1
gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và
ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm
là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh.

Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên
cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung
điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là
phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với
ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp
này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều
nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen
có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ
trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới
chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện
Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia),
Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long
(thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng
gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên,
phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ
quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hoặc các giải pháp hữu ích. Về
khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ
hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hoặc công
ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement,
MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho
mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên
cứu, sở hữu, chuyển giao... Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có
giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn
phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách
đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và
vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng
2
nhm mc ớch chuyn v biu hin cỏc gen ny trong cỏc i tng cõy trng
nc ta.
Trờn c s ý ngha lý lun v thc tin ca hng nghiờn cu ny, chỳng tụi

ó tin hnh ti: To chng vi khun Agrobacterium tumefaciens mang gen
khỏng cụn trựng chuyn vo cõy trng, vi cỏc mc ớch v ni dung nghiờn
cu chớnh sau õy:
Mục đích nghiên cứu
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ gen để nghiên cứu các đoạn
khởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tính kháng côn trùng. Trên cơ sở đó, thiết kế
các vectơ Ti-plasmit và tạo chủng A. tumefaciens phục vụ công nghệ chuyển gen nhằm
mục đích nâng cao tính kháng sâu bệnh của cây trồng.
Nội dung nghiên cứu
Su tập và phân lập các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tính
kháng côn trùng.
Thiết kế các vectơ Ti-plasmit mang gen kháng côn trùng dới sự điều khiển của
đoạn khởi động cơ định hoặc đoạn khởi động đặc hiệu thực vật trong tế bào E. coli.
Tạo các chủng A. tumefaciens mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn
trùng để chuyển vào cây trồng.
Thiết kế vectơ và biểu hiện gen kháng côn trùng trong tế bào E. coli.
Tạo kháng thể kháng protein có hoạt tính diệt côn trùng phục vụ cho nghiên cứu
và giám định cây chuyển gen.
Những đóng góp mới của luận án
Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh sau:
1. Đã nhân, tạo dòng và đọc trình tự đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza
synthaza (sucrose synthase) ở giống lúa C71 có khả năng điều khiển sự biểu hiện
gen đặc hiệu ở bó mạch. Đây là đoạn khởi động gen đầu tiên đợc phân lập và đọc
3
trình tự từ một giống lúa Việt Nam. Trình tự của đoạn khởi động này đã đợc
đăng ký trong các Ngân hàng trình tự gen quốc tế.
2. Đã tạo đợc một kết cấu gen mới đó là gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn
khởi động đặc hiệu bó mạch C71S-P nhằm mục đích chuyển vào các giống lúa
Việt Nam tạo khả năng kháng sâu đục thân lúa.
3. Đã thiết kế thành công 4 vectơ Ti-plasmit mới, cung cấp nguyên liệu cho các

nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng và nghiên cứu đoạn khởi động. Trong đó,
gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động Ubiquitin hoặc đoạn khởi
động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71 đã đợc đa vào vectơ Ti-
plasmit cải tiến và vectơ chuyển gen thế hệ mới nhất sử dụng hệ thống chọn lọc
tích cực (Positive Selection System).
4. Đã hoàn thiện và sử dụng phơng pháp xung điện và phơng pháp phối ba bố mẹ
để tạo 4 chủng A. tumefaciens mới, trên cơ sở các chủng LBA4404 và EHA105,
mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng.
5. Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã thành công trong việc biểu hiện gen
cryIA(c) tổng hợp hoá học bằng vi khuẩn E. coli. Protein CryIA(c) tái tổ hợp sau
khi tinh chế đã đợc dùng để sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) nhằm mục đích
sử dụng làm công cụ kiểm tra sự có mặt của sản phẩm gen cryIA(c) ở các cây
trồng đợc chuyển gen.
6. Các vectơ Ti-plasmit mới đã và đang đợc Viện Công nghệ Sinh học chuyển vào
lúa và các loại cây trồng quan trọng khác. Ngoài ra, 2 chủng A. tumefaciens mới
cũng đã đợc chuyển giao cho Viện Nghiên cứu Ngô (thuộc Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn) nhằm triển khai các nghiên cứu hợp tác chuyển gen cry
vào cây ngô Việt Nam.
4
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1 Vi khuẩn đất A. tumefaciens và phơng pháp chuyển gen
vào cây trồng
1.1.1 A. tumefaciens và hiện tợng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên
Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai
lá mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất
A. tumefaciens. Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu di
truyền của loài vi khuẩn này đã đợc Braun và Schilperoort khám phá. A. tumefaciens
có khả năng xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thơng của
cây chủ. Trong tự nhiên, A. tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là
nhóm thực vật có hoa. Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi và thuỷ tiên

mẫn cảm yếu với A. tumefaciens [34].
Hoàn toàn khác với mô và tế bào thực vật bình thờng, khối u do A. tumefaciens
sinh ra phát triển rất mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trởng (auxin và
cytokinin). Sở dĩ nh vậy vì A. tumefaciens đã chuyển một đoạn ADN (Transfer DNA
- T-ADN) sang tế bào thực vật và T-ADN điều khiển quá trình sinh tổng hợp các
hợp chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp opin là các axit amin (amino
acid - aa) đặc biệt và các dẫn xuất của đờng. Dạng opin đợc tổng hợp có thể là
nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin phụ thuộc vào từng chủng
Agrobacterium. Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opin phổ biến. Opin đợc vi
khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hoá
opin trên plasmit gây khối u thực vật (Tumour inducing plasmid - Ti-plasmit) [44],
[109].
Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã đợc quan tâm nghiên cứu nhằm
tìm ra phơng thức phòng trừ bệnh cho cây. Tuy nhiên, khi phát hiện ra Ti-plasmit và
khả năng tự chuyển T-ADN vào genom thực vật, ngời ta đã đặc biệt chú ý và khai
5
thác khả năng sử dụng chúng nh một vectơ tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào
thực vật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn [34], [37], [54].
1.1.1.1 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmit
Zaenen & đtg, Đại học Ghent (Bỉ) là nhóm tác giả đầu tiên phát hiện A.
tumefaciens mang một cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể chứa hầu hết các gen
liên quan đến sự hình thành khối u. Tuy nhiên, họ nghĩ rằng đó là bản sao của một
loại virut xâm nhiễm vi khuẩn. Thực tế, yếu tố di truyền này chính là một plasmit
khổng lồ với kích thớc khoảng 200 kb. Các chủng vi khuẩn có quan hệ gần gũi, nh
vi khuẩn tạo nốt sần ở rễ (Rhizobium trifolii) và ở lá (Phyllobacterium
myrsinacearum) cũng có khả năng hình thành khối u ở thực vật khi bị nhiễm Ti-
plasmit. Điều đó khẳng định vai trò quan trọng của yếu tố lây nhiễm nằm trên Ti-
plasmit đối với sự hình thành khối u ở cây chủ [54].
Ti-plasmit (hình 1.1) đợc tìm thấy ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây
nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dới 30

0
C. Đây là một phân tử ADN mạch vòng,
sợi kép và tồn tại trong tế bào nh một đơn vị sao chép độc lập. Phân tích di truyền
cho thấy, Ti-plasmit dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, đều có
4 vùng tơng đồng, trong đó vùng T-ADN và vùng gây độc (Virulence Region - vùng
VIR), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. Hai vùng còn lại chứa
gen mã hoá cho việc sao chép plasmit (Origin of replication) và chuyển nạp
(Conjugative transfer) [34].
Trên Ti-plasmit, chỉ có vùng T-ADN đợc chuyển từ vi khuẩn sang genom của
cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở đó [87]. Tuy nhiên, vùng này lại không mã hoá
những sản phẩm làm trung gian cho quá trình chuyển T-ADN mà cần có sự trợ giúp
đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn
(chv genes). Vùng VIR dài khoảng 40 kb đảm nhận chức năng gây nhiễm. ở Ti-
plasmit dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các
gen này mã hoá đã kích thích sự tách biệt T-ADN, bao bọc che chở và giúp chúng
tiếp cận với genom của cây chủ. Ngoài các gen vir, các gen trên nhiễm sắc thể của
6
A. tumefaciens (nh chvA và chvB) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm
nhập của A. tumefaciens vào thành tế bào thực vật [34], [109].
Hình 1.1. Bản đồ Ti-plasmit dạng octopin
1.1.1.2 Cấu trúc và chức năng của đoạn T-ADN
Trong genom của cây bị khối u, số lợng bản sao của T-ADN dao động từ một
vài đến hơn 10. Chúng có thể nằm trên cùng một locut hoặc tách rời và gắn với các
vùng khác nhau trên genom thực vật một cách ngẫu nhiên. ở cà chua, 7 đoạn T-
ADN đã gắn vào 5 nhiễm sắc thể thực vật, trong khi ở Crepis capillaris, T-ADN chỉ
đợc tìm thấy trên 3 nhiễm sắc thể [109].
Kết quả phân tích trình tự gen trên T-ADN ở các Ti-plasmit khác nhau cho
thấy, T-ADN đợc giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn từ khoảng
25 bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâm
nhập của T-ADN vào tế bào thực vật. ở đoạn biên phải (Right Border - RB) có yếu

tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-ADN. Đoạn biên trái (Left Border -
7
LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-ADN và là dấu hiệu để quá trình này
kết thúc bình thờng [147], [152]. ở Ti-plasmit dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào
genom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi, ở Ti-plasmit dạng
octopin, đoạn T-ADN này chỉ dài 13 kb. ở một số mô thực vật, khối u lại chứa một
đoạn ADN kích thớc 8 kb [208]. T-ADN mang rất nhiều gen nh: (1) Các gen mã hoá
những enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u nh
tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin
và cytokinin [34], [109].
1.1.1.3 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật
Các tế bào cây bị tổn thơng sẽ tiết ra các hợp chất dẫn dụ hoá học vi khuẩn
nh acetosyringon, -hydroxy-acetosyringon. Dới tác dụng của các hợp chất này, A.
tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào
thực vật. Quá trình này đợc sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và đoạn biên phải,
trái [32], [34]. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen
vùng VIR hoạt động và tăng cờng biểu hiện. Khi vi khuẩn xâm nhiễm tế bào thực
vật qua vết thơng, sản phẩm gen virA sẽ nhận biết sự có mặt và tơng tác với các phân
tử acetosyringon rồi truyền thông tin ngoại bào này vào trong tế bào dẫn đến sự hoạt
động của các protein VirG. Tiếp theo, VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác nh
virB, virC, virD và virE cũng nh tăng cờng mức độ phiên mã của virG [34], [44],
[144]. Sau đó, virD hỗ trợ quá trình tách T-ADN thành hai sợi đơn. Một sợi sẽ
chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' đi trớc. Sợi đơn còn lại sẽ làm khuôn để tổng
hợp nên sợi ADN bổ sung mới. Trong quá trình di chuyển, sợi ADN đơn đợc gắn với
protein VirE để chui qua rất nhiều màng trớc khi vào đợc đến nhân tế bào thực vật.
Protein VirB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-ADN
sợi đơn sang tế bào thực vật (hình 1.2) [209], [210]. Quá trình chuyển T-ADN này
gần giống với quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn, trong đó protein VirB tơng đơng với yếu
tố F, hoạt động nh một cầu nối chuyển gen. Sau khi T-ADN qua màng tế bào, chúng
đi thẳng vào nhân và kết hợp với genom thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên. Tại đó,

các gen trên T-ADN, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản
8
sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào
lân cận dẫn đến sự hình thành khối u.
Hình 1.2. Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật [208]
1.1.2 Công nghệ gen thực vật và kỹ thuật chuyển gen nhờ A. tumefaciens
1.1.2.1 Hệ thống chuyển gen nhờ A. tumefaciens
Nhìn chung, hệ thống chuyển gen này bao gồm các giai đoạn: (i) Chuyển
vùng T-ADN vào genom thực vật; (ii) Biểu hiện gen quan tâm (Gene of Interest)
trong tế bào thực vật; (iii) Tái sinh tế bào thực vật thành cây hoàn chỉnh. Những yếu
tố quan trọng và cần thiết cho hệ thống chuyển gen này bao gồm: (1) Các gen vir;
(2) Đoạn biên phải và trái; (3) Vùng T-ADN: ngoài hai đoạn biên, hầu hết các gen
trên T-ADN có thể đợc loại bỏ và thay thế bằng các gen quan tâm để chuyển vào
cây trồng. Đoạn T-ADN đợc cải biến di truyền này gọi là T-ADN bị vô hiệu hoá
(disarmed T-DNA), mất chức năng gây khối u; (4) Vùng mang các yếu tố điều
khiển cis: nh đoạn khởi động và đoạn kết thúc hỗ trợ và điều khiển sự biểu hiện các
gen; (5) Các gen chỉ thị chọn lọc [71].
9
Các loại vectơ Ti-plasmit nhân tạo: Ti-plasmit tự nhiên có kích thớc quá lớn
nên rất khó để sao chép ở mức phân tử cũng nh không đơn giản để tiến hành chuyển
gen. Mặt khác, chúng lại chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trởng thực vật và
opin không cần thiết và gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không đợc dùng trực
tiếp làm vectơ. Trên cơ sở này, Ti-plasmit đã đợc nghiên cứu cải biến nh cắt bỏ các
gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng (Multi
Cloning Site - MCS) tạo hai hệ thống vectơ chuyển gen hiệu quả: vectơ liên hợp (co-
integrate vector) và vectơ hai nguồn (binary vector) [197]. Nhờ vậy, cây trồng đợc
biến nạp Ti-plasmit cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và
phát triển bình thờng [66], [90].
a) Vectơ liên hợp: đợc xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tơng đồng
nằm trên plasmit vi khuẩn (nh vectơ của E. coli) với vùng T-ADN trên Ti-plasmit

của A. tumefaciens. Trong đó, ngời ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng mã hoá chức
năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn ADN mới trong Ti-plasmit (hình 1.3).
Nh vậy, có ba loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp: (1) Ti-plasmit: các
gen gây khối u đã bị vô hiệu hoá bằng cách thay thế vào đó gen kháng kanamycin
của vi khuẩn (Hệ thống vectơ SEV) hoặc một đoạn trình tự của vectơ pBR322 (Hệ
thống vectơ pGV); (2) Vectơ trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thớc nhỏ
và đợc sử dụng để bổ trợ chức năng không u việt của Ti-plasmit (kích thớc lớn và
thiếu vùng MCS). Chúng đợc nhân lên trong E. coli và chuyển sang A. tumefaciens
nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể sao chép trong A. tumefaciens nên chúng mang
những đoạn ADN tơng đồng với T-ADN. (3) Vectơ trợ giúp: tồn tại trong E. coli, có
kích thớc nhỏ, chứa các gen di động (mobilization) và gen chuyển (transfer) giúp
cho quá trình tiếp hợp và chuyển gen vào A. tumefaciens [197].
Khi tiếp hợp, Ti-plasmit và vectơ trung gian đã xảy ra quá trình tái tổ hợp, gen
quan tâm đợc chuyển từ E. coli sang vùng T-ADN của A. tumefaciens để tạo ra cấu
trúc T-ADN liên hợp. Nh vậy, vectơ liên hợp thờng bao gồm các thành phần chính:
(1) Các vị trí tạo dòng thích hợp; (2) Các gen vir; (3) Đoạn biên phải và trái; (4) Gen
quan tâm; (5) Chỉ thị chọn lọc vi khuẩn hoạt động trong E. coli và A. tumefaciens;
10
(6) Chỉ thị chọn lọc thực vật; (7) Vùng sao chép trong E. coli [186]. Vectơ pGV3850
là một vectơ liên hợp điển hình do Zambryski & đtg [207] thiết kế. Các gen gây
khối u trên Ti-plasmit dạng nopalin (C58) đã bị loại bỏ và thay thế bằng pBR322.
Gen quan tâm đợc tạo dòng trong pBR322 và đợc đa vào vùng T-ADN của
pGV3850 thông qua quá trình tái tổ hợp với sự trợ giúp của pGJ28 và pR64drd11
trong tế bào E. coli GJ28. Ngoài pGV3850, hàng loạt vectơ liên hợp khác cũng đã đ-
ợc sử dụng nh pMON200, pMON273, pGV831...
Mặc dù, vectơ liên hợp đợc thiết kế cho phép sự tái tổ hợp đặc hiệu vị trí dựa
trên hệ thống tái tổ hợp của phagơ P1 (nh thế hệ wP1/ oxP-Cre), nhng vectơ này ít đ-
ợc sử dụng, do:
(i) Những trình tự tơng đồng rất dài giữa Ti-plasmit và plasmit của E. coli
gây khó khăn khi thao tác và sử dụng;

(ii) Hiệu quả chuyển gen thấp với số lợng bản sao của vectơ rất ít [197].

Hình 1.3. Sơ đồ vectơ liên hợp
11
b) Vectơ hai nguồn: Trên cơ sở phát hiện vùng VIR không cần nằm trên cùng một
plasmit với vùng T-ADN mà vẫn điều khiển đợc sự chuyển và xâm nhập của T-
ADN vào genom thực vật, ngời ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống chuyển
gen thực vật nhờ vectơ hai nguồn trong đó vùng T-ADN và vùng VIR nằm trên hai
plasmit khác nhau nhng trong cùng một chủng A. tumefaciens. Có hai loại vectơ đ-
ợc sử dụng trong hệ thống vectơ hai nguồn: (1) Plasmit nhỏ có khả năng tự sao chép
và có phổ vật chủ rộng chứa gen quan tâm trên T-ADN, đoạn biên phải và trái, chỉ
thị chọn lọc và sao chép trong E. coli và A. tumefaciens, chỉ thị chọn lọc thực vật;
(2) Ti-plasmit trợ giúp: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng VIR đợc giữ lại
nhng loại bỏ hoàn toàn vùng T-ADN và đoạn biên phải, trái (hình 1.4) [104], [105].
Hình 1.4. Sơ đồ vectơ hai nguồn
Nhìn chung, quá trình biến nạp ở vectơ hai nguồn diễn ra nh sau: (i) Plasmit
nhỏ đợc nhân lên trong E. coli, sau đó đợc chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếp
hợp vào tế bào A. tumefaciens chứa sẵn Ti-plasmit trợ giúp; (ii) Tế bào thực vật đợc
nuôi cấy đồng thời với A. tumefaciens để chuyển T-ADN vào genom thực vật; (iii)
Chọn lọc tế bào thực vật trong những điều kiện thích hợp [37].
12
Thực tế cho thấy, plasmit với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững
trong E. coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vectơ hai nguồn có một
số u điểm nh: (i) Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmit; (ii) Kích thớc
vectơ khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E. coli sang A.
tumefaciens đã tăng lên. Hiện nay, vectơ hai nguồn đợc sử dụng rộng rãi với rất
nhiều loại đợc thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen nh:
Thế hệ vectơ pGA bao gồm: (1) Vùng sao chép trong E. coli và A. tumefaciens
có nguồn gốc từ RK2; (2) Yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình tiếp hợp; (3) Đoạn
biên phải và trái; (4) Gen mã hoá neomycin phosphotransferaza II (neomycin

phosphotransferase II gene - nptII) kháng kanamycin và G418 trong thực vật; (5)
Vùng MCS. Một số vectơ đặc biệt trong thế hệ pGA nh pGA580, pGA581-583 đã đ-
ợc thiết kế với: (i) vùng sao chép ColE1 hoạt động trong E. coli (nguồn gốc từ
pBR322), và một đoạn trình tự chứa vị trí cos của phagơ Lambda nhằm phân lập các
đoạn có kích thớc lớn tới 40kb; (ii) vùng MCS nằm kề gen mã hoá chloramphenicol
acetyltransferaza (chloramphenicol acetyltransferase gene - cat) khuyết đoạn khởi
động tạo điều kiện để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của đoạn khởi động; (iii) Có
vùng MCS nằm giữa đoạn khởi động thực vật và đoạn kết thúc để gắn và biểu hiện
các gen quan tâm [31].
Hệ thống vectơ pCG với: (1) Vùng sao chép có nguồn gốc từ pRiHRI của A.
rhizogenes giúp pCG bền vững hơn trong A. tumefaciens so với vùng sao chép từ
RK2; (2) Vùng ColE1 hoạt động trong E. coli [140].
Thế hệ vectơ pCIT: có chứa vùng MCS và chỉ thị chọn lọc thực vật, nh gen mã
hoá hygromycin phosphotransferaza (hygromycin phosphotransferase gene - hpt)
kháng hygromycin ở vectơ pCIT30, hoặc nptII ở vectơ pCIT101-104. Các vectơ
khác có vị trí Lambda cos cho phép phân lập các đoạn có kích thớc lớn tới 46 kb và
chứa các vùng cần thiết để chuyển gen nhờ A. tumefaciens [137].
pGPTV: chứa gen chọn lọc thực vật, nh nptII, hpt, gen mã hoá phosphinothricin
acetyl transferaza (phosphinothricin acetyl transferase gene - bar) nằm kề vị trí LB
13
nhằm tăng cờng khả năng chuyển gen quan tâm vào tế bào thực vật và biểu hiện gen
chỉ thị chọn lọc [37].
pPZP: có kích thớc nhỏ và rất đa năng với các đặc tính: (1) Chứa đoạn biên phải và trái
của pTiT37; (2) Các vùng ColE1 và pVS1 để sao chép trong E. coli và A. tumefaciens; (3)
Chỉ thị chọn lọc vi khuẩn nh chloramphenicol (pPZP100) hoặc Spectinomycin (pPZP200);
(4) Chỉ thị chọn lọc thực vật nh gen kháng kanamycin, gentamycin; (5) Ngoài ra, pPZP còn
chứa đoạn lacZ với vùng MCS của pUC18 nằm giữa đoạn biên phải và gen chọn lọc thực
vật [90].
pBECK2000: có chứa đoạn biên phải và trái tổng hợp nhân tạo và gen bar. Hơn
nữa, chúng sử dụng hệ thống tái tổ hợp đặc hiệu vị trí phagơ P1 Cre/ lox P cho phép

quá trình chuyển và xâm nhập gen chọn lọc và gen quan tâm vào genom thực vật đợc
diễn ra đồng thời (trên cùng T-ADN) hoặc trên hai đoạn T-ADN khác nhau của A.
tumefaciens. Thế hệ vectơ này cũng cho phép cắt bỏ gen chọn lọc khỏi genom thực
vật ở những vị trí đặc hiệu sau khi chúng đã đợc biến nạp vào tế bào thực vật [142].
Vectơ hai nguồn BAC (Binary-BAC: BiBAC): rất phù hợp để chuyển các phân
tử ADN có kích thớc lớn tới 150 kb vào genom thực vật. BiBAC có chứa vùng sao
chép đơn trong E. coli và A. tumefaciens. Plasmit trợ giúp mang nhiều bản sao của
các gen vir giúp cho T-ADN kích thớc rất lớn vẫn đợc chuyển nguyên vẹn vào
genom thực vật [93], [94].
pGREEN: là plasmit kích thớc nhỏ với: (1) Vùng sao chép có phổ vật chủ rộng
ORI pSa và vùng ColE1 có nguồn gốc từ pUC; (2) Gen rep A mã hoá chức năng sao
chép trong E. coli và A. tumefaciens nằm trên plasmit tơng thích (pSoup) trong A.
tumefaciens; (3) Vùng MCS từ pBlueScript cho phép sắp xếp các gen chọn lọc và
gen quan tâm theo ý muốn [96], [97].
1.1.2.2 Thành tựu chuyển gen vào cây trồng nhờ A. tumefaciens
Một trong những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên đã sử dụng A. tumefaciens
để đa gen kháng kháng sinh vào cây thuốc lá [99]. Sau đó, A. tumefaciens đã đợc
chứng minh là một phơng tiện rất hiệu quả để đa gen quan tâm vào rất nhiều loài
cây trồng quan trọng [57].
14
Chuyển gen vào cây hai lá mầm: Đến nay, trên đối tợng cây hai lá mầm, phơng
pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens đợc đánh giá là hiệu quả nhất và đợc thực hiện khá
đơn giản với sự hỗ trợ của các chỉ thị chọn lọc. Đầu những năm 1980, các cây thuốc lá
mang T-ADN với gen mã hoá alcohol dehydrogenaza (alcohol dehydrogenase - Adh) của
nấm men và nptII đã đợc tái sinh [110]. Firoozabady & đtg cũng đã thu đợc cây bông
chuyển gen khi sử dụng những mảnh lá mầm từ hạt nảy mầm 12 ngày tuổi nuôi cấy với A.
tumefaciens mang Ti-plasmit có chứa gen nptII [78]. Từ đó tới nay, rất nhiều loài cây đã đ-
ợc chuyển gen thành công, nh cà chua, khoai tây, cải, hớng dơng, da hấu, khoai lang [115],
[202]. Trong những điều kiện đặc biệt, A. tumefaciens cũng có thể chuyển đợc gen vào
genom của đậu tơng và nhiều loài cây hai lá mầm khác [155].

Chuyển gen vào cây một lá mầm: Cho đến những năm gần đây, phơng pháp
này vẫn còn ít thành công trên cây một lá mầm. Nguyên nhân có thể do cây một lá
mầm không mẫn cảm với sự xâm nhiễm của A. tumefaciens. Hiệu quả chuyển gen thấp
cũng có thể do sự cản trở trong quá trình biến nạp nh: sự dẫn dụ hoá học của A.
tumefaciens với các tế bào thực vật bị tổn thơng, sự gắn kết của A. tumefaciens vào tế
bào thực vật, sự cảm ứng của những phân tử nhận biết ở thực vật với các gen vir, sự sao
chép T-ADN, sự chuyển và xâm nhập của T-ADN vào genom thực vật [192]. Mặc dù
vậy, rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu và chuyển gen
thành công vào ngô, lúa, lay-ơn, măng tây và các loài cây khác bằng cách chọn lựa
nguyên liệu ban đầu, kỹ thuật tái sinh cây, điều kiện nuôi cấy mô, vectơ và chủng vi
khuẩn sử dụng thích hợp [49], [72], [147], [163]. Trên đối tợng cây ngô, kỹ thuật tái
sinh cây sau biến nạp đã thành công khi sử dụng siêu vectơ hai nguồn (super binary
vector) trong đó phôi ngô cha trởng thành của các dòng ngô lai nh A188, Hi II đợc gây
nhiễm bởi các chủng A. tumefaciens mang thêm các bản sao của virB, virC, và virG
[152]. Ishida & đtg đã đa ra phơng pháp nuôi cấy Agrobacterium mang vectơ hai nguồn
với phôi ngô cha trởng thành cho hiệu quả chuyển gen tăng từ 5% lên 30% [112]. Năm
2002, sử dụng hệ thống vectơ hai nguồn chuẩn, Frame & đtg đã hoàn chỉnh quy trình
biến nạp gen vào ngô [80]. ở lúa, Hiei & đtg đã sử dụng chủng A. tumefaciens gây độc
và vectơ hai nguồn đặc biệt mang một vài gen vir. Trong số rất nhiều cây chuyển gen
15
thu đợc, có khoảng 35% cây mang 1 bản sao của gen chuyển, còn lại mang từ 2 đến 4
bản sao [102]. Vijayachandra & đtg đã tập trung nghiên cứu khả năng cảm ứng của các
mô lúa với các gen vir nhằm tìm ra loại mô thích hợp nhất để chuyển gen vào lúa [192].
Riazuddin & đtg đã sử dụng vectơ chứa gen cryIA(c) dới sự điều khiển của Ubi-P và
gen hpt để chuyển vào lúa tạo khả năng kháng côn trùng ăn lá [166]. Komari & đtg đã
sử dụng vectơ với 2 đoạn trình tự T-ADN mang 2 gen khác nhau để chuyển vào lúa và
đã thu đợc rất nhiều thể biến nạp, trong đó đã chứng minh đợc sự xâm nhiễm và phân ly
của T-ADN ở thế hệ R
0
và R

1
[124].
Nhờ kỹ thuật chuyển gen hiệu quả này, gen quan tâm có thể dễ dàng đợc
chuyển vào genom thực vật và đợc điều khiển biểu hiện ở những mô, cơ quan đặc
biệt trong những giai đoạn phát triển nhất định. Số lợng gen quan tâm đợc tạo dòng,
đa vào vectơ thích hợp để chuyển vào cây trồng ngày một nhiều và sản phẩm của
quá trình chuyển gen là hàng loạt cây trồng mang những tính trạng mong muốn.
1. 2 thiết kế vectơ mang gen m hoá protein có hoạt tính diệtã
côn trùng để chuyển vào cây trồng nhờ a. tumefaciens
Hàng năm chi phí cho hoá chất nông nghiệp toàn cầu chiếm khoảng 7,8 tỷ đô
la Mỹ [154]. Hơn nữa, sử dụng thuốc trừ sâu hoá học còn ảnh hởng nghiêm trọng
đến môi trờng sinh thái. Mặc dù lợng hoá chất đợc sử dụng rất nhiều, thiệt hại do
côn trùng gây hại thực vật vẫn chiếm hơn 10% tổng sản lợng hàng năm [35]. Ngoài
ra, quần thể sâu hại có khả năng kháng thuốc trừ sâu hoá học đã tăng lên hơn 500
loài [126]. Vì vậy, hớng chiến lợc thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng đã mở ra
triển vọng mới trong công nghệ chuyển gen nhằm tạo cây trồng tự kháng sâu bệnh.
Rất nhiều loài cây trồng đã nhận đợc gen kháng côn trùng và hình thành khả năng
diệt côn trùng gây hại.
1.2.1 Các loại vectơ chính
Hiện nay có khá nhiều loại vectơ, nh plasmit, cosmit, phagơ, nhiễm sắc thể
nhân tạo của vi khuẩn và nấm men. Plasmit rất thông dụng. Các loại vectơ khác th-
ờng đợc sử dụng cho các mục đích đặc hiệu hơn. Việc nghiên cứu, ứng dụng gen
16
quan tâm cũng nh các gen kháng côn trùng thờng bắt đầu bằng kỹ thuật thiết kế các
vectơ plasmit này. Tiến bộ đáng kể đạt đợc khi hệ thống vectơ chuyển gen thực vật
thế hệ mới ra đời giúp tăng năng suất, chất lợng cây trồng và cải thiện môi trờng
sinh thái.
1.2.1.1 Vectơ tạo dòng
Đây là các plasmit nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thớc nhỏ và chứa gen
chọn lọc đợc sử dụng để tạo dòng các đoạn ADN. Chúng đợc phát hiện đầu tiên ở vi

khuẩn, sau đó không ngừng đợc cải tiến với nhiều đặc tính quý: (1) Plasmit thế hệ
thứ nhất nh ColE1, pSC101 nguồn gốc tự nhiên có rất ít các đặc tính cần thiết; (2)
Plasmit thế hệ thứ hai nh pBR322 đợc thiết kế nhân tạo trên cơ sở tập trung các tính
trạng quý của plasmit tự nhiên và đợc sử dụng để biến nạp gen quan tâm vào E. coli
nhằm tạo dòng và nhân lên với lợng lớn. Chúng thờng chứa vùng sao chép trong E.
coli, chỉ thị chọn lọc vi khuẩn và vùng MCS. Plasmit pBR322 và các thế hệ vectơ
biểu hiện có nguồn gốc từ pBR322 khá bền, tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế
hệ nuôi cấy ngay trong điều kiện không có kháng sinh chọn lọc. Tuy nhiên, trong
một vài trờng hợp, plasmit có thể không bền vững khi protein tái tổ hợp có hoạt tính
độc ảnh hởng đến sinh trởng của tế bào chủ [27]; (3) Plasmit thế hệ thứ ba: nh pUC,
pSP, pBluescript có kích thớc nhỏ nên sao chép rất nhanh trong tế bào vi khuẩn.
1.2.1.2 Vectơ biểu hiện
Đây là phơng tiện để biểu hiện các gen quan tâm đã đợc tạo dòng. Một trong
những hệ thống vectơ mạnh đợc sử dụng rộng rãi để tạo dòng và biểu hiện các
protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli là hệ thống vectơ pET [183]. Dới sự điều khiển
của các tín hiệu phiên mã và dịch mã có nguồn gốc từ phagơ T7, gen quan tâm đ ợc
tạo dòng trong pET, sau đó đợc chuyển sang hệ thống tế bào biểu hiện mang T7
ARN polymeraza (T7 RNA polymerase) dới sự điều khiển của lacUV5 và sự biểu
hiện đợc cảm ứng bởi Isopropylthio--D-galactosit (Isopropylthio--D-galactoside -
IPTG). Trong giai đoạn tạo dòng gen quan tâm, các tế bào chủ không chứa gen mã
hoá T7 ARN polymeraza nên khả năng sản xuất các protein có hoạt tính độc đối với
tế bào chủ không xảy ra. Nhờ vậy, plasmit đợc duy trì bền vững hơn. Đặc biệt, thế
17
hệ pET mới bao gồm vectơ phiên mã và dịch mã do Công ty Novagen thiết kế với
những đặc tính tăng cờng cho quá trình tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein: (i)
Vectơ phiên mã dùng để biểu hiện gen quan tâm của tế bào nhân sơ đã mang vị trí
gắn ribosom và mã khởi đầu ATG; (ii) Vectơ dịch mã mang vị trí gắn ribosom hiệu
quả của protein vỏ phagơ T7 để biểu hiện gen quan tâm của tế bào nhân thật.
ở thực vật, vectơ biểu hiện đợc thiết kế phù hợp với phơng pháp chuyển gen.
Trên cơ sở Ti-plasmit nhân tạo và phơng pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens, rất

nhiều vectơ biểu hiện thực vật đã đợc thiết kế và đa vào ứng dụng. Bevan đã tạo ra
vectơ hai nguồn mang vùng T-ADN cải biến với đoạn biên phải, trái, gen nptII và
vùng MCS từ M13mp19 giúp gắn gen quan tâm dễ dàng [39]. Velten & Schell đã
thiết kế hàng loạt vectơ có thể hoạt động trong nhiều đối tợng cây trồng với đặc tính
vừa mang gen chỉ thị chọn lọc, vừa mang đoạn khởi động điều khiển biểu hiện gen
quan tâm [191]. An đã thiết kế vectơ biểu hiện pGA492 mang gen cat khuyết đoạn
khởi động nhằm nghiên cứu chức năng của các yếu tố điều khiển trong tế bào thực
vật [30]. Cho tới nay, rất nhiều Ti-plasmit thế hệ mới đợc thiết kế và sử dụng với các
u điểm nh dễ tạo dòng gen quan tâm, dễ chuyển từ tế bào E. coli sang A.
tumefaciens và sang các mô cây bị tổn thơng.
1.2.2 Các thành phần chính của vectơ
Các vectơ sử dụng trong công nghệ gen thực vật thờng là các plasmit đơn giản
với một số đặc tính nh: (1) Có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào
chủ; (2) Có kích thớc nhỏ, dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập và dễ đợc sao chép;
(3) Mang chỉ thị chọn lọc giúp phát hiện dễ dàng tế bào chứa plasmit; (4) Tồn tại bền
vững trong tế bào chủ; Các đặc tính này là cơ sở quyết định các thành phần chính của
plasmit với: (1) Gen quan tâm đợc gắn thêm đoạn khởi động và đoạn kết thúc gen; (2)
Gen chỉ thị chọn lọc; (3) Các thành phần khác nh vùng khởi đầu sao chép và vùng
MCS.
1.2.2.1 Đoạn khởi động gen
18
Các gen kháng côn trùng có thể biểu hiện đợc thành protein cần phải có mặt
các tín hiệu điều khiển thích hợp ở những vị trí nhất định. Những tín hiệu tham gia
tích cực vào quá trình điều khiển biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen và
đoạn kết thúc gen. Ngoài ra, những yếu tố điều khiển phía trên nằm trớc gen cấu
trúc cũng tham gia vào quá trình kiểm soát biểu hiện gen về số lợng, thời gian và
không gian. Hơn nữa, các trình tự trên gen cấu trúc cần thiết cho quá trình xử lý
ARN cũng có vai trò quan trọng [130], [189], [194].
Đoạn khởi động bao gồm trình tự nucleotit phía trên đầu 5 của gen cấu trúc.
Nó đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận

biết cho enzym ARN polymeraza, cho các yếu tố hoạt hoá và khởi động [25]. Đoạn
khởi động chứa những trình tự ADN đặc biệt gọi là các yếu tố cis. ở các đoạn khởi
động gen thực vật, các yếu tố cis có thể chia làm hai loại: (1) Các yếu tố cis chuẩn
quyết định sự khởi đầu phiên mã của bất kỳ gen nào, bao gồm hộp CAAT, cung cấp
vị trí gắn cho ARN polymeraza và hộp TATA giúp cho quá trình gắn ARN
polymeraza chính xác vào vị trí khởi đầu phiên mã. Các hộp TATA và CAAT rất
bảo thủ và nằm gần gen cấu trúc; (2) Các yếu tố cis khác có liên quan đến sự điều
khiển biểu hiện gen mang tính đặc hiệu [27], [167]. Nh vậy, các đoạn khởi động có
thể đợc chia làm hai loại chính: đoạn khởi động không đặc hiệu hay còn gọi là đoạn
khởi động cơ định (constitutive promoter) và đoạn khởi động đặc hiệu với các yếu tố
cis chuyên biệt.
Đoạn khởi động có vai trò chính trong quá trình biểu hiện gen. Gen thiếu
đoạn khởi động giống nh ô tô không có động cơ [167]. Gần đây, Laporte & đtg đã
nghiên cứu và chứng tỏ ảnh hởng quan trọng của đoạn khởi động khi biểu hiện gen
mã hoá sucroza phosphat synthaza (sucrose phosphate synthase) ở cà chua. Sản lợng
cà chua tăng tới 80% khi sử dụng đoạn khởi động 35S tách từ virut khảm súp lơ
(Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter - CaMV35S-P) để điều khiển biểu hiện
gen này [129]. Trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật, CaMV35S-P đợc sử dụng
rộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô cây hai lá mầm [29], [47],
[139]. Trên cơ sở CaMV35S-P, rất nhiều đoạn khởi động lai hoặc kết hợp có khả
19
năng tăng cờng mức độ biểu hiện gen đã đợc thiết kế nh đoạn khởi động 35S kép,
đoạn khởi động lai với vùng trung tâm của CaMV19S-P và vùng tăng cờng phía trên
của CaMV35S [122], [196]... Ngoài CaMV35S-P, các đoạn khởi động chính hoạt
động trong thực vật bao gồm Adh-P, Ubi-P, đoạn khởi động của gen tổng hợp
nopalin (nopaline synthase promoter - NOS-P)... [62], [143], [176]. Đối với lúa,
đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza (Rice sucrose synthase promoter -
Rsuc-P) cũng đợc quan tâm nghiên cứu và sử dụng [163], [206].
1.2.2.2 Đoạn kết thúc gen
Các đoạn kết thúc này thờng chứa đuôi polyA nh AATTAA, hoặc AACCAA

giúp bảo vệ các phân tử ARN thông tin đợc bền vững hơn và tránh khỏi sự phân huỷ.
Hai đoạn kết thúc đợc sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn kết thúc
của CaMV35S (có mặt trong 7 sản phẩm chuyển gen hiện nay) và đoạn kết NOS (có
mặt trong ít nhất 16-28 sản phẩm) [98].
1.2.2.3 Gen chỉ thị
Việc thiết kế các gen chỉ thị có thể hoạt động đợc trong tế bào thực vật đã
nâng cao hiệu quả của kỹ thuật tạo cây trồng chuyển gen. Nhờ các quá trình chọn
lọc ở tế bào vi khuẩn hoặc sàng lọc ở các mô tái sinh, các thể biến nạp đợc nhận biết
và chọn lọc dễ dàng [195]. Các chỉ thị di truyền sử dụng trong biến nạp gen thực vật
thờng có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật với hai loại chính:
Chỉ thị chọn lọc (selectable markers) kháng lại một áp lực chọn lọc nhất định,
cho phép chọn lọc các tế bào biến nạp nhờ khả năng sinh trởng đợc trên môi trờng
chứa chất kháng sinh/ diệt cỏ. Ngoài ra, chúng là cơ sở để theo dõi sự di truyền qua
các thế hệ của gen ngoại lai trong quần thể thực vật đang phân ly [202]. Một trong
những chỉ thị chọn lọc đợc sử dụng rộng rãi là kết cấu gen mang đoạn khởi động
NOS điều khiển biểu hiện gen nptII. Ngoài gen nptII, các gen kháng kháng sinh
khác nh -lactamaza (-lactamase - bla), nptIII cũng có mặt trong genom của một số
cây trồng biến đổi di truyền. Trong một số trờng hợp, các gen này không đợc thiết
20
kế nh những chỉ thị chọn lọc thực vật mà vẫn chịu sự điều khiển của đoạn khởi động
vi khuẩn ban đầu [82], [83].
Chỉ thị sàng lọc (screenable markers) mã hoá cho các sản phẩm của gen với hoạt
tính enzym rất dễ phân tích. Chỉ thị sàng lọc không chỉ giúp nhận biết các thể biến nạp
mà còn dự đoán đợc mức độ biểu hiện của gen quan tâm trong mô thực vật đợc chuyển
gen. Các chỉ thị nh -glucuronidaza (-glucuronidase - GUS), -galactosidaza cho phép
sàng lọc hoạt tính của enzym dễ dàng trên cơ sở kỹ thuật xét nghiệm huỳnh quang,
nhuộm hoá tế bào. Chúng đợc ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đặc tính của tế bào
cũng nh sự biểu hiện của các gen điều chỉnh [119], [175], [202].
Thông thờng, các gen chỉ thị đợc gắn với những đoạn khởi động tách từ mầm
bệnh thực vật hoặc virut gây bệnh thực vật do các nhà thiết kế cho rằng các đoạn

khởi động này sẽ hoạt động tốt trong thực vật. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều bằng
chứng cho thấy mức độ biểu hiện của gen đợc điều khiển trực tiếp bởi các đoạn khởi
động này có thể đợc điều chỉnh tăng đến một mức độ nào đó nhờ một số yếu tố phát
triển hoạt động trong các cây nguyên vẹn không bị bệnh.
Vấn đề có an toàn hay không khi sử dụng gen chỉ thị trong chọn lọc các thể
biến nạp còn gây nhiều tranh cãi. Những điểm chính bao gồm vai trò quan trọng của
kanamycin, neomycin... trong chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn ở ngời và sự phát triển
rộng khắp của quần thể vi khuẩn kháng chất kháng sinh. Tuy nhiên, sự an toàn của
các gen kháng kháng sinh nh nptII dới sự điều khiển của các đoạn khởi động đặc hiệu
thực vật của Calgene đã đợc nghiên cứu chứng minh và đợc Cơ quan Quản lý Thực
phẩm và Dợc phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration - FDA) chấp thuận [82],
[83]. Cũng cần nhấn mạnh rằng, sở dĩ các gen chọn lọc có mặt trong các cây trồng
chuyển gen là do: (i) Gen quan tâm đầu tiên đợc thiết kế trong vectơ vi khuẩn (nh E.
coli) có chứa gen kháng kháng sinh, sau đó nhờ các phơng pháp biến nạp, vectơ hoàn
chỉnh đợc sử dụng để đa gen quan tâm vào cây trồng; (ii) Gen kháng kháng sinh chọn
lọc vi khuẩn nằm trong vùng T-ADN sẽ đợc chuyển đồng thời vào cây nhờ A.
tumefaciens. Các gen này rõ ràng là không đợc sử dụng trực tiếp để chọn lọc cây trồng
chuyển gen nên không cần thiết phải có mặt trong sản phẩm cuối cùng, nhất là khi
21
các cây trồng đợc sử dụng làm thực phẩm [82]. Ngoài ra, trong khi các thể biến nạp
thu đợc nhờ khả năng sống sót và sinh trởng trên môi trờng có chất chọn lọc nh kháng
sinh hoặc thuốc diệt cỏ, các tế bào không nhận đợc gen chuyển thì bị ảnh hởng bởi tác
động của các chất ức chế sinh trởng này. Nhằm tránh sử dụng các gen kháng kháng
sinh chọn lọc trong vi khuẩn, ngời ta đã sử dụng các gen chỉ thị chọn lọc thay thế nh
hệ thống Cre/ lox cho phép loại bỏ các chỉ thị chọn lọc sau biến nạp vào tế bào thực
vật [60], [132]. Gần đây, Công ty Novartis (hiện nay là Syngenta) công bố không sử
dụng các gen kháng kháng sinh để chọn lọc. Ngoài ra, một hớng chiến lợc khác cũng
đang đợc sử dụng trong phơng pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens, đó là hệ thống
biến nạp đồng thời gen quan tâm và gen chọn lọc, sau đó tiến hành tách riêng [82].
1.2.3 Vectơ mang gen kháng côn trùng

Các vectơ này đợc thiết kế để biến nạp vào cây trồng các gen kháng côn
trùng có giá trị phân lập từ động vật, thực vật, vi sinh vật hoặc tổng hợp nhân tạo.
1.2.3.1 Nguồn gen kháng côn trùng
a) Gen cry m hoá protein độc tố của ã Bacillus thuringiensis
Trong nguồn gen kháng côn trùng, gen cry mã hoá protein tinh thể độc có
hoạt tính diệt côn trùng (Insecticidal Crystal Proteins - ICPs) của Bt đợc sử dụng phổ
biến nhất để chuyển và biểu hiện ở hàng loạt cây trồng quan trọng.
Sơ lợc về Bt: Bt là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram dơng, có khả năng hình
thành bào tử trong điều kiện môi trờng bất lợi và sản sinh protein tinh thể độc ở
dạng ngoại bào (, , exotoxin) và nội bào (-endotoxin). Trong đó, -endotoxin là
một họ protein tinh thể độc chính do hơn 140 gen cry mã hoá đợc sản sinh trong quá
trình hình thành bào tử. Chúng gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng mẫn cảm và thờng
đợc sử dụng để khống chế côn trùng Bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Hai cánh (Diptera),
Cánh cứng (Coleoptera) và tuyến trùng (Nematoda) [23], [65]. Chế phẩm sinh học Bt
diệt côn trùng đợc sử dụng rộng rãi nhất, chiếm tới 90% thị trờng thuốc trừ sâu sinh
học và 2% thị trờng thuốc trừ sâu toàn cầu [4], [5], [121].
22
Mặc dù đợc coi là thuốc trừ sâu vi sinh hiệu quả, một số hạn chế nhất định
về phơng diện sinh học nh thời gian ảnh hởng ngắn, không tiếp xúc đợc với côn
trùng ẩn sâu dới lá, đất... đã phần nào giảm mức độ sử dụng chế phẩm Bt [126].
Những điểm bất lợi này hoàn toàn bị loại trừ khi chuyển và biểu hiện gen cry vào
cây trồng [169].
Cấu trúc phân tử và cơ chế hoạt động của protein tinh thể độc:
Protein tinh thể độc thờng tồn tại ở dạng tiền độc tố với cấu trúc gồm hai phần:
phần đầu N mang độc tính và phần đầu C. Cơ chế tác dụng của tiền độc tố lên
côn trùng đích đã đợc nghiên cứu khá sâu. Đầu tiên tinh thể xâm nhập vào cơ thể
côn trùng theo thức ăn qua đờng miệng. Sau đó dới tác động của môi trờng có độ
pH > 10 ở ruột giữa của sâu cùng với sự hoạt động của proteaza ruột sâu, tơng tự
trypsin, các tiền độc tố đã đợc hoạt hoá. Tiền độc tố CryI và CryIV với kích thớc
130-140 kDa khi đợc hoạt hoá đã hình thành độc tố, kích thớc 65-75 kDa có hoạt

tính và bền vững. Trong khi tiền độc tố CryII và III (70-75 kDa) sau quá trình
biến đổi đã tạo ra độc tố kích thớc 60-65 kDa. Sau khi đợc hoạt hoá, protein tinh
thể độc đã liên kết ái lực mạnh với các chất nhận glycoprotein tại những vị trí đặc
hiệu nằm trên các vi nhung mao của tế bào biểu mô ruột giữa của ấu trùng. Chính
mối liên kết của các độc tố với các chất nhận ở vi nhung mao này đã quyết định
tính đặc hiệu của độc tố. ở những côn trùng không mẫn cảm, mối liên kết này rất
lỏng lẻo. Hiện nay, ngời ta đã xác định đợc ba nhóm vị trí gắn. Một số vị trí có
thể liên kết với một loại độc tố, một số vị trí khác có thể liên kết với hai hay
nhiều loại. Nh vậy, một độc tố đặc thù có thể liên kết với nhiều vị trí nhận trong
ruột của côn trùng. Sau khi gắn kết, protein tinh thể độc tố đính trên bề mặt tế
bào biểu mô ruột giữa, gây tổn thơng và phá huỷ tế bào, tiêu diệt côn trùng mẫn
cảm [123].
Protein tinh thể độc có cấu trúc đặc thù. Các nghiên cứu về cấu trúc của
chúng thờng bắt đầu bằng những điều tra về chức năng của những vùng cấu trúc
này. Đặc điểm điển hình trong cấu trúc của protein tinh thể độc là có các vùng bảo
thủ nằm xen kẽ những vùng biến đổi. Các vùng bảo thủ này đóng vai trò quan trọng
23
về mặt cấu trúc và chức năng. Cấu trúc của -endotoxin vẫn cha đợc làm sáng tỏ cho
đến khi cấu trúc tinh thể của CryIIIA và CryIA(a) đợc công bố [89], [134]. Kết quả
nghiên cứu cấu trúc cho thấy protein tinh thể độc nhóm CryI và CryIII có 3 vùng
khác biệt: vùng đầu N bảo thủ cao (chứa 28-282 aa), vùng siêu biến ở giữa (283-461
aa) và vùng đầu C bảo thủ không hoàn toàn (462-610 aa). Về chức năng, vùng 1 của
CryIIIB2 và CryIA(c) liên quan đến hoạt động của kênh ion, bớc khởi đầu của quá
trình hình thành protein [198]. Vùng 2, 3 liên quan đến việc gắn thụ thể và quyết
định tính đặc hiệu côn trùng [161]. Tuy nhiên, ở một số độc tố, vùng 3 cũng tham
gia vào hoạt động của kênh ion [200].
Gen m hoá protein tinh thể độc:ã Gen cry tự nhiên thờng nằm trên plasmit
cỡ lớn kích thớc khoảng 3 kb, trong đó chỉ có đoạn khoảng 2 kb mã hoá protein tinh
thể độc. Các plasmit này có mặt trong hầu hết các chủng Bt với số lợng dao động từ
2 đến 12 bản sao. Ngoài ra, các gen cry cũng có thể nằm trên nhiễm sắc thể ở một số

chủng Bt nh chủng kurstaki HD-1, entomocidus, aizawai 7.29... Một chủng vi khuẩn
có thể mang đồng thời nhiều gen cry nh chủng aizawai và kurstaki HD-1 tự nhiên
chứa 5 gen cry nằm trên các vị trí tách biệt nhau; Chủng Bt var. israelensis có 4 gen
cry mã hoá protein diệt đặc hiệu côn trùng Bộ Hai cánh và một gen mã hoá
Cytolysin nằm trên cùng một plasmit [162].
Phân loại gen cry và protein tinh thể độc của Bt: Dựa trên khả năng
diệt côn trùng đặc hiệu và những trình tự tơng đồng, gen cry và protein tinh thể độc
đợc chia thành 4 nhóm chính: (1) Gen cryI mã hoá cho protein CryI 130-140 kDa
độc đối với côn trùng Bộ Cánh vảy; (2) Gen cryII mã hoá cho protein CryII kích th-
ớc 66 kDa độc đối với côn trùng Bộ Cánh vảy và Hai cánh; (3) Gen cryIII mã hoá
protein CryIII 73 kDa độc đối với côn trùng Bộ Cánh cứng; (4) Gen cryIV đợc phân
lập từ chủng israelensis mã hoá cho protein CryIV kích thớc 135, 128, 74 và 72 kDa
độc đối với côn trùng Bộ Hai cánh [107]. Dựa trên độ tơng đồng của các trình tự aa,
protein tinh thể độc đợc chia tiếp thành các nhóm phụ. Tuy nhiên, việc phân loại này
chỉ là tơng đối. CryI chỉ nhóm protein tinh thể độc có hoạt tính diệt côn trùng Bộ
Cánh vảy, nhng CryIAb lại đợc công bố có khả năng kháng lại ấu trùng muỗi. CryII
24
có hoạt tính kép (diệt đồng thời côn trùng Bộ Cánh vảy và Hai cánh) trong khi
CryIIB chỉ diệt côn trùng Bộ Cánh vảy [156].
b) Các gen m hoá protein khác có hoạt tính diệt côn trùngã
Một số loài thực vật có khả năng tự vệ trớc sự tấn công của côn trùng nhờ tạo
ra protein là các chất ức chế tác động vào hệ tiêu hoá của côn trùng. Khai thác tính
đặc hiệu của các protein này đã mở ra khả năng rất hấp dẫn trong chọn tạo giống
cây trồng. Hiện nay, rất nhiều protein thực vật có độc tính ảnh hởng đến trao đổi
chất của côn trùng đang là đối tợng quan tâm của các nhà công nghệ gen thực vật
(bảng 1.1) [103], [178].
Bảng 1.1. Protein có hoạt tính diệt côn trùng và phổ hoạt động của chúng
Protein độc tố
Côn trùng
Tuyến

trùng
Nấm Động
vật
Bộ Cánh
vảy
Bộ Cánh
cứng
Bộ Cánh
nửa
Bộ Cánh
thẳng
Chất ức chế proteaza
dạng serin
+ + - + +
Chất ức chế proteaza
dạng cystein
- + - + -
Lectin: Mannoza sp
NacGlu sp
+
+
+
+
+
+
+ + -
+
Chất ức chế -amylaza
+ + - +/ -
Enzym:

Lipoxygenaza
Acyl-hydrolaza
Chitinaza
+
+
+
+
+
+
- +
+
-
+
Protein bất hoạt hoá
ribosom
+ + + +
Protein tinh thể độc:
CryI
CryIII
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-

-
25